BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

**********************

PHẠM THANH NGA

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ CỦA CAO CHIẾT

CÂY MẦN TƯỚI (EUPATORIUM FORTUNEI TURCZ.) LÊN

SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN

LAM ĐỘC MICROCYSTIS AERUGINOSA KUTZING

TRONG CÁC THỦY VỰC NƯỚC NGỌT

Chuyên ngành: Kỹ thuật môi trường

Mã số: 9.52.03.20

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Hướng dẫn khoa học:

Hướng dẫn 1. GS.TS. Đặng Đình Kim

Hướng dẫn 2. TS. Lê Thị Phương Quỳnh

Hà Nội – 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi, Phạm Thanh Nga, tác giả luận án tiến sỹ xin cam đoan đây là công trình

nghiên cứu của riêng tôi, không trùng lặp và sao chép với bất kì công trình khoa học

nào khác. Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, được các

đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào, chưa

từng được công bố trong công trình nào khác.

Hà Nội, tháng……..năm 2019

Tác giả luận án

Phạm Thanh Nga

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ......................................... 3

1.1. Vi khuẩn lam độc và hiện tượng phú dưỡng trong các thủy vực nước ngọt ........ 4

1.1.1. Vi khuẩn lam độc .............................................................................................. 4

1.1.2. Hiện tượng phú dưỡng và triển bùng nổ sinh khối VKL độc ........................... 6

1.1.3. Các biện pháp kiểm soát phát triển bùng nổ sinh khối VKL độc .................. 10

1.1.4. Phương pháp triển khai áp dụng ngoài thực tế tại các ao, hồ Việt Nam ............ 17

1.2. Sử dụng cao chiết thực vật và hoạt chất thiên nhiên để kiểm soát bùng nổ Vi

khuẩn lam độc ........................................................................................................... 20

1.2.1. Hoạt tính sinh học của cao chiết và các hợp chất thiên nhiên ...................... 20

1.2.2. Nghiên cứu điển hình sử dụng cao chiết, dịch chiết thực vật kiểm soát bùng

phát VKL độc ............................................................................................................. 22

1.2.3. Một số nhóm hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên kiểm soát bùng nổ VKL ... 30

1.2.4. Cơ chế tác động của các cao chiết và các hợp chất thiên nhiên lên sinh

trưởng của VKL độc M. aeruginosa ......................................................................... 32

1.3. Cây Mần tưới Eupatorium fortunei .................................................................... 34

1.3.1. Sơ lược về cây Mần tưới Eupatorium fortunei................................................ 34

1.3.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học .................................................... 34

1.3.3. Hoạt tính sinh học của cây Mần tưới ............................................................. 42

1.3.4. Ứng dụng cao chiết cây Mần tưới để kiểm soát bùng phát sinh khối VKL độc

M. aeruginosa ........................................................................................................... 45

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 47

2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 47

2.1.1. Cây Mần tưới Eupatorium fortunei ................................................................ 47

2.1.2. Vi khuẩn lam độc nước ngọt Microcystis aeruginosa Kützing ..................... 47

2.1.3. Loài tảo lục Chlorella vulgaris ...................................................................... 48

2.1.4. Bèo tấm Lemna minor .................................................................................... 49

2.1.5. Giáp xác Daphnia magna .............................................................................. 49

2.1.6. Quần thể thực vật phù du hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng .................................... 50

2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất .............................................................................. 50

2.2.1. Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................... 50

2.2.2. Hóa chất ......................................................................................................... 50

2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 51

2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, tạo cao chiết và phân lập các hợp chất sạch ...... 51

2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất sạch ....................................... 51

2.3.3. Phương pháp đánh giá sinh trưởng của VKL, tảo lục Chlorella vulgaris và

thực vật phù du .......................................................................................................... 51

2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào VKL và Chlorella vulgaris [63] ...... 53

2.3.5. Phương pháp đánh giá độc tố của cao chiết lên Daphnia magna [135] ....... 53

2.3.6. Phương pháp đánh giá độc tố của cao chiết lên Lemna minor [22] ............. 54

2.3.7. Phương pháp phân tích chất lượng môi trường nước [17] ........................... 54

2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 55

2.4. Mô tả thực nghiệm .............................................................................................. 55

2.4.1. Thực nghiệm xử lý mẫu thực vật, tạo cao chiết và phân lập chất sạch ......... 55

Quy trình phân lập các chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl axetate Mần tưới .. 59

2.4.2. Thực nghiệm nghiên cứu độc tính diệt VKL độc và tảo lục của các cao chiết ....... 62

2.4.3. Thực nghiệm đánh giá tính an toàn của cao chiết .......................................... 64

2.4.4. Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao chiết đối với mẫu nước hồ tự nhiên ...... 66

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................. 67

3.1. Công thức cấu tạo các chất sạch được phân lập từ cây Mần tưới Eupatorium fortunei . 68

3.1.1. Hợp chất 7,8,9-trihydroxythymol (EfD4.7) .................................................... 69

3.1.2. Hợp chất 8,10-didehydro-7,9-dihydroxythymol(EfD4.8) ............................... 75

3.1.3. Hợp chất 8,9,10- Trihydroxythymol (EfD5.1) ................................................ 79

3.1.4. Hợp chất o-Coumaric acid (EfD1.8).............................................................. 80

3.1.5. Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)benzaldehyde (EfD10.1) ................................... 81

3.1.6. Hợp chất kaempferol (EfD10.3) ..................................................................... 82

3.1.7. Hợp chất 8,10-dihydroxy-9-acetoxythymol (EfD14.1) ................................... 83

3.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng và diệt VKL độc, vi tảo của các

cao chiết và chất sạch được phân lập ........................................................................ 86

3.2.1. Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng VKL độc Microcystis aeruginosa TC3

của các cao chiết tổng Mần tưới ............................................................................... 86

3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol Mần tưới lên sinh trưởng

của Microcystis aeruginosa TC3 và Chlorella vulgaris ........................................ 89

3.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn lên sinh trưởng của

Microcystis aeruginosa TC3 và Chlorella vulgaris .................................................. 95

3.2.4. Đánh giá tiềm năng kiểm soát bùng nổ sinh khối Microcystis aeruginosa TC3

của cao chiết Mần tưới ............................................................................................ 101

3.2.5. Đánh giá hoạt tính diệt Microcystis aeruginosa TC3 của các chất sạch .... 105

3.2.6. Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc tế bào M. aeruginosa TC3 và C. vulgaris ..... 109

3.3. Kết quả đánh giá tính an toàn của cao chiết thực vật Mần tưới (ảnh hưởng lên

một số sinh vật khác) ............................................................................................... 115

3.3.1. Ảnh hưởng của cao chiết đến giáp xác Daphnia magna ............................. 115

3.3.2. Ảnh hưởng của cao chiết đến bèo tấm Lemna minor ................................... 121

3.4. Bước đầu thử nghiệm ảnh hưởng của cao chiết lên sinh trưởng VKL độc trong

mẫu nước hồ tự nhiên .............................................................................................. 127

3.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng ức chế của cao chiết lên mẫu nước hồ Hoàn

Kiếm quy mô phòng thí nghiệm ............................................................................... 127

3.4.2. Kết quả thử nghiệm trên mẫu nước hồ Láng quy mô 5L tại phòng thí nghiệm .... 130

3.4.3. Kêt quả thử nghiệm trên mẫu nước hồ Láng quy mô ngoài trời .................... 134

3.4.4. Ảnh hưởng của cao chiết đến các thông số môi trường ............................... 137

KẾT LUẬN ............................................................................................................ 141

KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 142

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 142

PHỤ LỤC

1. Quyết định về việc công nhận trúng tuyển nghiên cứu sinh năm 2015

2. Quyết định về việc công nhận tên đề tài và người hướng dẫn

3. Danh mục các bài báo công bố của NCS

4. Danh mục các phổ của các chất sạch được phân lập từ cây Mần tưới

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

KÝ HIỆU TIẾNG VIỆT TIẾNG ANH

13C NMR Cộng hưởng từ hạt nhân 13C Carbon Nuclear Magnetic

Resonance (13C-NMR)

1H NMR Cộng hưởng từ hạt nhân 1H Proton Nuclear Magnetic

Resonance (1H-NMR)

DO Oxy hòa tan Dissolved Oxygen

EC50 Nồng độ ảnh hưởng 50% Half maximal effective

concentration

EtOAc Dung môi etyl axetat Ethyl acetate solvent

EtOH Dung môi etanol Ethanol solvent

HMBC Heteronuclear Multiple Bond

Coleration

HR-ESI-

MS

Phổ khối lượng phun mù điện

tử phân giải cao

High-resolution electrospray

ionisation mass spectrometry

HSQC Heteronuclear single-quantum

correlation spectroscopy

IE Hiệu quả ức chế sinh trưởng Inhibition efficiency

IR Phổ hồng ngoại Infrared spectroscopy

LC50 Nồng độ gây chết 50% Lethal Concentration, 50%

MeOH Dung môi metanol Methanol solvent

OD Mật độ quang Optical density

SEM Kính hiển vi điện tử quét Scanning Electron Microscope

TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua Transmission Electron

Microscopy

TN Tổng nitơ Total nitrogen

TP Tổng phốt pho Total phosphorus

TVN Thực vật nổi Phytoplankton

VKL Vi khuẩn lam Cyanobacteria

W Dung môi nước Water solvent

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Hiệu suất tạo cao chiết tổng trong các dung môi khác nhau ................... 68

Bảng 3.2. Hiệu suất tạo cao chiết phân đoạn từ cao chiết tổng ethanol Mần tưới .. 68

Bảng 3.3. Hiệu suất tách chiết các chất sạch từ Mần tưới ............................................ 69

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hai chất EfD4.7 và EfD4.8: ................................... 74

Bảng 3.5. Số liệu phổ 1H NMR (H và J) của EfD 10.1 và của hợp chất 8,9,10-

Trihydroxythymol đã được công bố trong tài liệu tham khảo [137] ..... 79

Bảng 3.6. Số liệu phổ 13C NMR của hợp chất axit o- coumaric ............................... 80

Bảng 3.7. Số liệu phổ 1H NMR của hợp chất axit o- coumaric ................................ 81

Bảng 3.8. Số liệu phổ 1H NMR (H và J) của EfD 10.3 và của kaempferol đã được

công bố .................................................................................................. 83

Bảng 3.9. Giá trị 1H NMR spectra (Hvà J) của EfD 14.1 với 8,9-didydroxy -9

axetoxythymol đã được công bố ............................................................ 84

Bảng.3.10. Hiệu qủa ức chế sinh trưởng của cao chiết etanol Mần tưới lên M.

aeruginosa và Ch. vulgaris tại nồng độ 200 và 500 µg/mL .................. 93

Bảng 3.11. Hiệu quả ức chế sinh trưởng của cao chiết phân đoạn etyl axetat và cao chiết

phân đoạn nước lên M. aeruginosa và Ch. vulgaris tại nồng độ 200 và 500

µg/mL ................................................................................................... 101

Bảng 3.12. Hiệu quả ức chế sinh sinh trưởng của chủng M. aeruginosa dưới ảnh

hưởng của CuSO4 5 µg/L và các cao chiết Mần tưới sau 72 giờ ........ 104

Bảng 3.13. Giá trị LC50 của cao chiết tổng etanol Mần tưới tại 24 và 48 giờ ....... 117

Bảng 3.14. Giá trị DO và pH của mẫu phơi nhiễm cao chiết tổng etanol Mần tưới

tại 0 và sau 48h .................................................................................... 119

Bảng 3.15. Giá trị DO và pH của mẫu phơi nhiễm cao chiết etyl axetat Mần tưới tại

0 và sau 48h ......................................................................................... 119

Bảng.3.16A. Biến động thông số thủy lý mẫu nước Hồ Hoàn Kiếm quy mô 5L bổ

sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol và etyl axetat Mần tưới .... 137

Bảng.3.16B. Biến động của thông số thủy hóa mẫu nước Hồ Hoàn Kiếm quy mô 5L bổ

sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol và etyl axetat Mần tưới ........ 137

Bảng.3.17.A Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 5L bổ sung

hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol và etyl axetat Mần tưới............. 138

Bảng.3.17 B. Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 5L bổ sung

hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol và etyl axetat Mần tưới............. 138

Bảng.3.18.A. Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 300L bổ

sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol Mần tưới .......................... 139

Bảng.3.18B. Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 300L bổ

sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol Mần tưới ........................... 139

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của phân tử microcystin [7] ...................................... 5

Hình.1.2. Bùng phát tảo nở hoa trên thế giới: A. Hồ Taihu, Trung Quốc. B. Hồ

Atitlan, Guatamala. C. Lake Erie, Mỹ - Canada. D. Ichetucknee

Springs, Florida, Mỹ. E and F. Hồ Taihu, Trung Quốc. G. Hồ Zaca,

California, Mỹ. H. and I. Sông St. Johns, Florida. Hồ J. Liberty,

Washington, Mỹ. K. Kênh Haarlem, Netherlands, L. Lagoon gần

sông St. Lucie Florida. [21] ................................................................... 9

Hình 1.3. Một số hồ tiêu biểu ở Việt Nam bùng phát tảo nở hoa [1, 29] ........... 11

Hình 2.1. Cây Mần tưới (Eupatorium fortunei) [115] ......................................... 47

Hình 2.2. Tập đoàn M. aeruginosa chụp dưới kính hiển vi điện tử Microscope

BX51 ................................................................................................... 48

Hinh 2.3. Các tế bào M. aeruginosa được phân lập trong phòng thí nghiệm chụp

dưới kính hiển vi điện tử Microscope BX51 ...................................... 48

Hình 2.4. C. vulgaris sử dụng trong phòng thí nghiệm ...................................... 48

Hình 2.5. Lemna minor ....................................................................................... 49

Hình 2.6. Daphnia magna .................................................................................... 49

Hình 2.7. Hồ Hoàn Kiếm .................................................................................... 50

Hình 2.8. Hồ Láng ............................................................................................... 50

Hình 2.9. Thành phần loài Microcystis trong hồ Hoàn Kiếm (a-e). dưới kính hiển

vi quang học (độ phóng đại 200 lần); (f). dưới kính hiển vi huỳnh quang

(độ phóng đại 1000 lần); a. Microcystis botrys; b. Microcystis

wessenbergii; c. Microcystis flos-aquae; d. Microcystis viridis; e và f.

Microcystis aeruginosa. [134] .............................................................. 18

Hình 2.10. Các loài Microcystis ở hồ Láng (A-F). A - Microcystis aeruginosa

Kützing, B - Microcystis flos-aquae (Wittrock) Kirchner, C -

Microcystis novacekii (Komárek) Compère, D - Microcystis smithii

Komárek & Anagnostidis, E - Microcystis viridis (Braun)

Lemmermann, F - Microcystis wesenbergii (Komárek) Komárek ex

Komárek .............................................................................................. 19

Hình 2.11. Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật tươi .............................. 55

Hình 2.11. Chiết phân đoạn hexan từ cao tổng ..................................................... 56

Hình 2.12. Chiết phân đoạn ethyl-axetat từ cao tổng ........................................... 56

Hình 2.13. Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật trong quy mô phòng .... 57

Hình 2.14. Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật trong quy mô phòng .... 58

Hình 2.15. Quy trình phân lập các hợp chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl

axetat Mần tưới ................................................................................... 60

Hình 2.16. Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các cao chiết từ cây Mần tưới

lên sinh trưởng M.aeruginosa và Chlorella vulgaris ........................... 62

Hình 2.17. Thực nghiệm đánh giá hoạt tính diệt VKL độc của các chất sạch phân

lập từ cây Mần tưới ............................................................................. 64

Hình 2.18. Thực nghiệm đánh giá độc tố của cao chiết Mần tưới lên giáp xác D.

magna ................................................................................................... 64

Hình 2.19. Thực nghiệm nghiên cứu mẫu bèo Lemna minor dưới ảnh hưởng của

cao chiết Mần tưới ............................................................................... 65

Hình 2.20. Thực nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới lên mẫu

nước hồ tự nhiên quy mô phòng thí nghiệm ....................................... 67

Hình 2.21. Thực nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới lên mẫu

nước hồ tự nhiên quy mô ngoài trời .................................................... 67

Hình 3.1. Cấu trúc hoá học và các tương tác HMBC chính của chất EfD4.7 ..... 69

Hình 3.2. Phổ HR-ESI-MS của chất EfD4.7 ....................................................... 70

Hình 3.3. Phổ 1H NMR của chất EfD4.7 ............................................................ 70

Hình 3.4. Phổ 13C NMR của chất EfD4.7 ........................................................... 71

Hình 3.5. Phổ HSQC của chất EfD4.7 ................................................................ 72

Hình 3.6. Phổ HMBC của chất EfD4.7 ............................................................... 73

Hình 3.7. Cấu trúc hoá học và các tương tác HMBC chính của chất EfD 4.8 .... 75

Hình.3.8. Phổ HR-ESI-MS của chất EfD4.8 ....................................................... 75

Hình.3.9. Phổ 1H NMR của chất EfD4.8 ............................................................ 76

Hình 3.10. Phổ 13C NMR của chất EfD4.8 ........................................................... 76

Hình 3.11. Phổ HSQC của chất EfD4.8 ................................................................ 77

Hình 3.12. Phổ HMBC của chất EfD4.8 ............................................................... 78

Hình 3.13. Cấu trúc hợp chất EfD5.1 .................................................................... 79

Hình 3.14. Cấu trúc hợp chất EfD1.8 .................................................................... 80

Hình 3.15. Cấu trúc hợp chất EfD10.1 .................................................................. 81

Hình 3.16. Cấu trúc hợp chất EfD10.3 .................................................................. 82

Hình 3.17. Cấu trúc hợp chất EfD14.1 .................................................................. 83

Hình 3.18. Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B)

lên sinh trưởng của M. aeruginosa TC3 tính theo mật độ quang (tại bước

sóng 680 nm) ........................................................................................ 87

Hình 3.19. Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B)

lên sinh trưởng của M. aeruginosa TC3 tính theo hàm lượng

chlorophyll a ........................................................................................ 88

Hinh 3.20. Sinh trưởng của M.aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết tổng etanol

Mần tướitính theo mật độ quang (A), hàm lượng chlorop hyll a (B) và mật

độ tế bào (C) ......................................................................................... 91

Hinh 3.21. Sinh trưởng của C. vulgaris dưới tác dụng của cao chiết tổng etanol Mần

tưới tính theo mật độ quang (A), hàm lượng chlorophyll a (B) và mật độ

tế bào (C) .............................................................................................. 93

Hình 3.22. Sinh trưởng của M. aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn

etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo mật độ quang

............................................................................................................. 95

Hình 3.23. Sinh trưởng của M.aeruginosa TC3 dưới tác dụng của cao chiết phân

đoạn etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo hàm

lượng chlorophyll a ............................................................................. 96

Hình 3.24. Sinh trưởng của M.aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn

etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) theo mật độ tế bào .. 97

Hình 3.25. Sinh trưởng của C.vulgaris dưới ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn etyl

axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo mật độ quang ...... 98

Hình 3.26. Sinh trưởng của C.vulgaris dưới ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn

etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) Mần tưới theo hàm

lượng chlorophyll a ............................................................................. 99

Hình 3.27. Sinh trưởng của C. vulgaris dưới ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn

etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo mật độ tế

bào ..................................................................................................... 100

Hình 3.28. Sinh trưởng của chủng M. aeruginosa trong vòng 72 giờ tác dụng của

các cao chiết Mần tưới Tính theo mật độ quang ................................ 98

Hình 3.29. Sinh trưởng của chủng M.aeruginosa dưới tác dụng của các chất sạch

sau 72 giờ tính theo mật độ quang bước sóng 680 nm (A) và theo mật

độ tế bào (B) ...................................................................................... 106

Hình 3.30. Cấu trúc siêu hiển vi của tế bào M.aeruginosa TC3 (A) và C.vulgaris

(B) dưới kính hiển vi điện tử truyền qua ........................................... 110

Hình 3.31. Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc siêu hiển vi của tế bào M.

aeruginosa TC3 dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (A- cao chiết

etanol, B- cao chiết phân đoạn etyl axetat, C- cao chiết phân đoạn

nước, .................................................................................................. 111

Hình 3.32. Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc siêu hiển vi của tế bào

C.vulgaris dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (A- cao chiết etanol,

B- cao chiết ethyl axetat, C- cao chiết nước, 3- sau 3 ngày, 6-sau 6

ngày, 10- sau 10 ngày) ...................................................................... 113

Hình 3.33. Tỷ lệ cá thể sống/chết của D.magna sau 24 giờ (A) và 48 giờ (B) phơi

nhiễm với cao chiết tổng etanol Mần tưới......................................... 116

Hình 3.34. Tỷ lệ cá thể sống/chết của D.magna sau 24 giờ và 48 giờ phơi nhiễm

với cao chiết etyl axetat Mần tưới ..................................................... 116

Hình 3.35. Ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol (A) và phân đoạn etyl axetat

Mần tưới (B) lên tổng số cánh bèo L.minor ...................................... 122

Hình 3.36. Hình thái ngoài của cánh bèo L.minor sau 5 ngày phơi nhiễm cao

chiết tổng ethanol Mần tưới .............................................................. 123

Hình 3.37. Hình thái ngoài của cánh bèo L.minor sau 5 ngày phơi nhiễm cao

chiết tổng phân đoạn etyl axetat Mần tưới ........................................ 123

Hình 3.38. Sinh khối tươi của bèo L.minor dưới tác động của cao chiết etanol (A) và

cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới (B) tại thời điểm bắt đầu (T0)

và sau 5 ngày (T5) .............................................................................. 124

Hình 3.39. Hàm lượng sắc tố quang hợp của bèo L.minor dưới tác động của cao

chiết etanol (A) và cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới (B) tại thời

điểm bắt đầu (T0) và sau 5 ngày (T5) ................................................. 125

Hình 3.40. Sự biến đổi sinh khối thực vật nổi (theo hàm lượng chlorophyll a) của mẫu

đối chứng, mẫu CuSO4 và mẫu bổ sung cao chiết trong mẫu nước hồ Hoàn

Kiếm .................................................................................................. 127

Hình 3.41. Biến động mật độ tế bào thực vật phù du nghiên cứu trên mẫu nước hồ

Hoàn Kiếm ngày T0 (A) và T10 (B) dưới ảnh hưởng của các cao chiết

Mần tưới ............................................................................................ 128

Hình 3.42. Sự biến đổi sinh khối thực vật nổi (theo hàm lượng chlorophyll a) của

mẫu đối chứng, mẫu CuSO4 và mẫu bổ sung cao chiết trong nước Hồ

Láng ................................................................................................... 130

Hình 3.43. Biến động mật độ tế bào thực vật phù du nghiên cứu trên mẫu nước

Hồ Láng ngày T0 (A) và T10 (B) dưới ảnh hưởng của các cao chiết

Mần tưới ............................................................................................ 131

Hình 3.44. Sự biến đổi sinh khối thực vật nổi (theo hàm lượng chlorophyll a) của

mẫu etanol Mần tưới trong nước Hồ Hoàn Láng quy mô ngoài trời 135

Hình 3.45. Mật độ tế bào thực vật phù du nghiên cứu trên mẫu nước Hồ Láng quy

mô ngoài trời ngày T0 (A) và ngày T10 (B) ..................................... 136

1

MỞ ĐẦU

Ô nhiễm môi trường không khí, nước và đất đã trở thành vấn đề hàng đầu, gióng

hồi chuông cảnh báo về sự suy giảm chất lượng cuộc sống và sức khỏe con người

không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nơi trên thế giới. Ô nhiễm nguồn nước mặt là

đặc biệt nghiêm trọng khi nhiều nơi trên thế giới người dân không có nước sạch để

sử dụng cho ăn uống và sinh hoạt kéo theo tỉ lệ tử vong và bệnh tật gia tăng vì sử

dụng nguồn nước không đạt yêu cầu. Nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến ô nhiễm

nguồn nước mặt như xả trực tiếp các nguồn nước thải công nghiệp, nước thải sinh

hoạt mà không qua xử lý hoặc lạm dụng quá mức phân bón hóa học và thuốc bảo vệ

thực vật trong sản xuất nông nghiệp để nâng cao sản lượng lương thực đáp ứng sự

gia tăng dân số thế giới trong những thập kỉ gần đây. Hậu quả dẫn đến gia tăng nguồn

dinh dưỡng (chủ yếu là nitơ và photpho) trong các thủy vực gây nên hiện tượng phú

dưỡng mà kéo theo là “tảo nở hoa” hoặc “nở hoa của nước”. Sự nở hoa của nước bản

chất là sự phát triển ồ ạt của Vi khuẩn lam (VKL) và vi tảo, có khả năng sản sinh độc

tố kéo theo sự nhiễm độc và cái chết của thủy hải sản, động vật nuôi, động vật hoang

dã và con người [1]. Sự nở hoa của nước thường gây ra những tác động xấu lên môi

trường như làm đục nước, tăng giá trị pH, giảm hàm lượng oxy hòa tan, tăng độc tố

đặc biệt là độc tố microcystin. Kết quả điều tra ở các thủy vực nước ngọt cho thấy

trong các loài VKL độc gây hiện tượng nở hoa nước thì Microcystis aeruginosa chiếm

đến 90% và sản sinh ba loại độc tố nguy hiểm là độc tố gan (hepatotoxins), độc tố

thần kinh (neurotoxins) và độc tố gây dị ứng da. Điều nghiêm trọng là tần suất xuất

hiện các loài VKL độc ngày càng tăng làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người và

động vật nuôi, động vật hoang dã do sử dụng nguồn nước có VKL độc. Do đó ngăn

ngừa và giảm thiểu sự phát triển bùng nổ của VKL độc là vấn đề quan trọng cần phải

được quan tâm.

Các phương pháp xử lý ô nhiễm môi trường nước gây ra bởi VKL độc đã được

nghiên cứu và áp dụng từ những phương pháp cơ học đơn giản như hớt váng, che

sáng hay pha loãng nước hồ đến các phương pháp lý - hóa như dùng sóng siêu âm,

sử dụng ánh sáng cực tím, hoặc sử dụng các hợp chất hóa học diệt tảo, các hợp chất

2

có tính oxi hóa cao, các kim loại và nano kim loại. Những phương pháp này bên cạnh

những ưu điểm dễ thấy như hiệu quả tác động nhanh, rõ rệt trong thời gian ngắn

nhưng còn tồn tại những hạn chế như tốn kém kinh phí triển khai hoặc gây ra sự ô

nhiễm môi trường thứ cấp, tác động không chọn lọc lên các loài sinh vật do đó gây

suy giảm đa dạng sinh học đặc biệt sử dụng hóa chất sau một thời gian quan sát thấy

hiện tượng nhờn thuốc và vì thế chúng bị hạn chế triển khai ở quy mô thực tế. Do đó

phương pháp sinh học dùng các cao chiết có nguồn gốc thực vật để ức chế sinh trưởng

VKL đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu vì tính hiệu quả và thân thiện

với môi trường.

Cây Mần tưới Eupatorium fortunei Turcz., thuộc họ Cúc (Asteraceae) là loài cây

cỏ lâu năm, được sử dụng trong dân gian như một loại thuốc chữa bệnh và được chứng

minh hoạt tính kháng khuẩn trong nhiều nghiên cứu khác nhau. Năm 2013, Nguyễn

Tiến Đạt và cộng sự đã tiến hành khảo sát và so sánh hoạt tính diệt VKL độc M.

aeruginosa của nhiều loại cao chiết từ các loài thực vật khác nhau tại Việt Nam cho

thấy cao chiết cây Mần tưới có hiệu quả nhất để kiểm soát bùng nổ VKL độc [2]. Kết

luận này được khẳng định bởi các công bố của Phạm Thanh Nga trong những năm tiếp

theo [3]. Tuy nhiên đây mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu khảo sát hoạt tính diệt

VKL độc của cao chiết cây Mần tưới.

Từ những lý do trên đề tài luận án tiến sỹ: “Nghiên cứu tác dụng ức chế của

cao chiết cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) lên sinh trưởng của Vi

khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa Kutzing trong các thủy vực nước ngọt”

đã được lựa chọn để thực hiện.

Luận án đã đặt ra mục tiêu như sau: Tạo được cao chiết thực vật ức chế hiệu quả

sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa. Luận án có tính chất kế

thừa kết quả của những nghiên cứu trước và sẽ giải quyết nhiều vấn đề còn tồn tại.

Luận án đã đặt ra những nội dung như sau:

1. Xây dựng quy trình tạo cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn, các chất sạch

phân lập từ cây Mần tưới.

2. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết tổng Mần tưới lên sinh

trưởng của M. aeruginosa và đánh giá an toàn sinh thái.

3

3. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết phân đoạn etyl axetat

và cao chiết phân đoạn nước Mần tưới lên sinh trưởng của M. aeruginosa và đánh giá

an toàn sinh thái.

4. Nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt tính diệt VKL độc M.aeruginosa của

07 hợp chất hóa học được phân lập từ cây Mần tưới.

5. Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng cao chiết để kiểm soát bùng nổ Vi khuẩn

lam trong các mẫu nước hồ tự nhiên.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án

Ô nhiễm môi trường nước, đặc biệt hiện tượng phú dưỡng kéo theo sự bùng phát

sinh khối VKL với việc giải phóng độc tố microcystin đã nhận được nhiều sự quan tâm,

nghiên cứu trong thời gian gần đây. Sử dụng cao chiết từ thực vật để kiểm soát bùng nổ

sinh khối VKL thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống

được áp dụng trước đây. Kết quả của luận án cung cấp cơ sở khoa học, chứng minh tính

ưu việt khi áp dụng cao chiết thực vật như một hoạt chất ức chế và diệt chọn lọc VKL

độc để kiểm soát bùng phát sinh khối VKL độc.

Tính mới của luận án

- Tách chiết được 02 chất mới (7,8,9 - trihydroxythymol và 8,10-didehydro-7,9-

trihydroxythymol) và đánh giá tác động của 02 chất này lên M. aeruginosa trong dải

nồng độ từ 1,0 µg/mL đến 50,0 µg/mL với hiệu quả ức chế sinh trưởng ghi nhận từ

39,1÷41,2 % và 20,0 – 25,0 %, tương ứng sau 72 giờ.

- Bước đầu ghi nhận khả năng ức chế sinh trưởng M. aeruginosa ≥ 90 % tại

nồng độ 500 µg/mL ở quy mô phòng thí nghiệm và hiệu quả trên 60 % ở quy mô

ngoài trời với mẫu nước hồ tự nhiên. Độc tính của cao chiết tổng etanol Mần tưới đối

với Daphnia magna và Lemna minor ghi nhận là thấp hơn so với M. aeruginosa.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

4

1.1. Vi khuẩn lam độc và hiện tượng phú dưỡng trong các thủy vực nước ngọt

1.1.1. Vi khuẩn lam độc (VKL)

Vi khuẩn lam (Cyanobacteria, Cyanoprokaryota, Cyanophyta, Blue-green

microalgae) là một trong những sinh vật xuất hiện trên Trái Đất cách đây hàng tỷ năm

và mang nhiều tên gọi khác nhau trong quá trình nghiên cứu. Từ năm 1854, Kopp đã

coi vi khuẩn và tảo lam là một nhóm có chung nguồn gốc phát sinh. Theo những đặc

điểm hình thái khác nhau, VKL được chia làm 4 bộ, Chlorococcales, Oscillatoriales,

Nostocales và Stigonematales. Theo các tài liệu công bố, hiện nay có khoảng 100 loài

VKL độc nước ngọt thuộc 40 chi trong đó Microcystis đặc biệt là Microcystis

aeruginosa, một trong những chi thường gặp nhất phổ biến nhất với tỉ lệ trên 75 %

[1, 4]. Microcystis aeruginosa có dạng tập đoàn, dạng hình cầu hoặc mắt lưới với

các khoảng trống giữa các tế bào, tế bào phân bố trong tập đoàn có dạng hình cầu,

màu xanh nhạt, xếp chồng lên nhau.

Cấu trúc cơ thể, hình dạng và kích thước: Trong phân loại hiện đại, VKL và vi

khuẩn có nhiều những nét chung như sinh vật chưa có nhân điển hình, chỉ có chất

nhân và nhiễm sắc thể. Màng tế bào cấu tạo từ murein một loại gluco aminopeptid

trong tế bào chất có nhiều riboxom, có khả năng đồng hóa được N2 tự do và có khả

năng quang hợp. Tế bào chứa sắc tố quang hợp và hấp thụ bước sóng từ 430-440 nm

và từ 660-680 nm [5]. Ngược lại với vi tảo nhân thật, VKL không có màng nhân mà

chỉ có lớp màng peptidoglycan và chứa ribosom loại 70 S [1]. Chi Microcystis thường

tồn tại dưới dạng tập đoàn gồm hàng nghìn tế bào riêng lẻ có kích thước từ 3-10 µm

dao động phụ thuộc vào từng loài.

Dinh dưỡng và sinh sản: Phần lớn VKL là những cơ thể quang tự dưỡng hiếu

khí. VKL có khả năng dự trữ các chất dinh dưỡng thiết yếu và đồng hóa bên trong

tế bào chất, có thể quan sát dưới kính hiển vi các hạt glycogen, giọt lipip, các hạt

cyanophycin, các thể polyphosphate hay carboxysome.

VKL chỉ sinh sản vô tính. Các loài dạng sợi thường sinh sản bằng cách phân

đoạn các trichome hoặc hình thành các đoạn tảo (hormogonia). Đoạn tảo là những

đoạn sợi sinh sản phân biệt. Chúng được tạo thành nhờ chuyển động trượt và dần

dần phát triển thành những trichome mới, các loài dạng sợi thường sinh sản bằng

cách phân đoạn.

5

Phân bố VKL: Sự phân bố của VKL phụ thuộc vào nhiều yếu tố thủy văn và

khí hậu của từng vùng đặc biệt là điều kiện dinh dưỡng của môi trường sống. Đa số

các loài VKL trong tế bào đều chứa không bào khí. Đó là các thể nội bào dạng túi

chứa khí giúp điều khiển sự nổi của tế bào giúp cho chúng có ưu thế trong cạnh

tranh ánh sáng và dinh dưỡng. VKL phân bố rộng, chúng có trong nước, đất, ở các

nơi khô hạn, trên cây, băng tuyết.

Độc tố VKL: Neurotoxin là nhóm các chất độc thần kinh, hợp chất độc hại nhất

do VKL sản sinh ra và chúng can thiệp vào hệ thần kinh, gây tê liệt các cơ quan hô

hấp, gây tử vong chỉ sau vài phút tác động. Độc tố LD50-24 h (Lethal dose, 50%) của

các nhóm là khác nhau nhưng nhìn chung là rất độc dao động từ 10 đến 200 μg/kg,

độc nhất phải kể đến Saxitoxin với LD50-24 h là 10 μg/kg, LD50 của nhóm

Microcystin-LR là 50 μg/kg [6]. Microcystin là phân tử peptit có cấu trúc vòng, hiện

nay ghi nhận hơn 80 loại biến thể cấu trúc, trong đó ba loại phổ biến nhất được trình

bày tại hình 1.1 [7]. Microcystin có thể được tạo ra từ các loài thuộc chi Microcystis,

Anabaena, Nostoc, Oscillatoria và Hapalosphon.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của phân tử microcystin [7]

VKL và độc tố của nó ảnh hưởng đến tất cả các loài trong hệ sinh thái bao gồm

vi khuẩn, tảo, động thực vật phù du, nhóm động vật không xương sống ở nước đặc

biệt nhóm loài Daphnia bao gồm gây độc cấp tính (trong vòng 48h) và mãn tính (sau

21 ngày). Tại nồng độ thấp microcystin hòa tan trong nước không gây ảnh hưởng độc

6

hại đến D. magna nhưng phơi nhiễm lâu hơn tại nồng độ cao có thể dẫn đến chết vì

microcystin đã được tích tụ trong D. magna ức chế sự hoạt động của enzyme

photphatase [8, 9]. Độc tố VKL còn ảnh hưởng tới các loài cá như Misguruns

mizolepis, Leuciscus cephalus, Danio rerio, Oryzias latipes, Oncorhynchus mykiss.

Nồng độ gây độc dao động từ 0,5 đến 50 μg MC-LR làm giảm 50% khả năng sống

sót, 25% khối lượng, gây tử vong bất thường, quái thai ở cá con, giảm khả năng nở

của trứng [10]. Đối với con người, gan là bộ phận bị ảnh hưởng nặng nề nhất, sau đó

đến thận và đại tràng, thời gian tích tụ lâu dài có thể dẫn đến ung thư gan và ung thư

trực tràng [11]. Khả năng gây hại cho người đối với nguồn nước phục vụ các hoạt

động giải trí từ 20.000 tế bào VKL/mL (tức hơn 10 µg/L nồng độ chlorophyll a). Khi

tăng mật độ lên đến 20.000 – 50.000 tế bào/mL (10 - 50 µg/L nồng độ chlorophyll a)

VKL tác động rõ rệt và trên 100.000 tế bào/mL gây nguy hiểm cho con người, động

vật nuôi và động vật hoang dã [6].

1.1.2. Hiện tượng phú dưỡng và phát triển bùng nổ sinh khối VKL độc

1.1.2.1. Hiện tượng phú dưỡng

Hiện tượng phú dưỡng (Eutrophication) là một thuật ngữ sinh thái được sử dụng

cho quá trình làm giàu nước bởi các chất dinh dưỡng, đặc biệt là nitơ và photpho dẫn

đến sự phát triển bùng nổ các loại VKL và vi tảo [12, 13]. Năm 1931, Naumann lần

đầu tiên đưa ra phân loại các hồ theo các cấp độ dinh dưỡng khác nhau như nhóm

nghèo dinh dưỡng (oligotrophic), dinh dưỡng trung bình (mesotrophic), phú dưỡng

(eutrophic) và phì dưỡng (hypertrophic) [1]. Hakanson đã giới thiệu hệ thống phân

loại các mức độ dinh dưỡng khác nhau dựa trên các chỉ tiêu như độ trong, hàm lượng

chlorophyll a, nitơ tổng, photpho tổng và VKL trong các môi trường nước ngọt (độ

muối: từ 0 đến 5%o), nước lợ (độ muối từ 5 đến 20 %o) và nước mặn (độ muối: > 20

%o) thành các nhóm nghèo dinh dưỡng, nhóm trung dưỡng, nhóm phú dưỡng và nhóm

phì dưỡng [13, 14].

Nguyên nhân ban đầu của hiện tượng phú dưỡng được xác định là do mất cân

bằng nguồn dinh dưỡng đầu vào, chủ yếu là các nguồn nước thải chưa qua xử lý của

hệ sinh thái, từ đó tạo ra ưu thế cạnh tranh của một số loài. Bên cạnh yếu tố dinh

dưỡng, hiện tượng phú dưỡng trong môi trường nước cũng chịu ảnh hưởng mạnh mẽ

7

và đồng thời bởi các điều kiện ngoại cảnh như các tính chất thuỷ lý, thuỷ hoá của cột

nước, nhiệt độ nước; cường độ chiếu sáng, pH, hàm lượng CO2.

Nghiên cứu tại một số hồ ở Thái Lan cho thấy hàm lượng các chất dinh dưỡng

thay đổi theo quy luật mùa khô cao hơn mùa mưa: hồ Nong Han (NO3- là 1,50 và

0,62 mgN/L; PO43- là 0,43 và 0,11 mg P/L); hồ Kwan Phayao (NO3- là 1,70 và 0,19

mgN/L); hồ Bung Boraped (NO3- là 1,4 và 0,55 mgN/L; PO4

3- là 0,51 và 0,051

mgP/L). Hồ Dianchi (Trung Quốc) là hồ phú dưỡng với sự nở hoa của tảo quan sát

thấy rõ rệt và chất lượng nước của hồ: nito tổng (TN): 1,20 - 8,70 mg/l và photpho

tổng (TP): 0,09 - 0,79 mg/L. Nghiên cứu này cho rằng chất lượng nước hồ bị ô nhiễm

nặng trong giai đoạn 1996 - 2003, là thời kì đô thị hóa ở thành phố Tây An, Trung

Quốc. Hồ Kojima (Nhật Bản), chất lượng nước là COD: 10 mg/l, TN: 1,8 mg/L, TP:

0,21 mg/L [15].

Tại Việt Nam, theo các nghiên cứu gần đây, hầu hết các hồ Hà Nội và các tỉnh

thành khác của Việt Nam ở trạng thái phú dưỡng, hàm lượng các chất dinh dưỡng

(NH4+ ; NO3

- ; PO43-mg/L) dao động ở các hồ khác nhau như hồ Ba Mẫu (8 – 10; 3

– 5; 7,3 – 10 mg/L) ), hồ Giảng Võ (7 – 10; 2 – 10; 3,2 - 6 mg/L) ); hồ Ngọc Khánh

(8 – 9; 30 – 40; 3,2 – 5 mg/L) [16]. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Ngọc [17]

tổng nitơ vô cơ trong các hồ được nghiên cứu ở Hà Nội dao động từ 0,34 -3,85 mg/L,

P tổng từ 0,23-1,77 mg/L. Hàm lượng P tổng số trong các hồ nội đô tại Hà Nội trong

quan trắc đều cao hơn so với một số hồ trên thế giới, như: hồ Dianchi (Trung Quốc)

dao động 0,09 - 0,79 mg/L; hồ Tega (Nhật Bản) là 0,1 mg/L; hồ Ypakarai (Mỹ) dao

động 0,15 – 0,3 mg/L. Sự suy giảm chất lượng nước hồ ở trạng thái phú dưỡng cũng

được ghi nhận ở nhiều nghiên cứu khác như hồ Xuân Hương, Đà Lạt [18] với nồng

độ nitơ tổng cao nhất đo được là 27,8 mg/L và nồng độ P tổng cao nhất là 1,52 mg/L.

Chính sự phú dưỡng của các hồ luôn ở mức cao khi gặp điều kiện nhiệt độ thích hợp

đặc biệt vào tháng 3, 4 hoặc tháng 9,10 thường xuyên dẫn đến hiện tượng phát triển

bùng nổ sinh khối VKL hay hiện tượng “nở hoa nước”.

1.1. 2.2.Hiện tượng bùng nổ sinh khối VKL độc

a. Hiện tượng bùng nổ sinh khối VKL độc trên thế giới

Nở hoa của tảo gây hại đã được biết đến cách đây từ hơn 2000 năm. Những

người dân bản địa ở các vùng Bắc Mỹ, châu Phi và châu Úc đã từ lâu nhận thức được

tính độc của VKL [6, 10, 19]. Ngoài ra, các công trình nghiên cứu về bản chất hóa

8

học, đặc tính gây độc của các hoạt chất phân lập từ các mẫu nước nở hoa ngày càng

gia tăng. Sự ô nhiễm và bùng nổ tảo xảy ra thường xuyên hơn ở các quốc gia trên thế

giới, trong đó ghi nhận ít nhất 25% trường hợp có sự giải phóng độc tố microcystin

với nồng độ trên 10 µg/L, có tác động tiêu cực đến các loài thủy hải sản và sức khỏe

con người khi sử dụng [20]. Ở các quốc gia Châu Phi như Angola (2008), Lesotho

(2009), Botswana (2010) cũng công bố xuất hiện bùng nổ tảo độc, đặc biệt Brazine

ghi nhận hơn 100 bệnh nhân khi tiếp xúc với độc tố. Những hồ chứa nước lớn khác

trên thế giới như hồ Taihu (Trung Quốc) đến hồ Erie (America) xuất hiện tường xuyên

tảo nở hoa nước [21]. Hồ Krugersdrift, South Africa phát triển bùng nổ tảo trong các

tháng hè năm 2004 dẫn đến hiện tượng cá chết hàng loạt do tích lũy hàm lượng độc

tố microcystin cao đến 43 µg/L [22]. Năm 2007 trong vườn quốc gia Kruger National

Park cũng ghi nhận hậu quả nặng nề gây chết toàn bộ sinh vật hoang dã do sử dụng

nước đầm Nhlangezwane để uống với nồng độ độc tố cao đến 20000 µg/L. Bùng nổ

các loài Microcystis cũng đã được quan sát thấy tại trong hồ Midmar

(Pietermaritzburg, KwaZulu Nata) năm 2007, tại Hồ chứa Loskop năm 2014. Nhìn

chung khu vực Châu Á- Thái Bình Dương, 54% hồ hoặc hồ chứa bị phú dưỡng, tỉ lệ

này tại Châu Âu, Châu Phi, Bắc và Nam Mỹ là 53, 28, 48 và 41% [23]. Ảnh hưởng

bùng phát tảo không chỉ gây thiệt hại về người, ảnh hưởng đến đa dạng sinh thái thủy

vực mà còn gây những tổn thất về kinh tế, ví dụ tại Mỹ hậu quả của bùng nổ vi tảo

làm tiêu tốn hằng năm hơn 2,2 tỉ USD [24].

9

Hình.1.2. Bùng phát tảo nở hoa trên thế giới: A. Hồ Taihu, Trung Quốc. B. Hồ Atitlan,

Guatamala. C. Lake Erie, Mỹ - Canada. D. Ichetucknee Springs, Florida, Mỹ. E and F.

Hồ Taihu, Trung Quốc. G. Hồ Zaca, California, Mỹ. H. and I. Sông St. Johns, Florida. Hồ

J. Liberty, Washington, Mỹ. K. Kênh Haarlem, Netherlands, L. Lagoon gần sông St. Lucie

Florida. [21]

10

b. Hiện tượng phát triển bùng nổ sinh khối VKL độc tại Việt Nam

Ở Việt Nam, nghiên cứu VKL độc mới được tiến hành trong hai thập niên trở

lại đây. Nhiều công bố ghi nhận sự phát triển bùng nổ của VKL trong hệ sinh thái

nước ngọt ở nhiều thành phố và tỉnh thành khác nhau, như hồ Dầu Tiếng, Bình

Dương [7], hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội [25, 26], hồ Núi Cốc, Thái Nguyên [27], hồ

Xuân Hương, Đà Lạt [18], Sông Hương, Huế [28]. Kết quả nghiên cứu cho thấy tại

các hồ Ba Bể, Hồ Tây, Hồ Hoàn Kiếm, Hồ Thác Mơ, Hồ Núi Cốc, Hồ Láng, Hồ

Dầu Tiếng, …đều quan sát thấy sự hiện diện của VKL độc chủ yếu là các loài thuộc

chi Microcystis [18]. Tại các thủy vực nghiên cứu tại Hà Nội và một số tỉnh phía

Bắc như Bắc Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Bắc

Giang, Hà Tây, Hoà Bình và Hà Tĩnh, mật độ thực vật nổi (TVN) khá cao [1]. Hàm

lượng chlorophyll a (là chỉ số sinh khối TVN dao động từ 0,17 g/L (hồ Sông Rác)

đến 5,43 µg/L (hồ Đại Lải). Mật độ VKL tại những hồ này thay đổi rất lớn phụ

thuộc vào thời gian và địa điểm lấy mẫu khoảng 0,02 x103 TB/L (vào mùa khô, hồ

Sông Rác) đến 3,121x103 TB/L (mùa khô, hồ Đồng Mô). Tỷ lệ VKL không độc, ví

dụ Spirulina, là không đáng kể trong quần thể VKL. Tại những hồ đã khảo sát có

diện tích mặt nước lớn, ví dụ hồ Hòa Bình và hồ Núi Cốc hiện tượng nở hoa nước

thường gặp với hàm lượng chlorophyll a trung bình trong cả năm là 1,25 g/L và

1,05 g/L, tương ứng [1] (hình 1.3).

1.1.3. Các biện pháp kiểm soát phát triển bùng nổ sinh khối VKL độc

Các phương pháp để ngăn ngừa, giảm thiểu ảnh hưởng có hại của sự bùng phát

sinh khối VKL độc có thể được phân loại theo các tiêu chí khác nhau như: (1) nơi áp

dụng (nước mặt hoặc trầm tích); (2) mục đích tác động ( tác động gián tiếp thông qua

giảm nồng độ các chất dinh dưỡng nitơ, photpho hoặc ức chế tiêu diệt trực tiếp các loài

VKL); (3) đặc tính của các phương pháp (phương pháp cơ học- vật lý, phương pháp hóa

học, phương pháp sinh học [19].

11

Hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội Hồ Văn Quán, Hà Nội

Hồ Xuân Hương, Đà Lạt Hồ Núi Cốc, Thái Nguyên (Ảnh

Hồ Thành Công Hà Nội Hồ Giảng Võ, Hà Nội

Hình 1.3. Một số hồ tiêu biểu ở Việt Nam bùng phát tảo nở hoa [1, 29]

12

1.1.3.1. Phương pháp cơ học

Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện tuy nhiên có tính thủ công và thường

chỉ có hiệu quả tức thời. Tại thời điểm “tảo nở hoa”, VKL phát triển dày đặc kín mặt hồ

và làm hồ nước đổi màu cũng như làm các loài thực vật khác không có khả năng tiếp cận

nguồn ánh sáng. Sử dụng các công cụ như vợt, lưới, lọc nước có thể thu được lớp tảo bề

mặt từ đó có thể kiểm soát được quá trình bùng nổ [1]. Hoặc che sáng giúp hạn chế sự

sinh trưởng của tảo cũng như hạn chế quá trình phân hủy của chúng gây thiếu oxy. Tuy

nhiên việc che sáng để hạn chế quang hợp của các loài VKL độc cũng đồng thời làm ảnh

hưởng đến quang hợp của các loài thực vật nổi khác và từ đó làm ảnh hưởng nghiêm

trọng đến toàn bộ lưới thức ăn trong hệ sinh thái [1]. Sự bùng nổ của VKL có thể kiểm

soát bằng việc xả nước hoặc pha loãng nước hồ (có hàm lượng chất dinh dưỡng thấp

hơn) dẫn đến giảm nồng độ chất dinh dưỡng và tăng tỷ lệ trao đổi nước [30].

1.1.3.2. Phương pháp vật lý

Thay đổi pH: Nghiên cứu cho thấy giá trị pH bằng 9, M. aeruginosa có tốc độ

sinh trưởng tốt nhất, nhưng pH cao hơn có thể gây độc cho chính loài này và tại pH

là 5 làm sinh trưởng của M. aerguginosa giảm rõ rệt. Tuy nhiên sử dụng pH thấp để

kiểm soát bùng nổ vi tảo độc thì đồng thời cũng ảnh hưởng đến các loài sinh vật khác

[31]. Dùng siêu âm: Sóng siêu âm với tần số lớn hơn 20 kHz được sử dụng để kiểm

soát bùng nổ VLK M. aeruginosa vì có thể gây ra sự tổn thương về cấu trúc và chức

năng tế bào [4, 32]. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là thân thiện với môi

trường và có tính chọn lọc vì tác động đến các loài VKL thông qua hệ thống không

bào khí làm cho tế bào không có khả năng nổi trên bề mặt, chìm xuống đáy. Lee và

cộng sự quan sát thấy khi sử dụng sóng siêu âm công suất 120 W, tần số 28 kHz sau

3 giây 80 % tổng số M. aeruginosa bị chìm xuống, sau 30 giây lên đến 100 % . Ngoài

ra sóng siêu âm còn có thể phân hủy độc tố microcystin - LR do M. aeruginosa thải

ra môi trường từ đó hạn chế ảnh hưởng độc hại đến các loài xung quanh. Nhược điểm

của phương pháp này đó là cường độ siêu âm sử dụng trong phòng thí nghiệm khá

cao, tốn kém khi triển khai ở thực tế với quy mô lớn và hiệu quả ức chế thấp vì 87 %

tế bào có thể phục hồi sau 60 giờ [4]. Sử dụng ánh sáng cực tím: Tia cực tím đặc biệt

là tia cực tím sóng ngắn (UV-C tại bước sóng λ= 254 nm) [33] có hiệu quả cao trong việc

kiểm soát bùng nổ VKL M. aeruginosa. Tia UV-C gây ra những tổn hại nghiêm trọng

13

tế bào đặc biệt là cấu trúc phân tử ADN, ảnh hưởng đến quá trình sao chép và tổng

hợp protein. Sakai cho rằng hầu hết các tế bào M. aeruginosa bị chết sau 6 ngày khi bị

chiếu sáng với bức xạ UV-C 600 mJ/cm2 [34]. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp

này là sự tác động không chọn lọc vì ánh sáng cực tím phá hủy cấu trúc tế bào không

chỉ đối với loài M. aeruginosa mà còn với tất cả các tế bào sống khác trong hệ sinh

thái nước ngọt.

1.1.3.3. Phương pháp hóa học

Sử dụng hợp chất của kim loại: Các hợp chất muối nhôm (nhôm sunphat

Al2(SO4)3, nhôm clorit AlCl3, polime polyaluminum chloride) có thể ảnh hưởng đến

VKL theo nhiều cách khác nhau như loại bỏ photpho, làm giảm chất dinh dưỡng trong

môi trường từ đó gián tiếp tác động lên VKL, hoặc tác động trực tiếp do hình thành

các hạt lơ lửng không tan gắn với VKL và sau đó lắng xuống đáy [35]. Các muối sắt

FeCl3, FeCl2, Fe2(SO4)3 được sử dụng rất rộng rãi để loại bỏ chất dinh dưỡng phốt

pho trong nước mặt từ đó kiểm soát bùng nổ VKL. Việc này được áp dụng ở hồ chứa

Bautzen, Đức. Trong những năm 1996, 1997, 113 và 99 tấn sắt bổ sung vào nước hồ

đã làm giảm phốt pho hòa tan trong nước hồ xuống 54 ÷ 72 % [36]. Đồng là một

trong những hợp chất diệt tảo thông dụng nhất, thường ở dạng đồng sunphat CuSO4.

5H2O hoặc các sản phẩm thương mại như Cuprogarb 500, Cobre Sandoz BR,

Clearigate, Cutrine-Plus [37]. Nhược điểm chung của phương pháp này là tính không

chọn lọc, ví dụ nghiên cứu chỉ ra tác động mạnh lên các loài sinh vật khác không

thuộc đối tượng tác động, đặc biệt loài Daphnia (48-h EC50 = 0,013 mg Cu/L), cá

Danio rerio (48-h LC50 = 0,063 mg Cu/ L), sau đó là tảo lục Raphidocelis subcapitata

(IC50 48h = 0,119 mg Cu/L). Nhược điểm tiếp là sự lắng đọng và tích lũy kim loại này

trong trầm tích. Việc sử dụng lặp đi lặp lại để kiểm soát bùng nổ thực vật phù du có thể

dẫn đến sự “nhờn thuốc”, làm phá vỡ tế bào VKL dẫn đến giải phóng độc tố mirocystin

[38] hoặc làm giảm pH của nước hồ dẫn đến làm tăng tính độc của những kim loại

khác trong môi trường axit [39]. Sử dụng các hợp chất có tính oxi hóa mạnh: H2O2 là

một hợp chất oxi hóa mạnh, từ năm 1986 được áp dụng để kiểm soát bùng nổ vi tảo

Oscilatoria rubescens trong liền 3 thập kỉ do có ưu điểm nổi bật là hiệu quả diệt tảo

cao, dễ bị phân hủy thành nước và oxi, không gây ảnh hưởng phụ đến môi trường và

14

giá thành thấp. Tuy nhiên, sự tác động không chọn lọc trên cá và trên Daphnia với tỉ

lệ gây chết 100 % sau 19 ngày phơi nhiễm tại nồng độ 2,5 ÷ 5,0 mg/L thấp hơn nồng

độ tối ưu để kiểm soát bùng nổ vi tảo là 6,6 mg/L [19]. Nhược điểm thứ hai, thời gian

tồn tại của H2O2 rất ngắn, dao động phụ thuộc vào nhiều yếu tố dẫn đến cần phải lặp

lại nhiều lần gây tốn kém kinh tế. Sử dụng hợp chất này với nồng độ cao còn gây

nguy hiểm đến người sử dụng. Năm 2013, Fan và cộng sự chứng minh rằng khi tiếp

xúc với KMnO4 với nồng độ 5 mg/L trong vòng 6 giờ, 26 % tế bào VKL bị phá vỡ,

độc tố microcystin bị phân hủy còn 16 µg/L sau 7 giờ xử lý, thấp hơn nhiều so với

của mẫu đối chứng (44 µg/L) [40]. Cơ chế tác động của KMnO4 là phá vỡ tế bào VKL

kéo theo giải phóng độc tố microcystin và phân hủy độc tố nhờ tính oxi hóa mạnh.

O3 cũng được sử dụng vì tác động lên tế bào M. aeruginosa bằng cách làm thay đổi

tính thấm của màng tế bào dẫn đến làm tế bào chết, ví dụ khi xử lý bằng Ozôn với

nồng độ tăng từ 2 mg/L đến 4 mg/L dẫn đến 32-41 % số tế bào bị phá vỡ [41]. Nhược

điểm của phương pháp này là sự ức chế không có tính chọn lọc, khi giải phóng độc

tố từ M. aeruginosa có thể làm ảnh hưởng đến các loài sinh vật khác. Sử dụng các

hợp chất diệt cỏ: 2,4-D (2,4-dichlorophenoxiacetic axit) là hợp chất diệt cỏ trong

nông nghiệp đã được nghiên cứu để kiểm soát bùng nổ vi tảo độc M. aeruginosa với

giá trị IC50-96h là 71,20 mg/L [42]. Sự phơi nhiễm 2,4-D ảnh hưởng đến hàm lượng

sắc tố quang hợp, thay đổi hoạt tính enzyme cũng như siêu cấu trúc tế bào M.

aeruginosa từ đó làm giảm sinh khối rõ rệt. Tuy nhiên hóa chất này lại làm tăng quá

trình tổng hợp độc tố microcystin. Điều này gây bất lợi đến các loài sinh vật khác và

liên quan đến sự ô nhiễm hợp chất diệt tảo trong môi trường nước. Glyphosate (N-

(phosphonomethyl) glycine) và Fenoxaprop-p-ethyl - hai chất diệt cỏ được áp dụng

để kiểm soát bùng nổ vi tảo độc trong hệ sinh thái nước ngọt [43]. Nhưng các hóa

chất diệt cỏ này lại gây ô nhiễm môi trường, sự tồn dư của chúng trong môi trường

nước có thể gây lên ảnh hưởng không tốt cho những loài thủy sinh khác trong hệ sinh

thái nước ngọt. Sử dụng vật liệu nano kim loại là một hướng mới trong nghiên cứu

kiểm soát ô nhiễm vi tảo độc. Park và cộng sự chứng minh rằng vật liệu nano bạc

được tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học ức chế sinh trưởng chọn lọc đối với

VKL độc M. aeruginosa tại nồng độ 1 mg/L với hiệu suất lên đến 87 % [44]. Theo

15

nghiên cứu của Sankar [45] vật liệu nano đồng được sinh tổng hợp từ dịch chiết của

lá cây O. vulgare ức chế sinh trưởng đến VKL M. aeruginosa lên đến 89,7 % so với

mẫu đối chứng. Vật liệu nano sắt Feo cũng là một hướng quan tâm của nhiều nhà khoa

học trên thế giới. Các hạt nano Feo có khả năng ức chế sinh trưởng hiệu quả, ngăn

ngừa sự hình thành bùng phát VKL với giá trị EC50 là 50 mg/L do chúng có thể loại

bỏ phốt pho sinh học, phá hủy cấu trúc tế bào VKL, ngăn ngừa sự giải phóng

microcystin từ đó gây chết tế bào [46]. Mặc dù những ưu điểm của vật liệu nano được

kể trên, nhưng việc nghiên cứu và ứng dụng vật liệu nano kiểm soát bùng nổ tảo nở

hoa cần được nghiên cứu toàn diện và cẩn thận do độc tính và tính chất của vật liệu

nano trong thực tế còn bị ảnh hưởng bởi rất nhiều các yếu tố khác như khả năng giải

phóng và hòa tan ion kim loại trong nước, khả năng hòa tan các hợp chất hữu cơ, khả

năng tích tụ trong môi trường và trong các cơ thể sống [47, 48].

1.1.3.4. Phương pháp sinh học

Dùng chế phẩm vi sinh vật cạnh tranh dinh dưỡng: Vi sinh vật hữu ích thường

được sử dụng bao gồm một số loài như: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus

acidophilus; Lactobacillus casei; Lactobacillus rhamnosus; Lactobacillus

bulgaricus, Carnobacterium, Vibrio alginolyticus, Bacillus subtilis, Bacillus

licheniformis; Bacillus megaterium; Bacillus polymyxa, Actinomycetes,

Nitrobacteria, Nitrosomonas [1]. Kiểm soát bùng nổ thông qua động vật phù du sử

dụng VKL làm nguồn thức ăn bao gồm các động vật nguyên sinh, giáp xác và rất

nhiều các động vật nhỏ. Khi bổ sung động vật phù du (Daphnia magna,

Ceriodaphnia Bosmina sp. và Daphnia similis) khiến mật độ các loài VKL trong mẫu

giảm mạnh từ đó góp phần kiểm soát bùng phát sinh khối [49]. Cơ chế ức chế cảm

nhiễm giữa các loài sinh vật: Ức chế cảm nhiễm là mối quan hệ giữa các loài trong

quần xã, trong đó một loài trong quá trình sinh trưởng tiết ra các hoạt chất kìm hãm

sự sinh trưởng và phát triển của loài khác. Các chất ngoại bào của vi sinh vật loài

Aeromonas sp. strain FM [50] là một ví dụ có thể gây ra những ức chế sinh trưởng

lên M. aeruginosa. Cao chiết, dịch chiết và hoạt chất diệt tảo có nguồn gốc thực vật:

Thực vật dưới nước như Stratiotes aloides [51], Myriophyllaceae spicatum [52],

16

Phragmites communis [53], Ceratophyllum demersum và Najas marina sp.

Intermedia [54] ức chế tốt quá trình sinh trưởng VKL. Ngoài ra, cao chiết từ các

loài thực vật trên cạn như các loài thuộc họ Papaceraceae [55], Rutaceae [56], [57],

Apiaceae [58], Asteraceae và Ephedraceae [59] được chứng minh có hiệu quả cao

trong quá trình kiểm soát bùng nổ VKL. Những nghiên cứu bắt đầu từ những năm

1990 tới nay chứng minh tiềm năng sử dụng các hoạt chất diệt tảo có nguồn gốc tự

nhiên và có thể triển khai ở quy mô lớn, tuy nhiên để có thể đưa vào thực tế và giải

quyết bài toán kinh tế thì vẫn còn đối mặt với nhiều thách thức và khó khăn [60].

Vấn đề này sẽ được tác giả luận án trình bày và phân tích kỹ ở phần 1.2.

1.1.3.5. Các phương pháp kiểm soát bùng phát VKL độc tại Việt Nam

a. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.

Năm 2010, Nguyễn Thị Hoài Hà và cộng sự đã nghiên cứu khả năng phân giải

độc tố của Microcystis sp. bằng vi khuẩn Sphingomonas saccharolytica N7 được phân

lập từ hồ Hoàn Kiếm [26]. Kết quả cho thấy Sphingomonas asaccharolytica N7 có

hoạt tính phân giải microcystin tương đối tốt. Thời gian bán phân hủy đối với nồng

độ microcystin ban đầu 10 μg/L của chủng Sphingomonas N7 là 3, 4 giờ. Tuy nhiên

nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm mà chưa nghiên cứu sự phân

hủy độc tố ở mẫu nước hồ tự nhiên. Năm 2013, Nguyễn Tiến Đạt và cộng sự đã

chứng minh cao chiết từ cây Mần tưới có độc tố chọn lọc lên VKL M. aeruginosa.

Nhưng tác giả chưa khảo sát ảnh hưởng của cao chiết thực vật đến các loài sinh vật

khác trong môi trường, chưa đánh giá ảnh hưởng lên các thông số thủy lý, thủy hóa

của mẫu nước cũng như chưa lý giải cơ chế ảnh hưởng của cao chiết lên tế bào M.

aeruginosa. Sử dụng vật liệu nano để kiểm soát bùng nổ vi tảo độc M. aeruginosa

được Dương Thị Thủy và cs triển khai trong quy mô phòng thí nghiệm năm 2015

[61]. Nhóm nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của nano bạc, nano đồng, nano

titandioxit và nano sắt lên sinh trưởng của M. aeruginosa. Kết quả cho thấy nano

đồng tại nồng độ 1 mg/L có khả năng ức chế sinh trưởng chọn lọc lên đối tượng M.

aeruginosa so với Ch. vulgaris. Mặc dù vậy nghiên cứu cũng chưa đánh giá toàn diện

về mức độ an toàn sinh thái của vật liệu lên các đối tượng khác trong môi trường.

Hoặc sử dụng các loài thực vật như Bèo tây, Rau muống, Bèo tấm, Ngổ…để hạ hàm

17

lượng nitơ hoặc phốt pho trong nước có thể dẫn đến hiện tượng phú dưỡng của thủy

vực từ đó gián tiếp kiểm soát bùng phát sinh khối VKL [62] .

1.1.4. Phương pháp triển khai áp dụng ngoài thực tế tại các ao, hồ Việt Nam

Tại Việt Nam, nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng để kiểm soát

bùng nổ sinh khối VKL. Phương pháp xử lý ban đầu là dùng vợt vải màn, vớt váng

tảo chết, mỗi lần vớt có thể thu được từ 6-8kg, sau đó được đem chôn xuống đất và

dùng vôi bột để khử trùng. Thời gian đầu các nhà môi trường đã sử dụng hoạt chất

đồng CuSO4 để diệt tảo, nhưng gây ảnh hưởng đến các loài khác nên sau đó hạn

chế. Tại Đà Lạt, năm 2010 áp dụng phương pháp thay nước ở hồ Xuân Hương để

xử lý tảo độc nhưng gây lãng phí tài nguyên nước, phá hủy hệ thủy sinh tự nhiên,

ảnh hưởng đến các trầm tích trong hồ [63]. Tại Hà Nội, Hồ Hoàn Kiếm hay còn gọi

là Hồ Gươm được các nhà quản lý và các nhà môi trường quan tâm hơn cả vì là nơi

cung cấp nước, điều hòa không khí cho thành phố, đồng thời là nơi gắn liền với

truyền thuyết văn hóa của người Việt. Trong những năm gần đây, gia tăng các chất

dinh dưỡng đã khiến nơi đây thường xuyên xảy ra hiện tượng bùng nổ tảo, trong đó

phổ biến là các nhóm loài VKL (chiếm đến 80-90%) trong đó chi Microcytis chiếm

tỉ lệ cao nhất, số lượng tế bào chi tảo Scenedesmus và các chi khác ngành tảo lục và

tảo mắt, tảo silic chiếm tỉ lệ không đáng kể (nhỏ hơn 1%) [25, 26, 64]. Theo công

bố của Dương Thị Thủy và cộng sự, thành phần loài của chi Microcystis trong hồ

Hoàn Kiếm rất đa dạng tập trung các loài như Microcystis botrys; Microcystis

wessenbergii; Microcystis flos-aquae; Microcystis viridis, M. aeruginosa (Hình

1.4). Hai dạng Microcystin MC-RR, MC-LR được xác định trong các mẫu nước với

nồng độ khá cao dao động từ 2,08 đến 46,00 µg MC/L và mẫu nước nở hoa đạt

0,11-0,18 µg MC/mg khối lượng khô

18

Hình 1.4. Thành phần loài Microcystis trong hồ Hoàn Kiếm (a-e). dưới kính hiển vi

quang học (độ phóng đại 200 lần); (f). dưới kính hiển vi huỳnh quang (độ phóng đại

1000 lần); a. Microcystis botrys; b. Microcystis wessenbergii; c. Microcystis flos-

aquae; d. Microcystis viridis; e và f. Microcystis aeruginosa. [65]

Năm 2009, trong khuôn khổ hợp tác khoa học Việt - Đức, thành phố Hà Nội đã

tiến hành việc hút bùn thử nghiệm tại hồ Hoàn Kiếm nhằm cải thiện môi trường nước

hồ, loại bớt VKL độc và tạo điều kiện tốt hơn cho loài rùa quý hiếm sinh sống [1].

Năm 2011, sử dụng sóng siêu âm bằng thiết bị Z9i-S100 đặt ngầm dưới mặt nước hồ

Gươm vận hành liên tục trong 14 ngày đêm làm cho VKL chết hàng loạt, nổi thành

từng đám trên mặt hồ và sau đó lắng xuống đáy hồ. Tuy nhiên phương pháp này chỉ

xử lý được một phần diện tích nhỏ mặt hồ.

Tương tự như hồ Hoàn Kiếm, mức độ phú dưỡng của hồ Láng luôn ở mức

cao do đây là nơi tập trung nguồn nước thải sinh hoạt của khu dân cư và bệnh viện.

Trong mẫu nước hồ Láng thành phần các chi Microcystis cũng chiếm ưu thế, thành

phần thực vật nổi trong hồ bao gồm chủ yếu là M. aeruginosa Kützing, M. flos-

aquae (Wittrock) Kirchner, M. novacekii (Komárek) Compère, M. smithii

Komárek & Anagnostidis, M. viridis (Braun) Lemmermann, M. wesenbergii [hình

1.5]. Mật độ tập đoàn Microcystis thay đổi theo thời gian và địa điểm. Hiện tượng

19

“tảo nở hoa” và tạo lớp váng tảo trên bề mặt rõ nhất vào thời điểm tháng 6 khi đó

mật độ tập đoàn Microcystis lên đến (17,17 ± 3,81) × 103 tập đoàn/mL. Tuy nhiên

hiện thành phố cũng chưa có những biện pháp cải tạo phù hợp.

Hình 1.5. Các loài Microcystis ở hồ Láng (A-F). A - Microcystis aeruginosa

Kützing, B - Microcystis flos-aquae (Wittrock) Kirchner, C - Microcystis novacekii

(Komárek) Compère, D - Microcystis smithii Komárek & Anagnostidis, E -

Microcystis viridis (Braun) Lemmermann, F - Microcystis wesenbergii (Komárek)

Komárek ex Komárek

Năm 2012, xử lý ô nhiễm hồ Trúc Bạch, Hà Nội được Bộ Khoa học và Công

nghệ tài trợ. Quy trình xử lý nước hồ và bùn đáy bao gồm các công nghệ hoạt hóa

nước, sử dụng thực vật thủy sinh, các chất khoáng hoạt hóa, chế phẩm diệt vi tảo, chế

phẩm vi sinh và khuyến khích cộng đồng cùng tham gia. Điểm nổi trội của dự án là

sử dụng các công nghệ thân môi trường [1]. Năm 2017, hồ Hoàn Kiếm Hà Nội đã

được nạo vét toàn bộ bùn ở để giảm hàm lượng dinh dưỡng trong hồ, từ đó dẫn đến

hạn chế sự bùng nổ tảo tuy nhiên lại làm ảnh hưởng đến hệ thực vật trong hồ. Trồng

các loài thực vật thủy sinh (bèo tây, bèo cái, rau muống, bèo tấm, cải xoong...) là

20

phương pháp khác để loại bỏ các chất hữu cơ, chất rắn và tác nhân gây bệnh, ngoài

ra sinh khối thực vật có thể được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi, sản xuất phân bón

hoặc làm nguyên liệu cho sản xuất etanol nhiên liệu. Nhưng sự phát triển mạnh của

các loài thực vật thủy sinh trong điều kiện dinh dưỡng và nhiệt độ tối ưu lại đặt ra

những bài toán môi trường nếu không được kiểm soát tốt. Xử lý nước hồ có thể bằng

vi sinh vật hữu hiệu. Dưới tác động của vi sinh, mùi hôi thối sẽ được giảm đáng kể

và cải thiện điều kiện nuôi trồng thủy sản cho hồ mà không phải nạo vét, thay nước

hồ. Năm 2013, Viện Công nghệ môi trường - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ

Việt Nam chủ trì thực hiện Dự án xây dựng mô hình xử lý ao hồ bị ô nhiễm do nước

thải sinh hoạt và chăn nuôi ở vùng nông thôn bằng chế phẩm vi sinh (Biomix 2) sinh

tại Hà Nam. Sau hơn 1 năm triển khai dự án kết quả cho thấy, nước các ao, hồ đã

trong xanh trở lại, không còn mùi hôi, các kim loại nặng đã được xử lý, diệt được

VKL độc và các vi sinh vật gây bệnh [66]. Tuy nhiên để có thể thành công bằng việc

dùng chế phẩm, cần phải kết hợp đồng thời nhiều phương pháp khác như nạo vét lòng

hồ, sục khí bổ sung khí O2 và thiết kế các bè thủy sinh. Ngoài ra thời gian áp dụng

còn ngắn, chưa đánh giá được tính hiệu quả lâu dài và ảnh hưởng đến các loài sinh

vật khác. Các phương pháp nói chung vẫn trong thời gian thử nghiệm và chưa kiểm

chứng sự tác động với môi trường thủy sinh. Vì thế trong nhiều năm nay, bài toán

giải quyết dứt điểm hiện tượng “tảo nở hoa” tại các thủy vực Việt Nam vẫn chưa có

lời giải hiệu quả.

1.2. Sử dụng cao chiết thực vật và hoạt chất thiên nhiên để kiểm soát bùng nổ

VKL độc

1.2.1. Hoạt tính sinh học của cao chiết và các hợp chất thiên nhiên

Trong vòng hai thập kỉ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm có

nguồn gốc thiên nhiên bao gồm các hợp chất của phenolics, carotenoid, anthocyanin

và tocopherols để phòng, trị bệnh, chăm sóc sức khỏe trong mỹ phẩm làm đẹp, để

kháng khuẩn và kháng nấm trở nên phổ biến [67]. Các loài thực vật có thể tạo ra một

lượng lớn hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học đa dạng, là nguồn nguyên liệu phong

phú cung cấp các chất chống oxy hóa, như các hợp chất vitamin A, C, E và phenolic

21

như flavonoid, tannin và lignin [68]. Những hoạt chất này giúp giảm tổn thương và

kìm hãm quá trình oxy hóa trong thực phẩm bằng cách trì hoãn hoặc ức chế quá trình

oxy hóa gây ra bởi các gốc tự do chứa oxy. Beta carotene, axit ascorbic và nhiều

phenolics đóng vai trò quan trọng trong việc trì hoãn lão hóa, giảm viêm và ngăn

ngừa một số bệnh ung thư. Ngoài ra các hợp chất sinh học phân lập từ thực vật còn

có tính kháng khuẩn, chống đông máu, chống oxy hóa, chống ung thư. Theo các

nghiên cứu được công bố hoạt tính sinh học của các cao chiết, các hợp chất hóa học

từ thực vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố như dung môi tách chiết, công nghệ tách chiết,

phân lập chất sạch, nhiệt độ, ánh sáng….

Ảnh hưởng của dung môi

Các nhà khoa học đã chứng minh ảnh hưởng của các dung môi lên quá trình

tách chiết, phân lập các hợp chất hóa học từ các phần khác nhau của thực vật (thân,

rễ, lá) do đó ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học như khả năng diệt khuẩn, diệt nấm

hoặc điều trị các tế bào ung thư [69-71]. Ví dụ dung môi axetone và dung môi N, N

dimethylformamide (DMF) phù hợp để chiết xuất các hợp chất chống oxy hóa trong

khi dung môi metanol hiệu quả hơn khi tách phân lập các hợp chất phenol từ quả óc

chó [67]. Hoặc cao chiết etanol của của cây Ivorian phân lập các hợp chất phenolics

với hàm lượng hơn so với cao chiết khác trong dung môi axetone, cồn và metanol

[72]. Theo Qiao phân đoạn etyl axetat ức chế sinh trưởng mạnh các vi sinh vật, đặc

biệt là Pseudomonas aeruginosa và Bacillus subtilis (với nồng độ ức chế thấp nhất

ghi nhận là 125 μg/mL và 62,5 μg/mL), trong khi phân đoạn cồn và dầu hỏa, nước thì

chỉ đạt được mức gây ức chế trung bình và yếu [70].

Quy trình công nghệ tạo cao chiết và tinh sạch các hợp chất từ thực vật

Lựa chọn quy trình công nghệ và các phương pháp để tinh sạch hợp chất từ thực

vật là một nhiệm vụ quan trọng trong hóa học các hợp chất thiên nhiên để thu được

hiệu xuất tổng hợp cao cũng như tìm kiếm được các hoạt chất quý hiếm. Bên cạnh đó

loại bỏ dung môi còn tồn đọng trong cao chiết là khâu quan trọng góp phần giảm ảnh

hưởng độc hại của dung môi trong mẫu khi tiến hành thực nghiệm, đặc biệt là các thử

nghiệm về độc tính trên các loài sinh vật. Ngày nay, máy cô quay chân không thường

được sử dụng rộng rãi để loại bỏ dung môi khỏi cao chiết bằng phương pháp bay hơi

22

dựa trên sự khác nhau về nhiệt độ sôi, nhiệt độ bay hơi của các dung môi. Nghiên cứu

của Davea cho thấy ảnh hưởng hóa sinh của dung môi sử dụng trong chiết tách đến

các loài sinh vật có ích trong môi trường như tảo lục Chlorella emersonii, cá Salmo

gairdneri, hai loài vi khuẩn phân hủy xenlulozo như Cellulomonas sp. và

Sporocytophaga myxococcoides [73]. Các dung môi ức chế sinh trưởng, ảnh hưởng

đến quá trình sinh sản của cá bằng cách tác động gián tiếp đến nội tiết tố [74].

Nhiệt độ

Trong nhiều nghiên cứu, cao chiết cần phải bảo quản ở nhiệt độ thấp đến 40C

[55] hoặc thấp hơn -5 đến -10 0C cho đến khi sử dụng trong thực nghiệm [75]. Dưới

ảnh hưởng của nhiệt độ cao, cao chiết có thể bị phân hủy và mất hoặc yếu đi hoạt tính

kháng khuẩn. Theo Gibson và cộng sự [76] khi mẫu rơm được xử lý nhiệt bằng cách

hấp thanh trùng thì không còn khả năng ức chế sinh trưởng của M. aeruginosa. Tương

tự, Yan xử lý mẫu cao chiết từ rễ cây Ephedra equisetina tại nhiệt độ 35 0C trong thời

gian 7 ngày không quan sát thấy sự khác biệt giữa các mẫu thực nghiệm và mẫu đối

chứng (p>0,05) [59].

Ánh sáng

Ánh sáng ảnh hưởng đến cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên từ đó ảnh hưởng

đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng [59]. Các cao chiết thực vật thường được bảo quản

trong bóng tối, tránh ánh sáng hoặc ánh nắng tác động trực tiếp [55].

1.2.2. Nghiên cứu điển hình sử dụng cao chiết, dịch chiết thực vật kiểm soát bùng

phát VKL độc

1.2.2.1. Dịch chiết từ rơm lúa mạch Hordeum vulgare

Nghiên cứu sử dụng rơm lúa mạch (Hordeum vulgare) như một hoạt chất diệt tảo,

kiểm soát sự bùng phát sinh khối thực vật phù du được triển khai từ đầu những năm

1990. Gibson và cộng sự sử dụng dịch chiết phân hủy rơm lúa mạch để ức chế sinh

trưởng của các loài Cladophorag lomerata, Chlorella vulgaris và Selenastrum

capricornutum với hiệu quả ức chế lên đến 63 % sau 6 tháng triển khai tại 20 0C [76].

Khi mẫu rơm được xử lý nhiệt bằng cách hấp thanh trùng, tác giả không quan sát thấy

khả năng ức chế. Nguyên nhân gây ra sự ức chế sinh trưởng theo Gibson là do các

hợp hợp chất phenolic đặc biệt là tannin được giải phóng ra từ quá trình phân hủy

23

yếm khí rơm. Tuy nhiên, Pillinger phản biện cho rằng 3 loài nấm như Pycnidiophora

dispersa Clum (IMI 346597) và Z. leucotricha (Speg.) Mall. & Cain,

Cladorrhinumfoecundissimum Sacc. & Marchal được sinh ra trong quá trình phân hủy

hiếu khí rơm là nguyên nhân chính gây ra sự ức chế này [77]. Năm 1993, Jonathan lặp

lại thí nghiệm trên M. aeruginosa dưới tác dụng của dịch chiết phân hủy rơm ghi nhận

hiệu quả ức chế lên đến 95 % khi dùng 2,57 g sinh khối khô/m3 [78]. Theo Jonathan và

Pillinger, các hợp chất phenolic như axit p-coumaric, axit ferulic, axit tannic, đặc biệt là

các hợp chất quinones như 2,6-dimethoxyphenol,2,6-dimethoxy-p-benzoquinon đóng

vai trò quan trọng tạo nên hoạt tính diệt khuẩn của mẫu rơm. Năm 1996, Everall triển

khai thử nghiệm dịch chiết rơm lên mẫu nước hồ thực tế với tỉ lệ 25 g/m3 và bước đầu

ghi nhận những kết quả khả quan. Thực nghiệm cũng khẳng định việc ứng dụng dịch

chiết rơm lên mẫu nước hồ không làm ảnh hưởng đến chất lượng của nguồn nước cũng

như ổn định các điều kiện lý hóa của hệ sinh thái [79] .

Tuy nhiên năm 2003, Boylan chứng minh những hạn chế của phương pháp này

như hiệu quả ức chế chỉ quan sát được sau 8-9 tuần triển khai, những tuần sau sinh

khối thực vật phù du tiếp tục tăng mạnh đến tuần thứ 14 thì không còn quan sát được

vai trò ức chế của dịch chiết [80]. Ngoài ra trong suốt 12 tuần tác giả không quan sát

thấy sự khác biệt sinh khối thực vật phù du giữa hai mẫu thực nghiệm bổ sung rơm

với tỉ lệ 15 và 60 g/m3. Sự khác biệt hiệu quả ức chế của dịch chiết rơm so với kết

quả của Everall, là do hàm lượng oxy hòa tan trong mẫu vì oxy đóng vai trò quan

trọng thúc đẩy quá trình phân hủy rơm lúa mạch [79]. Khi hàm lượng oxy hòa tan

thấp đã làm giảm hiệu quả ức chế sinh trưởng của rơm lúa mạch lên các loài thực vật

phù du. Ferrier và cộng sự triển khai mẫu dịch chiết lên 12 loài VKL nước ngọt. Các

tác giả này thu được ba nhóm kết quả khác nhau như ức chế mạnh lên sinh trưởng cả

ba loài VKL độc nước ngọt trong đó có loài M. aeruginosa, nhưng lại kích thích sinh

trưởng hoặc không thể hiện ảnh hưởng ức chế lên đối tượng khác. Triển khai với 6

mẫu nước hồ tự nhiên, Ferrier và cộng sự cho rằng không có sự khác biệt giữa mẫu

đối chứng và mẫu thực nghiệm và kết luận rằng dịch chiết của rơm lúa mạch không

có hiệu quả để kiểm soát bùng nổ sinh khối TVN trong các hệ sinh thái [81].

24

Năm 2009, Timothy tiến hành thực nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng lên sinh

trưởng VKL độc M. aeruginosa của 3 loại cao chiết nước từ rơm lúa mạch được tạo

ra ở các điều kiện khác nhau về dung môi và thời gian ngâm chiết [82]. Kết quả cho

thấy cả ba loại cao chiết đều vẫn thể hiện sự ức chế lên M. aeruginosa với nồng độ

rất cao là 1720, 2400 và 3030 mg/L. Tác giả cho rằng thời gian ngâm và dung môi

chiết không làm ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của dịch chiết, đồng thời khẳng định

vai trò của các hợp chất phenolic với khối lượng phân tử dao động từ 1000 đến 3000

Da trong hiệu quả diệt VKL. Mặc dù rơm lúa mạch là đối tượng được nghiên cứu chi

tiết và toàn diện nhất trong một thời gian dài bởi nhiều nhà khoa học khác nhau,

nhưng các kết quả nghiên cứu được công bố còn chưa có sự thống nhất về hoạt tính

ức chế lên M. aeruginosa, chưa đưa ra sự giải thích thỏa đáng về cơ chế tác động của

cao chiết lên tế bào VKL cũng như những ảnh hưởng đến các thông số thủy hóa và

thủy lý của môi trường.chưa được nghiên cứu.

1.2.2.2. Cao chiết từ rơm lúa gạo Oryza sativa

Rơm lúa gạo cũng là một đối tượng được các nhà khoa học quan tâm và nghiên

cứu như một tác nhân phòng chống bùng nổ VKL độc, đặc biệt là ức chế sinh trưởng

M. aeruginosa. Park và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết metanol của

rơm lúa gạo lên sinh trưởng của M. aeruginosa với các nồng độ khác nhau từ 0,1

đến 10 mg/L, đồng thời đánh giá hoạt tính diệt tảo của 7 hợp chất hóa học (nồng độ

0,01 và 0,1 mg/L) được phân lập từ rơm trong 8 ngày thực nghiệm [75]. Kết quả

chứng minh hiệu quả ức chế sinh trưởng của cao chiết lên đến 98 % tại nồng độ 10

mg/L và axit salicylic có hoạt tính diệt tảo cao nhất so với các chất còn lại, sự trộn

lẫn các hợp chất ví dụ như axit p-coumaric, axit salicylic và axit benzoic với nồng

độ 0,01 mg/L gây ức chế đến 60 %, cao hơn hẳn so với sự ức chế sinh trưởng VKL

của từng chất riêng lẻ. Sự ảnh hưởng của cao chiết lên các tế bào VKL ở dạng đơn

lẻ mạnh mẽ hơn khi VKL tồn tại dưới dạng các tập đoàn M. aeruginosa [83].

Về tính an toàn sinh thái khi sử dụng cao chiết rơm như hoạt chất diệt tảo, Park

và cộng sự đã chứng minh cao chiết O. sativa thể hiện sự ức chế có chọn lọc lên loài

VKL độc so với các loài khác không thuộc đối tượng tác động như tảo lục

(Ankistrodesmus convolutus và Scenedesmus quadricauda) và giáp xác (Daphnia

25

magna) thể hiện tính thân thiện và hứa hẹn sử dụng như một hoạt chất diệt tảo tiềm

năng [84]. Các hoạt chất hóa học phân lập từ cao chiết của O. sativa cũng được các

nhà khoa học quan tâm và đánh giá hiệu quả ức chế lên M. aerugionsa. Ateeque và

cộng sự đã thử nghiệm 5 chất sạch (nồng độ 1, 10 và 100 mg/L) lên sinh trưởng của

M. aeruginosa và ghi nhận hiệu quả ức chế cao nhất 92,6 % tại nồng độ 100 mg/L

của hoạt chất oleioyl-β-D-arabinoside sau 6 ngày thực nghiệm [85]. Tuy nhiên kết

quả triển khai thử nghiệm cao chiết rơm lúa gạo lên các mẫu nước hồ tự nhiên cũng

như triển khai thử nghiệm quy mô ngoài trời cũng chưa được công bố. Các tác giả

cũng chưa đưa ra được cơ chế tác động của cao chiết rơm lúa mạch cũng như của các

hoạt chất lên sinh trưởng của M. aeruginosa.

1.2.2.3. Cao chiết nước từ các loài cây họ Anh túc Papaveraceae

Mặc dù nghiên cứu về hiệu quả sử dụng cao chiết từ các loài cây họ

Papaveraceae lên sinh trưởng M. aeruginosa không được nhiều nhà khoa học quan

tâm như hai đối tượng trên, tuy nhiên kết quả nghiên cứu khả quan và toàn diện của

Jancula và cộng sự năm 2007 [55] trở thành một ví dụ tiêu biểu cho phương pháp ứng

dụng cao chiết thực vật để kiểm soát sự bùng nổ thực vật phù du nói chung và sinh

trưởng M. aeruginosa nói riêng trong các hệ sinh thái nước ngọt. Cao chiết nước của

rễ 5 loài cây Anh túc có khả năng kiểm soát tốt quá trình sinh trưởng của M.

aeruginosa với giá trị EC50 dao động từ 57,11 đến 870,92 mg/L, trong đó là hai loài

Dicranostigma lactucoides (EC50 55,81 mg/L) và Chelidonium majus (EC50 57,11

mg/L) có tính kháng VKL tốt nhất tiếp theo là các loài Sanguinaria canadensis (EC50

122,01 mg/L, Stylophorum lasiocarpum (EC50 161,69 mg/L) và Macleaya

microcarpa (EC50 870,92 mg/L).

Để đánh giá độ an toàn sinh thái khi sử dụng cao chiết như hoạt chất diệt tảo cụ

thể nghiên cứu sự tác động của cao chiết lên các loài sinh vật khác, hai loài tảo

Pseudokirchneriella subcapitata và Scenedesmus quadricauda, động vật phù du

Daphnia magna và bèo tấm Lemna minor được lựa chọn. Đây là những loài sinh vật

có lợi rất nhạy cảm với sự ô nhiễm của môi trường và là đối tượng được sử dụng

trong nghiên cứu đánh giá độc chất. Trong 5 loại cao chiết từ 5 loài cây họ Anh túc

Papaveraceae nói trên, cao chiết từ C. majus được quan tâm hơn vì độc tính của

26

chúng lên tảo P. subcapitata, S. quadricauda thấp hơn so với VKL với giá trị EC50

ghi nhận là 60,87 và 78,01 mg/L [84]. Cao chiết C. majus cũng ít độc hơn lên D.

magna với giá trị EC50> 500 mg/L sau 24 và 48 giờ phơi nhiễm và ít độc hơn lên L.

minor với giá trị EC50 là 448,69 mg/L.

Dựa vào các kết quả nghiên cứu trên, Jancula và cộng sự đã lựa chọn cao chiết

từ C. majus để triển khai thử nghiệm với mẫu nước đầm thực tế trong điều kiện tự

nhiên để đánh giá ảnh hưởng ức chế của các cao chiết này lên nhóm TVN trong đó

Actinastrum sp., Dictyosphaerium sp., Mougotia sp., Nitzschia sp., Planktothrix

agardhii là những loài chiếm ưu thế. Sau 10 ngày thí nghiệm, tính theo phương pháp

đo hàm lượng chlorophyll a, giá trị EC50 của cao chiết lên thực vật phù du là 87,71

mg/L, cao hơn với giá trị EC50 trên VKL và vi tảo. Để giải thích nguyên nhân gây ra

sự ức chế sinh trưởng của cao chiết các loài cây Họ Anh túc lên VKL, nhóm tác giả

đã tiến hành phân tích thành phần và tỉ lệ các alkaloids có trong 5 loại cao chiết. Thực

nghiệm cho thấy magnoflorine và coptisine được tìm thấy với tỉ lệ cao nhất trong cao

chiết của C. majus với hiệu suất là 0,345 và 1,372 % theo sinh khối khô. Các hợp chất

enzo[c]phenanthridine alkaloids này có thể là nguyên nhân gây ra khả năng ức chế

sinh trưởng M. aeruginosa.

Mặc dù nhóm tác giả đã lựa chọn được cao chiết C. majus trong 5 cao chiết thử

nghiệm vì tiềm năng diệt VKL độc và an toàn đối với các loài khác trong môi trường,

đã phân tích thành phần hóa học để giải thích hoạt tính diệt khuẩn của các cao chiết

này, tuy nhiên tác giả chưa đánh giá được ảnh hưởng của cao chiết đến các thông số

môi trường khi áp dụng ở quy mô nước đầm hồ tự nhiên, chưa đánh giá ảnh hưởng

của cao chiết lên siêu cấu trúc tế bào M. aeruginosa để đưa ra cơ chế giải thích ảnh

hưởng của cao chiết phù hợp.

1.2.2.4 . Cao chiết từ cây keo Acacia mearnsii

Năm 2012, Zhou và cộng sự nghiên cứu cao chiết từ cây keo đen để kiểm soát

sự bùng nổ VKL và các loài thực vật phù du trong mẫu nước hồ thực tế [86]. Mô hình

nghiên cứu được triển khai dưới hai hình thức – mô hình thí nghiệm thời gian ngắn –

đánh giá vai trò của cao chiết ức chế bùng nổ VKL trong trường hợp khẩn cấp (1

tháng) và mô hình thí nghiệm thời gian dài (1 năm) - đánh giá ảnh hưởng của cao

chiết lên chất lượng môi trường nước cũng như hiệu quả kiểm soát bùng nổ vi tảo độc

27

trong thời gian dài. Kết quả chỉ ra rằng, trong mô hình thí nghiệm ngắn, bổ sung 3,623

mg/L cao chiết một lần duy nhất trong ngày đầu tiên dẫn đến sự giảm đáng kể mật độ

tế bào và hàm lượng chlorophyll a của VKL sau thời gian 17 ngày. Hiệu quả ức chế

giảm dần, sau 11 ngày hiệu quả ức chế là 59 % và giảm xuống còn 38% sau ngày thứ

14 thực nghiệm. Theo tác giả điều này có liên quan đến việc tự phân hủy của các cao

chiết theo thời gian. Nồng độ lúc đầu của cao chiết cây keo đen trong nước sạch là 2

mg/L sau 3 ngày tốc độ phân hủy sinh học là 26 %, sau 6 ngày là 45 %, đến ngày thứ

15 là 80 %. Trong mô hình thí nghiệm thời gian dài, cao chiết được bổ sung hằng

tuần 1-2 mg/L để đảm bảo cao chiết có trong mẫu trong suốt quá trình thực nghiệm.

Kết quả cho thấy cao chiết có khả năng kiểm soát bùng nổ VKL độc rất hiệu quả đặc

biệt là ở những giai đoạn đầu.

Ngoài ra ảnh hưởng lên các loài động vật phù du và thực vật phù du cũng được

nghiên cứu đồng thời. Trong giai đoạn đầu có sự tăng rất mạnh sinh khối của các

chủng tảo đặc biệt chiếm ưu thế của Pseudanabaenaceae, Cryptophyceae và Navicula,

sau đó mật độ tế bào giảm dần. Sau hai tuần bổ sung cao chiết vào mẫu nghiên cứu,

các loài động vật phù du cỡ nhỏ (< 1mm) cũng suy giảm mạnh số lượng chỉ còn bằng

2,4 % so với số lượng ban đầu. Tuy nhiên các loài động vật phù du cỡ lớn lại gia tăng

mạnh sinh khối, đặc biệt bộ Calanoida chiếm ưu thế, tăng đến 681% tại thời điểm

cuối thực nghiệm. Các thông số của môi trường cũng bị ảnh hưởng bởi cao chiết thực

vật, đặc biệt là giá trị pH.

1.2.2.5. Cao chiết từ rễ cây Ephedra equisetina

Yan cho rằng cao chiết nước rễ cây E. equisetina ức chế có hiệu quả lên sinh

trưởng của thực vật phù du trong đó loài M. aeruginosa chiếm ưu thế [59]. Ở mẫu

đối chứng, hàm lượng chlorophyll a tăng lên từ 670 đến 1360 µg/L trong khi ở các

mẫu thực nghiệm có bổ sung cao chiết (nồng độ 10, 25, 50 và 75µg), giá trị này giảm

dần từ 670 xuống 150 µg/L sau 5 ngày thực nghiệm. Ảnh hưởng của cao chiết đến

chất lượng nước hồ tự nhiên, đặc biệt lên các thông số thủy hóa, không thấy có sự

khác biệt lớn giữa mẫu đối chứng và thực nghiệm (p>0,05): giá trị trung bình ghi

nhận nitơ tổng (TN) (6,45 mg/L), photpho tổng (TP) (0,65 mg/L), tổng photphat hòa

28

tan (TDP) (0,23 mg/L), hàm lượng nitrat (NO3-N) (1,77 mg/L) và hàm lượng amoni

(NH4-N) là 2,69 mg/L.

Nhóm tác giả cũng đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên quần thể cá trong mẫu

nước hồ tự nhiên. Dưới tác động của cao chiết, tỉ lệ sống sót và sinh sản của cá giữa

mẫu đối chứng và thực nghiệm không có sự khác biệt lớn (p<0,05). Quan sát tương

tự trên đối tượng động vật phù du, thực vật bậc cao và vi khuẩn, mật độ tế bào của

các loài còn cao hơn so với mẫu đối chứng mà nguyên nhân theo tác giả là từ việc

giảm mật độ của M. aeruginosa, cũng như giảm nồng độ độc tố microcystin khi sử

dụng cao chiết dẫn đến làm sạch, trong môi trường nước taọ điều kiện cho các loài

khác phát triển. Ngoài ra, chỉ số đa dạng các loài cũng chứng minh rằng hệ sinh thái

thủy sinh phục hồi đến một trạng thái tương đối ổn định và khỏe mạnh sau khi xử lý

bằng cao chiết E. equisetina. Thử nghiệm ảnh hưởng của cao chiết từ E. equisetina

lên sinh trưởng của M. aeruginosa dưới ánh sáng (8000 ± 200 lux) và nhiệt độ cao

(350C) trong 7 ngày. Kết quả không quan sát thấy sự khác biệt giữa các mẫu thực

nghiệm và mẫu đối chứng (p>0,05). Điều đó chứng minh rằng các hoạt chất trong

cao chiết có tác dụng diệt M. aeruginosa đã bị phân hủy dưới điều kiện ánh sáng và

nhiệt độ cao. Đặc biệt đối với các hoạt chất có nhóm hydroxyl gắn với C-3 của vòng

benzene.

Sau khi bổ sung cao chiết, đã quan sát thấy xác tế bào VKL lắng đọng ở đáy

bình thí nghiệm. Dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), các thành tế bào của

M. aeruginosa vẫn còn nguyên vẹn trong cả mẫu đối chứng và mẫu thực nghiệm. Tuy

nhiên, trong các mẫu thực nghiệm, màng thylakoid bị tách ra khỏi tế bào chất của

VKL. Các cấu trúc bên trong màng thylakoid bắt đầu bị tổn thương. Điều này gợi ý

rằng cái chết của VKL là do ''tấn công hóa học'' bởi các hợp chất flavonoid trong cao

chiết đã đi qua màng tế bào gây tổn thương bên trong hơn là tác động tổn thương về

mặt cơ học như các tia UV.

1.2.2.6. Cao chiết từ các cây thuộc họ Myriophyllaceae

Nakai và cộng sự đã phân lập các hoạt chất từ cao chiết cây M. spicatum và

đánh giá ảnh hưởng của chúng lên sinh trưởng của M. aeruginosa [87]. Nhóm tác giả

phân lập được các hợp chất polyphenol như axit gallic (EC50 1,0 mg/L) và axit

pyrogallic (EC50 0,65 mg/L) có khả năng hòa tan trong nước rất tốt do chứa các nhóm

hydroxyl có khả năng tự oxi hóa trong môi trường và được coi là nguyên nhân chính

29

tạo ra hoạt tính diệt tảo lên M. aeruginosa. Năm 2005, Nakai và cộng sự chứng minh

rằng ngoài các hợp chất phenolic thì các axit béo từ M. spcatum cũng đóng một vài

trò quan trọng tạo nên tính kháng khuẩn của cao chiết [88]. M. aquaticum, một loài

thuộc họ Myriophyllaceae L, được coi một tác nhân diệt tảo tiềm năng vì những đặc

điểm nổi bật như có khả năng tăng sinh khối mạnh trong môi trường phú dưỡng, khả

năng loại bỏ ô nhiễm và tự làm sạch môi trường [89]. Thực nghiệm cho thấy M.

aquaticum có khả năng ức chế sinh trưởng M. aeruginosa đến 89,61 % sau 9 ngày

phơi nhiễm dựa trên việc tạo ra hiệu ứng cảm nhiễm lên VKL. Hàm lượng của

allophycocyanin, phycocyanin và chlorophyll a của chủng VKL này giảm mạnh tới

7,6; 15,3 và 52,7 %, tương ứng, sau 5 ngày tác động. Mặc dù ảnh hưởng ức chế của

các loài họ Myriophyllaceae chưa được nghiên cứu toàn diện trên các đối tượng khác

(D. magna, L. minor….) để kiểm tra mức độ an toàn sinh thái của phương pháp, cũng

như chưa triển khai thử nghiệm với các mẫu nước hồ tự nhiên, nhưng so với các

nghiên cứu trước, các tác giả đã có những thành công đầu tiên giải thích cơ chế tác

động của các hoạt chất này lên tế bào VKL đặc biệt là sự ảnh hưởng lên hệ thống

quang hợp PSI và PSII.

1.2.2.7. Những nghiên cứu khác về sử dụng cao chiết để kiểm soát bùng nổ VKL độc

Bên cạnh những nghiên cứu điển hình đã được trình bày ở trên, nhiều nghiên

cứu khác về sử dụng cao chiết thực vật để kiểm soát bùng nổ VKL độc M. aeruginosa

như từ cao chiết vỏ chuối và vỏ quýt [90], cao chiết etanol từ lá cây Vallisneria

spiralis L với 6 hoạt chất được phân lập trong đó 2-ethyl-3-methylmaleimide chiếm

tỉ lệ cao nhất và tác nhân chính gây ra hoạt tính diệt tảo [91]. Năm 2006, Park khảo

sát hoạt tính diệt tảo của các cao chiết từ loài sồi thuộc chi Quercus họ Fagaceae, tại

nồng độ 100 mg/L 17 loại cao chiết metanol của lá, thân, vỏ, rễ sồi đều có khả năng

ức chế sinh trưởng M. aeruginosa với hiệu suất trên 90% trong 7 ngày [92]. Tại nồng

độ 20 mg/L tất cả các cao chiết đều ức chế sinh trưởng với giá trị IE > 50 % nhưng

tại nồng độ 10 mg/L sự ức chế chỉ quan sát thấy tại 2 mẫu cao chiết từ lá Q. salicina

(IE 81%) và Q. acuta (IE 25%) trong khi ba cao chiết khác kích thích sinh trưởng M.

aeruginosa, đặc biệt mẫu thực nghiệm bổ sung cao chiết từ lá cây Q. acutissima và

từ vỏ cây Q. acuta sinh khối bằng 201 và 171 % sinh khối của mẫu đối chứng tính

30

theo phương pháp đếm tế bào. Sự ức chế này theo tác giả là do lượng lớn hoạt chất

tannin trong cao chiết, với nồng độ thấp hơn 17 mg/L, tannin không ảnh hưởng lên

sinh trưởng của M. aeruginosa, ở nồng độ thấp 1,7 và 8,5 mg/L thì kích thích sinh

trưởng của VKL lên đến 150 % so với mẫu đối chứng. Các nghiên cứu gần đây nhất

về hoạt tính diệt tảo của cao chiết từ thực vật như cao chiết từ 40 loại thảo dược của

Trung Quốc [93] hoặc cao chiết từ Salvia miltiorrhiza Bung [94] , Camellia sinensis

(L.) O. Kuntze [95], Solidago canadensis L.[96], Lactuca sativa L. và Eruca sativa

Mill [97], Ailanthus altissima [98], vỏ Shaddock, vỏ Pomegranate, hạt Pomegranate

[99], Sagittaria trifolia [100], Cinnamomum camphora [101], Cryptomeria japonica

[102], Thymus satureioides Coss và Artemisia herba alba L [103] chứng tỏ tầm quan

trọng của vấn đề, hứa hẹn tìm được một hoạt chất diệt tảo tiềm năng có nguồn gốc

thiên nhiên để kiểm soát bùng nổ vi tảo độc trong các hệ sinh thái nước ngọt.

1.2.3. Một số nhóm hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên kiểm soát bùng nổ VKL

Nhiều hợp chất hóa học có khả năng diệt tảo đã được tách chiết từ các cao chiết

thực vật ức chế hiệu quả sinh trưởng VKL độc. Các hợp chất hóa học diệt tảo chủ yếu

là hợp chất phenols, quinones, alkaloids, các axit hữu cơ, estes, axit amin, terpenes

và những chất khác [60]. Những thông số trong các tài liệu tham khảo về nồng độ

hiệu quả ức chế sinh trưởng VKL là khó so sánh và mang tính tham khảo vì các chủng

VKL trong các thực nghiệm là khác nhau, nghiên cứu trên tập đoàn VKL cũng khác

so với nghiên cứu trên từng cá thể độc lập. Ví dụ, chỉ số IC50 của tryptamine trên

VKL M. aeruginosa là 1,05 mg/L, trong khi chỉ số đó là 9,22 mg/L với chủng VKL

khác Planktothrix rubescens [104]. Chỉ số IC50 của saguainarine đối với M.

aeruginosa là 0,29 mg/L tuy nhiên trong nghiên cứu khác thì chỉ số IC50 của hợp chất

này với M. aeruginosa NIES-843 là 0,035 mg/L [105]. Một điểm quan trọng nữa là

không có chuẩn mực giữa những thực nghiệm sinh học về đánh giá hoạt tính của các

hợp chất thiên nhiên lên VKL. Những yếu tố như thời gian nuôi cấy và mật độ nuôi

cấy ban đầu ảnh hưởng rất lớn tới kết quả, không được quy định và kiểm soát tốt

trong quá trình thực nghiệm [104, 106]. Dưới đây là một vài nhóm chất được tách

chiết từ thực vật có khả năng ức chế sinh trưởng của M. aeruginosa.

1.2.3.1. Các hợp chất của phenol

31

Các hợp chất của phenol từ lâu đã được coi là thành phần chính trong các cao

chiết thực vật gây ra ức chế sinh trưởng M. aeruginosa [77, 82, 87]. Các hợp chất

polyphenol như axit gallic (EC50 1,0 mg/L) và axit pyrogallic (EC50 0,65 mg/L) được

coi là nguyên nhân chính ức chế sinh trưởng M. aeruginosa do hòa tan tốt trong nước

nhờ các nhóm hydroxyl, ngoài ra còn có khả năng tự oxi hóa trong môi trường. Năm

2001, Nakai khảo sát hoạt tính của 9 hợp chất phenol được phân lập từ các loài thực

vật khác nhau như caffeic, axit p-coumaric, ferulic, protocatechuic, sinapic, syringic,

vanillic, catechol và hydroquinone, hai loại axit từ thực vật (quinic và shikimic) và các

hợp chất phenol khác như phenol, resorcinol, hydroxyl hydroquinone và

phloroglucinol đều quan sát thấy hiệu quả ức chế sinh trưởng M. aeruginosa [52]. Các

hợp chất khác như benzaldehyde, 2-phenyl-phenol, p-cresol và axit benzoic cũng được

Murry và cộng sự đánh giá ảnh hưởng trên sinh trưởngM. aeruginosa thu được giá trị

EC50 tương ứng là 100, 150, 150 và 250 µg/ L [107].

1.2.3.2. Các hợp chất của axit béo

Theo nghiên cứu của Zhu [108], các hoạt chất được phân lập từ M. spicatum

như axit pyrogallic (PA), axit gallic (GA), axit ellagic (EA) và (+)-catechin (CA) có

ảnh hưởng rất lớn đến hệ quang hợp của M. aeruginosa đặc biệt là con đường vận

chuyển điện tử không quang hóa và hiệu suất lượng tử. Axit pyrogallic (nồng độ 2,97

mg/L), axit gallic (nồng độ 2,65 mg/L) làm giảm mạnh năng suất quang hệ II (PSII)

và hoạt động của chuỗi mạch dẫn truyền điện tử của tế bào M. aeruginosa xuống

71,43 và 18,37 %; 70,95 và 40,77 % tương ứng sau 24 giờ phơi nhiễm. Năm 2005,

Nakai và cộng sự chứng minh rằng các axit béo từ M. spicatum cũng đóng một vai

trò quan trọng tạo nên tính kháng khuẩn của cao chiết đặc biệt là axit nonanoic, cis-

6-octadecenoic và cis-9-octadecenoic với các giá trị EC50 lần lượt là 0,5; 3,3 và 1,6

mg/L [88]. Theo tác giả hiệu quả ức chế sinh trưởng VKL của các axit béo phụ thuộc

mạch cacbon (sự hòa tan của axit béo trong nước giảm khi mạch cacbon của phân tử

axit tăng lên), vào số lượng các liên kết đôi C=C và vị trí của các nối đôi trong cấu

tạo phân tử. Trong các hợp chất nói trên, thì axit nonanoic có mạch cacbon ngắn nhất,

là axit béo bão hòa, ghi nhận hiệu quả ức chế cao nhất so với các axit béo còn lại.

1.2.3.3. Các hợp chất este

Choe chứng minh dịch chiết phân hủy của cây ngải cứu (Artemisia asiatica) có

hiệu quả ức chế tăng trưởng VKL độc với hiệu suất trên 70% sau 2 ngày phân hủy tại

32

nồng độ 5g/L [109]. Hiệu quả ức chế này giảm dần theo các ngày thực nghiệm ví dụ

sau 8 ngày giá trị IE còn là 54%. Các hoạt chất ức chế được giải phóng từ các loài

thực vật có mùi như ngải cứu, rơm lúa mạch, rơm và hoa cúc, được xác định là axit

hexanedioic, este dioctyl và axit 1,2-benzenedicaboxylic, bis (2-ethylhexyl). Các hợp

chất este đã được tìm thấy là các hóa chất chính có tác dụng diệt tảo, trong khi hợp

chất phenol được xác định là tác nhân phụ. Theo Choe, sự có mặt của hợp chất phenol,

các hợp chất este dường như có ảnh hưởng mạnh hơn đến sự ức chế sự tăng trưởng

của VKL.

1.2.3.4. Các hợp chất của axit amin hoặc amin

L-lysine là một trong những hợp chất diệt tảo tự nhiên được quan tâm nhất. Đây

là một amino axit cần thiết đối với tế bào sinh học, đồng thời cũng có ảnh hưởng ức

chế chống lại VKL tại nồng độ 0,6 mg/L [110], tiềm năng là một trong những hợp chất

tự nhiên có khả năng diệt VKL thân thiện với môi trường. Phun 7,3 mg/L L-lysine vào

thủy vực đang bùng nổ sinh khối VKL, sinh khối tập đoàn M. aeruginosa giảm trong

2 ngày sau đó và kéo theo sự chiếm ưu thế của Euglena sp. và Phormidium tenue sau

khi M. aeruginosa tiêu diệt. Những ưu điểm nổi bật của hợp chất L-lysine như độc tính

chọn lọc lên VKL, độ hòa tan trong nước cao, dễ dàng bị phân hủy sinh học và tính an

toàn hứa hẹn một hoạt chất tiềm năng để kiểm soát bùng nổ VKL độc. Một vài hợp

chất amin khác cũng được phân lập và kiểm tra hoạt tính diệt VKL như N-phenyl-1-

naphthylamine phân lập từ Elodea nuttallii, Hydrilla verticillata , Vallisneria spiralis

với giá trị EC50- 48h là 16,62 µM [111].

1.2.4. Cơ chế tác động của các cao chiết và các hợp chất thiên nhiên lên sinh

trưởng của VKL độc M. aeruginosa

Cơ chế ảnh hưởng của cao chiết thực vật và các hợp chất thiên nhiên lên tế bào

VKL M. aeruginosa là vấn đề cần quan tâm. Dưới đây là một số cách giải thích khác

nhau về cơ chế tác động của cao chiết hoặc các hợp chất lên tế bào VKL

1.2.4.1. Ảnh hưởng lên siêu cấu trúc tế bào VKL

Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của các tế bào VKL dưới

tác động của cao chiết A. mearnsii (20 mg/L) cho thấy rõ những tổn thương lên thành

tế bào và nguyên sinh chất [112]. So với mẫu đối chứng có tế bào đầy đặn, hình cầu,

bề mặt ngoài nhẵn, mịn thì tế bào dưới tác dụng của cao chiết có thành, màng tế bào

33

và cấu trúc bên trong bắt đầu bị hư hại, hình dáng tế bào bóp méo sau hai ngày tiếp

xúc [113]. Sau 4 ngày, thành tế bào bị vỡ, nguyên sinh chất một phần bị chảy ra ngoài,

hoặc xuất hiện những khoảng rỗng trắng trong nguyên sinh chất.Ảnh hưởng lên siêu

cấu trúc tế bào VKL cũng được quan sát dưới tác động các cao chiết rễ E. equisetina

Solidago [59] hoặc Solidago canadensis L [114] hay Fructus ligustri lucidi [71].

Những tổn thương này tăng lên theo thời gian và theo nồng độ của cao chiết. Ảnh

chụp SEM của các tế bào M. aeruginosa chứng minh cao chiết gây lên những tổn

thương bề ngoài tế bào. Nếu tế bào đối chứng tròn và đầy đặn, thì sau hai ngày tiếp

xúc với cao chiết, tế bào M. aeruginosa bị ảnh hưởng rõ rệt với hình dạng tế bào bị

bóp méo, bề mặt ngoài nhăn nheo và kích thước bị thu nhỏ hơn so với các mẫu đối

chứng [98].

1.2.4.2. Ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen trong tế bào M. aeruginosa

Theo Liu và cộng sự cao chiết thực vật có thể làm ảnh hưởng đến biểu hiện của

3 gen (rbcL, psaB và psbD) liên quan đến quá trình quang hợp [112]. Kết quả cho

thấy biểu hiện của gen rbcL, psaB dưới tác động của cao chiết A. mearnsii nồng độ

20 mg/L giảm đáng kể sau 24 giờ phơi nhiễm và tuyến tính với nồng độ và thời gian

phơi nhiễm, trong khi biểu hiện của gen còn lại (psbD) giảm nhẹ sau 24 giờ nhưng

sau 48 và 72 giờ thì bị giảm rất mạnh. Thông qua tác động lên biểu hiện của gen, tác

giả cho rằng cao chiết đã gián tiếp ảnh hưởng đến quá trình và hiệu quả quang hợp

của M. aeruginosa từ đó dẫn đến ức chế sinh trưởng và gây chết tế bào. Zhang và

cộng sự phân lập hợp chất neo-przewaquinone A (EC50 4,68 mg/L) từ cao chiết Salvia

miltiorrhiza Bung, có ảnh hưởng mạnh mẽ lên tế bào VKL thông qua việc ức chế lên

3 gen liên quan đến quá trình quang hợp (psaB, psbD, và rbcL) [94].

1.2.4.3. Ảnh hưởng lên các quá trình sinh lý tế bào M. aeruginosa

Cao chiết tác động lên tế bào VKL gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng lên

tế bào M. aeruginosa như tác động lên quá trình phân chia tế bào, quá trình giải phóng

các chất ngoại bào như độc tố microcystin, hoạt tính của các chất chống oxy hóa

(SOD) (Superoxide dismutase- một enzym chuyển đổi các gốc superoxide độc hại

thành một dạng ít nguy hiểm hơn) và hàm lượng của malondialdehyde (MDA) – một

chất hữu cơ có vai trò như chỉ dấu sinh học của tình trạng mất cân bằng oxy hóa [98].

34

Năm 2015, Liu cùng cộng sự nghiên cứu cơ chế tác động của cao chiết lên tế bào vi

khuẩn M. aeruginosa. Kết quả chứng minh rằng cao chiết ảnh hưởng lớn đến tính

thẩm thấu của màng tế bào và tăng hoạt tính enzym Ca2+/Mg2+ - ATPase [112].

Ngoài ra, thông qua ảnh hưởng lên cấu trúc tế bào VKL, cao chiết gây những tổn

thương lên màng thylakoid, gián đoạn quá trình vận chuyển điện tử, giảm hiệu suất

lượng tử, làm ngừng quá trình quang hợp của M. aeruginosa và gây chết tế bào [59,

94].

1.3. Cây Mần tưới Eupatorium fortunei

1.3.1. Sơ lược về cây Mần tưới Eupatorium fortunei

Tên Việt Nam: Mần tưới. Tên khác Mạch lan, Lan thảo, Hương thảo, tên khoa

học: Eupatorium fortunei Turcz., thuộc Họ Cúc (Asteraceae).

Cây Mần tưới là cỏ lâu năm, thân cao 0,4-1,0 m, hình trụ nhẵn bóng, phân nhánh

và có lông. Lá mọc đối, thường xẻ sâu ba thùy hình lưỡi mác, lá ở gần ngọn không

xẻ thùy. Lá có mùi thơm, cỡ 8-13 x 2-4 cm, chóp nhọn, viền răng cưa nhọn đều, gân

bên 6-7 đôi, nổi rõ; mặt trên màu nâu tía, mặt dưới có lông tơ thưa và ngắn. Cuống lá

dài 0,8-1 cm. Cụm hóa đầu hợp thành dạng tán dày đặc, ở tận cùng mỗi đầu dài 7-8

cm, cuống ngắn có lông, trong mỗi đầu có 5 hoa. Tất cả hoa hình ống, lưỡng tính

[115].

Phân bố: Cây Mần tưới (Eupatorium fortunei) là một loại thảo dược phân bố

tập trung ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ, được trồng ở Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc,

Lào. Tại Việt Nam, cây phân bố nhiều ở Lào Cai (Bắc Hà), Cao Bằng (Quảng Yên),

Lạng Sơn, Phú Thọ….

Công dụng: Dân gian dùng Mần tưới để chữa mụn nhọt, lở ngứa ngoài ra, diệt

chấy, rận, rệp, xua đuổi các loại bọ chó, bọ mạt dĩn. Lá và toàn cây sắc uống có tác

dụng lợi tiểu, điều kinh, hạ sốt. Đọt non đồng bào dân tộc ở Cao Bằng, Lạng Sơn còn

dùng ăn như rau vì thế hiện nay cây Mần tưới có thể dễ dàng tìm và thu hái trong các

hộ gia đình.

1.3.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

Cây Mần tưới được sử dụng từ lâu trong dân gian như một loài cây có khả năng

kháng khuẩn, chữa được nhiều bệnh và cũng được các nhà khoa học nghiên cứu phân

35

tích thành phần hóa học trong lá, thân và rễ. Những báo cáo đã được công bố về thành

phần hóa học của thân và lá Mần tưới tìm thấy các 16 dẫn xuất mới của Thymol (1-

16) [116] từ cao chiết tổng metanol thân, lá Mần tưới

8,9-dehydrothymol3-O-

tiglate

9-acetoxy-8,10-

dehydrothymol 3-O-

tiglate

9-acetoxythymol3-O-

tiglate

(chưa có tên danh pháp)

9-acetoxy-8,10-epoxy-6

hydroxythymol 3-O-

angelate.

7-acetoxy-8-hydroxy-9-

isobutyryloxythymol

36

8-methoxy-9-hydroxythymol

Dẫn xuất 3-O-isobutyryl

của (7)

Dẫn xuất 3-O-tiglate của

(7)

Dẫn xuất 3-O-

(3-methyl-2-butenoyl) của (7)

Dẫn xuất 9-O-angeloyl

của (7)

Dẫn xuất 9-O-isobutyryl

của (7)

2-methylbutyryloxy

37

2-(1′-hydroxy-2′-oxopropyl)-

5-methylphenol.

Năm 2006, Jiang cùng cộng sự tách chiết được các hợp chất terpenoids từ cây

Mần tưới. Các cao chiết phân đoạn Mần tưới trong các dung môi khác nhau như dầu

hỏa, AcOEt, BuOH từ cao chiết tổng metanol Mần tưới cũng được kiểm tra đánh giá

khả năng chống tế bào ung thư người như tế bào ung thư gan, tế bào ung thư bạch

cầu. Từ cao chiết phân đoạn etyl axetat đã phân lập được 04 hợp chất terpenoids mới

(17- 20) cùng với 14 chất (21-36) đã được công bố [117]

17. rel-(1R,2S,3R,4R,6S)-p-

menthane-1,2,3,6-tetrol

18. rel-(1R,2R,3R,4S,6S)-p-menthane-1,2,3,6-

tetrol

38

19. 9-hydroxythymol 3-O-

angelate

20. (3b,20R)-20-hydroxylanost-25-en-3-yl

palmitate

21. 5-methyl-2-(1-methylethyl)phenol

22. 7-hydroxythymol hoặc 5- (hydroxymethyl)-2-(1-methylethyl)phenol

23. 9-hydroxythymol hoặc 2-(2-hy-droxy-1-methylethyl)-5-methylphenol

24. 8,9-dihydroxythymol hoặc 2-(2-hydroxy-4- methylphenyl)propane-1,2-diol

25. 4-(1-hydroxy-1-

methylethyl)benzoic acid

26. (1b,6b)-5,7-

epieudesm-4(14)-ene-

1,6-diol1)

27. (1b,6a)-

eudesm-4(14)-ene-1,6-

diol1)

R1 R2 R3

21 H H H

22 ÒH H H

23 H H OH

24 H OH OH

39

28. (1b,5a)-eudesm-4(14)-

ene-1,5-diol1)

29.(1b,9b)-caryolane-

1,9-diol

30.(2b,9a)-clovane-2b,9a-

diol

31. (3S,5R,8R)-3,5-dihydroxymegastigma-6,7-dien-9-

one

32. acetone

thymol-8,9-diyl ketal

33. 7,11,15-trimethyl-3-methylidenehexadecane-1,2-

diol

34. 8-methoxy-9-

hydroxythymol 3-O-

angelate

40

35. (3b,24RS)-cycloart-25-ene-3,24-diol

36. cycloaudenyl palmitate

Các hợp chất là dẫn xuất benzofuran (37-39) được tách chiết từ phần thân, lá

mẫu khô Mần tưới E.fortunei bởi các nhà khoa học Trung Quốc năm 2008 [118]

R1

α-OH 37. 3, 6-dimethyl-2, 3dihydrobenzofuran-2-ol

β- OH 38. 3,6-dimethyl-2, 3-dihydrobenzofuran-2-ol

β -O- β-D-

glu

39. 3, 6-dimethyl-2, 3-dihydrobenzofuran 2-

O-D-glucopyranoside

Năm 2011, nhóm nghiên cứu tại Việt Nam [119, 120] công bố tách chiết được

03 chất (40-42) lần đầu tiên phát hiện ở cây Mần tưới và 03 nhóm các dẫn xuất khác

của thymol (43-45).

41

40.teraxasteryl axetat

41. o-coumaric axit

42.α-Axetylamino-phenylpropyl α-

benzoylamino-phenylpropanoate

43. 8,9,10 - trihydroxythymol

44. 9-angeloyoxy-10 axetoxy -8-hydroxythymol

45.9-angeloyoxy-8,10-

dihydroxythymol

Năm 2014, nhóm tác giả Wang cùng cộng sự đã tách chiết được thêm

02 chất mới từ cây Mần tưới (46-47) và 05 hợp chất là dẫn xuất của thymol

42

(48-52) [ [121]

46.9-angeloyloxythymol

47.8-hydroxyl-9-

angeloyloxythymol

48.9-acetoxythymol

49. 5α-hydroxy-2-oxo-p-

menth-6(1)-ene

50.eupatobenzofuran

51.9-O-angeloyl-8,10-

dehydrothymol

52.9-hydroxythymo

53. patriscabratin [122]

Thành phần hóa học của Cây Mần tưới chủ yếu được nghiên cứu trong

thân và lá. Đó là nhóm các hợp chất flavonoids, thylmol, terpenoids, benzofuran,

polyphenol được phân lập từ cao chiết metanol, etanol và cao chiết nước Mần

tưới [123, 124] với thành phần chủ yếu là terpenoids đặc biệt các

monoterpenoids chiếm ưu thế.

1.3.3. Hoạt tính sinh học của cây Mần tưới

Thành phần hóa học của cây Mần tưới rất đa dạng với hoạt tính sinh học kháng

43

viêm, chống oxi hóa, kháng nấm, khả năng ngăn ngừa, chống lại tế bào ung thư và

khả năng chống đái tháo đường [123-125]. Dưới đây là một vài hoạt tính tiêu biểu

của cao chiết cũng như các hợp chất đã được phân lập từ cây Mần tưới.

1.3.3.1. Hoạt tính gây độc đối với các dòng tế bào ung thư

Năm 2014, Kim cùng cộng sự đã tiến hành thực nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng

của cao chiết nước Mần tưới lên khả năng di căn của tế bào ung thư ác tính. Cơ chế

tác động của cao chiết lên tế bào ung thư thông qua sự ức chế hoạt động của tác nhân

MMP - 9 (Matrix metalloproteinase-9) [126]. MMP - 9 là một họ các enzyme tiêu

protein, đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy chất nền ngoại bào và màng cơ

bản, trong đó MMP - 9 được xem như enzyme chủ [127]. Cao chiết còn kích hoạt

NF-κB (yếu tố nhân kappa B), tham gia vào quá trình phosphoryl hóa của P38, vai

trò quan trọng thúc đẩy quá trình chết tế bào và giảm tổng hợp sản xuất yếu tố tăng

trưởng nội mô mạch máu (VEGF- Vascular endothelial growth factor). VEGF là một

protein được sản sinh từ các tế bào có chức năng kích thích hình thành các mạch máu

mới, đáp ứng với tình trạng thiếu oxy bởi gen gây ung thư, tác nhân này gây ra sự

tăng sinh tế bào nội mô, thúc đẩy di cư tế bào và ức chế gây chết. Trong mô hình điều

trị tế bào ung thư di căn ở phổi, sử dụng hằng ngày dịch chiết nước Mần tưới với liều

lượng 50 mg/kg sẽ làm giảm đáng kể các tập đoàn di căn của các tế bào B16F10 trên

bề mặt phổi của chuột.

1.3.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn

Nghiên cứu của Ushiki chứng minh rằng dịch chiết từ rễ của E. fortunei ức chế

sinh trưởng mạnh mẽ 04 loài vi sinh vật như Streptomyces scabies (tạo vảy khoai

tây), Phytophthora megasperma (gây thối rễ), Verticillium dahliae (gây héo lá và

thân) và Rhizoctonia solani (gây chết úng) [128]. Năm 2010, các nhà khoa học Trung

Quốc nghiên cứu về nhóm vi khuẩn tạo ra các hợp chất lưu huỳnh dễ bay hơi gây

triệu chứng hôi miệng cho rằng dịch chiết nước từ cây Mần tưới có khả năng ức chế

quá trình giải phóng các hợp chất dễ bay hơi của lưu huỳnh và ức chế sinh trưởng của

loài vi khuẩn với giá trị IE lần lượt là 51,96 và 25,98 % [129].

Năm 2017, nhóm nghiên cứu của Choi đã đánh giá khả năng tăng cường miễn

dịch của các đại thực bào RAW 264,7 dưới tác dụng cao chiết nước từ cây Mần tưới

44

trước ảnh hưởng các loại virut như virut cúm A, virut gây bệnh trên trâu bò, vi rút

gây bệnh viêm miệng. Các tác giả này đã chứng minh rằng cao chiết có tác dụng sản

sinh một loại cytokine gây viêm, đồng thời phân lập được các hợp chất quercetin,

psoralen và quercitrin, có vai trò quan trọng trong quá trình miễn dịch của tế bào

RAW 264,7 [124].

1.3.3.3. Hoạt tính ức chế enzyme

Tyrosinase hay còn gọi là enzym polyphenol oxidase là một enzym

monooxygenase, có chứa nguyên tố đồng tham gia vào hai phản ứng riêng biệt của

quá trình chuyển hóa melanin. Do đó các chất ức chế tyrosinase đã và đang được sử

dụng rất rộng rãi để điều trị các bệnh tăng sắc tố trong y học và trong mỹ phẩm thì sử

dụng như một yếu tố làm trắng da. Nhiều nghiên cứu được triển khai tìm kiếm các

hoạt chất từ thiên nhiên có khả năng ức chế hoạt động của enzyme này, ví dụ kushenol

A và 8-prenylkaempferol được phân lập từ rễ loài Sophora flavescens có khả năng ức

chế mạnh với giá trị IC50 tương ứng là 1,1 và 2,4 μM [130]. Năm 2012, nghiên cứu

của Nguyễn Tường Vy đã khảo sát ảnh hưởng ức chế của cao chiết tổng Mần tưới

trong các dung môi khác nhau cũng như ảnh hưởng của hai hợp chất hóa học phân

lập được từ cây Mần tưới là o- coumaric (41) và patriscabratin (53) lên hoạt tính của

enzyme tyrosinase [122]. Kết quả thử hoạt tính ức chế tyrosinase cho thấy cao chiết

metanol Mần tưới cho giá trị IC50 là 315,8 µg/mL, cao hơn so với cao chiết tổng n-

hexan Mần tưới (IC50 là 237,5 µg/mL). Hợp chất axit o-coumaric và patriscabratin

ghi nhận IC50 lần lượt là 2,8 mM và >10 mM. Đặc biệt, axit o-coumaric có tác dụng

ức chế mạnh hơn so với đối chứng dương hydroquinone (IC50 3,1 mM), là một trong

những hoạt chất được sử dụng nhiều và rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm và mỹ

phẩm.

1.3.3.4. Hoạt tính kháng viêm

Nitơ oxit (NO) là thành phần quan trọng đối với cơ thể vật chủ, giúp chống lại

các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, vi rút, nấm và ký sinh trùng. Tuy nhiên, nghiên

cứu chứng minh rằng việc dư thừa NO trong hệ thần kinh trung ương dẫn đến những

tổn hại thần kinh, thúc đẩy một số rối loạn thần kinh khác nhau như Parkinson,

Alzheimer, gây tổn thương cấp tính và mãn tính [131]. Vì vậy, ức chế quá trình sản

45

sinh ra NO được coi là một giải pháp tiềm năng để phòng và điều trị các bệnh viêm

liên quan đến hệ thần kinh. Lipopolysaccharide một thành phần từ thành tế bào của

vi khuẩn gram âm, là một trong những chất hoạt hóa mạnh nhất của đại thực bào và

liên quan việc sản xuất các cytokine tiền viêm. Để nghiên cứu tác dụng dược lý và

tiềm năng của các dẫn xuất thymol phân lập được từ toàn bộ (thân, rễ, lá) cây Mần

tưới, nhóm tác giả Wang đã đánh giá ảnh hưởng của 07 hợp chất (46-52) lên sự ức

chế tổng hợp NO do Lipopolysaccharide gây ở đại thực bào trong tế bào vi sinh vật

BV-2 [121]. Kết quả cho thấy hợp chất (50), (51) có khả năng gây ức chế mạnh với

giá trị IC50 tương ứng là 69,0 và 95,0 µM, các hợp chất còn lại thể hiện sự ức chế kém

hơn với IC50 > 100 µM. Điều quan trọng là các hợp chất này không gây độc cho tế

bào vật chủ BV-2 ngay tại nồng độ thể hiện khả năng ức chế sự tổng hợp hợp chất

NO.

1.3.4. Ứng dụng cao chiết cây Mần tưới để kiểm soát bùng phát sinh khối VKL

độc M. aeruginosa

Việc tìm kiếm khai thác hoạt chất thiên nhiên có tính kháng khuẩn đã được các

nhóm nghiên cứu tại Việt Nam triển khai từ lâu và hầu hết là phục vụ cho mục đích

ứng dụng y dược [119, 122]. Năm 2013, Nguyễn Tiến Đạt và cộng sự đã khảo sát

hoạt tính diệt M. aeruginosa của cao chiết metanol một số loài thực vật tại Việt Nam

như Lược vàng (Callisia fragrans), Củ gấu, (Cyperus rotundus), Củ gấu biển (Cyperus

stoloniferu), Cỏ lào tím (Eupatorium coelestinum), Mần tưới (Eupatorium fortunei)

và Cỏ lào (Chromolaena odorata) trong dải nồng độ từ 4 đến 500 µg/mL [2]. Kết quả

cho thấy cao chiết từ 6 mẫu thực vật trên đều có tác dụng ức chế sinh trưởng ở nồng

độ 500 µg/mL, giá trị IC50 dao động từ 87,6- 252,4 µg/mL đối với VKL M. aeruginosa

và từ 34,3 đến 315,1 µg/mL đối với tảo Ch. vulgaris. Trong đó, cao chiết metanol từ

lá, thân cây Mần tưới có độc tố chọn lọc lên VKL M. aeruginosa, cụ thể có khả năng

ức chế sinh trưởng mạnh lên M. aeruginosa với giá trị IC50 119,3 µg/mL so với Ch.

vulgaris - ,một loài tảo lục có lợi, giá trị IC50 313,1 µg/mL. Sự tác động có chọn lọc

của cao chiết Mần tưới lên hai đối tượng này hứa hẹn tiềm năng sử dụng cao chiết

như một chất diệt tảo hiệu quả và thân thiện với môi trường. Năm 2014, Phạm Thanh

Nga cùng cộng sự khẳng định lại hoạt tính diệt VKL M. aeruginosa của cao chiết cây

46

Mần tưới bằng phương pháp đo mật độ quang (λ=680nm) và phương pháp đo hàm

lượng chlorophyll a. Hoạt tính diệt VKL độc của cao chiết này tại nồng độ 500 µg/mL

có thể so sánh với độc tính của hợp chất đồng CuSO4 nồng độ 5 µg/mL [3]. Kết quả

công bố của các tác giả nói trên mới dừng lại ở nghiên cứu khảo sát bước đầu trong

quy mô phòng thí nghiệm khi sử dụng cao chiết cây Mần tưới như một hoạt chất diệt

VKL độc. Các nghiên cứu đều khẳng định tiềm năng ứng dụng cao chiết này để kiểm

soát sự bùng nổ sinh khối TVN và chủng Microcystis trong các hệ sinh thái nước

ngọt, hứa hẹn một phương pháp mới hiệu quả và thân thiện với môi trường.

Tuy nhiên, ứng dụng cao chiết Mần tưới như một hoạt chất diệt tảo tiềm năng

định hướng ứng dụng quy mô thực tế còn có nhiều những vấn đề cần phải làm rõ như

ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính diệt tảo của cao chiết thực vật, cơ chế

tác động của cao chiết lên tế bào M. aeruginosa từ đó gây ra hiệu ứng kìm hãm sinh

trưởng và gây chết tế bào hoặc tìm kiếm các hợp chất hóa học trong cao chiết đóng

vai trò quan trọng tạo nên độc tính đối với VKL. Tổng hợp nhân tạo các hợp chất này

ở quy mô công nghiệp mở ra một giải pháp mới khi nguồn cung cấp đầu của một số

loài thực vật bị hạn chế. Câu hỏi về tính an toàn của cao chiết đối với các loài sinh

vật khác không thuộc đối tượng tác động như giáp xác (Daphnia magna), bèo tấm

(Lemna minor), hai loài tiêu biểu được sử dụng trong đánh giá độc tính, cũng như ảnh

hưởng của cao chiết đối với các thông số thủy lý và thủy hóa của môi trường vẫn còn

chưa được công bố. Những vấn đề được liệt kê ở trên sẽ được nghiên cứu và giải

quyết trong luận án tiến sỹ này.

47

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Cây Mần tưới Eupatorium fortunei Turcz.

Hình 2.1.Cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) [115]

Mẫu tươi Mần tưới Eupatorium fortunei Turcz. (lá và thân) được thu hái tại

Sóc Sơn, Hà Nội vào tháng 03.2016. Mẫu được xác định tên khoa học bằng phân tích

hình thái bởi: TS. Nguyễn Thế Cường và TS. Nguyễn Văn Hải, Viện Sinh thái và Tài

nguyên sinh. Mẫu được làm tiêu bản và lưu giữ tiêu bản tại Bộ môn Hóa công nghệ

môi trường, Khoa hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội với mã số No Ef.

28032017 và No CNMT 0611.

2.1.2. VKL độc nước ngọt Microcystis aeruginosa Kützing

Chủng Microcystis aeruginosa Kützing kí hiệu TC3 được phân lập từ Hồ Núi

Cốc theo phương pháp của Shirai (1989), lưu giữ tại Phòng Thủy sinh học môi trường,

Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18

Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. M. aeruginosa được nuôi cấy trong môi trường

CB, pH ≈ 9, tại nhiệt độ phòng 25 0C, cường độ chiếu sáng 1000 lux chu kỳ 12 giờ

sáng: 12 giờ tối [61, 113].

48

Hình 2.2. Tập đoàn M. aeruginosa chụp

dưới kính hiển vi điện tử Microscope

BX51

Hinh 2.3. Các tế bào M. aeruginosa

được phân lập trong phòng thí

nghiệm chụp dưới kính hiển vi điện

tử Microscope BX51

2.1.3. Loài tảo lục Chlorella vulgaris Beijerinck.

Hình 2.4. Ch. vulgaris Beijerinck. sử dụng trong phòng thí nghiệm

Tảo lục Ch. vulgaris Beijerinck. được lưu giữ tại Phòng Thủy sinh học môi

trường, Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Ch. vulgaris được nuôi cấy trong môi

trường Sorokin và Krauss [113] pH 6,8 tại nhiệt độ phòng 25 0C, cường độ chiếu

sáng 1000 lux chu kỳ 12 giờ sáng: 12 giờ tối.

49

2.1.4. Bèo tấm Lemna minor Linnaeus

Bèo tấm L. minor Linnaeus thu từ

một số thủy vực tại Cầu Giấy, Hà

Nội và nghiên cứu tại Phòng thực

nghiệm môi trường, Bộ môn Hóa

Công nghệ & Môi trường, Khoa

Hóa học, Trường Đại học Sư phạm

Hà Nội, 136 Xuân Thủy Cầu Giấy

Hà Nội.

Hình 2.5. Lemna minor

Bèo được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng (ISO 20079, 2005). Môi

trường nuôi dinh dưỡng nuôi cấy bèo Hoagnlan [132]. Bèo tấm L. minor được sử

dụng làm sinh vật thí nghiệm đánh giá độc tính của các cao chiết.

2.1.5. Giáp xác Daphnia magna Straus

Daphnia magna Straus có

nguồn gốc từ công ty Microbiotests Inc

(Bỉ), được cung cấp bởi PGS.TS Đào

Thanh Sơn, Khoa Môi trường và Tài

nguyên thuộc Đại học Bách khoa TP

Hồ Chí Minh, 268 Lý Thường Kiệt,

Quận 10, TP Hồ Chí Minh.

Hình 2.6. Daphnia magna

Daphnia magna Straus được nuôi cấy trong môi trường ISO theo hướng dẫn

của APHA (2012) và được sử dụng làm sinh vật thí nghiệm đánh giá độc tính của các

cao chiết.

50

Quần thể thực vật phù du hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng

Hình 2.7. Hồ Hoàn Kiếm Hình 2.8. Hồ Láng

Hồ Hoàn Kiếm hay còn gọi là Hồ Gươm thuộc quận Hoàn Kiếm nằm ở trung tâm

thành phố Hà Nội [17], với diện tích bề mặt 0,12 km2, thể tích nước là 0,18 × 106 m3 ,

tọa độ N 21o 01’33’’, E 105o 51’11’’ [65, 133]. Hồ Láng thuộc quận Đống Đa, Hà Nội

là những hồ nước ngọt tự nhiên nằm ở trung tâm thành phố có vai trò quan trọng trong

sinh hoạt và điều hòa vi khí hậu. Trong những năm vừa qua do nhận nước thải nước

thải (sinh hoạt và bệnh viện), hàm lượng dinh dưỡng cao cùng các điều kiện thuận lợi

gây bùng nổ tảo trong đó có VKL độc đặc biệt vào tháng 3-4 và tháng 9-10 hằng năm.

2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.2.1. Thiết bị và dụng cụ

Máy quay ly tâm; tủ lạnh bảo quản mẫu; máy đo quang , kính hiển vi quang

học Olympus-BX51, Dụng cụ: bình tam giác 100, 500 mL, cốc thủy tinh 2L, phễu

chiết, ống đong 50 mL, 100, 500 mL, bình cầu cất quay, giấy lọc; ống nghiệm thủy

tinh 25mL

2.2.2. Hóa chất

Hóa chất dùng trong tổng hợp cao chiết thực vật bao gồm: nước cất, dung môi

methanol (MeOH), etanol (EthOH), hexan, etyl axetat (EtOAc),

Hóa chất dùng trong nuôi cấy tế bào VKL và tảo lục (môi trường CB của Shirai):

Ca (NO3)2. 4H2O; KNO3; MgSO4 .7H2O; 1-disodium glycerophosphate, FeCl3.6H2O;

MnCl2 .4H2O; ZnSO4 .7H2O; CoCl2.6H2O; Na2MoO4. 2H2O; disodium EDTA. 2H2O,

51

NH4H2PO4, KNO3, Ca(NO3)2, MgSO4 và các nguyên tố vi lượng H3BO3,

MnCl2·4H2O, ZnSO4·7H2O, CuSO4, H2MoO4, Fe-EDTA.

Hóa chất dùng trong môi trường nuôi cấy bèo (môi trường Hoagnland): KNO3;

KH2PO4; K2HPO4; K2SO4; MgSO4.7H2O; CaCl2; FeSO4.7H2O; H3BO3; MnCl2.4H2O;

ZnSO4.7H2O; (NH4)Mo7O24.4H2O; CuSO4.5H2O; CoCl2.6H2O.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, tạo cao chiết và tách chiết các hợp chất sạch

Xử lý mẫu, tạo dịch chiết tổng và chiết phân đoạn được thực hiện theo các

phương pháp đang áp dụng tại các nước tiên tiến trên thế giới nhằm đảm bảo thành

phần hoá học và hoạt tính sinh học của mẫu không bị biến đổi.

2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất sạch

- Sử dụng các phương pháp sắc kí: Sắc ký cột pha thường (silica gel thường),

pha đảo (RP18, YMC ODS), dùng nhựa trao đổi ion (Dianion HP20) hoặc hấp phụ

cỡ hạt (Sephadex LH20) với các hệ dung môi hữu cơ thông dụng như hexan,

diclometan, axeton, etyl axetat, metanol, nước, sắc kí lỏng điều chế prep. HPLC, sắc

kí bản mỏng với các chất hấp phụ thuận, pha đảo pha phù hợp của hãng Merck; hệ

dung môi rửa giải tăng dần độ phân cực (n-hexan, etyl axetat, methanol, nước….) để

tách các hợp chất từ cao phân đoạn đã lựa chọn.

- Xác định cấu trúc các chất tách chiết được bằng các phương pháp phổ hiện đại

bao gồm phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) (để xác định sự có mặt của các nhóm chức bằng

tần số dao động đặc trưng của các nhóm chức), tử ngoại (UV), phổ NMR một chiều

và hai chiều (1H, 13C-NMR, DEPT, HMBC,) để xác định số lượng H và C, số nhóm

H và C các bậc khác nhau và cách tương tác của các nhóm, phổ khối lượng HR- ESI-

MS để xác định khối lượng và công thức phân tử của các chất tinh sạch

2.3.3. Phương pháp đánh giá sinh trưởng của VKL, tảo lục Chlorella vulgaris và

thực vật phù du

2.3.3.1. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm tế bào:

M. aeruginosa và Ch. vulgaris thuộc nhóm tảo đơn bào, nên mật độ tế bào có

thể đếm trực tiếp ở buồng đếm Sedgewick- Rafter (20 mn × 50 nm × 1 nm). Số tế bào

được đếm trong 1ml dưới kính hiển vi quang học Olympus-BX51, Japan. Số lượng

tế bào được tính theo công thức như sau:

52

N0/mL= C × 1000 𝑚𝑚3

𝐿.𝐷.𝑊.𝑆

Trong đó:

C: số lượng tế bào đếm được

L: Chiều dài của mỗi thước

D: chiều sâu của thước

W: Chiều rộng của thước

S: số ô đếm

2.3.3.2. Xác định sinh trưởng thông qua đo mật độ quang [61]

M. aeruginosa, Ch. vulgaris được nuôi trong môi trường dinh dưỡng CB hoặc

Sorokin và Krauss. Mẫu nuôi cấy chủng M. aeruginosa có bổ sung hoạt chất tại các

nồng độ tương ứng được thu ở các thời điểm khảo sát (T0, T3, T6, T10). Mẫu được

đo mật độ quang ở bước sóng 680 nm, sử dụng máy đo quang phổ UV-Vis (Shimadzu,

Nhật Bản) với độ lặp 3 lần. Hiệu quả ức chế sinh trưởng IE (Inhibition efficiency)

được tính theo công thức:

IE (%) = 𝐎𝐃 (𝐕𝐨)−𝐎𝐃(𝐕𝐭)

𝐎𝐃(𝐕𝐨) × 100

Trong đó:

- OD (Vo): giá trị đo mật độ quang của mẫu đối chứng không bổ sung hoạt

chất (coi nồng độ các hoạt chất là 0 µg/mL)

- OD (Vt): giá trị đo mật độ quang của mẫu bổ sung hoạt chất với nồng độ

tương ứng

2.3.3.3. Xác định hàm lượng chlorophyll a (Lorenzen, 1965)

Một thể tích nhất định (V= 30 hoặc 50 mL) các dịch nuôi cấy VKL M.

aeruginosa, chủng tảo lục Ch. vulgaris được lọc qua giấy lọc GF/C với kích thước lỗ

1,2 µm (Whatman GF/C). Mẫu được chiết bằng 10 ml axeton (90%) trong 24 giờ trong

bóng tối tại nhiệt độ 5 0C. Sau đó được quay ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút tại

15 0C. Lấy 3mL dịch chiết sau khi li tâm đo quang tại bước sóng 665 và 750 nm trước

và sau khi bổ sung axit HCl 0,1M. Hàm lượng chlorophyll a được tính theo công thức

sau [1]:

53

Trước axit:

𝐴665𝑛𝑎 = (𝐴𝑏665

𝑛𝑎 - 𝑏𝑐665) – (𝐴𝑏750𝑛𝑎 -𝑏𝑐750)

Sau axit

𝐴665𝑎 = (𝐴𝑏665

𝑎 - 𝑏𝑐665) – (𝐴𝑏750𝑎 -𝑏𝑐750)

Chl a (µg.L-1) = 26,7 × (𝐴665

𝑛𝑎 − 𝐴665𝑎 )×𝑣

𝑉×𝑙

Trong đó:

Ana – hấp thụ tại bước sóng khi không có axit

Aa- hấp thụ tại bước sóng có axit

v- thể tích axton ngâm mẫu (10 mL)

V- thể tích lọc mẫu (L)

l: khoảng cách quang học của cuvet (1cm)

2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào VKL và Chlorella vulgaris [61]

Dịch nuôi cấy chủng M. aeruginosa và chủng Ch. vulgaris trong ngày T0, T3, T6

và T10 khi xử lý bằng cao chiết thực vật được lấy đi chụp ảnh TEM để đánh giá tác

động của hoạt chất lên tế bào. Đầu tiên dịch nuôi cấy được ly tâm (5000 vòng/phút)

trong thời gian 10 phút để thu lấy sinh khối. Mẫu các tế bào đó được xử lý trong dung

dịch 2,5% glutaraldehyte/cacodylate 0,1 M, pH= 7,2 - 7,4. Sau khi rửa bằng dung dịch

cacodylate 0,1M mẫu tế bào được cố định lại bằng dung dịch OsO4 1% trong

cacodylate 0,1M. Các tế bào được xử lý và qua quá trình kết tinh trong expoxy rein;

cắt lát siêu mỏng ở mức 50-100 nm và nhuộm bằng Uranyl Acetate; quan sát lát cắt

bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) JEOL 1010 ở các độ phóng đại khác nhau

để quan sát sự khác biệt vi cấu trúc giữa tế bào đối chứng (không có tác động của hoạt

chất) và tế bào chịu sự tác động của hoạt chất tại các thời điểm khác nhau.

2.3.5. Phương pháp đánh giá độc tố của cao chiết lên Daphnia magna [134]

Đánh giá độc cấp tính của cao chiết lên D. magna được thực hiện theo hướng

dẫn của APHA 2012. Trong mỗi bình chứa môi trường nuôi D. magna bổ sung vào

10 con D. magna non (< 24h tuổi) và đếm các con D. magna còn sống hoặc đã chết

dưới tác dụng của dịch chiết trong vòng 24 và 48 giờ.

54

2.3.6. Phương pháp đánh giá độc tố của cao chiết lên Lemna minor

Các phương pháp bao gồm [22]: Phương pháp đếm số cánh bèo: số cánh bèo

được đếm hằng ngày tại một thời điểm nhất định. Thống kê tất cả các cánh bèo được

nhìn thấy. Phương pháp quan sát hình thái cánh bèo: các cánh bèo L. minor được

chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số lại để so sánh tác động của các cao chiết sau 5

ngày với mẫu đối chứng. Phương pháp xác định trọng lượng tươi: bèo được nuôi

trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung cao chiết thực vật và thu mẫu tại các thời

điểm khảo sát (T0 và T5). Các cánh bèo được thấm khô nước bằng giấy ăn trước khi

cân. Sử dụng cân phân tích AND model GR, Nhật Bản. Phương pháp phân tích hàm

lượng sắc tố quang hợp chlorophyll a và b: theo phương pháp của

Wintermans & DeMots (1965)

2.3.7. Phương pháp phân tích chất lượng môi trường nước

Các thông số thủy lý bao gồm: Các thông số thủy lý bao gồm nhiệt độ nước,

độ pH, hàm lượng oxy hòa tan (DO), độ dẫn điện, độ muối, độ đục, hàm lượng chất

rắn hòa tan (TDS). Các thông số này được đo hằng ngày trực tiếp tại hiện trường bằng

máy đo nhanh WQC – 22 A (TOA, Nhật Bản) [17]

Các thông số thủy hóa: Các thông số thủy hóa bao gồm hàm lượng N-NO2-,

N-NO3-, N-NH4

+, photpho tổng, PO4-3 và Silic hòa tan được xác định trên các mẫu

nước sau 0, 3, 6 và 10 ngày đặt thí nghiệm và được xác định bằng phương pháp so

màu với máy đo quang UV-Vis 2450, Shimadzu – Nhật Bản. [17]

- Xác định NO2- (mg/L): mẫu sau khi tác dụng với axit sulfanilic và

naphthylamine ở môi trường pH = 2 –2,5 tạo thành hợp chất màu đỏ tím của

axit azobenzol naphthylamine sulfonic. Phép so màu được thực hiện tại bước

sóng λ = 540 nm

- Xác định NH4+ (mg/L): trong môi trường kiềm với sự có mặt của citrate trinatri

và natri hypoclorit, ion amoni phản ứng với phenol tạo phức màu xanh, đồng thời sử

dụng cyanua natri làm chất xúc tác của phản ứng. Phép so màu được thực hiện ở bước

sóng λ = 630 nm.

55

- Xác định Phốt pho tổng: chuyển hóa toàn bộ lượng photpho trong mẫu về dạng

photphat (PO43-) (mg/L): trong môi trường axit (H2SO4) với sự có mặt của K2S2O8.

Sau đó tiến hành xác định theo phương pháp xác định hàm lượng photphat dưới đây.

- Xác định PO43- (mg/L): Trong môi trường axit, các ion photphat PO4

3- phản

ứng với amoni molybdat tạo thành phức chất photphomolybdic. Phức chất này phản

ứng với axit ascorbic cho ra dung dịch màu xanh đặc trưng. Phức chất kali antimonyl

tactrat được cho thêm vào để thúc đẩy phản ứng và hạn chế ảnh hưởng của một số

chất hữu cơ trong quá trình phản ứng. Phép so màu được thực hiện tại bước sóng λ =

885 nm.

- Xác định Silic (mg/L): Các ion silicate SiO32- trong môi trường axit phản ứng

với molybdate tạo thành axit silico-molybdic có màu xanh. Ảnh hưởng của photphat

trong mẫu sẽ được loại bỏ khi cho thêm axit oxalic. Phép so màu được thực hiện ở

bước sóng λ = 885 nm

2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu

Các phần mềm như Excel 2013, OriginPro 8, GraphPad 6 và SPSS 23.0, được

sử dụng để xử lý số liệu thực nghiệm và đánh giá độ tin cậy với ý nghĩa xác xuất

thống kê p< 0,05. Tất cả các thực nghiệm được lặp lại 3, 4 hoặc 5 lần.

2.4. Mô tả thực nghiệm

2.4.1. Thực nghiệm xử lý mẫu thực vật, tạo cao chiết và phân lập chất sạch

Hình 2.9. Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật tươi

56

Hình 2.10. Chiết phân đoạn hexan từ

cao tổng

Hình 2.11. Chiết phân đoạn ethyl-

axetat từ cao tổng

Bước 1. Thu mẫu

Mẫu tươi Mần tưới Eupatorium fortunei (lá và thân) được thu hái tại Sóc Sơn,

Hà Nội vào tháng 03.2016. Mẫu được xác định tên khoa học bằng phân tích hình thái,

làm tiêu bản và lưu giữ tiêu bản tại Bộ môn Hóa công nghệ môi trường, Khoa hóa

học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.

Bước 2. Xử lý mẫu, phơi khô trong bóng râm, xay nhỏ

28,5 kg mẫu tươi lá, thân cây Mần tưới sau khi thu hái được sơ chế loại bỏ tạp

bẩn và các lá già rồi phơi khô trong bóng râm để tránh các hoạt chất bị phân huỷ bởi

ánh sáng và nhiệt độ. Để khô hoàn toàn, mẫu được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 45-

50ºC tại phòng Thí nghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Mẫu

sau đó được xay nhỏ thành bột mịn nhằm tăng khả năng tiếp xúc với dung môi, nâng

cao hiệu suất chiết hoạt chất. Thu được 3,56 kg bột khô mẫu Mần tưới.

Bước 3. Ngâm chiết mẫu thực vật trong các dung môi

Dung môi EtOH, MeOH và nước là các dung môi được sử dụng phổ biến trong

lĩnh vực hoá thực vật do có khả năng hoà tan nhiều lớp chất hoá học khác nhau. Lần

1 tạo cao chiết tổng, lựa chọn dung môi ethanol EtOH 96%. Đổ dung môi EtOH vào

bình tam giác có chứa bột mẫu thực vật sao cho ngập hết lớp mẫu bột (tỉ lệ 1kg bột

khô trong 4 lit dung môi). Đặt bình tam giác vào bể siêu âm trong vòng 30 phút ở

nhiệt độ 40 -50 ºC. Gạn hết lớp dung dịch có chứa hoạt chất sau khi được ngâm

57

chiết, sau đó bổ sung dung môi vào bình và lặp lại quá trình ngâm chiết 2 -3 lần

nữa.

Bước 4. Cất loại dung môi

Dịch chiết EtOH thu được từ quá trình ngâm chiết được gom lại, lọc bằng bộ lọc

hút Buchner loại tạp không tan sau đó được cất loại dung môi bằng máy cất quay chân

không (tại nhiệt độ T khoảng 550C, áp suất 70 kPa) thu được cao chiết tổng EtOH của

Mần tưới (0,326 kg) với hiệu suất chiết tương ứng là 9,17. Các bước 1, 2 và 3 tiến hành

trong quy mô phòng thí nghiệm, nhiệt độ ổn định 23- 25 0C. Lặp lại quy trình tương

tự với hai dung môi là metanol (MeOH) và dung môi nước (W) thu được cao chiết

tổng methanol, cao chiết tổng nước của Mần tưới tương ứng.

Hình 2.12. Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật trong quy mô phòng

thí nghiệm

Lý do tác giả luận án đã sử dụng cao chiết tổng etanol Mần tưới để triển khai

chiết phân đoạn và tách chiết các chất sạch sẽ được giải thích trong mục 3.2.

Bước 5. Chiết phân bố với n-hexan

Từ 5,2 kg mẫu Mần tưới khô thu được 476,5 gam cao chiết tổng etanol Mần

tưới. Cao chiết tổng EtOH Mần tưới sau khi đã loại hết dung môi EtOH được hoà lại

Ngâm chiết với dung môi EtOH, MeOH, W

Mẫu thực vật

Dịch chiết thô

Bột khô nguyên liệu

Xử lý mẫu, phơi khô trong bóng râm, xay nhỏ

Lọc, cất loại dung môi dưới áp suất giảm

Cao chiết EtOH, MeOH, W Lựa chọn cao chiết

tổng diệt VLK hiệu quả

58

vào trong nước với tỷ lệ 1 lít nước/100 g cao chiết. Dịch hoà tan có dạng huyền phù

được chuyển vào phễu chiết và chiết phân bố với n-hexan (tỷ lệ 1 lít hexan /2 lít dịch).

Do hexan là dung môi kém phân cực nên nó hoà tan các thành phần rất kém tan trong

nước. Lắc kỹ hỗn dịch sau đó để lắng cho nước và hexan tách lớp. Gạn lớp hexan ở

trên sau đó lặp lại quá trình chiết phân bố với hexan thêm 2 lần nữa. Gom dịch chiết

hexan lại và cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không thu được 90,51 gam

cao hexan với hiệu suất 18,97 %. Vì dung môi n-hexan rất độc với sinh vật do đó

nhóm nghiên cứu không tiến hành thử độc tính của cao chiết phân đoạn hexan lên

sinh trưởng M. aeruginosa.

Bước 6. Chiết phân bố với etyl axetat (EtOAc)

Lớp nước còn lại sau khi chiết phân bố với hexan được chiết tiếp bằng dung môi

EtOAc. Quá trình được tiến hành tương tự Bước 5, dịch chiết EtOAc gom lại được

cất loại dung môi thu được cao EtOAc có khối lượng là 76,70 gam đạt hiệu suất

16,10%. Cao này được bảo quản ở nhiệt độ -5 ºC cho đến khi sử dụng. Thời gian bảo

quản có thể từ 2-6 tháng.

Bước 7. Cất loại nước tạo cao nước

Dịch nước còn lại sau khi chiết EtOAc được cô đến khô bằng máy cất quay chân

không (tại nhiệt độ khoảng 60 0C, áp suất dao động 80 kPa) thu được 280,82 gam cao

chiết phân đoạn nước (hiệu suất là 60,27 %). Cao này được bảo quản ở nhiệt độ -5 ºC

cho đến khi sử dụng.

Hình 2.13. Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật trong quy mô phòng

thí nghiệm

Cao n- hexan

- Hoà cao chiết với nước,

- Chiết phân bố với hexane

Cao chiết tổng EtOH

Cao EtOAc Cao H2O

Lớp nước ở dưới

chiết phân bố với

EtOAc

59

Kế thừa kết quả của những nghiên cứu trước, tác giả luận án đặt ra nhiệm vụ

mới là tìm và lựa chọn dung môi phù hợp để nâng cao hoạt tính diệt tảo của cao chiết

tổng, tiến hành tạo cao chiết phân đoạn và tách chiết các hợp chất sạch.

Quy trình phân lập các chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl axetate Mần tưới

Từ 5,20 kg bột khô Mần tưới thu được 476,50 g cao chiết tổng etanol, tiếp tục

chiết phân đoạn được 76,72g cặn chiết etyl axetat. Cao chiết phân đoạn etyl axetat

tiến hành sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải gradient (100%

dicholorometan → 100% axeton v/v) thu được 7 phân đoạn EfD1.1 → EfD1.7. Tiến

hành sắc ký phân đoạn EfD1.4 trên cột silicagel với hệ dung môi rửa giải

dichlorometan/metanol (10/1 v/v) thu được hợp chất sạch EfD1.8 (100,0 mg) và 3

phân đoạn nhỏ EfD1.9, EfD1.10 và EfD1.11. Từ phân đoạn EfD1.9 tiến hành sắc

ký trên cột silicagel cùng với hệ dung môi rửa giải ethyl axetat/metanol (50/1 v/v)

thu được phân đoạn EfD5.3, tiến hành sắc ký EfD5.3 trên cột silica gel cùng với hệ

dung môi rửa giải dichlorometan/metanol (15/1 v/v) thu được phân đoạn EfD7.3,

phân đoạn EfD9.1 thu được khi sắc ký phân đoạn EfD7.3 trên cột silicagel với hệ

dung môi rửa giải n-hexan/etyl axetat/metanol (5/50/1 v/v). Từ phân đoạn EfD9.1

tiếp tục sắc ký trên cột pha đảo RP18 cùng hệ dung môi metanol/nước (1/1 v/v) thu

được hai phân đoạn EfD9.4 và EfD9.2, từ hai phân đoạn này tiếp tục sắc ký trên hai

cột sắc ký và dung môi rửa giải phù hợp thu được hai hợp chất sạch tương ứng là

EfD10.1 (3,5 mg) và EfD10.3 (3,0 mg). Từ phân đoạn EfD1.10 tinh chế bằng cột

sắc ký silicagel thu được chất sạch EfD14.1 (16,0 mg). Phân đoạn EfD1.11 được

tiến hành sắc ký trên các cột silica gel, cột pha đảo và hệ dung môi phù hợp thu

được hợp chất sạch tương ứng EfD5.1 (55,0 mg), EfD4.8 (1,2 mg) và EfD4.7 (2,0

mg).

60

Hình 2.14. Quy trình tách chiết các hợp chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl

axetat Mần tưới

61

EfD4.7. Chất rắn màu trắng; []D24 = +0,2 (c 0.1, MeOH). HR-ESI-MS (positive):

m/z 221,0783 [M + Na]+ (tính toán lý thuyết 221,0790 cho công thức C10H14NaO4).

1H NMR (500 MHz, CD3OD) δH (m, J in Hz): 6,79 (1H, d, 2.0); 7,20 (1H, d, 7,5);

6,81 (1H, dd, 7,5; 2,0); 4,52 (2H, s); 3,76 (1H, d, 11.0); 13C NMR (125 MHz,

CD3OD): δC 140,1 (C-1); 116,3 (C-2); 156,8 (C-3); 133.5 (C-4); 129,5 (C-5); 120,5

(C-6); 64,9 (C-7); 76,9 (C-8); 72,4 (C-9); 26,1 (C-10).

EfD4.8. Chất rắn màu trắng. HR-ESI-MS (positive): m/z181.0864 [M + H]+ (tính toán

lý thuyết 181,0865 cho công thức C10H13O2). 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δH (m, J

in Hz) 6.82 (1H, d, 2.0); 7.12 (1H, d, 7.5); 6.80 (1H, dd, 7.5, 2.0); 4.55 (2H, s); 4.39

(2H, s); 5.41 (1H, d, 2.0) và 5.20 (1H, d, 2.0) và 13C NMR (125 MHz, CD3OD); δC

143.6 (C-1); 115.1 (C-2); 155.8 (C-3); 127.8 (C-4); 131.1 (C-5); 119.0 (C-6); 64.8

(C-7); 149.3 (C-8); 65.8 (C-9); 114.8 (C-10);

EfD5.1. Hợp chất EfD5.1 thu được dưới dạng chất rắn màu trắng. 1H NMR (500

MHz, CD3OD): H 2,16 (3H, s, H-7); 3,74 (4H, s, H-9, 10); 6,57 (2H, br d, H-2, 6);

6,79 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5).

EfD1.8. Hợp chất EfD1.8 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. 1H NMR (500 MHz,

CD3OD): H 6,57 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-8), 6,83 (1H, br d, J = 1,0; 6,0; 8,5 Hz, H-

5), 6,86 (1H, d, J = 1,0; 7,5 Hz, H-3), 7,21 (1H, br d, J = 1,5; 6,0; 7,5 Hz, H-4), 7,49

(1H, br d, J = 1,5; 8,5 Hz, H-6), 7,99 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-7). 13C NMR (125 MHz,

CD3OD): C 122,6 (C-1), 158,1 (C-2), 118,6 (C-3), 132,5 (C-4), 120,7 (C-5), 129,9

(C-6), 142,4 (C-7), 116,9 (C-8), 171,3 (C-9).

EfD10.1. Hợp chất EfD10.1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. 1H NMR (500

MHz, CD3OD): H 2,74 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-7a); 3,71 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-7b);

7,04 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, 6); 7,33 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, 5), 9,70 (1H, s, -CHO).

13C NMR (125 MHz, CD3OD): C 147,2 (C-1); 116,1 (C-2, 6), 130,8 (C-3, 5); 141,7

(C-4), 39,3 (C-7), 64,5 (C-8), 193,0 (-CHO).

EfD10.3. Hợp chất EfD10.3 thu được dưới dạng chất bột màu vàng. 1H NMR (500

MHz, CD3OD): H 6,20 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6); 6,42 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8); 6,93

(2H, d, J = 8,0 Hz, H-3ʹ, 5ʹ); 8,12 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2ʹ, 6ʹ).

62

EfD14.1. Hợp chất EfD14.1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. 1H NMR (500

MHz, CD3OD): H 2,00 (3H, s, CH3CO-); 2,25 (3H, s, H-7), 3,85 (1H, d, J = 11,5

Hz, Ha-9); 3,90 (1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-9); 4,46 (1H, d, J = 11,5 Hz, Ha-10); 4,54

(1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-10); 6.61 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-2), 6,66 (1H, d, J = 1,0; 8,0

Hz, H-6); 7,19 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5).

2.4.2. Thực nghiệm nghiên cứu độc tính diệt VKL độc và tảo lục của các cao chiết

Thí nghiệm đánh giá tác động ức chế của cao chiết Mần tưới lên sinh trưởng

của M. aeruginosa và Ch. vulgaris quy mô phòng thí nghiệm được tiến hành tại Phòng

Thủy Sinh học môi trường, Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn Lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam. Đầu tiên các chủng M. aeruginosa TC3 và Ch. vulgaris được

nuôi và nhân tăng sinh khối theo phương pháp của Shirai (1989) trong các bình tam

giác (250 mL) chứa 150 mL môi trường CB hoặc môi trường Sorokin và Krauss với

nhiệt độ ổn định 250C, ánh sáng huỳnh quang cường độ 1000 lux chu kỳ 12 giờ

sáng/12 giờ tối.

Hình 2.15. Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các cao chiết từ cây Mần tưới lên

sinh trưởng M. aeruginosa và Ch. vulgaris

Để đánh giá tác động ức chế của cao chiết cây Mần tưới lên M. aeruginosa

hoặc Ch. vulgaris, các thí nghiệm được bố trí như sau: đầu tiên các cao chiết được

hòa tan vào dung môi DMSO hoặc dung môi etanol tạo nồng độ gốc ban đầu 10

mg/mL, thể tích dung môi DMSO và etanol sử dụng đảm bảo nồng độ dung môi

trong môi trường nuôi nghiên cứu nuôi VKL hoặc Ch.vulgaris nhỏ hơn 1% về thể

63

tích sẽ không gây độc của cho các loài [135]. Sau đó các mẫu cao chiết được bổ

sung vào bình Erlen dung tích 250 mL có chứa các tế bào VKL M. aeruginosa hoặc

Ch. vulgaris (với mật độ tế bào ban đầu ≈ 3 × 105 TB/mL) theo các nồng độ nghiên

cứu tương ứng từ 50 đến 500 µg/mL, đồng thời theo dõi song song mẫu đối chứng

(mẫu chứa VKL M. aeruginosa hoặc Ch. vulgaris nuôi trong môi trường dinh dưỡng

cùng điều kiện nhưng không bổ sung cao chiết) và hợp chất CuSO4 nồng độ 5 µg/mL

–mẫu đối chứng dương. Các công thức thí nghiệm được bố trí ba lần lặp lại, theo

dõi liên tục trong 10 ngày, lấy mẫu theo chu kì sau: T0 (ngày đầu tiên), T3 (sau 3

ngày), T6 (sau sáu ngày) và T10 (sau 10 ngày). Mẫu sau khi thu, mẫu được xử lý

và đánh giá bằng các phương pháp khác nhau như đo mật độ quang, phân tích hàm

lượng chlorophyll a và đếm mật độ tế bào. Từ thực nghiệm sẽ lựa chọn ra dung môi

phù hợp, xây dựng quy trình để tạo cao chiết hiệu quả với số lượng lớn phục vụ cho

các bước nghiên cứu tiếp theo.

Xác định hoạt tính diệt VKL độc M. aeruginosa của các chất sạch phân lập từ

cao chiết Mần tưới được triển khai trong các lọ thủy tinh thể tích 25 mL. Các tế bào

được nuôi trong môi trường dinh dưỡng CB (với mật độ tế bào ban đầu ≈ 14 × 105

TB/mL) có bổ sung thêm các chất sạch theo dải nồng độ từ 1, 10, 20 và 50 µg/mL.

Tác dụng của chất sạch lên sinh trưởng của VKL độc sau 72 giờ phơi nhiễm được

xác định thông qua đo mật độ quang ở bước sóng 680 nm trên máy đọc đĩa 96 giếng

và phương pháp đếm mật độ tế bào tại thời điểm bắt đầu (T0) và sau 72 giờ (T72).

64

Hình 2.16. Thực nghiệm đánh giá hoạt tính diệt VKL độc của các chất sạch tách

chiết từ cây Mần tưới

2.4.3. Thực nghiệm đánh giá tính an toàn của cao chiết

2.4.3.1. Đánh giá độc tính của cao chiết Mần tưới lên giáp xác (Daphnia magna)

Đánh giá độc tính của cao chiết tổng etanol và cao chiết phân đoạn etyl axetat

từ cây Mần tưới lên động vật Giáp xác (Daphnia magna) được tiến hành tại Khoa

Môi trường và Tài nguyên thuộc Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh. Loài D. magna

được cung cấp bởi công ty Microbiotests Inc (Bỉ) và nuôi trong môi trường COMBO

(Kilham,1990) ở điều kiện nhiệt độ ổn định 22 ± 0.5 oC với cường độ chiếu sáng 800

lux và chu kì 16 giờ sáng: 8 giờ tối. Môi trường và thức ăn cho Daphnia là Ch.

vulgaris được bổ sung và thay mới định kì 2 ngày một lần cho tới khi đủ số lượng

cho nghiên cứu. 10 cá thể Daphnia 1 ngày tuổi được lựa chọn ngẫu nhiên. Một lô đối

chứng (không cho hoạt chất CuSO4 hoặc cao chiết vào) được tiến hành song song để

so sánh. Đối với mỗi hoạt chất (CuSO4 hoặc cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn Mần

tưới) tác giả bố trí 1 lô đối chứng (không cho CuSO4 hay cao chiết vào). Mỗi công

thức thực nghiệm được lặp lại 4 lần (n = 4) kí hiệu A1 – A4.

Hình 2.17. Thực nghiệm đánh giá độc tố của cao chiết Mần tưới lên giáp xác D. magna

65

Trong mỗi bình chứa 40 mL môi trường nuôi D. magna bổ sung vào 10 con D.

magna non (< 24h tuổi). Các giá trị pH và DO được đo trong từng lô thí nghiệm khi bắt

đầu và kết thúc thí nghiệm để đảm bảo 2 yếu tố này không ảnh hưởng xấu lên sinh vật.

Độc tính của cao chiết đến D. magna được tính bằng tỷ lệ số lượng con sống/con chết

(hoặc con chết/tổng số con) trong sau 24 giờ và 48 giờ tác động. Kết quả thu được tính

toán dựa vào phần mềm Probit – SPSS 23 để ước tính giá trị LC50.

2.4.3.2. Đánh giá độc tính của cao chiết Mần tưới lên bèo tấm (Lemna minor)

Đánh giá độc tính của cao chiết Mần tưới lên bèo tấm (Lemna minor) được tiến

hành tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Bèo tấm được thu nhận từ

một số thủy vực tự nhiên tại Cổ Nhuế, Từ Liêm, Hà Nội, sau đó được đưa về phòng

thí nghiệm để lựa chọn những cây bèo khỏe mạnh, kích thước và số lá đồng đều nhau.

Đầu tiên các cây bèo được nuôi trong môi trường dinh dưỡng Hoagnlan [132] (ISO

20079, 2005), điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm ổn định 25 ± 0,5 0C và cường độ

chiếu sáng là 1000 lux với chu kỳ 16 giờ sáng: 8 giờ tối. Môi trường nuôi cấy được

điều chỉnh đến pH 6,5 trước khi tiến hành hấp thanh trùng. Cần 3-4 tuần nuôi cấy

trong điều kiện như trên để bèo thích nghi với môi trường trong phòng thí nghiệm.

Hình 2.18. Thực nghiệm nghiên cứu mẫu bèo Lemna minor dưới ảnh hưởng của

cao chiết Mần tưới

Lựa chọn từ đó 6 cá thể bèo 3 cánh, cây bèo khỏe mạnh và đồng đều nhau về

kích thước cho vào cốc thủy tinh 250 mL có chứa 150 mL dung dịch Hoagnlan, sau

đó bổ sung cao chiết theo nồng độ nghiên cứu để đánh giá độc tính. Mỗi công thức

66

thí nghiệm được lặp lại 5 lần (n=5) và theo dõi liên tục trong 5 ngày. Bên cạnh các

mẫu thực nghiệm bổ sung cao chiết, bố trí song song mẫu đồng sunphat (CuSO4)

nồng độ 5 µg/mL và mẫu đối chứng chỉ chứa môi trường dinh dưỡng và đối tượng

bèo nghiên cứu.

Để đánh giá độc tính của cao chiết thực vật lên bèo, số cánh bèo được đếm hằng

ngày từ ngày T0 (ngày đầu) đến T5 (ngày cuối), đồng thời so sánh sự thay đổi sinh

khối tươi của bèo tại thời điểm T0 và T5, so sánh sự khác nhau về hình thái cánh bèo,

hàm lượng chlorophyll a và chlorophyll b của mẫu thực nghiệm và mẫu đối chứng

tại ngày T5.

2.4.4. Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao chiết đối với mẫu nước hồ tự nhiên

Các mẫu nước hồ (Hồ Hoàn Kiếm và Hồ Láng) được lấy vào tháng 3 năm

2017 và tháng 9 năm 2017 và được chuyển về phòng thí nghiệm ngay trước khi

tiến hành thực nghiệm. Tại thời điểm lấy mẫu, nhiệt độ ngoài trời dao động 27-28

0C, mặt nước hồ nổi váng xanh. Tiến hành soi mẫu dưới kính hiển vi điện tử huỳnh

quang BX51 thấy chủng Microcystis chiếm ưu thế rõ rệt. Sau khi lấy mẫu về, nước

hồ được lọc qua lưới để loại bỏ rác và các tạp chất lơ lửng sau đó được chia đều

vào các bình thủy tinh mỗi bình 5L nước hồ đối với quy mô trong phòng thí nghiệm

hoặc 300 L vào thùng nhựa với quy mô ngoài trời. Bổ sung các cao chiết và hoạt

chất đồng vào bình hoặc thùng nhựa theo nồng độ nghiên cứu, sau đó đặt bình

trong điều kiện chiếu sáng tự nhiên, nhiệt độ phòng và thời gian quan sát 10 ngày

liên tục. Các công thức thí nghiệm được nghiên cứu bao gồm: Mẫu Control (mẫu

đối chứng chỉ có nước hồ), mẫu CuSO4 (mẫu nước hồ được bổ sung CuSO4 tại

nồng độ 5µg/mL) và mẫu cao chiết tại nồng độ 500 mg/L. Mỗi công thức thí

nghiệm được lặp lại 3 lần, theo dõi trong 10 ngày liên tục. Khuấy trộn ngày 3 lần

đối với quy mô phòng thí nghiệm và không khuấy trộn mẫu đối với quy mô ngoài

trời. Các thông số thủy lý như nhiệt độ, pH, DO, độ mặn, độ dẫn điện được đo

hằng ngày tại một thời điểm nhất định. Các thông số thủy hóa (NH4-N, NO2-N, P-

tổng, PO43-, Silic hòa tan) được phân tích tại các ngày T0, T1, T3, T6 và T10 tại

Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam. Phân tích hàm lượng chlorophyll a và đếm mật độ tế bào đánh giá ảnh

hưởng của cao chiết được thực hiện vào các ngày T0, T3, T6 và T10 tại Viện Công

67

nghệ môi trường. Ở quy mô phòng thí nghiệm, các mẫu được bố trí tại Phòng Thủy

sinh học môi trường, Viện Công nghệ môi trường; quy mô ngoài trời tại Vườn

Thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội với các mẫu được

đặt trong nhà kính có mái che để loại bỏ ảnh hưởng của mưa dẫn đến pha loãng

nồng độ.

Hình 2.19. Thực nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới lên mẫu

nước hồ tự nhiên quy mô phòng thí nghiệm

Hình 2.20. Thực nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới lên mẫu

nước hồ tự nhiên quy mô ngoài trời

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

68

3.1. Công thức cấu tạo các chất sạch được tách chiết từ cây Mần tưới Eupatorium

fortunei

Tại Việt Nam, Mần tưới cùng nhiều loài thực vật khác đã được khảo sát ảnh

hưởng ức chế lên sinh trưởng của M. aeruginosa và Ch. vulgaris [2, 3]. Kết quả

thực nghiệm cho thấy những ưu điểm nổi bật của cao chiết tổng Mần tưới so với

các loài thực vật khác đó là khả năng ức chế chọn lọc lên VKL độc M. aeruginosa

và tảo lục Ch. vulgaris. Hiệu suất tổng hợp cao chiết tổng methanol, cao chiết tổng

nước của Mần tưới tương ứng được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1. Hiệu suất tạo cao chiết tổng trong các dung môi khác nhau

Dung Môi Hiệu suất tạo cao chiết tổng từ Mần tưới

(g cao chiết/100g mẫu thực vật khô)

Etanol 9,17

Metanol 12,75

W (Nước) 7,75

Lý do tác giả luận án đã sử dụng cao chiết tổng etanol Mần tưới để triển khai

chiết phân đoạn và tách chiết các chất sạch sẽ được giải thích trong mục 3.2.

Tiến hành chiết phân bố tạo với dung môi n-hexan, etyl axetat và nước thu

được cao chiết phân đoạn tương ứng theo hiệu suất được trình bày tại bảng 3.2.

Bảng 3.2. Hiệu suất tạo cao chiết phân đoạn từ cao chiết tổng ethanol Mần tưới

Cao chiết phân đoạn Hiệu suât (%) từ cao chiết tổng

etanol Mần tưới

Cao chiết phân đoạn n-hexan 18,97

Cao chiết phân đoạn etyl axetate 16,10

Cao chiết phân đoạn nước (W) 60,27

69

Quy trình phân lập các chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl axetate Mần tưới

Hiệu suất phân lập các chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl acetat Mần tưới

được trình bày trong bảng 3.3.

Bảng 3.3. Hiệu suất tách chiết các chất sạch từ Mần tưới

STT Hợp chất Tỉ lệ mg chất sạch/100 g cao chiết

phân đoạn etyl axetat Mần tưới

1. EfD5.1 71,69

2. EfD14.1 20,80

3. EfD1.8 13,34

4. EfD10.1 4,56

5. EfD10.3 3,91

6. EfD4.7 2,61

7. EfD4.8 1,56

Tác giả đã tách chiết được 7 chất sạch được kí hiệu EfD4.7; EfD4.8, EfD10.1;

EfD1.8; EfD14.1, EfD5.1 và EfD10.3. Sau đây là kết quả xác định công thức cấu tạo

và các đặc trưng khác liên quan của 7 chất sạch nói trên.

3.1.1. Hợp chất 7,8,9-trihydroxythymol (EfD4.7)

Hình 3.1. Cấu trúc hoá học và các tương tác HMBC chính của chất EfD4.7

Công thức phân tử C10H14O4 của EfD4.7 được gợi ý là trên cơ sở sự xuất hiện

pic ion giả phân tử tại m/z 221,0783 [M + Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức

phân tử C10H14NaO4, 221,0790) trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS.

70

Hình 3.2. Phổ HR-ESI-MS của chất EfD4.7

Trên phổ 1H NMR của hợp chất EfD4.7 xuất hiện tín hiệu đặc trưng của

vòng thơm dạng ABX [δH 6,79 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 7,20 (1H, d, J = 7,5 Hz,

H-5), and 6,81 (1H, dd, J = 7,5, 2,0 Hz, H-6)], một nhóm methyl singlet ở C-10

tại δH 1,58 (3H, s, H-10). Ngoài ra còn có các tín hiệu của proton ở vùng trường

trung bình δH 4,57; 3,74 và 3,65.

Hình 3.3. Phổ 1H NMR của chất EfD4.7

71

Phân tích dữ liệu phổ 13C NMR kết hợp với phổ HSQC nhận thấy có sự xuất

hiện tín hiệu cộng hưởng của 10 cacbon, bao gồm 1 nhóm methyl (δC 26,1, C-

10), 2 nhóm oxymethylene tại δC 64,9 (C-7) và 72,4 (C-9), 1 cacbon bậc 3 mang

nhóm hydroxy (δC 76,9, C-8) và một vòng thơm thế ABX [δC 140,1 (C-1); 116,3

(C-2); 156,8 (C-3); 133,5 (C-4); 129,5 (C-5); 120,7 (C-6)].

Hình 3.4. Phổ 13C NMR của chất EfD4.7

72

Hình 3.5. Phổ HSQC của chất EfD4.7

73

Hình 3.6. Phổ HMBC của chất EfD4.7

74

Các dữ liệu trên khẳng định hợp chất EfD4.7 có dạng khung thymol khá phổ

biến trong chi Eupatorium [123]. Thực tế các số liệu 1H và 13C-NMR của EfD4.7 rất

tương đồng với số liệu đã công bố của hợp chất 8,9-dihydroxythymol [136], ngoại

trừ sự xuất hiện của nhóm hydroxymethyl thay vì nhóm methyl tại C-7. Phân tích trên

phổ hai chiều HMBC cũng đã chỉ ra các tương tác từ H-7 (δH 4,52) đến C-1, C-2 và

C-6, từ H-9 (δH 3,76 và 3,65) đến C-4, C-8 và C-10, và từ H-10 (δH 1,58) đến C-4, C-

8 và C-9. Như vậy có thể kết luận hợp chất EfD4.7 là 7,8,9-trihydroxythymol, một

hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập.

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hai chất EfD4.7 và EfD4.8:

STT EfD4.7

[CD3OD]

EfD4.8

[CD3OD]

δH (m, J in Hz) δC δH (m, J in Hz) δC

1 140,1 - 143,6

2 6,79 (1H, d; 2,0) 116,3 6,82 (1H, d; 2,0) 115,1

3 - 156,8 - 155,8

4 - 133,5 - 127,8

5 7,20 (1H, d, 7.5) 129,5 7,12 (1H, d; 7,5) 131,1

6 6,81 (1H, dd; 7,5; 2,0) 120,5 6,80 (1H, dd; 7,5; 2,0) 119,0

7 4,52 (2H, s) 64,9 4,55 (2H, s) 64,8

8 - 76,9 - 149,3

9 3,76 (1H, d; 11,0)

3,65 (1H, d; 11,0)

72,4 4,39 (2H, s) 65,8

10 1,58 (3H, s) 26,1 5,41 (1H, d; 2,0)

5,20 (1H, d; 2,0)

114,8

75

3.1.2. Hợp chất 8,10-didehydro-7,9-dihydroxythymol(EfD4.8)

Hình 3.7. Cấu trúc hoá học và các tương tác HMBC chính của chất EfD 4.8

Phổ 1H và 13C-NMR của EfD4.8 rất tương đồng với phổ của EfD4.7 ngoại

trừ sự xuất hiện của 1 nhóm methylene ngoại vòng (δC/δH 114,8/5,41 and 5,20)

thay vì nhóm methyl C-10 như chất EfD4.7. Điều này cũng được khằng định dựa

vào số liệu phổ khối lượng phân giải cao. Công thức phân tử C10H13O2 của EfD4.8

được xác định dựa trên pic ion giả phân tử tại m/z 181.0864 [M + H]+ (tính toán

lý thuyết cho công thức phân tử C10H14O2,181.0865) trên phổ khối lượng phân giải

cao HR-ESI-MS. Các tương tác HMBC (Hình 3.12) cũng khẳng định cấu trúc của

hợp chất EfD4.8

Hình.3.8. Phổ HR-ESI-MS của chất EfD4.8

76

Hình.3.9. Phổ 1H NMR của chất EfD4.8

Hình 3.10. Phổ 13C NMR của chất EfD4.8

77

Hình 3.11. Phổ HSQC của chất EfD4.8

78

Hình 3.12. Phổ HMBC của chất EfD4.8

79

3.1.3. Hợp chất 8,9,10- Trihydroxythymol (EfD5.1)

Hình 3.13. Cấu trúc hợp chất EfD5.1

Phổ 1H NMR trên vùng trường yếu xuất hiện 3 tín hiệu proton của vòng thơm

tại H 6,57 (2H, br d, H-2, 6); 6,79 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5), dịch về vùng trường

mạnh xuất hiện tín hiệu chập của hai nhóm methylene tại H 3,74 (4H, s, H-9, 10), và

còn lại là một tín hiệu của nhóm methyl tại H 2,16 (3H, s, H-7).

Bảng 3.5. Số liệu phổ 1H NMR (H và J) của EfD 10.1 và của hợp chất 8,9,10-

Trihydroxythymol đã được công bố trong tài liệu tham khảo [137]

Proton EfD 5.1

[CD3OD]

8,9,10- Trihydroxythymol

[CD3OD] [137]

H J (Hz) H J (Hz)

H2 (1H, d) 6,57 - 6,59 1,7

H5 (1H, d) 6,79 7,5 7,17 7,8

H6 (2H, br d) 6,57 - 6,64 (1H,dd) 7,8 và 1,7

H7 (3H, s) 2,16 - 2,20 -

H9 (4H, s) 3,74 - 3,88 (1H, s) 12,0

H10 (4H, s) 3,74 - 3,85 (1H, s) 12,0

Qua những phân tích trên, so sánh với giá trị H và Rf của hợp chất 8,9,10-

trihydroxythymol đã công bố (bảng 3.5) kết luận được hợp chất EfD5.1 là 8,9,10-

trihydroxythymol.

80

3.1.4. Hợp chất o-Coumaric acid (EfD1.8)

Hình 3.14. Cấu trúc hợp chất EfD1.8

Hợp chất EfD1.8 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H NMR trên vùng

trường yếu xuất hiện 6 tín hiệu proton sp2, trong đó có 4 tín hiệu proton của vòng thơm

tại H 6,83 (1H, br d, H-5); 6,86 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-3); 7,21 (1H, br d, H-4) và 7,49

(1H, br d, H-6) và hai tín hiệu proton của liên kết đôi tại H 6,57 (1H, d, J = 16,5 Hz,

H-8); 7,99 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-7). Phổ 13C NMR kết hợp phổ DEPT cho thấy hợp

chất chứa 9 tín hiệu các nguyên tử cacbon trong đó bao gồm 6 nhóm methine và 3

nguyên tử carbon không chứa hydro. Sáu tín hiệu của vòng thơm tại C 122,6 (C-1);

158,1 (C-2); 118,6 (C-3); 132,5 (C-4); 120,7 (C-5) và 129,9 (C-6). Hai tín hiệu của liên

kết đôi tại C 142,4 (C-7)/116,9 (C-8) và một tín hiệu của nhóm carboxylic tại C 171,3

(C-9). Tại liên kết đôi, hai proton có hằng số tương tác khá cao (J = 16,5 Hz) nên liên

kết đôi này có cấu hình trans.

Bảng 3.6. Số liệu phổ 13C NMR của hợp chất axit o- coumaric

STT

Giá trị δ (ppm)

Tài liệu tham khảo [138]

[DMSO]

Thực nghiệm

[CD3OD]

C1 120,97 122,66

C2 156,64 158,16

C3 118,30 118,63

C4 131,47 132,53

C5 119,45 120,76

C6 128,72 129,98

C7 168,13 142,49

C8 116,18 116,99

C9 139,65 171,30

81

Bảng 3.7. Số liệu phổ 1H NMR của hợp chất axit o- coumaric

STT

Giá trị δ (ppm)

Tài liệu tham khảo

[DMSO] [138]

Thực nghiệm

[CD3OD]

H1 - -

H2 - -

H3 6,90 6,86

H4 7,21 7,21

H5 6,82 6,85

H6 7,56 7,49

H7 6,51 6,57

H8 7,82 7,99

Với những phân tích trên và so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố xác

định được hợp chất EfD1.8 là o-coumaric axit [138, 139]. Axit o- coumaric được

tìm thấy ở rất nhiều các loài thực vật khác như Eupatorium adenophorum, Mikania

laevigata Sch.Bip. ex Baker (Compositae), Mikania glomerata Spreng, Medicago

sativa L. (Leguminosae), Caucalis platycarpos L. (Apiaceae) và Urtica urens,

Mikania laevigata [140, 141]. Những nghiên cứu trước đã chứng minh rằng axit o

-coumaric có hoạt tính sinh học khác nhau như tính kháng khuẩn, chống đông máu,

chống oxy hóa, chống ung thư và còn ức chế sự nảy mầm của hạt [142]

3.1.5. Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)benzaldehyde (EfD10.1)

Hình 3.15. Cấu trúc hợp chất EfD10.1

Hợp chất EfD10.1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H NMR

vùng trường rất yếu xuất hiện một tín hiệu đặc trưng của nhóm aldehyde tại H

9,70 (1H, s, -CHO), trên vùng trường yếu là xuất hiện hai tín hiệu chập của proton

thơm (aromatic) tại H 7,04 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, 6); 7,33 (2H, d, J = 8,5 Hz,

H-3, 5). Vùng trường mạnh hơn xuất hiện hai tín hiệu hai nhóm methylene tại H

82

2,74 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-7a) và 3,71 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-7b), tín hiệu có giá

trị cao hơn giá trị của nhóm methylene bình thường tại H 3,71 do nhóm này liên

kết trực tiếp với nguyên tử hút điện mạnh oxy. Phổ 13C-NMR vùng trường mạnh

xuất hiện tín hiệu của nhóm methylene tại C 39,3 (C-7), dịch về phía vùng

trường yếu hơn cũng xuất hiện tín hiệu của nhóm methylene nhưng có giá trị cao

hơn nhóm methylene thông thường do nhóm này liên kết trực tiếp với nguyên tử

mang độ âm điện lớn là oxy tại C 64.5 (C-8). Trên phổ 13C-NMR cũng xuất hiện

4 tín hiệu của 6 cacbon hệ vòng thơm tại C 147,2 (C-1); 116,1 (C-2, 6); 130,8

(C-3, 5); 141,7 (C-4). Ngoài ra còn tín hiệu của nhóm aldehyde tại C 193,0. Với

những phân tích dữ liệu phổ trên và so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố

xác định được hợp chất EfD10.1 là 4-(2-hydroxyethyl) benzaldehyde [143].

3.1.6. Hợp chất kaempferol (EfD10.3)

Hình 3.16. Cấu trúc hợp chất EfD10.3

Hợp chất EfD10.3 thu được dưới dạng chất bột màu vàng. Phổ 1H NMR

trên vùng trường yếu xuất hiện 2 cặp tín hiệu proton chập của vòng thơm hệ

A2B2 tại H 6,93 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3ʹ, 5ʹ); 8,12 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2ʹ, 6ʹ),

dịch về vùng trường mạnh xuất hiện 2 tín hiệu proton thơm khác trong vòng thơm

ở vị trí meta với nhau tại H 6,20 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6); 6,42 (1H, d, J = 1,5

Hz, H-8).

83

Bảng 3.8. Số liệu phổ 1H NMR (H và J) của EfD 10.3 và của kaempferol đã được

công bố

EfD 10.3

[CD3OD]

Kaempferol

[CD3OD][137]

H (ppm) J(Hz) H (ppm) J (Hz)

H2’-6’ 8,12 (2H, d) 8,0 8,04 9,0

H3’-5’ 6,93 (2H, d) 8,0 6,92 9,0

H6 6,20 (1H, d) 1,5 6,19 1,8

H8 6,42 (1H, d) 1,5 6,44 1,8

Với những phân tích dữ liệu phổ trên và so sánh với tài liệu tham khảo đã

công bố của hợp chất kaempferol xác định được hợp chất EfD10.3 là

kaempferol [144]. Hợp chất này được tìm thấy từ các nguồn thực vật khác nhau

ví dụ như từ cây P. vittata L hoặc từ lá cây Urena lobata L thuộc họ Malvaceae.

Từ lâu những loài cây chứa hàm lượng cao kaempferol luôn được sử dụng như

những loại thuốc dân gian chữa sưng, viêm khớp [145].

3.1.7. Hợp chất 8,10-dihydroxy-9-acetoxythymol (EfD14.1)

Hình 3.17. Cấu trúc hợp chất EfD14.1

Hợp chất EfD14.1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H NMR trên vùng

trường yếu xuất hiện 3 tín hiệu proton của vòng thơm tại H 6,61 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-2);

6,66 (1H, dd, J = 1,0; 8,0 Hz, H-6); 7,19 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), dịch về vùng trường

mạnh xuất hiện 4 tín hiệu của hai nhóm methylene tại H 3,85 (1H, d, J = 11,5 Hz, Ha-9),

3,90 (1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-9); 4, 46 (1H, d, J = 11,5 Hz, Ha-10), 4,54 (1H, d, J = 11,5

84

Hz, Hb-10), và còn lại là một tín hiệu của nhóm methyl tại H 2,25 (3H, s, H-7) và một

nhóm acetyl tại H 2,00 (3H, s, CH3CO-). Qua những phân tích trên, so sánh với phổ

1H NMR của hợp chất 8,9-didydroxy -9 axetoxythymol đã được công bố [137] kết

luận được hợp chất EfD14.1 là 8,9-didydroxy-9 axetoxythymol.

Bảng 3.9. Giá trị 1H NMR spectra (Hvà J) của EfD 14.1 với 8,9-didydroxy -9

axetoxythymol đã được công bố

EfD 14.1

[CD3OD]

8,9-didydroxy -9

axetoxythymol

[CD3OD]

H (ppm) J (Hz) H (ppm) J (Hz)

3H, 2,00 s- CH3CO - 1,98 -

H2 6,61(1H, d) 1,0 6,61 1,7

H5 8,0(1H, d) 8,0 7,17 8,0

H6 6,66(1H, dd) 1,0 và 8,0 6,64 1,7 và 8,0

H7 2,25(3H, s) - 2,23 -

Ha9 3,85(1H, d) 11,5 3,85 11,4

Hb9 3,90(1H, d) 11.5 3,90 11,4

Ha10 4,46(1H, d) 11,5 4,46 11,4

Hb10 4,54(1H, d) 11,5 4,54 11,4

Nhận xét những kết quả đạt được của Phần 3.1.

1. Đã xây dựng được quy trình tạo cao chiết tổng và cao chiết phân đoạn quy mô

phòng thí nghiệm. Hiệu quả chiết mẫu cao tổng Mần tưới trong các dung môi

metanol, etanol và nước lần lượt là 12,75; 9,17 và 7,75 %.

2. Đã xây dựng được quy trình tạo cao chiết phân đoạn từ cao chiết tổng etanol Mần

tưới. Hiệu suất tạo cao chiết phân đoạn n-hexan, etyl axetat và cao chiết nước lần

lượt là 18,97; 16,10 và 60,27%

3. Đã tách chiết được 07 chất sạch từ cao chiết etyl axetat Mần tưới trong đó 02 chất

(7,8,9-trihydroxythymol và 8,10-didehydro-7,9-dihydroxythymol) là chất mới

chưa được công bố trong các tài liệu trước đây.

85

Cấu trúc phân tử của 7 hợp chất phân lập được từ cây Mần tưới E

.fortunei

7,8,9-trihydroxythymol (EfD4.7)

4-(2-hydroxyethyl)

benzaldehyde (EfD10.1)

8,10-didehydro-7,9-

dihydroxythymol

(EfD4.8)

o-Coumaric acid (EfD1.8)

8,9-didydroxy -9 axetoxythymol

(EfD14.1)

8,9,10- Trihydroxythymol

(EfD 5.1)

86

Kaempferol (EfD10.3)

3.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng và diệt VKL độc, vi tảo của

các cao chiết và chất sạch được tách chiết

3.2.1. Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng VKL độc Microcystis aeruginosa của

các cao chiết tổng Mần tưới

Nghiên cứu trước đây đã chứng minh cao chiết từ một vài loài thực vật tại

Việt Nam có khả năng ức chế sinh trưởng M. aeruginosa trong dải nồng độ 4 -

500 µg/mL và ghi nhận hiệu quả ức chế sinh trưởng cao nhất tại nồng độ 500

µg/mL đối với cao chiết metanol từ cây Mần tưới E. fortunei [2, 3]. Nghiên cứu

này khảo sát và so sánh ảnh hưởng của các cao chiết tổng khác nhau từ cây Mần

tưới (E-Eth, E-Me và E-W) thu được từ các dung môi tương ứng etanol, metanol

và dung môi nước đến sự sinh trưởng của M. aeruginosa TC3 trong 10 ngày tại

hai nồng độ 200 và 500 µg/mL với mật độ tế bào ban đầu 3 × 105 TB/mL. Động

thái tăng trưởng sinh khối M. aeruginosa được theo dõi ở các ngày T0, T3, T6,

và T10 bằng phương pháp đo mật độ quang tại bước sóng 680 nm và phân tích

hàm lượng chlorophyll a [Hình 3.18]

Kết quả cho thấy các cao chiết được tạo ra từ các dung môi khác nhau có ảnh

hưởng ức chế lên M. aeruginosa khác nhau phụ thuộc vào thời gian và nồng độ

phơi nhiễm (p<0,05). Tại công thức đối chứng, các tế bào M. aeruginosa tăng dần

theo thời gian (OD tại T0 là 0,03 ± 0,01) và đạt giá trị cao nhất tại ngày cuối (T10)

(OD là 0,39 ± 0,01). Sự ức chế sinh trưởng của chủng M. aeruginosa được quan

sát rõ nhất dưới ảnh hưởng của cao chiết etanol Mần tưới nồng độ 500 µg/mL với

hiệu suất chế (IE) tính theo mật độ quang là 91,50 % cao hơn so với các cao chiết

methanol (IE là 78,50) và cao chiết nước (IE là 61,72 %) (p<0,05). Hoạt chất

CuSO4 5 µg/mL – mẫu đối chứng dương ghi nhận có giá trị tương đương với hiệu

quả của cao chiết tổng metanol Mần tưới tại 500 µg/mL. Cao chiết tổng etanol tại

87

nồng độ 200 µg/mL và CuSO4 nồng độ 1 µg/mL có giá trị IE tương đương dao

động từ 42,85 đến 48,56 %, cao hơn đáng kể so với cao chiết tổng metanol Mần

tưới chỉ đạt IE là 5,12% (p<0,05). Ngược lại, cao chiết tổng nước từ cây Mần tưới

lại kích thích nhẹ sinh trưởng M. aeruginosa ghi nhận mật độ quang tại ngày T10

là 0,43 ± 0,01 tương ứng với giá trị IE là -12,17%.

Hình 3.18. Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B) lên

sinh trưởng của M. aeruginosa tính theo mật độ quang (tại bước sóng 680 nm)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

T0 T3 T6 T10

Mật

độ q

uan

g,

(λ=

680 n

m)

Thời g ian (ngày)

Control - M.a

E- Eth-200

E- Me-200

E-W-200

CuSO4-1

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

T0 T3 T6 T10

Mật

độ q

uan

g,

(λ=

680 n

m)

Thời gian (ngày)

Control- M.a

E- Eth-500

E- Me-500

E-W-500

CuSO4-5

A

B

88

Hình 3.19. Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B)

lên sinh trưởng của M. aeruginosa tính theo hàm lượng chlorophyll a

Tương tự phương pháp đo mật độ quang, kết quả phân tích hàm lượng

chlorophyll a cho thấy sau khi bị phơi nhiễm với cao chiết, sinh trưởng của chủng

M. aeruginosa có sự khác biệt rõ rệt giữa mẫu đối chứng và các mẫu thực nghiệm,

đặc biệt là mẫu bổ sung cao chiết etanol và metanol Mần tưới (p< 0,05). Sinh

khối trong mẫu đối chứng ngày T0 là 0,41 ± 0,05 µg/L tăng dần đến ngày kết

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

T0 T3 T6 T10

Hàm

lư

ợn

g c

hlo

rop

hyll

a,

µg/L

Thời gian (ngày)

Control- M.a

E- Eth-200

E- Me-200

E-W-200

CuSO4-1

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

T0 T3 T6 T10

Hàm

lư

ợng c

hlo

rophyll

a,

µg/L

Thời gian (ngày)

Control - M.aE- Eth-500E- Me-500E-W-500CuSO4-5

A

B

89

thúc thí nghiệm T10 là 6,57 ± 0,62 µg/L. Trong khi đó tại mẫu thí nghiệm bổ

sung cao chiết etanol và metanol nồng độ 500 µg/mL sinh khối VKL đều thấp

hơn với mẫu đối chứng ở các thời điểm khảo sát T3, T6 và T10 (p<0,05) ghi nhận

hiệu quả ức chế sinh trưởng tại ngày T10 là 88,28 và 69,10 %. Mẫu bổ sung cao

chiết nước ở 500 µg/mL ghi nhận hiệu quả ức chế là 52,51 % với sinh khối tại

ngày T10 là 3,12 ± 0,37 µg/L, tuy nhiên ở nồng độ 200 µg/L lại kích thích sinh

trưởng nhẹ so với mẫu đối chứng (p<0,05). Sự kích thích sinh trưởng M.

aeruginosa khi bổ sung cao chiết ở nồng độ thấp cũng được quan sát thấy ở nhiều

nghiên cứu trước [75, 100]. Điều này có thể do khi cao chiết bổ sung đã cung

cấp thêm chất dinh dưỡng cho môi trường nuôi dưỡng M. aeruginosa đặc biệt là

thành phần nitơ và phốtpho.Theo các nhà khoa học thành phần hóa học trong các

cao chiết thực vật quyết định đến độc tố, hoạt tính sinh học của chúng lên các

loài vi khuẩn [120, 124, 146, 147]. Các cao chiết thực vật được tạo ra từ việc

ngâm chiết mẫu trong dung môi khác nhau như metanol, etanol, nước, etyl axetat

đều có khả năng ức chế sinh trưởng M. aeruginosa nhưng với hiệu quả tác động

khác nhau vì các dung môi khác nhau ảnh hưởng đến tỉ lệ các hợp chất phenol

và hoạt tính chống oxi hóa của mẫu cao chiết [60, 148]. Trong nghiên cứu này, 3

dung môi thông dụng nhất là dung môi etanol, metanol và dung môi nước được

lựa chọn vì phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, hiệu suất điều chế và tiềm

năng kinh tế [149]. Các mẫu cao chiết thực vật được tạo ra trong dung môi etanol

thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao hơn đồng thời có chứa hàm lượng các hợp

chất phenol cao hơn so với cao chiết từ dung môi metanol và nước [69, 150].

Ngoài ra, các hợp chất phenol đã được chứng minh trong các nghiên cứu trước

có khả năng ức chế sinh trưởng lên chủng M. aeruginosa [60, 77]. Đó là cơ sở

giải thích tại sao trong thực nghiệm này cao chiết tổng etanol từ Mần tưới ức chế

sinh trưởng cao hơn so với các mẫu cao chiết từ dung môi metanol và dung môi

nước. Do đó, dung môi etanol được lựa chọn để điều chế cao chiết tổng Mần tưới

phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn.

3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol Mần tưới lên sinh trưởng

của Microcystis aeruginosa và Chlorella vulgaris

90

Ảnh hưởng của cao chiết etanol Mần tưới lên sinh trưởng của M.

aeruginosa và Ch. vulgaris trong dải nồng độ 50 ÷ 500 µg/mL sau 10 ngày tiếp

xúc cho thấy sự nhạy cảm của hai loài đối với tác động của các cao chiết khác

nhau là khác nhau phụ thuộc vào thời gian phơi nhiễm và nồng độ phơi nhiễm.

Kết quả đo bằng 3 phương pháp đánh giá sinh trưởng (hình 3.20) có sự khác

biệt lớn giữa mẫu đối chứng (không bổ sung hoạt chất) và công thức thực

nghiệm bổ sung cao chiết tổng etanol Mần tưới (đặc biệt ở nồng độ 500 µg/mL)

(p<0,05). Tại mẫu đối chứng với M. aeruginosa, mật độ quang, hàm lượng

chlorophyll a và mật độ tế bào tăng dần từ ngày T0 là 0,035 ± 0,004; 0,40 ±

0,04 µg/L và (3,12±0,45) ×105 TB/mL đến thời điểm kết thúc thí nghiệm T10

lần lượt đạt 0,36 ± 0,01; 6,05 ± 0,21µg/L và (29,10± 2,43) ×105 TB/mL. Ở các

công thức thí nghiệm có bổ sung cao chiết nồng độ 200 µg/mL, mật độ quang,

hàm lượng chlorophyll a và mật độ tế bào vẫn tăng nhẹ trong suốt quá trình

thực nghiệm, đạt hiệu quả ức chế sinh trưởng tương ứng là 56,10; 61,3 và 51,72

%. Sinh trưởng của M. aeruginosa tiếp xúc với các cao chiết nồng độ 500 µg/mL

bị ức chế mạnh, mật độ quang và hàm lượng chlorophyll a tại ngày T10 là 0,05

± 0,001; 0,60 ± 0,03µg/L và ghi nhận hiệu quả ức chế sinh trưởng dao động từ

87÷ 90% trong khi hiệu quả ức chế sinh trưởng tính theo mật độ tế bào là

68,61%. Trong các mẫu thực nghiệm bổ sung cao chiết nồng độ 500 µg/mL

quan sát bằng mắt thường thấy các tế bào bị chết, chuyển sang màu trắng đục

và lắng xuống đáy bình thí nghiệm.

91

Hinh 3.20. Sinh trưởng của M. aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết tổng etanol Mần

tưới tính theo mật độ quang (A), hàm lượng chlorop hyll a (B) và mật độ tế bào (C)

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

T0 T3 T6 T10

Mật

độ

quan

g (

λ=

68

0 n

m)

Thời gian (ngày)

Control- M.a

E-Ethanol 50

E-Ethanol- 100

E-Ethanol-200

E-Ethanol-500

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

T0 T3 T6 T10

Hàm

lư

ợng c

hlo

rophyll

a,

µg/L

Thời gian (ngày)

Control- M.a

E-Ethanol 50

E-Ethanol- 100

E-Ethanol-200

E-Ethanol-500

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

T0 T3 T6 T10

Mật

độ t

ế bào

x 1

05

TB

/mL

Thời gian (ngày)

Control- M.a

E-Ethanol-50

E-Ethanol-100

E-Ethanol-200

E-Ethanol-500

A

B

C

92

Ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol Mần tưới nồng độ 50 ÷ 500 µg/mL lên

sinh trưởng tảo lục Ch. vulragis cũng cho kết quả tương tự (hình 3.21). Trong công

thức đối chứng Ch. vulgaris không bổ sung cao chiết, mật độ quang và hàm lượng

chlorophyll a và mật độ tế bào tăng mạnh từ ngày T0 đến ngày T10. Trong khi các

mẫu thực nghiệm bổ sung cao chiết tăng sinh khối từ từ. Kết quả cho thấy tại nồng

độ 50 và 100 µg/mL cao chiết gây ảnh hưởng không đáng kể (p>0,05) ghi nhận

giá trị IE từ 5-20 %, trong khi ở nồng độ cao hơn như 200 và 500 µg/mL sự ức

chế sinh trưởng quan sát thấy rõ rệt hơn.

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

T0 T3 T6 T10

Mật

độ q

uan

g,

(λ=

68

0 n

m)

Control-Chlorella

E-Ethanol-50

E-Ethanol-100

E-Ethanol- 200

E-Ethanol- 500

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

T0 T3 T6 T10

Hàm

lư

ợng c

hlo

rophyll

a,

ug/L

Thời gian )

Control- Chlorella

E-Ethanol -50

E-Ethanol-100

E-Ethanol-200

E-Ethanol-500

A

B

93

Hinh 3.21. Sinh trưởng của Ch. vulgaris dưới tác dụng của cao chiết tổng etanol Mần

tưới tính theo mật độ quang (A), hàm lượng chlorophyll a (B) và mật độ tế bào (C)

Mẫu thực nghiệm phơi nhiễm với cao chiết tổng etantol tại nồng độ 500 µg/mL

cho hiệu quả ức chế tính theo mật độ quang là 70,59 % (OD: 0,11± 0,02); theo hàm

lượng chlorophyll a là 66,42% (Chla: 9,25± 1,20 µg/L) và theo mật độ tế bào là 55,61

% [(12,14± 2,32) ×105 TB/mL]. Thống kê các kết quả phân tích thu được bảng sau:

Bảng.3.10. Hiệu qủa ức chế sinh trưởng của cao chiết etanol Mần tưới lên M.

aeruginosa và Ch. vulgaris tại nồng độ 200 và 500 µg/mL

Nồng độ cao

chiết

M. aeruginosa Ch. vulgaris

IE %

(OD)

IE %

(Chla)

IE

(TB)

IE %

(OD)

IE %

(Chla)

IE (%)

(TB)

200 µg/mL 56,10 61,32 51,72 32,89 35,89 41.73

500 µg/mL 87,80 90,13 68,6 70,59 66,42 55,61

Bảng 3.10 cho thấy cao chiết etanol Mần tưới thể hiện sự tác động có chọn lọc

rõ rệt giữa hai đối tượng M. aeruginosa và Ch. vulgaris với các giá trị ức chế sinh

trưởng lên Ch. vulgaris ghi nhận được đều thấp hơn M. aeruginosa ở cả ba phương

pháp phân tích (p<0,05). Ảnh hưởng của cao chiết lên hai loài sinh vật nghiên cứu

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

T0 T3 T6 T10

Mật

độ t

ế bào

x 1

05

TB

/mL

Thời gian (ngày)

Control- Chlorella

E-Ethanol -50

E-Ethanol-100

E-Ethanol-200

E-Ethanol -500

C

94

phụ thuộc nhiều vào nồng độ phơi nhiễm. Cao chiết nồng độ 500 µg/mL gây ảnh

hưởng mạnh hơn lên sinh trưởng hai loài so với cao chiết ở các nồng độ 200, 100 và

50µg/mL (p<0,05). Đặc biệt cao chiết nồng độ 50 µg/mL gây ảnh hưởng không đáng

kể thậm chí trong những ngày đầu còn quan sát thấy sự kích thích sinh trưởng nhẹ so

với mẫu đối chứng, ở ngày cuối thực nghiệm hiệu suất ức chế ghi nhận từ 5÷10 % ở

cả ba phương pháp. Độc tố của cao chiết thực vật tại các nồng độ khác nhau lên các

chủng vi tảo, vi khuẩn lam phụ thuộc vào hàm lượng, tỉ lệ thành phần các hoạt chất

sinh học [116, 118, 119, 146]. Độ nhạy cảm khác nhau của chủng VKL M. aeruginosa

và Ch. vulgaris đối với cùng một loại cao chiết ở cùng nồng độ có thể do sự khác biệt

về cấu trúc tế bào, đặc biệt là thành tế bào. Theo các công bố khoa học, M. aeruginosa

là vi khuẩn gram âm với thành tế bào mỏng, cấu tạo chủ yếu là peptidoglycan trong

khi tế bào Ch. vulgaris có thành tế bào rất dày chủ yếu là cenllulosa [44, 151]. Sự

khác biệt lớn về cấu trúc thành tế bào dẫn đến chủng M. aeruginosa có thể cho các

cao chiết dễ dàng thẩm thấu hơn và xâm nhập nhanh hơn vào bên trong tế bào so với

chủng tảo lục Ch. vulgaris, từ đó gây ra những tổn thất nặng nề hơn và ghi nhận hiệu

quả ức chế của các cao chiết cao hơn. Theo các tài liệu công bố, nồng độ của cao

chiết tại đó có hiệu quả ức chế sinh trưởng M. aeruginosa dao động từ vài miligam

đến hàng nghìn miligam trên lít. Nghiên cứu được biết đến nhiều nhất là cao chiết từ

rơm lúa mạch với nồng độ hiệu quả diệt VKL từ 6 ÷28 µg/mL [152], một vài cao

chiết khác cũng có giá trị tương đương như cao chiết từ vỏ quýt, vỏ chuối với nồng

độ hiệu quả từ 70 g/mL [90] hoặc cao chiết rơm lúa gạo từ 0,1 ÷ 10 g/mL và cây

keo đen là 2 g/mL [86]. Tuy nhiên, những cao chiết khác chỉ thể hiện hiệu quả ức

chế tại nồng độ cao ví dụ như cao chiết cây Mần tưới từ 100 ÷ 500 g/mL [2, 3], cao

chiết từ loài Ailanthus altissima với nồng độ hiệu quả từ 25 ÷ 200 g/mL [98] hoặc

theo nghiên cứu của Timothy cao chiết nước của các mẫu rơm lúa mạch ức chế sinh

trưởng của M. aerguinosa tại các nồng độ từ 1729 ÷ 3030 g/mL [82]. Những thông

số trong các tài liệu tham khảo về nồng độ hiệu quả ức chế sinh trưởng VKL là khó

so sánh và mang tính tham khảo vì các chủng VKL trong các thực nghiệm là khác

nhau, nghiên cứu trên tập đoàn VKL cũng khác so với nghiên cứu trên từng cá thể

độc lập. Một điểm quan trọng nữa là không có chuẩn mực giữa những thực nghiệm

95

sinh học về đánh giá hoạt tính của các hợp chất thiên nhiên lên VKL. Những yếu tố

như thời gian nuôi cấy và mật độ nuôi cấy ban đầu ảnh hưởng rất lớn tới kết quả,

không được quy định và kiểm soát tốt trong quá trình thực nghiệm [104, 106].

3.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn lên sinh trưởng của

Microcystis aeruginosa và Chlorella vulgaris

Ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn etyl axetat và cao chiết phân đoạn nước

Mần tưới lên sinh trưởng M.aeruginosa sau 10 ngày tiếp xúc trong dải nồng độ 50,

100, 200 và 500 µg/mL được trình bày ở hình 3.22; 3.23 và 3.24.

Hình 3.22. Sinh trưởng của M. aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn

etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo mật độ quang

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

T0 T3 T6 T10

Mật

độ q

uan

g (

λ=

680 n

m)

Thời gian (ngày)

Control- M.aE-Ethyl-50E-Ethyl-100E-Ethyl-200E-Ethyl-500

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

T0 T3 T6 T10

Mật

độ q

uan

g (

λ=

680 n

m)

Thời gian (ngày)

Control - M.aE-W-50E-W-100E-W-200E-W-500

A

B

96

Hình 3.23. Sinh trưởng của M. aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn

etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo hàm lượng chlorophyll a

Kết quả cho thấy cao chiết phân đoạn etyl acetat ảnh hưởng mạnh hơn lên sinh

trưởng của M. aeruginosa so với cao chiết phân đoạn nước sau 10 ngày thí nghiệm

(p<0,05). Tại công thức đối chứng, thời điểm bắt đầu thí nghiệm (T0) mật độ quang

và hàm lượng chlorophyll a ghi nhận là 0,034 ± 0,002 và 0,43 ±0,05 µg/L. Hai giá

trị này tăng dần trong suốt quá trình thực nghiệm và cao nhất tại ngày T10 là 0,481±

0,031 và 7,03 ± 0,22 µg/L. M. aeruginosa dưới ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn

nước nồng độ 50-500 µg/mL vẫn tiếp tục sinh trưởng, không quan sát thấy sự khác

biệt rõ rệt giữa công thức đối chứng và mẫu cao chiết nước tại hai nồng độ 50 và

100 µg/mL (p>0,05). Tại nồng độ cao hơn (200 và 500 µg/mL), cao chiết phân đoạn

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

T0 T3 T6 T10

Hàm

lư

ợn

g c

hlo

rop

hyll

a ,

ug/L

Thời gian (ngày)

Control- M.aE-Ethyl-50E-Ethyl-100E-Ethyl-200E-Ethyl-500

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

T0 T3 T6 T10

Hàm

lư

ợng c

hlo

rophyll

a ,

ug/L

Thời gian (ngày)

Control - M.aE-W-50E-W-100E-W-200E-W-500

A

B

97

nước ức chế nhẹ lên M. aeruginosa được ghi nhận tại ngày T10 với mật độ quang

là 0,354 ± 0,015 và 0,199 ± 0,016, hàm lượng chlorophyll a tương ứng là 5,76 ±

0,38 và 3,96 ± 0,223 µg/L, tương ứng với hiệu quả ức chế lên sinh trưởng M

.aeruginosa tại 200 µg/mL là 18; 20% và tại 500 µg/mL là 45; 60%. Cao chiết etyl

axetat ức chế hiệu quả hơn lên VKL tại nồng độ 200 và 500 µg/mL sau 10 ngày

phơi nhiễm, mật độ quang tương ứng là 0,102 ± 0,03; 0,031 ±0,001 và hàm lượng

chlorophyll a là 1,78± 0,02 và 0,27 ± 0,02 µg/L, hiệu quả ức chế sinh trưởng lên

đến trên 90% tại 500 µg/mL.

Hình 3.24. Sinh trưởng của M. aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn

etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) theo mật độ tế bào

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

T0 T3 T6 T10

Mật

độ t

ế bào

x 1

05

TB

/mL

Thời gian (ngày)

Control-M.aE-Ethyl -50E-Ethyl-100E-Ethyl-200E-Ethyl -500

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

T0 T3 T6 T10

Mật

độ t

ế bào

x 1

05T

b/m

L

Thời gian (ngày)

Control- M.aE-W-50E-W-100E-W-200E-W-500

A

B

98

Phương pháp đếm tế bào cũng cho kết luận tương tự khi cao chiết phân đoạn

etyl axetat có độc tính mạnh hơn lên chủng VKL so với cao chiết phân đoạn nước

(p<0,05). Cụ thể, tính theo mật độ tế bào tại nồng độ 500 µg/mL, hiệu quả ức chế

sinh trưởng của cao chiết phân đoạn etyl axetat lên M. aerginosa là 75,61% trong khi

đối với cao chiết nước thì giá trị tương ứng này 37,58%.

Ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn etyl axetat và cao chiết phân đoạn nước

Mần tưới lên sinh trưởng Ch. vulgaris – một loài tảo lục có ích trong hệ sinh thái

nước ngọt được trình bày tại hình 3.25. 3.26 và 3.27.

Hình 3.25. Sinh trưởng của Ch. vulgaris dưới ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn etyl

axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo mật độ quang

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

T0 T3 T6 T10

Mật

độ q

uan

g,

(λ=

680nm

)

Thời gian (ngày)

Control- Chlorella

E-Ethyl -50

E-Ethyl-100

E-Ethyl-200

E-Ethyl -500

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

T0 T3 T6 T10

Mật

độ q

uan

g (

λ=

680 n

m)

Thời gian (ngày)

Control- Chlorella

E-W-50

E-W-100

E-W-200

E-W-500

A

B

99

Hình 3.26. Sinh trưởng của Ch. vulgaris dưới ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn

etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) Mần tưới theo hàm lượng

chlorophyll a

Kết quả phân tích cho thấy sự trùng hợp của ba phương pháp và thể hiện

xu hướng tương tự tác động của cao chiết tại 4 nồng độ nghiên cứu 50, 100, 200

và 500 µg/mL lên Ch.vulgaris. So với M. aeruginosa, các cao chiết thể hiện độc

tố thấp hơn ở Ch. vulgaris. Đối với công thức bổ sung cao chiết nước tại 500

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

T0 T3 T6 T10

Hàm

lư

ợng c

hlo

rophyll

a,

µg/L

Thời gian (ngày)

Control- Chlorella

E- Ethyl -50

E- Ethyl-100

E- Ethyl-200

E- Ethyl -500

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

T0 T3 T6 T10

Hàm

lư

ợng

chlo

rophyll

a ,

µg/L

Thời gian (ngày)

Control- Chlorella

E- W-50

E- W-100

E- W-200

E- W-500

A

B

100

µg/mL, ngày T10 giá trị mật độ quang là 0,260 ± 0,013, thấp hơn so với công

thức đối chứng ( 0,391 ±0,023), ghi nhận hiệu quả ức chế là 32,33% trong khi

với hàm lượng chlorophyll a giá trị IE là 40,16%. Cao chiết phân đoạn etyl

axetat Mần tưới thể hiện độc tính mạnh hơn so với cao chiết phân đoạn nước

khi tác động lên Ch. vulgaris (p<0,05). Tại ngày T10 mẫu thực nghiệm Ch.

vulgaris phơi nhiễm cao etyl axetat tại nồng độ 500 µg/mL so cho giá trị ức

chế sinh trưởng tương ứng là 76,98 và 67,82 % theo phương pháp đo mật độ

quang và hàm lượng chlorophyll a.

Hình 3.27. Sinh trưởng của Ch. vulgaris dưới ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn

etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo mật độ tế bào

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

T0 T3 T6 T10

Mật

độ

tế

bào

x 1

05

TB

/mL

Thời gian (ngày)

Control- Chlorella

E-Ethyl -50

E-Ethyl-100

E-Ethyl-200

E-Ethyl -500

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

T0 T3 T6 T10

Mật

độ t

ế bào

x 1

05T

b/m

L

Thời gian (ngày)

Control- Chlorella

E-W-50

E-W-100

E-W-200

E-W-500

A

B

101

Kết quả đếm tế bào cho thấy, ở tất cả các nồng độ thử nghiệm của cao chiết

phân đoạn etyl axetat và cao chiết phân đoạn nước, sinh khối tế bào Ch. vulgaris tăng

tuyến tính theo thời gian. Ngày thứ 10 không có sự khác biệt đáng kể về mật độ tế

bào của mẫu đối chứng so với các mẫu bổ sung cao chiết nồng độ 50 và 100 mg/mL

đặc biệt là đối với cao chiết nước (p> 0,05). Mẫu thực nghiệm bổ sung cao chiết phân

đoạn etyl axetat và phân đoạn nước nồng độ 500 mg/mL có mật độ tế bào ngày cuối

là 15,14 × 105 TB/mL và 23,41 × 105 TB/mL cho giá trị IE tương ứng là 55,6 và 31,34

% thấp hơn so với kết quả thu được từ phương pháp đo mật độ quang và phương pháp

đo hàm lượng chlorophyll a.

Bảng 3.11. Hiệu quả ức chế sinh trưởng của cao chiết phân đoạn etyl axetat và cao chiết

phân đoạn nước lên M. aeruginosa và Ch. vulgaris tại nồng độ 200 và 500 µg/mL

Mẫu nghiên cứu

M. aeruginosa Ch. vulgaris

IE %

(OD)

IE %

(Chla)

IE%

(TB)

IE %

(OD)

IE %

(Chla)

IE %

(TB)

E-Ethyl 500 93,55 96,16 75,61 76,98 78,40 55,6

E-W-500 58,62 43,46 37,58 32,33 40,16 31,34

Từ bảng 3.11, kết quả so sánh hiệu quả ức chế sinh trưởng của cao chiết phân

đoạn etyl axetat và cao chiết phân đoạn nước Mần tưới lên M. aeruginosa và Ch.

vulgaris cho thấy cao chiết phân đoạn etyl axetat có độc tính cao hơn được lựa chọn

cho bước nghiên cứu tiếp theo phân lập các chất sạch để thử hoạt tính trên M.

aeruginosa.

3.2.4. Đánh giá tiềm năng kiểm soát bùng nổ sinh khối Microcystis aeruginosa

của cao chiết Mần tưới trong vòng 72 giờ

Ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol và cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần

tưới lên sinh trưởng của M. aeruginosa trong vòng 72 giờ được thiết lập với mật độ

ban đầu của M. aeruginosa là (15,62 × 105 TB/mL) tương tự với nồng độ ghi nhận

được ở giai đoạn bùng nổ tảo [1]. Ngoài ra hoạt chất CuSO4 nồng độ 5 µg/mL cũng

được bố trí đồng thời nhằm so sánh hiệu quả ức chế của cao chiết Mần tưới với một

102

hóa chất diệt tảo thông dụng kiểm soát bùng nổ vi tảo độc tại các hệ sinh thái nước

ngọt [153]. Kết quả phân tích được trình bày ở hình 3.28 (A, B và C).

Hình 3.28. Sinh

trưởng của chủng

M. aeruginosa

trong vòng 72 giờ

tác dụng của các

cao chiết Mần tưới

A. Tính theo mật

độ quang

B. Tính theo hàm

lượng

chlorophyll a

C. tính theo mật độ

tế bào

0.00

0.04

0.08

0.12

0.16

0.20

0.24

0.28

T0 T24 T48 T72Mật

độ q

uan

g

(Abs

680nm

)

Thời gian (giờ)

Control. M.aCuSO4-5E-Ethanol 500E-Ethyl 500

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

Control CuSO4-5 E-Ethanol 500 E-Ethyl-500

Hàm

lư

ợng c

hlo

rophyll

a,

µg/m

L T0 T72

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

Control - Ma CuSO4-5 Ethanol-500 Ethyl- 500

Mật

độ t

ế bào

×10

5T

B/m

L T0 T72

103

Hình 3.28A trình bày ảnh hưởng của M. aeruginosa TC3 dưới tác động

của cao chiết tính theo phương pháp đo mật độ quang. Sau 24 giờ, cao chiết

phân đoạn etyl axetat ở nồng độ 500 µg/mL thể hiện độc tính cao nhất lên VKL

với giá trị IE là 31,12 %, cao hơn so với hợp chất CuSO4 ở 5 µg/mL và cao

chiết ethanol ở nồng độ tương ứng, giá trị IE tương đương khoảng 15%. Sau 72

giờ, sự tăng trưởng của M. aeruginosa bị ức chế mạnh bởi cao chiết etyl axetat

tại 500 µg/mL; IE tăng lên tới 62,77 % trong khi - CuSO45 µg/mL và cao chiết

etanol ở 500 µg/mL có giá trị IE tương ứng là 47,44% và 52,19%. Tác dụng ức

chế của các cao chiết khác nhau từ E. fortunei lên M. aeruginosa phụ thuộc vào

thời gian phơi nhiễm và bản chất dung môi sử dụng để tạo cao chiết. Điều này

phù hợp với các nghiên cứu trước đây [70, 71]. Theo các tác giả này hoạt tính

ức chế VKL của cao chiết tổng etanol và cao chiết phân đoạn etyl axetat có thể

được giải thích bằng sự có mặt các hợp chất polyphenolic, tuy nhiên cao chiết

phân đoạn trong thực nghiệm cho hoạt tính kháng khuẩn cao hơn có thể là do

tỷ lệ của các flavonoid và các axit phenolic trong đó cao hơn.

Chlorophyll a là một sắc tố chính của hệ thống quang hợp vi tảo và thường

được sử dụng để phản ánh gián tiếp sinh khối vi khuẩn trong nghiên cứu đánh

giá sinh trưởng [100]. Sau 72 giờ, cao chiết etyl axetat 500 µg/mL có độc tính

cao nhất đối với VKL với nồng độ chlorophyll a thu được 0,56 µg/L, với giá

trị IE là 79,60 %. Mẫu thực nghiệm phơi nhiễm với CuSO4 (5 µg/mL) và cao

chiết etanol (500 µg/mL) cho hàm lượng chlorophyll a sau 72 giờ là 0,69 và

0,89 µg/L tương ứng với IE là 74,72 và 67,35 %. Kết quả tương tự đã được

công bố bởi Lürling [154]. Các cao chiết từ Fructus mume, Salvia miltiorrhiza

ở nồng độ 240 và 640 µg/mL làm giảm sự tăng trưởng của M. aeruginosa. Theo

các tác giả, suy giảm hàm lượng chlorophyll a sẽ làm suy yếu hiệu quả quang

hợp, thậm chí làm hỏng hệ quang hợp, và sau đó dẫn đến chết tế bào [155]. Sự

ức chế đối lên sinh trưởng của M. aeruginosa của hoạt chất CuSO4 đã được

công bố trong nhiều nghiên cứu [156, 157]. Thời gian đầu, đây là hoạt chất diệt

104

tảo được sử dụng phổ biến nhất cho các hồ chứa bị“nở hoa”, có hiệu quả ở nồng

độ thấp dao động từ hàng chục đến hàng trăm microgram trên lít. Hợp chất này

độc hại với M. aeruinosa bằng cách xâm nhập vào các tế bào gây ra sự thay thế

kim loại Mg trong sắc tố chlorophyll a và cũng ảnh hưởng đến các phân tử khác

trong các quá trình sinh hóa của tế bào. Nghiên cứu cũng chứng minh rằng bổ

sung đồng dẫn đến tổn thương tế bào, phá hủy nguyên sinh chất và giải phóng

độc tố microcystin. Đồng sunphat đã được sử dụng trong một thời gian dài vì

những ưu điểm vượt trội như dễ sử dụng, giá thành thấp, và hiệu quả cao, tức

thời, tuy nhiên hóa chất này đồng thời có ảnh hưởng xấu đến các loài thủy sản

không phải mục tiêu tác động như các loài thực vật phù du, ốc, daphnids, cá và

có khả năng tích tụ kim loại nặng trong sinh vật và trong trầm tích. Do vậy, gần

đây các nhà quản lý môi trường nước đã ngăn chặn việc sử dụng hợp chất đồng

ở quy mô lớn [156]. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên sinh trưởng

của M. aeruginosa bằng phương pháp đếm mật độ tế bào được trình bày trong

hình 3.28C. Đối với mẫu đối chứng, mật độ tế bào của M. aeruginosa tăng từ

15,62 ± 1,06 tại thời điểm bắt đầu đến 21,54 ± 0,88 (× 105TB/mL) sau 72 giờ

phơi nhiễm. Mật độ này cao hơn so với ba công thức thực nghiệm như CuSO4,

E- Etanol 500 và E-Ethyl-500 ghi nhận giá trị IE của của cả ba mẫu thực nghiệm

dao động từ 34,77 ÷ 37,41 %.

Bảng 3.12. Hiệu quả ức chế sinh sinh trưởng của chủng M. aeruginosa dưới ảnh

hưởng của CuSO4 5 µg/L và các cao chiết Mần tưới sau 72 giờ

Mẫu nghiên cứu IE 72h IE (72h) IE% (72)

OD Chla TB

CuSO4-5 47,4 74,72 35,10

E-Ethanol 500 52,2 67,35 34,77

E-Ethyl-500 62,8 79,60 37,42

Bảng 3.12 cho thấy giá trị IE (%) hay hiệu suất ức chế của các hoạt chất lên sinh

trưởng của M. aeruginosa được tính theo hàm lượng chlorophyll a cao hơn giá trị IE

105

của hai phương pháp còn lại ở tất cả các mẫu. Đặc biệt, đối với phương pháp đếm

mật độ tế bào, tác giả quan sát thấy hiệu quả ức chế sinh trưởng của các mẫu là thấp

nhất so với hai phương pháp còn lại và không có sự khác biệt đáng kể ở các mẫu thực

nghiệm (p>0,05). Điều này sẽ được giải thích rõ hơn khi quan sát ảnh (TEM) chụp

cấu trúc siêu hiển vi của tế bào M. aeruginosa dướit ác dụng của cao chiết (xem trong

mục 3.2.6).

3.2.5. Đánh giá hoạt tính diệt Microcystis aeruginosa của các chất sạch

Nghiên cứu hoạt tính diệt VKL M. aeruginosa của các chất sạch được tách chiết

từ các cao chiết thực vật hiệu quả đã được tiến hành trong nhiều năm trở lại đây với

mong muốn tìm được hợp chất hóa học kiểm soát bùng nổ VKL trong các thủy vực

[85, 88, 91, 107, 156, 158-160]. Từ cây Mần tưới E. fotunei nhiều hoạt chất hóa học

đã được tách chiết và thử hoạt tính sinh học trên nhiều đối tượng khác nhau khẳng

định tính kháng khuẩn, khả năng chống oxy hóa và chống các tế bào ung thư ác tính

ở người [69, 116, 122, 124, 126]. Tuy nhiên, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu

nào đánh giá ảnh hưởng của các chất sạch tách chiết cây Mần tưới E. fotunei Turcz.

trên chủng M. aeruginosa. Trong nghiên cứu này, 07 hợp chất hóa học từ cây Mần

tưới được tách chiết và đánh giá hiệu quả ức chế của chúng lên sinh trưởng M.

aeruginosa sau 72 giờ phơi nhiễm bằng phương pháp đo mật độ quang trên đĩa đọc

98 giếng và phương pháp đếm mật độ tế bào (hình 3.29 A và B).

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

EfD 1.8 EfD 4.8 EfD 4.7 EfD 5.1 EfD 10.1 EfD 10.3 EfD 14.1

Mật

độ q

uan

g (

Abs

680 n

m)

0 µg/mL 1 µg/mL 10 µg/mL 20 µg/mL 50 µg/mL A

106

Hình 3.29. Sinh trưởng của chủng M. aeruginosa dưới tác dụng của các chất sạch

sau 72 giờ tính theo mật độ quang bước sóng 680 nm (A) và theo mật độ tế bào (B)

Mẫu đối chứng không bổ sung hoạt chất (hoặc mẫu tại nồng độ các hoạt chất là

0 µg/mL) có sự tăng mật độ quang và mật độ tế bào từ 0,121 và (14,67 ± 0,31) × 105

TB/mL tại thời điểm bắt đầu lên 0,213 và (19,84 ± 1,13)× 105 TB/mL sau 72 giờ.

Trong khi đó ở các mẫu có bổ sung hoạt chất các giá trị trên giảm dần theo thời gian

thực nghiệm và nồng độ tác động. Đặc biệt, mẫu được bổ sung hoạt chất 8,9,10-tri

hydroxythymol (EfD 5.1) với nồng độ 50 µg/mL, sau 72 giờ thì mật độ quang và

mật độ tế bào đo được là 0,120 và (10,71 ± 1,04) × 105 TB/mL. EfD 5.1 có hiệu quả

ức chế sinh trưởng cao nhất theo mật độ quang và mật độ tế bào là 45,6 và 49,0 %,

tương đương với độc tính của CuSO4 nồng độ 5 µg/mL, tiếp theo là hợp chất 10-

acetoxy-8,9-dihydroxythymol (EfD14.1) and 4-(2-hydroxyethyl) benzaldehyde (EfD

10.1) với giá trị IE tương ứng là 43,1 và 41,6 %; 43,0 và 39,6 %. Hợp chất 8,10-

didehydro-7,9-dihydroxythymol (EfD 4.8) có IE thấp hơn là 39,1% và 41,1%. Ngược

lại hợp chất, 7,8,9-trihydroxythymol (EfD 4.7) và aglycone kaempferol (EfD 10.3)

ức chế sinh trưởng kém lên M. aeruginosa với IE chỉ đạt từ 20-25 % tại cùng nồng

độ và thời gian phơi nhiễm.

Mẫu bổ sung hoạt chất kaempferol (EfD10.3) có hiệu quả ức chế thấp nhất, giá

trị IE của hai phương pháp nghiên cứu ghi nhận sau 72 giờ tác động thấp từ 4 ÷ 8 %

theo cả hai phương pháp phân tích. Tuy nhiên trong nghiên cứu khác khi thời gian

phơi nhiễm dài hơn là 144 giờ kaempferol có khả năng ức chế mạnh sinh trưởng của

M. aeruginosa [161]. Theo kết quả của Linrong và cộng sự, tại nồng độ 16 và 32

mg/L kaempferol ức chế sinh trưởng của M. aeruginosa, tính theo mật độ tế bào giá

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

EfD1.8 EfD 4.8 EfD 4.7 EfD 5.1 EfD 10.1 EfD 10.3 EfD 14.1

Mật

độ t

ế bào

×10

5T

B/m

L B

107

trị IE ghi nhận là 74,40% và 85,35% sau 144 giờ thực nghiệm. Nguyên gây ra là do

hợp chất này đã tăng cường quá trình oxy hóa của tế bào hoặc làm tổn thương quá

trình quang hợp dẫn đến tổn thương tế bào vi khuẩn lam và gây chết. Hợp chất EfD

10.3 cũng được tìm thấy từ các loài thuộc chi Eupatorium như Eupatorium

odorratum, Eupatorium perforliatum, Eupatorium subtatum, [123] và từ cây

Solenostemma argel, và hợp chất này cũng ghi nhận khả năng kháng khuẩn

(Brodetella brochiseptica, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus

subtilis), có hiệu quả ức chế tốt nhất so với các hợp chất hóa học khác cùng được

tách ra từ Solenostemma argel [162].

Hợp chất 8,9,10-trihydroxythymol (EfD 5.1) là đồng phân của hợp chất EfD

4.7 có hiệu quả ức chế M. aeruginosa tốt nhất (p<0,05). Ngoài loài Mần tưới, EfD

5.1 cũng được tách chiết từ Centipedaminima hoặc từ rễ cây Mikania micrantha

[137]. EfD 5.1 ghi nhận ngoài khả năng kháng khuẩn Salmonella typhimurium còn

có khả năng kháng nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani.

Hợp chất 10-acetoxy-8,9-dihydroxythymol (EfD 14.1) cũng được tìm thấy ở

loài Arnica sachalinensis [163] tuy nhiên các tác giả không tìm thấy tài liệu nào công

bố về khả năng kháng khuẩn cũng như tác động lên đối tượng M. aeruginosa.

Hợp chất tách chiết từ E. fortunei với hiệu suất cao nhất là o-coumaric axit (EfD

1.8), cũng được tách chiết với hàm lượng lớn từ loài E. adenophorum [142]. Tuy

nhiên, EfD 1.8 ức chế sinh trưởng thấp lên M. aeruginosa sau 72 giờ phơi nhiễm, IE

tính theo mật độ quang là 31,1% và theo phương pháp đếm tế bào là 27,9% (p<0,05).

Hiện chưa có công bố nào nghiên cứu về ảnh hưởng của axit o-coumaric lên sinh

trưởng M. aeruginosa ngoài nghiên cứu của chính nhóm tác giả. Tuy nhiên nghiên

cứu của Guowei và cộng sự cho thấy o-coumaric ức chế mạnh sự nẩy mầm của hạt

Arabidopsis, sự kéo dài rễ, giảm quá trình quang hợp và ảnh hưởng đến gen liên quan

đến lão hóa và sức đề kháng của cây. Những nghiên cứu về axit p-coumaric được

phân lập từ rơm rạ - một đồng phân cấu tạo của axit o-coumaric, cho rằng hợp chất

thể hiện tính kháng khuẩn, ức chế sinh trưởng M. aeruginosa phụ thuộc chặt chẽ vào

nồng độ tác động [52, 75, 158]. Nghiên cứu của Nakai và cộng sự cho rằng axit p-

coumaric không có ảnh hưởng lên sinh trưởng M. aeruginosa tại các nồng độ 2,5;

5,0; 7,5 và 10,0 mg/L sau 15 ngày phơi nhiễm [52]. Kết quả tương tự được nhóm

nghiên cứu của Park khi khảo sát trong dải nồng độ từ 0,01 ÷ 10,0 mg/L sau 8 ngày

108

[75]. Tại nồng độ cao hơn, p-coumaric có khả năng ức chế mạnh lên sinh trưởng M.

aeruginosa với giá trị EC50 là 42,65 ±11,48 mg/L [158]. Kết quả tương tự được công

bố năm 2014 của Hong-Qiang [164].

Việc nghiên cứu tách chiết các hợp chất hóa học từ các cao chiết có hiệu quả ức

chế sinh trưởng Vi khuẩn lam độc đã và đang được nghiên cứu để tìm hiểu và giải

thích cơ chế tác động [77, 86, 123, 165, 166]. Nồng độ (dose) của các hợp chất hóa

học được tách chiết từ thực vật mà tại đó thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng M.

aeruginosa một cách hiệu quả được công bố trong các tài liệu tham khảo rất khác

nhau từ vài µg/L đến hàng trăm mg/L và rất khó so sánh [60]. Năm 1997, Everal cùng

cộng sự đã phân lập và khẳng định vai trò của các hợp chất phenolic có trong dịch

chiết từ rơm lúa mạch Hordeum vulgare trong quá trình ức chế sinh trưởng M.

aeruginosa với các hợp chất điển hình như 4-methylphenol2, 6-dimethoxy-4-phenol

và lignin. Năm 2010, Murray tiếp tục phân lập được các hợp chất phenolic từ rơm lúa

mạch và kiểm tra hoạt tính diệt tảo trong dải nồng độ từ 10, 100 200, 500 và 1000

µg/L với thời gian 72 giờ phơi nhiễm [107]. Kết quả cho thấy các hợp chất có khả

năng ức chế cao nhất lên M. aeruginosa là benzaldehyde, 2-phenyl-phenol, p-cresol

và axit benzoic với giá trị EC50 tương ứng là 100, 150, 150 và 250 µg/L. Tuy nhiên

các hợp chất này lại có độc tính mạnh hơn trên C. vulgaris với giá trị EC50 lần lượt là

28, 10, 110 và 140 µg/L. Các hợp chất khác như benzyl cyanide, trans-cinnamic acid,

acetophenone, 2,6-dimethoxyphenol and hydrocinnamicacid thì không thể hiện sự ức

chế lên M. aeruginosa trong giải nồng độ từ 10 đến 1000 µg/L. Hợp chất oleioyl-β-

D-arabinoside từ cao chiết metanol của rơm lúa gạo Oryza sativa [85] có hiệu quả ức

chế cao nhất đạt 92,6 ± 0,3 % tại nồng độ 100 mg/L. Một vài hợp chất hóa học khác

cũng được tách chiết và kiểm tra hoạt tính diệt VKL như N-phenyl-1-naphthylamine

từ Elodea nuttallii, Hydrilla verticillata, Vallisneria spiralis với giá trị EC50- 48h là

16,62 µM [111] hoặc ethyl 2-methyl acetoacetate (Phragmites communis) (EC50 là

0,65 mg/L), Artemisinin từ Artemisia annua) (EC50 là 3,2 mg/L) [159]. Những hợp

chất được tách chiết từ Myriophyllum spicatum cũng được nhóm nghiên cứu Nakai

khẳng định khả năng ức chế VKL độc như pyrogallol (EC500,5 mg.L-1), axit

protocatechuic, catechin (EC50 5,5 mg/L), axit ellagic (EC50 5,1mg/L), axit gallic

(EC50- 1,0 mg/L), eugeniin (EC50 1,5 mg/L) [52, 88, 165].

109

Sự khác biệt về hiệu quả ức chế sinh trưởng giữa các hợp chất hữu cơ được tách

chiết từ thực vật hoặc của các hợp chất là đồng phân cấu tạo của nhau ví dụ như 7,8,9-

trihydroxythymol (EfD 4.7) and 8,9,10-trihydroxythymol (EfD 5.1) hoặc 0-coumaric

(EfD 1.8) và p-coumaric lên M. aeruginosa có thể giải thích bằng sự xuất hiện thêm

hoặc bằng vị trí khác nhau của nhóm hydroxyl (OH) lên vòng benzene. Sự có mặt các

nhóm OH làm tăng tính tan trong nước của hợp chất và sự ức chế sinh trưởng M.

aeruginosa của các hợp chất phenol này có thể giảm khi nhóm hydroxyl đính vào

vòng benzene ở vị trí ortho hoặc para, còn ở vị trí meta cho hiệu quả ngược lại [52].

Ngoài ra sự kéo dài mạch cacbon hoặc tác động đồng thời của các hợp chất phân lập

được từ cao chiết có thể cho hiệu quả ức chế sinh trưởng cao hơn so với sự tác động

riêng rẽ của từng chất ở cùng nồng độ [75]. Các hợp chất này có thể là tannin axit

phenol, quinone, alkaloid, các axit béo và hợp chất ester. Sự ức chế của các hợp

chất được tách chiết từ các loài thực vật trên được giải thích là do có khả năng kết

hợp với các protein trong tế bào chất và làm bất hoạt các enzyme α-amylase, lipase

và glucosidase của vi khuẩn [167] hoặc có thể liên kết với các chất ngoại bào, can

thiệp đến quá trình khoáng hóa cacbon và nitơ từ đó làm giảm nguồn dinh dưỡng

của VLK dẫn đến suy giảm sinh khối hoặc có thể ảnh hưởng đến các gen liên quan

đến quá trình quang hợp từ đó ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển và gây chết

[86].

3.2.6. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc tế bào Microcystis aeruginosa và

Chlorella vulgaris

Hình 3.30 A và B cho thấy ảnh hưởng của cao chiết đến M. aerguinosa và Ch.

vulgaris, đặc biệt là tác động lên hình thái và siêu cấu trúc tế bào

110

Hình 3.30. Cấu trúc siêu hiển vi của tế bào M. aeruginosa Kutzing (A) và Ch.

vulgaris Beijerinck. (B) dưới kính hiển vi điện tử truyền qua

Hình 3.30 (A) cho thấy siêu cấu trúc tế bào VKL M. aeruginosa trong

điều kiện nuôi cấy bình thường (không chịu tác động của các cao chiết hoặc

yếu tố bất lợi) có cấu trúc đặc trưng của tế bào vi khuẩn với thành tế bào rõ

ràng, trơn nhẵn, các bào quan nằm gọn trong tế bào với nguyên sinh chất đậm

đặc và đồng nhất [33, 52, 71]. Tế bào Ch. vulgaris có hình cầu hoặc hình elip,

các bào quan nằm gọn trong tế bào, nhìn rõ cấu trúc không bào, các hạt tinh

bột và lipid (hình 3.30 B). M. aeruginosa là vi khuẩn gram âm với thành tế

bào mỏng hơn cấu tạo chủ yếu là peptidoglycan, glycopeptides và

mucopeptide trong khi tế bào Ch.vulgaris có thành tế bào dày, thành phần cấu

tạo chủ yếu là xenllulose [44, 151]. Sự khác biệt về độ dày, cấu trúc hóa học

của thành tế bào mà các cao chiết thẩm thấu dễ dàng hơn và nhanh hơn để xâm

nhập vào bên trong tế bào chủng VLK M. aeruginosa so so với chủng tảo lục

Ch. vulgaris dẫn đến những tổn thương cũng như ức chế sinh trưởng cao hơn.

A3

A B

A6 A10

111

Hình 3.31. Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc siêu hiển vi của tế bào M.

aeruginosa Kutzing dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (A- cao chiết etanol, B-

cao chiết phân đoạn etyl axetat, C- cao chiết phân đoạn nước,

3- sau 3 ngày, 6-sau 6 ngày, 10- sau 10 ngày.

Khi tiếp xúc với cao chiết, cấu trúc tế bào VKL thay đổi theo thời gian, sự biến

đổi tế bào phụ thuộc vào bản chất của từng cao chiết. Ảnh chụp dưới kính hiển vi

điện tử truyền qua cho thấy cấu trúc tế bào M. aeruginosa dưới ảnh hưởng của cao

chiết etanol Mần tưới sau 3 ngày phơi nhiễm đã thay đổi rõ rệt, nguyên sinh chất dần

bị phá hủy, đến ngày thứ 6 quan sát có sự co rút kích thước tế bào, phá hủy dần các

bào quan. Đến ngày cuối thực nghiệm, thành tế bào mất đi sự trơn nhẵn, trở nên gồ

ghề, gấp nếp, kích thước tế bào rất nhỏ so với tế bào ban đầu, nhưng vẫn giữ nguyên

hình cầu. Ngược lại, đối với tế bào tiếp xúc với cao chiết phân đoạn etyl axetat, từ ngày

thứ 3 sự xuất hiện của các lỗ trống (các khoảng không bào), khó quan sát được các bào

quan, nguyên sinh chất mất đi sự đồng nhất, sau 6 ngày khoảng trống không bào tăng

lên và đến ngày thứ 10, tế bào hoàn toàn bị đục rỗng, nguyên sinh chất, các bào quan bị

phá hủy hoàn toàn. Tuy nhiên vẫn quan sát thấy tế bào trọn vẹn vì thành tế bào không bị

quá hủy. Trong ba cao chiết được nghiên cứu, cao chiết nước có ảnh hưởng ít nhất đến

cấu trúc tế bào M. aeruginosa, sau 10 ngày phơi nhiễm, tế bào nhìn chung có sự khác

biệt không đáng kể so với mẫu đối chứng, tế bào hình cầu, nguyên sinh chất vẫn nằm

C6

B3 B6 B10

C10 C3

112

gọn trong thành tế bào, tuy nhiên mất đi sự đồng nhất của nguyên sinh chât, quan sát

thấy các nếp gấp là các thể thylacoid trong tế bào. Cao chiết tổng etanol và cao chiết

phân đoạn etyl axetat Mần tưới làm thay đổi cấu trúc tế bào như ảnh hưởng đến chất

nguyên sinh, phá hủy các bào quan trong đó có cả lục lạp đóng vai trò quan trọng trong

quá trình quang hợp của VKL, nhưng vẫn giữ hình dạng của tế bào. Điều đó giải thích

tại sao hiệu quả ức chế sinh trưởng dựa trên kết quả của phương pháp mật độ quang học

và hàm lượng chlorophyll a ở phần trình bày trên đều cao hơn so với hiệu quả ức chế khi

được tính bằng phương pháp đếm tế bào. Phương pháp đếm trực tiếp tế bào dưới kính

hiển vi quang học Olympus BX51 trong buồng đếm Sedgewick- Rafter ở vật kính 10X

cho phép đếm tất cả các tế bào xuất hiện dưới mặt kính, không phân biệt kích thước to

nhỏ, sự thay đổi màu sắc đậm nhạt của tế bào. Vì vậy có thể tế bào đã bị chết, diệp lục

bị phân hủy một phần hay hoàn toàn nhưng vẫn giữ nguyên cấu trúc hình cầu và do đó

vẫn được tính đếm.

Sự thay đổi cấu trúc siêu hiển vi của tế bào M. aeruginosa dưới tác dụng của các

cao chiết thực vật từ 24 giờ, 48 giờ, hoặc 3, 7, 10 ngày được công bố trong nhiều nghiên

cứu khác nhau [50, 59, 71, 114]. Sự biến đổi cấu trúc tế bào rất đa dạng phụ thuộc vào

thời gian và bản chất của từng cao chiết, sau 7 ngày có quan sát thấy sự co rút kích thước

tế bào, xuất hiện các không bào trắng, thể nguyên sinh chất và các bào quan bị phá hủy

nhưng thành tế bào vẫn nguyên bao gọn các bào quan bên trong [59]. Tuy nhiên, trong

một số trường hợp khác, dưới tác động của cao chiết thành tế bào bị phá hủy hoàn toàn,

giải phóng nguyên sinh chất ra ngoài [71, 114]. Mặc dù hình thái tế bào M. aeruginosa

có thể bị biến đổi khác nhau dưới tác dụng của cao chiết nhưng hậu quả chung của cao

chiết là phá hủy bào quan đặc biệt là màng thylakoid, phá hủy sự dẫn truyền electron,

giảm hiệu suất dẫn truyền điện tử của quá trình quang hợp [114].

Ảnh chụp TEM của tế bào Ch. vulgaris dưới tác động của cao chiết được trình bày

ở hình 3.32. Quan sát sự thay đổi cấu trúc và hình thái tế bào theo các ngày thực nghiệm

cho thấy cao chiết nước có ảnh hưởng không đáng kể so với mẫu đối chứng, tế bào vẫn

giữ nguyên được cấu trúc đồng nhất của nguyên sinh chất, thành tế bào không bị ảnh

hưởng các bào quan vẫn nằm gọn trong tế bào. Ngược lại, cao chiết etyl axetat làm thay

đổi tế bào Ch. vulgaris mạnh mẽ nhất, nguyên sinh chất sau 10 ngày phơi nhiễm bị phá

hủy thay vào đó là các khoảng trống rỗng trong tế bào, không quan sát thấy sự có mặt

của các hạt lipid và tinh bột. Do thành tế bào Ch. vulgaris dày nên không quan sát thấy

113

sự co rút, thu nhỏ kích thước của tế bào như trường hợp tế bào M. aeruginosa dưới ảnh

hưởng của cao chiết etanol.

Hình 3.32. Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc siêu hiển vi của tế bào Ch.vulgaris

Beijerinck. dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (A- cao chiết etanol, B- cao chiết etyl

axetat, C- cao chiết nước, 3- sau 3 ngày, 6-sau 6 ngày, 10- sau 10 ngày)

Nhiều nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của độc tố, đặc biệt là các ion kim loại kích

thước nano lên cấu trúc tế bào Ch. vulgaris cho thấy tiếp xúc với các ion kim loại có thể

dẫn đến phá vỡ thành tế bào, hạt nano hấp thu ở màng và sau đó tương tác trực tiếp với

cấu trúc bên trong gây tổn thương tế bào, phá hủy các chức năng của bào quan cũng như

can thiệp vào các phản ứng sinh hóa [168]. Ngược lại khi tiếp xúc với dung môi hữu cơ

như dichlometan và dichloetan, cấu trúc thành tế bào lại ít bị ảnh hưởng, nhưng cấu trúc

bên trong đặc biệt là thể thylakoids, hoặc lục lạp bị tổn thương mạnh mẽ [169]. Không

nhiều nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của cao chiết thực vật lên hình thái cấu trúc tế bào

A3 A6 A10

B3 B6 B10

C3 C10 C6

114

Ch. vulgaris. Tuy nhiên những đặc điểm về cấu tạo thành tế bào có thể giúp cho loài vi

tảo này có khả năng chống lại tốt hơn ảnh hưởng của các độc tố nói chung và của cao

chiết thực vật nói riêng so với chủng VKL độc M. aeruginosa.

Nhân xét kết quả đạt được của phần 3.2

1. Đánh giá ảnh hưởng của các cao chiết Mần tưới trong các dung môi khác nhau

(etanol, metanol và nước) cho thấy cao chiết tổng etanol có hiệu quả ức chế sinh

trưởng cao nhất là 91,50 % tính theo mật độ quang và 88,28 % tính theo hàm lượng

chlorophyll a. Từ đó lựa chọn dung môi etanol cho quá trình tổng hợp cao chiết tổng

phục vụ cho các bước nghiên cứu tiếp theo.

2. Ức chế sinh trưởng của cao chiết etanol Mần tưới đối với VKL M. aerugniosa và

tảo lục Ch. vulgaris có tính chọn lọc. Ba phương pháp đo mật độ quang, hàm lượng

chlorophyll a và mật độ tế bào cho thấy hiệu quả ức chế của cao chiết lên chủng

VKL độc dao động từ 68,60 ÷ 90,13 % trong khi giá trị này đối với chủng tảo lục

là 55,61 ÷ 70,59 %.

3. Cao chiết phân đoạn etyl axetat có độc tính mạnh hơn cao chiết phân đoạn nước lên

cả hai loài M. aeruginosa và Ch. vulgaris với giá trị IE từ 55,6 ÷ 96,16 % trong khi

cao chiết phân đoạn nước tác động lên hai loài nghiên cứu với chỉ số IE là 31,34 ÷

58,62 % (p<0,05). Đã lựa chọn cao chiết phân đoạn etyl axetat để phân lập các chất

sạch để thử hoạt tính trên M. aeruginosa.

4. Phân tích ảnh hưởng của các cao chiết đến siêu cấu trúc tế bào M. aeruginosa và Ch.

vulgaris cho thấy tổn thương tế bào ở mức độ nghiêm trọng khác nhau phụ thuộc

vào cấu trúc tế bào, bản chất cao chiết và thời gian phơi nhiễm. Đặc biệt, cao chiết

etyl axetat gây phân hủy nguyên sinh chất, phá hủy các bào quan và tạo ra cấu trúc

rỗng bên trong tế bào, còn cao chiết etanol làm tế bào bị biến dạng co rút và thu nhỏ

kích thước.

5. Đánh giá hoạt tính diệt VKL độc M. aeruginosa của 07 chất sạch tách chiết từ Mần

tưới cho thấy hợp chất 8,9,10-trihydroxythymol EfD 5.1 có hiệu quả ức chế sinh

trưởng cao nhất tính theo mật độ quang và mật độ tế bào là 45,6 và 49,0 % tại

nồng độ 50 µg/mL sau 72 giờ phơi nhiễm. Hợp chất mới 8,10-didehydro-7,9-

dihydroxytymol(EfD 4.8) cho hiệu quả ức chế sinh trưởng là 39,1 - 41,2 % trong

khi đối với hợp chất 7,8,9-trihydroxythymol(EfD 4.7) là 20-25%.

115

3.3. Kết quả đánh giá tính an toàn của cao chiết thực vật Mần tưới (ảnh hưởng

lên một số sinh vật khác)

Trong nghiên cứu trước đã chứng minh tiềm năng diệt tảo của cao chiết etanol

và etyl axetat Mần tưới với hiệu quả ức chế sinh trưởng 85-90% tại nồng độ 500

µg/mL. Tuy nhiên để đưa vào sử dụng như một hoạt chất diệt tảo trong các hệ sinh

thái thủy vực tự nhiên thì ảnh hưởng của các cao chiết này đến các loài sinh vật khác

không thuộc đối tượng tác động cần phải nghiên cứu kỹ để đưa ra kết luận về tính an

toàn và thân thiện với môi trường. Dưới đây là những kết quả ảnh hưởng của cao

chiết lên D. magna và L. minor - hai đối tượng tiêu biểu thường dùng để đánh giá độc

tính trong thử nghiệm nghiên cứu độc học.

3.3.1. Ảnh hưởng của cao chiết đến giáp xác Daphnia magna

Trong nghiên cứu độc học, nhiều loài sinh vật được sử dụng làm đối tượng kiểm

định độc tố như tảo lục (Ankistrodesmus convolutus and Scenedesmus

quadricauda), bèo (Lemna minor, Spirodella polyrhiza), giáp xác (Daphnia magna), các

loài thực vật phù du, cá nhỏ (Prochilodus lineatus, Larias gariepinus) [12, 55] Daphnia

magna (thuộc nhóm vi giáp xác, động vật phù du) là một trong những loài sinh vật điển

hình trong nghiên cứu độc học và được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu đánh giá độ

an toàn của cao chiết thực vật [55, 84, 170]. Với ưu điểm nổi bật như độ nhạy cảm của

chúng đối với các hợp chất có chứa độc tố, dễ dàng nhận biết và kiểm soát, có khả năng

phân bố rộng và sinh sản nhanh bằng hình thức sinh sản vô tính [170], D. magna được

lựa chọn để kiểm tra đánh giá độc tính của cao chiết từ cây Mần tưới E. fortunei. Tỷ lệ

sống sót của giáp xác D. magna dưới tác động của cao chiết tổng etanol và cao chiết

phân đoạn etyl axetat Mần tưới trong 24 và 48 giờ được trình bày trong hình 3.33 và

3.34. Kết quả nghiên cứu cho thấy độc tính của các cao chiết khác nhau với các nồng độ

và thời gian phơi nhiễm khác nhau ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ sống sót của các cá thể D.

magna một ngày tuổi. D. magna được phơi nhiễm với cao chiết tổng etanol Mần tưới

trong dải nồng độ từ 0 đến 400 µg/mL và phơi nhiễm với cao chiết phân đoạn etyl axetat

Mần tưới từ 0 đến 160 µg/mL.

116

Hình 3.33. Tỷ lệ cá thể sống/chết của D.magna sau 24 giờ (A) và 48 giờ (B) phơi

nhiễm với cao chiết tổng etanol Mần tưới

Hình 3.34. Tỷ lệ cá thể sống/chết của D.magna sau 24 giờ và 48 giờ phơi nhiễm với

cao chiết etyl axetat Mần tưới

Đối với cao chiết etanol Mần tưới, sau 24 giờ phơi nhiễm tỉ lệ phàn trăm cá thể

chết thay đổi từ 0% (đối với các mẫu đối chứng – không bị phơi nhiễm độc tố) đến

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 100 200 240 280 320 360 400

Tỷ l

ệ số

ng c

hết

sau

24

giờ

(%

)

Tỷ lệ chết Tỷ lệ sống

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 100 200 240 280 320 360 400

Tỷ l

ệ số

ng /

chết

sau

48

giờ

(%

)

Nồng độ cao chiết tổng etanol Mần tưới , µg/mL

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 10 20 40 80 120 160

Tỷ l

ệ số

ng c

hết

sau

24

giờ

(%

)

Tỷ lệ chết Tỷ lệ sống

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 10 20 40 80 120 160

Tỷ l

ệ số

ng c

hết

sau

48

giờ

(%

)

Nồng độ cao chiết phân đoạn etyl axetate Mần tưới, µg/mL

A

B

B

A

117

100% (mẫu giáp xác phơi nhiễm cao chiết nồng độ 400 µg/mL. Sau 48 giờ, tỷ lệ chết

của giáp xác tại các nồng độ tương ứng đều cao hơn đạt 82,5% tại 320 µg/mL và tại

360 µg/mL là 100%. Cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới thể hiện độc tính cao

hơn so với cao chiết tổng etanol, sau 24 giờ phơi nhiễm tại nồng độ 160 µg/mL và

sau 48 giờ tại 80 µg/mL thì đã gây chết 100 % các cá thể giáp xác nghiên cứu, trong

khi đối với mẫu đối chứng thì tỷ lệ chết là 0% trong suốt quá trình thực nghiệm.

Bảng 3.13. Giá trị LC50 của cao chiết tổng etanol Mần tưới tại 24 và 48 giờ

Tỷ lệ chết

Nồng độ cao chiết tổng etanol

(µg/mL)

Nồng độ cao chiết phân đoạn

etyl axetat (µg/mL)

24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ

LC/EC 1 71,40 37,0 7,80 1,80

LC/EC 5 102,80 59,2 13,20 3,20

LC/EC 10 125,00 76,0 17,60 4,40

LC/EC 15 142,40 90,0 21,20 5,40

LC/EC 50 247,80 183,2 47,40 13,60

LC/EC 85 431,20 373,4 105,80 34,20

LC/EC 90 491,60 442,0 128,00 42,40

LC/EC 95 596,80 567,2 169,60 58,60

LC/EC 99 859,20 885,8 287,80 107,40

Trong nghiên cứu này tác giả sử dụng giá trị LC50 (lethal concentration) or EC50

(Half maximal effective concentration) là nồng độ của cao chiết mà tại đó làm chết

50% sinh vật thí nghiệm. Tại nồng độ 400 µg/mL cao chiết etnaol Mần tưới gây 100%

chết đối với D. magna, tuy nhiên giá trị LC50 tại 24 và 48 giờ ghi nhận trên D. magna

là 247,80; 183,2 µg/mL, cao hơn giá trị IC50 của Mần tưới lên M. aeruginosa (IE50

119,3 µg/mL) [2]. So sánh ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol Mần tưới lên M.

aeruginosa cho thấy tại nồng độ 200 µg/mL cao chiết tổng Mần tưới gây ức chế

sinh trưởng lên M. aeruginosa, IE là 50-55 % và tại nồng độ 500 µg/mL gây chết

trên 90 % với M. aeruginosa. Tuy nhiên nồng độ này đồng thời cũng gây chết 100

% với D. magna. Đối với cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới, quan sát thấy

độc tính rất mạnh lên D. magna ghi nhận giá trị LC/EC50 sau 24 giờ là 47,40 µg/mL

và sau 48 giờ là 13,60 µg/mL và tại nồng độ 160 µg/mL gây chết 100 % cá thể D.

118

magna nghiên cứu. Ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn lên M. aeruginosa tại nồng

độ 200 µg/mL giá trị IE từ 75-80 %.

Giá trị đo DO và pH của các mẫu đối chứng cũng như các mẫu thực nghiệm bổ

sung cao chiết tổng và phân đoạn được đo tại 0 và sau 48 giờ. Kết quả (bảng 3.11 và

bảng 3.12) cho thấy có sự thay đổi không đáng kể giá trị DO và pH của mẫu cao chiết

tổng cụ thể ở thời điểm bắt đầu các giá trị này dao động từ 7,77 ÷7,92 mg/L và 6,07÷7,78

sau 48 giờ ghi nhận sựu thay đổi là 6,72 ÷ 7,72 mg/L và 6,55 ÷ 7,57. Đối với cao chiết

phân đoạn etyl axetat Mần tưới giá trị DO thời điểm bắt đầu (0 giờ) là 7,77 ÷ 7,88 mg/L

và pH từ 7,44 ÷7,78 sau 48 giờ thực nghiệm giá trị có chút thay đổi không đáng kể, lần

lượt là DO: 6,44 ÷ 7,72 mg/L và pH: 7,03 ÷ 7,49. Sự thay đổi hai thông số quan trọng

này vẫn nằm trong giới hạn cho phép để đảm bảo giáp xác D.magna sinh trưởng và phát

triển bình thường. D. magna có khả năng chịu đựng tốt trong điều kiện môi trường có

chỉ số oxy hòa tan thấp (DO) ví dụ tỉ lệ sống sót đạt 85 % khi DO là 1,8 mg/L, đạt hơn

90% khi DO có giá trị 2,7; 3,7 và 7,6 mg/L. Tuy nhiên, chỉ số OD thấp có thể làm giảm

khả năng D. magna thích nghi với các điều kiện khác của môi trường, khi D. magna tiếp

xúc với nồng độ DO thấp nhất được thử nghiệm (1,8 mg/L) đã làm giảm đáng kể phản

ứng đối với các thông số khác. Ngoài ra, khi sống trong môi trường có chỉ số DO là 2,7

mg/L, D. magna có trọng lượng ít hơn so với các mẫu đối chứng [171]. pH là một chỉ số

quan trọng của môi trường nước vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến các loài sinh vật sống

thông qua các hoạt động sinh lý như quá trình trao đổi ion và quá trình hô hấp. Theo

nghiên cứu trước đây, tại pH 8,33 D. magna ghi nhận tỷ lệ sống và tăng trưởng cao nhất

và điều kiện tối ưu là pH từ 7,9 đến 8,3. Khi pH môi trường giảm xuống 4,66 ÷ 4,44 hoặc

tăng lên 10,13 ÷10,55 giảm tỷ lệ sống sót và giảm khả năng tăng trưởng của loài Daphnia

[172]. Như vậy, giá trị pH của thực nghiệm dao động từ 6,5 ÷ 8,0 vẫn đảm bảo điều kiện

sinh trưởng tốt cho D. magna. Tùy thuộc vào thành phần hóa học của cao chiết bổ sung,

giá trị pH của môi trường được xử lý mẫu có thể tăng (flavonoid, các thành phần alkaloid)

hoặc giảm (trong trường hợp bổ sung thêm các hợp chất phenolic). Trong nghiên cứu

này, giá trị pH của tất cả các mẫu thực nghiệm đều thấp hơn một chút so với giá trị pH

của các mẫu đối chứng tại thời điểm bắt đầu và sau 48 giờ. Điều này có thể giải thích bởi

sự hiện diện của các hợp chất tương tự như các hợp chất polyphenolic trong cả cao chiết

119

etanol và cao chiết phân đoạn etyl axetat. Sự khác biệt về thành phần và tỷ lệ flavonoid

và axit phenolic trong các chất chiết xuất dẫn đến một số quá trình hóa học như quá trình

oxy hóa hoặc quá trình khử có thể xảy ra là nguyên nhân cho những thay đổi về giá trị

pH.

Bảng 3.14. Giá trị DO và pH của mẫu phơi nhiễm cao chiết tổng etanol Mần tưới

tại 0 và sau 48h

Nồng độ tổng

(mg/L) DO (T0) DO (T48) pH (T0) pH (T48)

0,00 7,77 7,72 7,78 7,42

100,00 7,76 7,52 6,87 7,54

200,00 7,82 7,40 6,57 7,56

240,00 7,85 7,57 6,07 7,57

280,00 7,92 6,83 6,18 6,76

320,00 7,86 6,72 6,17 6,55

360,00 7,86 7,34 6,15 7,14

Bảng 3.15. Giá trị DO và pH của mẫu phơi nhiễm cao chiết etyl axetat Mần tưới tại

0 và sau 48h

Nồng độ phân

đoạn (mg/L) DO (T0) DO (T48) pH (T0) pH (T48)

0 7,77 7,42 7,77 7,42

10 7,87 7,51 7,78 7,49

20 7,85 7,44 7,70 7,44

40 7,88 6,88 7,65 7,37

80 7,83 6,44 7,52 7,17

120 7,86 6,92 7,44 7,15

160 7,85 7,72 7,29 7,03

Theo tìm hiểu của tác giả, chưa có nghiên cứu nào công bố về ảnh hưởng của

cao chiết từ chi Eupatorium nói chung và loài Mần tưới E. fortunei nói riêng lên

D.magna trong những năm gần đây ngoài những nghiên cứu trên các đối tượng vi

khuẩn, kí sinh trùng khác như đánh giá độc tố của các loại cao chiết từ E. fortunei lên

120

Dactylogyrus intermedius (Monogenea)- một loài kí sinh trùng của cá vàng

(Carassius auratus) và ghi nhận giá trị thấp nhất là EC50 dao động 84,9 mg/L sau 48

giờ phơi nhiễm [173].

Đánh giá tính an toàn sinh thái của cao chiết được sử dụng như một hoạt chất

diệt tảo, lên các loài không thuộc đối tượng tác động như D. magna được công bố

trong nhiều nghiên cứu trước đây. Park và cộng sự [84] nghiên cứu cao chiết tổng

methanol cây lúa gạo Oryza sativa L. var. japonica tại 4 nồng độ là 1, 10, 100 và

1000 µg/L cho thấy cao chiết có tác động ức chế chọn lọc giữa M. aeruginosa và D.

magna, ghi nhận giá trị IE lên sinh trưởng của M. aeruginosa đạt 95% tại nồng độ

1000 µg/L sau 7 ngày tác động, nhưng đối với D. magna giá trị này chỉ là 53,3% ở

cùng nồng độ và thời gian nghiên cứu. Kết quả tương tự cũng được nhóm Jancula

[55] công bố khi triển khai thực nghiệm trên cao chiết nước của 5 loài cây thuộc họ

Papaveracea. Giá trị EC50 của 5 loài lên M. aeruginosa dao động từ 19,96 đến 984,81

mg/L trong đó loài Dicranostigma lactucoides và Sanguinaria canadensis ghi nhận

độc tính cao nhất (EC50 20 mg/L). Đối với D. magna, cao chiết nước D. lactucoideslại

có độc tính thấp hơn với EC50 là 81,70 mg/L sau 24 giờ và 31,25 mg/L sau 48 giờ

phơi nhiễm. Các giá trị này với cao chiết nước S.canadensis tương ứng là 82,30 và

62,00 mg/L. Như vậy cao chiết tổng etanol Lúa gạo và cao chiết nước hai loài họ

Papaveracea có ưu điểm hơn so với các cao chiết từ cây Mần tưới E. fortunei vì có

ảnh hưởng chọn lọc giữa loài vi tảo độc M. aerugniosa và loài giáp xác D. magna -

một loài sinh vật có ích trong chuỗi thức ăn. Kết quả nghiên cứu về sự ức chế không

chọn lọc trên đối tượng cần diệt với các loài sinh vật khác có ích trong hệ sinh thái

cũng được nhiều nhóm tác giả công bố [170]. Như cao chiết nước Tetraclinis

articulata (Vahl) Mast được sử dụng như một phương pháp mới để kiểm soát muỗi

(Culexpipiens, Aedescaspius, Culisetalongiareolata, Anopheles maculipennis) ở

vùng đất ngập nước tại Mohammedia, Morocco cho giá trị LC50 tương ứng dao dộng

từ 110 ÷ 220 µg/mL và 210 ÷ 530 µg/mL sau 24 và 48 giờ phơi nhiễm, nhưng cao

chiết này lại có độc tính lên D. magna, ghi nhận giá trị LC50 sau 24 và 48 giờ tương

ứng là 8,17 và 6,49 µg/mL. Kết quả phân tích cho thấy cần phải tiến hành thêm các

nghiên cứu về độc tính bán trường diễn của cao chiết Mần tưới trên đối tượng D.

121

magna để đánh giá sâu hơn ảnh hưởng của cao chiết và cần phải cẩn thận khi đưa cao

chiết vào sử dụng ở quy mô lớn.

3.3.2. Ảnh hưởng của cao chiết đến bèo tấm Lemna minor

Với những ưu điểm như kích thước nhỏ, bề mặt tiếp xúc lớn, sinh sản nhanh,

nhạy cảm với những chất ô nhiễm và là một mắt xích quan trọng của chuỗi thức ăn,

Lemna minor trở thành một trong những đối tượng được sử dụng rộng rãi để triển

khai đánh giá độc tố của các hóa chất bao gồm các chất vô cơ, chất hữu cơ, kim loại,

nano kim loại và nhiều các chất ô nhiễm khác có mặt trong môi trường nước [174].

Trong nghiên cứu này, đánh giá ảnh hưởng của các cao chiết lên sinh trưởng của bèo

Lemna sp. dựa trên nhiều phương pháp khác nhau như đánh giá sự thay đổi tổng số

cánh bèo, sự đổi hình thái ngoài cánh bèo, sự thay đổi trọng lượng tươi và hàm lượng

sắc tố quang hợp chlorophyll a, b.

Kết quả đếm tổng số cánh bèo thay đổi từng ngày từ thời điểm bắt đầu (T0) và

thời điểm 5 ngày kết thúc thí nghiệm (T5) cho thấy ảnh hưởng của cao chiết tổng và

cao chiết phân đoạn etyl axetat lên bèo Lemna sp. là khác nhau (p<0,05). Ở mẫu đối

chứng số lượng cánh bèo ngày đầu là 90 và tăng liên tục cho đến ngày T5 đạt giá trị

343÷375. Dưới tác động của cao chiết tổng etanol Mần tưới, số lượng cánh bèo biến

đổi không đáng kể tại nồng độ 200 µg/mL, khi tăng nồng độ đến 500 µg/mL, số lượng

giảm xuống còn 311 ± 12, ghi nhận hiệu quả ức chế sinh trưởng là 16 %. Tại nồng

độ thấp từ 50 ÷ 200 µg/mL cao chiết phân đoạn etyl axetate Mần tưới cũng có ảnh

hưởng tương tự như cao chiết tổng lên số cánh bèo L. minor (hình 3.35B). Tuy nhiên

tại nồng độ cao hơn là 500 µg/mL, cao chiết phân đoạn thể hiện độc tố rất mạnh làm

số lượng cánh bèo chỉ tăng lên trong một hai ngày đầu tiên và dừng lại, tại ngày T5

giá trị IE thu được là 70 %, tương tự như ảnh hưởng của hoạt chất CuSO4 5 µg/mL

lên bèo L. minor (hình 3.35A và 3.35B).

122

Hình 3.35. Ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol (A) và phân đoạn etyl axetat Mần

tưới (B) lên tổng số cánh bèo L. minor

Quan sát sự thay đổi hình thái bên ngoài của cánh bèo dưới tác động của

các cao chiết thực vật và hoạt chất CuSO4 cho kết quả tương đối phù hợp với kết

quả phân tích ở trên (Hình 3.36 và 3.37).

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

T0 T1 T2 T3 T4 T5

Số

cán

h b

èo

Thời gian (ngày)

Control-L.minor

CuSO4-5

E- Eth-500

E-Eth-200

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

T0 T1 T2 T3 T4 T5

Số c

ánh b

èo

Thời gian (ngày)

Control -L.minor

E-Ethyl- 500

E-Ethyl- 200

E-Ethyl- 100

E-Ethyl- 50

A

B

123

A. Control

B. CuSO4

C. E-Ethanol 200

D. E-Ethanol 500

Hình 3.36. Hình thái ngoài của cánh bèo L.minor sau 5 ngày phơi nhiễm cao chiết

tổng ethanol Mần tưới

Control- L.minor

E-Ethyl 500

E-Ethyl 200

E-Ethyl 100

E-Ethyl 50

Hình 3.37. Hình thái ngoài của cánh bèo L.minor sau 5 ngày phơi nhiễm cao chiết

tổng phân đoạn etyl axetat Mần tưới

Các cánh bèo L. minor trong mẫu đối chứng, mẫu thực nghiệm bổ sung cao chiết

tổng etanol Mần tưới nồng độ 200 -500 µg/mL và mẫu bổ sung cao chiết phân đoạn

etyl axetat Mần tưới nồng độ từ 50 ÷ 200 µg/mL ở trạng thái khỏe mạnh, cánh bèo

xanh, đẹp và phát triển tốt. Ngược lại, đối với mẫu bèo L. minor tiếp xúc với cao chiết

phân đoạn etyl axetat Mần tưới nồng độ 500 µg/mL và CuSO4 5µg/mL các cánh bèo

124

bị tách rời nhau sau 3h tiếp xúc, chuyển sang màu vàng nâu tại ngày T2, ngừng quá

trình gia tăng cánh bèo, đến ngày cuối T5 chuyển sang màu nâu đậm hoặc màu trắng..

Tiến hành phân tích trọng lượng tươi của bèo sau 5 ngày tiếp xúc với các cao chiết

cho kêt quả ở hình 3.38. Dưới ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol Mần tưới bèo L.

minor vẫn gia tăng sinh khối theo thời gian. Ở công thức đối chứng, trọng lượng tươi gia

tăng gấp hơn 3 lần sau 5 ngày phát triển với thời điểm ban đầu sinh khối tươi là 15,3 ±

2,7 mg. Sinh khối tươi với các mẫu E-Eth200, E-Eth500 và CuSO4-5 tại ngày cuối lần

lượt là 42,5 ± 2,08; 35,6 ± 2,69 và 6,20 ± 0,41 mg, cho hiệu quả ức chế tương ứng là

10,63; 25,18 và 86,93 %.

Hình 3.38. Sinh khối tươi của bèo L.minor dưới tác động của cao chiết etanol (A) và cao

chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới (B) tại thời điểm bắt đầu (T0) và sau 5 ngày (T5)

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

T0 T5

Sin

h k

hôi

tươ

i (

mg)

Control-L.minor

CuSO4-5

E- Eth-500

E-Eth-200

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

T0 T5

Sin

h k

hối

tươ

i (m

g)

Control - L.minor

E-Ethyl- 500

E-Ethyl- 200

E-Ethyl- 100

E-Ethyl- 50

A

B

125

Đối với cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới hiệu quả ức chế ghi nhận từ

5,83 đến 10,87% tại nồng độ từ 50 đến 200 µg/mL. Khi tiếp xúc với cao chiết này ở

nồng độ cao hơn bèo bị suy giảm khối lượng và chỉ đạt 9,0 ± 1,25 mg, tương ứng với

hiệu quả ức chế sinh trưởng của cao chiết lên bèo là 77,76%.

Hình 3.39. Hàm lượng sắc tố quang hợp của bèo L.minor dưới tác động của cao

chiết etanol (A) và cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới (B) tại thời điểm bắt đầu (T0)

và sau 5 ngày (T5)

Mẫu cao chiêt phân đoạn etyl axetat Mần tưới 500 µg/mL và mẫu hoạt chất

đồng tác động mạnh lên cánh bèo, làm giàm hàm lượng sắc tố quang hợp chlorophyll

a và b so với mẫu đối chứng (hình 3.39B). Ở mẫu đối chứng, hàm lượng chlorophyll

a và b phân tích là 0,35 ± 0,03 và 0,13 ±0,01 mg/g.sinh khối tươi trong khi đó tại

mẫu E-Ethyl-500 và CuSO4-5 giá trị thu được tương ứng là 0,150 ± 0,039; 0,11 ±

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

Control - L.minor CuSO4-5 E- Eth-500 E-Eth-200

Hàm

lư

ợng s

ắc t

ố q

uan

g h

ợp

(mg/g

FW

)

Chla Chlb Chl (a+b)

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

Control- L.minor E-Ethyl- 50 E-Ethyl- 100 E-Ethyl- 200 E-Ethyl- 500

Hầm

lư

ợng s

ắc tố

quan

g h

ợp

(mg/g

FW

)

Chla Chlb Chla + b

A

B

126

0,013 và 0,10 ± 0,01; 0,10 ± 0,10 mg/g.sinh khối tươi. Các phương pháp phân tích

được áp dụng trên đã chứng minh rằng mẫu cao chiết tổng etanol Mần tưới gây ảnh

hưởng thấp đến bèo L. minor ngay cả ở nồng độ 500 µg/mL ghi nhận hiệu quả ức chế

từ 16 đến 25%, ngược lại cao chiết phân đoạn etyl axetat 500 µg/mL có độc tố cao

đối với bèo L. minor, tương tự với độc tố của hoạt chất CuSO4 5 µg/mL với hiệu quả

ức chế sinh trưởng từ 75 đến 85% (p< 0,05).

Sự khác nhau về độc tính của cao chiết tổng và cao chiết phân đoạn lên D.

magna và L. minor có thể giải thích do cùng chứa thành phần các hợp chất polyphenol

như nhau nhưng cao chiết phân đoạn etyl axetat có nhiều hơn các hợp chất flavoniold

và axit phenolic vì thế có độc tích cao hơn và cũng có khả năng kháng khuẩn cao hơn

[70]. Các hợp chất phenol này cũng đã được chứng mình ảnh hưởng bất lợi lên sinh

trưởng các loài [175]. Như vậy kết quả nghiên cứu khẳng định cao chiết tổng etanol

Mần tưới có khả năng ức chế chọn lọc lên M. aeruginosa so với bèo L .minor. So

sánh kết quả với các nghiên cứu trước đây, tác giả không thấy nghiên cứu nào đánh

giá ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới lên bèo L. minor, còn ảnh hưởng của các cao

chiết được chiết suát từ các loài thực vật khác lên bèo Lemna.sp cũng được công bố

trong nhiều nghiên cứu [55, 175-177]. Kết quả tương tự được nhóm nghiên cứu

Jančula công bố năm 2007 trên dịch chiết nước của các loài họ Papaveraceae khi so

sánh độc tố của cao chiết các loài cây trên M. aeruginosa, cũng cho thấy khẳ năng

tác động chọn lọc của cao chiết giữa chủng VKL độc và các loài khác trong đó có

L.minor [55].

Tóm tắt kết quả đạt được của phần 3.3.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các cao chiết Mần tưới lên D. magna cho thấy giá trị LC50

trong 24 và 48 giờ đối với cao chiết etanol là 247,80 và 183,2 µg/mL tương ứng, cao

hơn so với cao chiết etyl axetat tương ứng 47,40 và 13,60 µg/mL. Các giá trị DO và

pH của mẫu thực nghiệm dao động từ 6,64 -7,7 mg/L và 6,65 – 7,49 vẫn nằm trong

giới hạn cho phép.

- Nghiên cứu trên bèo tấm L. minor cho thấy cao chiết etanol Mần tưới ảnh hưởng nhẹ

đến loài bèo tấm, có sự khác biệt không đáng kể giữa mẫu đối chứng với mẫu thực

nghiệm nồng độ 500 µg/mL. Ngược lại, cao chiết etyl axetat có độc tính mạnh đối

127

với bèo khi phá hủy hoàn toàn cánh bèo, chuyển màu của lá, làm rụng rễ bèo và ức

chế sinh trưởng tới 80% tính theo trọng lượng tươi

3.4. Bước đầu thử nghiệm ảnh hưởng của cao chiết lên sinh trưởng VKL độc

trong mẫu nước hồ tự nhiên

3.4.1. Kết quả thử nghiệm trên mẫu nước hồ Hoàn Kiếm quy mô 5L tại phòng thí

nghiệm

Phương pháp đo hàm lượng chlorophyll a (các ngày T0, T3, T6 và T10) và

phương pháp đếm tế bào (ngày T0 và ngày T10) được sử dụng để đánh giá tăng

trưởng của nhóm thực vật nổi trong nước hồ Hoàn Kiếm dưới ảnh hưởng của cao

chiết E-Ethanol-500, E-Ethyl 500 và của CuSO4-5. Kết quả thu được trình bày trong

hình 3.40 và 3.41.

Hình 3.40. Sự biến đổi sinh khối thực vật nổi (theo hàm lượng chlorophyll a) của mẫu

đối chứng, mẫu CuSO4 và mẫu bổ sung cao chiết trong mẫu nước hồ Hoàn Kiếm

Hình 3.40 chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa về sinh trưởng của nhóm TVN trong

hồ Hoàn Kiếm giữa mẫu đối chứng với mẫu thực nghiệm E-Ethanol 500, E-Ethyl

500 và CuSO4-5 (p<0,05). Theo kết quả phân tích hàm lượng chlorophyll a, sinh

khối ban đầu của mẫu đối chứng ngày T0 là 25,34 ± 1,15 µg/L và tăng liên tục

trong suốt 10 ngày thí nghiệm, ở ngày cuối sinh khối đạt giá trị lớn nhất là 34,32

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

T0 T3 T6 T10

Hàm

lư

ợng c

hlo

rophyll

a, µ

g/L

Thời gian (ngày)

Control - HK CuSO4-5 E-Ethanol-500 E-Ethyl-500

128

± 2,15 µg/L. Ngược lại ở các mẫu có bổ sung hoạt chất, sinh khối TVN giảm dần

theo các ngày, nếu ngày đầu tiên T0 ghi nhận ở các mẫu CuSO4, E-Ethanol 500 và

E-Ethyl 500 tương ứng là 24,89 ± 2,75 µg/L; 25,95 ± 1,58 µg/L và 26,16± 1,37

µg/L, ngày cuối thí nghiệm, hàm lượng chlorophyll a tương ứng ghi nhận thấp hơn

lần lượt là 18,91± 1,80 µg/L; 22,41 ± 1,15 µg/L và 17,19± 1,75 µg/L. Theo công

thức tính hiệu quả ức chế sinh trưởng (IE) của Park [75] thì giá trị IE tính theo

hàm lượng chlorophyll a cao nhất đối với mẫu E-Ethyl 500 là 49,91%, tiếp theo

mẫu CuSO4-5 - 44,90 % và E-Ethanol 500 là 34,70 %

Hình 3.41. Biến động mật độ tế bào thực vật phù du nghiên cứu trên mẫu nước hồ

Hoàn Kiếm ngày T0 (A) và T10 (B) dưới ảnh hưởng của các cao chiết Mần tưới

Hình 3.41 A và B cho thấy thành phần và mức độ ảnh hưởng của các cao chiết

cũng như hợp chất CuSO4 đến nhóm TVN trong mẫu nước Hồ Hoàn Kiếm, nói chung

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

Control-HK CuSO4-5 E-Ethanol-500 E-Ethyl-500

Mật

độ t

ế bào

x 1

05

TB

/mL

Microcystis sp

VKL khác

Tảo lục & tảo silic Nhóm TVN

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

Control - HK CuSO4-5 E-Ethanol - 500 E-Ethyl- 500

Mật

độ t

ế bào

×10

5 T

B/m

L Microcystis sp

VKL khácTảo lục & tảo silic Nhóm TVN

A

B

129

và Microcystis sp., nhóm VKL độc, nhóm tảo lục và tảo silic, nói riêng. Kết quả thu

được chứng minh sự khác biệt có ý nghĩa giữa mẫu đối chứng và các mẫu thực nghiệm

(p<0,05). Phân tích thành phần loài tại ngày đầu (T0) cho thấy trong quần xã TVN

Hồ Hoàn Kiếm, chi Microcystis chiếm ưu thế với tỉ lệ 90-95 %, tảo lục, tảo lam và

tảo silic chỉ chiếm chiếm 4 ± 5 %. Tổng nhóm TVN hồ Hoàn Kiếm ngày đầu ghi

nhận trong các mẫu trung bình là (10,67 ± 0,51) x 106 TB/mL. Nhưng đến ngày T10

có sự khác biệt rõ rệt giữa mẫu đối chứng và mẫu thực nghiệm (p<0,05). Ở mẫu đối

chứng quan sát thấy sự tăng sinh khối của tất cả các loài đặc biệt chủng Microcystis

tăng từ ngày T0 là (10,91 ± 0,37) x 106TB/mL đến ngày T10 là (21,16 ± 1,27) x106

TB/mL, trong khi ở các công thức thực nghiệm còn lại sinh khối chủng Microcystis

giảm mạnh so với mẫu đối chứng ngày T0, cụ thể với mẫu CuSO4-5 chỉ còn (11,77 ±

1,24) x 106 TB/mL; E-Ethanol 500 là (13,16 ± 1,12) x106 TB/mL và E-Ethyl 500

tương ứng là (11,93 ± 1,14) x106 TB/mL. Như vậy hiệu suất ức chế sinh trưởng của

các chất này tương ứng 44,40; 37,82 và 43,61 %.

Trong công thức thực nghiệm phơi nhiễm đồng sunphat, không có sự khác biệt

về hiệu quả ức chế sinh trưởng giữa chủng Microcystis đối với các nhóm loài khác

như tảo lục, tảo lam và tảo silic (p>0,05), hiệu quả ức chế sinh trưởng (giá trị IE) của

hoạt chất CuSO4 tương ứng là 49,04 % và đối với TVN là 46,26%. Kết quả tương tự

được quan sát thấy với mẫu E-Etyl 500, khi hiệu quả ức chế sinh trưởng đối với tất

cả các đối tượng nghiên cứu không có sự khác biệt lớn (p>0,05), IE dao động từ 42,78

đến 46,99 %. Kết quả này cho thấy, giống như hoạt chất đồng sunphat cao chiết phân

đoạn etyl axetate không ức chế chọn lọc giữa các loài Microcystis với các loài còn lại

trong mẫu nghiên cứu. Ngược lại, mẫu E-Ethanol 500 ức chế sinh trưởng tảo lam, tảo

lục và tảo silic là 27,67%, thấp hơn so với tác động lên Microcystis và các loài VKL (IE

tương ứng là 37,81 và 38,21%). Mặc dù hiệu quả diệt Microcystis và VKL của cao chiết

etanol Mần tưới không cao như hoạt chất đồng và cao chiết phân đoạn etyl axetat nhưng

cao chiết này lại có khả năng ức chế chọn lọc lên Microcystis và các loài VKL độc so

với các loài thực vật nổi có ích khác trong mẫu nước hồ Hoàn Kiếm là tảo lục và tảo

silic. Sự khác biệt về hiệu quả ức chế sinh trưởng của cao chiết có thể được giải thích

do mật độ tế bào ngày đầu đã có sự khác nhau lớn, thời gian triển khai thực nghiệm

130

khác nhau dẫn đến các điều kiện môi trường thay đổi, thành phần loài trong nhóm TNV

cũng thay đổi theo. Những yếu tố này ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả thực nghiệm

sinh học về đánh giá hoạt tính của các hợp chất thiên nhiên lên VKL [104, 106].

3.4.2. Kết quả thử nghiệm trên mẫu nước hồ Láng quy mô 5L tại phòng thí nghiệm

Kết quả phân tích sinh khối quần xã mẫu nước từ Hồ Láng ở quy mô 5L bằng

phương pháp đo hàm lượng chlorophyll a được trình bày ở hình 3.42.

Hình 3.42. Sự biến đổi sinh khối thực vật nổi (theo hàm lượng chlorophyll a) của

mẫu đối chứng, mẫu CuSO4 và mẫu bổ sung cao chiết trong nước Hồ Láng

Ở thời điểm ban đầu T0 ghi nhận sinh khối TVN mẫu nước hồ Láng có giá trị

thấp hơn nhiều so với sinh khối TNV nước hồ Hoàn Kiếm. Ở mẫu nước hồ Láng, thời

điểm bắt đầu thí nghiệm ghi nhận hàm lượng chlorophyll a đối với các mẫu dao động

từ 10,42 đến 11,68 µg/L. Trong 10 ngày thí nghiệm, mẫu đối chứng tăng sinh khối

dần dần theo thời gian, tại ngày cuối hàm lượng chlorophyll a tăng nhẹ lên 14,89 ±

1,30 µg/L, trong khi các công thức còn lại sinh khối giảm dần, và sự suy giảm mạnh

nhất quan sát thấy ở mẫu E-Ethyl-500 tại ngày T10 là 6,13 ± 0,94 µg/L tương ứng

giá trị IE là 58,83%, tiếp theo là mẫu CuSO4-5 là 6,76 ± 0,38 µg/L và IE 54,60 %;

mẫu thực nghiệm E-Ethanol 500 là 7,68 ± 1,36 µg/L; IE 48,42 %. Hiệu quả ức chế

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

T0 T3 T6 T10

Hàm

lư

ợng c

hlo

rophyll

a,

µg/L

Thời gian (ngày)

Control CuSO4-5

Ethanol- 500 Ethyl - 500

131

sinh trưởng của các công thức thực nghiệm đều cao hơn so với kết quả thực hiện trên

mẫu nước hồ Hoàn Kiếm (p<0,05).

Hình 3.43. Biến động mật độ tế bào thực vật phù du nghiên cứu trên mẫu nước Hồ

Láng ngày T0 (A) và T10 (B) dưới ảnh hưởng của các cao chiết Mần tưới

Kết quả đếm tế bào của mẫu nước hồ Láng cho thấy có sự khác biệt về thành phần

và tỉ lệ các loài so với mẫu nước hồ Hoàn Kiếm. Các loài Microsystis chiếm 60 -70 %

trong khi VKL khác chiếm 13- 20 % và tảo silic là 5-10%. Tổng số TVN dao động ngày

đầu là (8,43 ± 0,97)× 105 TB/mL đến (9,07 ±1,03) × 105 TB/mL. Đến ngày T10, tổng TNV

của mẫu đối chứng tăng lên (15,67±1,05) × 105 TB/mL, trong khi ở các mẫu bổ sung

CuSO4, hoạt chất E-Ethanol 500; E-Ethyl 500 thì giảm xuống tương ứng là (6,53 ± 0,45)

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

Control - HL CuSO4-5 E-Ethanol-500 E-Ethyl-500

Mật

độ t

ế bào

×10

5T

B/m

L

Mẫu thực nghiệm

Microcystis sp

VKL khác

Tảo lục & tảo silic Nhóm TVN

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

Control-HL CuSO4-5 E-Ethanol-500 E-Ethyl-500

Mật

độ t

ế bào

×10

5T

B/m

L

Mẫu thực nghiệm

Microcystis sp

VKL khác

Tảo lục & tảo silic

Nhóm TVN

A

B

132

× 105TB/mL, (8,83 ± 1,30) ×105 TB/mL và (7,96 ± 0,93) ×105 TB/mL ứng với hiệu suất

ức chế sinh khối tổng TNV lần lượt là 58,33; 43,65 và 49,20 %.

Tương tự như kết quả phân tích trên mẫu nước hồ Hoàn Kiếm, thử nghiệm trên

mẫu nước hồ Láng cho thấy sự ức chế có chọn lọc của cao chiết E-thanol-500 lên

nhóm Microcystis sp. trong quần xã so với hoạt chất đồng và cao chiết phân đoạn etyl

axetat. Tại công thức đồng sunphat nồng độ 5 µg/mL, các loài trong quần xã đều bị

ức chế với giá trị IE dao động từ 55,15 ÷ 59,95 %, mẫu bổ sung cao chiết etyl axetat

IE ghi nhận từ 48,12 ÷ 51,37%, không thấy khác biệt lớn về hiệu quả ức chế giữa

chủng Microcystis với các loài tảo khác trong môi trường (p>0,05). Trong khi đối với

mẫu E-Etanol-500, tỉ lệ ức chế lên Microcystis và VKL dao động 43,43 ÷ 46,44 %

nhưng đối với tảo lục và tảo silic giá trị IE thu được là 34,68 % (p>0,05). Mặc dù cao

chiết E-Ethyl 500 ghi nhận có hiệu quả ức chế chủng Microcystis, loài VKL và tổng

TVN tốt hơn cao chiết E-Ethanol nhưng có độc hơn lên các loài khác trong hệ sinh

thái như tảo lục và tảo silic.

Mật độ các loài TNV trong mẫu nước nghiên cứu là nguyên nhân chính dẫn đến

sự khác biệt về hiệu quả sử dụng cao chiết để kiểm soát sự sinh trưởng bùng nổ các

loài vi tảo trong nước hồ. So sánh kết quả thực nghiệm trên mẫu nước hồ Hoàn Kiếm,

hồ Láng trong nghiên cứu này thấy rằng khi mật độ tế bào trong mẫu tại thời điểm

ban đầu càng cao thì hiệu quả ức chế sinh trưởng của cao chiết càng thấp và ngược

lại. Ví dụ mật độ tế bào TVN trong nước hồ Láng dao động từ (8,43 ÷15,67) × 105

TB/mL, là thấp nhất so với mẫu nước hồ Hoàn Kiếm trong hai thực nghiệm nói trên và

ghi nhận hiệu quả ức chế cao nhất với chủng Microcystis, VKL và TNV, với giá trị IE

là 43,43 ÷ 51,37%. Kết quả nghiên cứu của Lirong cũng cho kết luận tương tự [178],

khi mật độ ban đầu của mẫu nghiên cứu thấp hơn 5 × 106 TB/mL, hiệu quả ức chế sinh

trưởng của cao chiết thể hiện rõ sau 48 giờ thử nghiệm và đạt cao nhất sau 72 giờ. Tuy

nhiên khi mật độ tế bào thực vật nổi lên đến 8 × 107 TB/mL, hiệu quả ức chế quan sát

thấy trong 24÷48 giờ đầu tiên và sau 36 giờ cao chiết không còn thể hiện được tác dụng

ức chế.

Việc triển khai thử nghiệm cao chiết thực vật để ức chế bùng nổ vi tảo độc

trong các mẫu nước hồ tự nhiên cũng được nhiều tác giả nghiên cứu. Năm 2007,

133

Jancular và cộng sự [55] đã sử dụng nước đầm phú dưỡng với mật độ các loài VKL

và các tảo nhân chuẩn chiếm ưu thế, đặc biệt là các loài như Actinastrum sp.,

Dictyosphaerium sp., Mougotia sp., Nitzschia sp., Planktothrix agardhii. Cao chiết

etanol từ cây Chelidonium majus được nhóm tác giả ưu tiên sử dụng vì có tiềm năng

diệt vi tảo độc rất hiệu quả, ngoài ra còn thể hiện độc tính thấp đối với các loài

không thuộc đối tượng tác động như các loài tảo lục, giáp xác và bèo. Sự ức chế có

hiệu quả của cao chiết C. majus có thể được giải thích là do chứa các hợp chất

quaternary benzo [c]phenanthridine alkaloids (QBA) nhưCoptisine, Magnoflorine,

Protopine, Sanguinarine, Cheleryhtrine đặc biệt là Sanguinarine, Magnoflorine

chiếm tỉ lệ lớn nhất đạt 1,37 và 0,35 % trọng lượng khô của rễ cây C. majus.

Nhóm tác giả Zhou năm 2012 triển khai sử dụng cao chiết từ cây keo đen

(Acacia mearnsii) với mẫu nước sông Jinjiang, tại Chengdu, Trung Quốc, ở quy mô

nhỏ với thể tích nghiên cứu là 200 mL, điều kiện trong phòng thí nghiệm và nhiệt

độ được điều chỉnh ổn định là 25oC [86]. Kết quả được đánh giá dựa trên hai thông

số là hàm lượng chlorophyll a và mật độ tế bào. Hiệu quả ức chế sinh trưởng của

cao chiết tính theo mật độ tế bào đạt 59 % sau 11 ngày phơi nhiễm. Tuy nhiên sau

14 ngày thì hiệu quả ức chế giảm xuống so với mẫu đối chứng là 29 % (p<0,05) do

quá trình phân hủy tự nhiên của cao chiết trong môi trường. Sau hai tuần triển khai

80% cao chiết đã được phân hủy chứng minh tính an toàn, không bị tích lũy trong

môi trường khi sử dụng như một hoạt chất diệt tảo. Theo tác giả, hoạt tính chống

các loài vi khuẩn lam của cao chiết cây keo đen là do tannin, có khả năng kết hợp

với các protein trong tế bào chất và làm bất hoạt các enzyme α-amylase, lipase và

glucosidase của vi khuẩn [167] hoặc có thể liên kết với các chất ngoại bào, can thiệp

đến quá trình khoáng hóa cacbon và nitơ từ đó làm giảm nguồn dinh dưỡng của

VLK dẫn đến suy giảm sinh khối [178, 179]. Nhóm tác giả cũng đánh giá ảnh hưởng

của cao chiết lên TVN như họ Pseudanabaenaceae, Cyclotella…và các họ động vật

phù du như Calanoida, Cladocera, Cyclops chiếm ưu thế trong các thủy vực phú

dưỡng. Sau thực nghiệm quan sát thấy sự giảm số lượng đáng kể các loài này đặc

biệt là các động vật phù du kích thước nhỏ (<1mm). Nhóm tác giả Lirong cho kết

quả ngược lại khi triển khai thử nghiệm cao chiết lên mẫu nước hồ trong 40 ngày

134

[178]. Nghiên cứu phân tích ảnh hưởng của cao chiết đến các loài thủy sinh trong

môi trường theo chiều hướng tích cực. Sự ảnh hưởng này là do khi bổ sung hoạt

chất vào môi trường, dẫn đến giảm số lượng nhóm loài TNV, làm cho các loài động

vật thủy sinh cỡ nhỏ như Alonella sp., Chydorus sp., Trichocerca sp. Centropyxis

sp. giảm theo do hạn chế về nguồn thức văn, dẫn đến tăng mật độ các loài động vật

phù du cỡ lớn như Cladocera. sp. Hiệu quả làm trong mẫu nước, tăng sự đa dạng

các loài đặc trưng và môi trường sinh thái được duy trì ổn định. So sánh hiệu quả

ức chế của hai loại cao chiết thực vật từ cây Mần tưới, cao chiết tổng etanol được

lựa chọn để triển khai thử nghiệm ở quy mô ngoài trời do những ưu điểm nổi bật so

với cao chiết phân đoạn etyl axetat như hiệu quả ức chế VKL cao, ít độc hơn với C.

vulgaris, Daphnia magna, Lemna minor cũng như các loài tảo lục và tảo silic trong

quần thể thực vật nổi trong mẫu nước hồ tự nhiên (hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng).

3.4.3. Kêt quả thử nghiệm trên mẫu nước hồ Láng quy mô ngoài trời

Dựa vào kết quả thử nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm với mẫu nước hồ

Hoàn Kiếm và hồ Láng dung tích 5L, cao chiết etanol Mần tưới có khả năng ức chế

chọn lọc lên VKL độc do đó được lựa chọn để triển khai thử nghiệm quy mô ngoài

trời. Mẫu nước lấy từ hồ Láng là đối tượng được lựa chọn vì phù hợp với yêu cầu

của thực nghiệm đồng thời luận lợi cho quá trình thu mẫu với thể tích lớn (2,7 m3).

Phương pháp đo hàm lượng chlorophyll a và đếm tế bào được sử dụng để đánh giá

ảnh hưởng của cao chiết thực vật lên nhóm thực vật nổi hồ Láng. Kết quả phân tích

được trình bày tại hình 3.44 và 3.45.

135

Hình 3.44. Sự biến đổi sinh khối thực vật nổi (theo hàm lượng chlorophyll a) của

mẫu etanol Mần tưới trong nước Hồ Láng quy mô ngoài trời

Phân tích hàm lượng chlorophyll a cho thấy ở điều kiện tự nhiên, không khuấy

trộn, mẫu đối chứng (Control-HL) có sự suy giảm sinh khối dần theo thời gian thực

nghiệm, tại ngày T0 giá trị đo được là 14,35 ± 0,97 µg/L, trong khi ngày T10 là 11,04

±1,25 µg/L. Sự suy giảm này có thể giải thích do sự thiếu hụt về chất dinh dưỡng khi

thực nghiệm thiết kế là một hệ kín không được bổ sung chất dinh dưỡng từ các nguồn

bên ngoài. Ở các mẫu thực nghiệm sự suy giảm mạnh hơn, cụ thể ở mẫu hoạt chất

đồng CuSO4-5 và E-Ethanol 500 hàm lượng chlorophyll a ngày T0 là 15,70 ± 1,26

µg/L; 15,17± 1,18 µg/ và đến ngày T10 chỉ còn 5,31± 0,78 µg/L, 6,36 ± 0,94 µg/L

cho hiệu quả ức chế sinh trưởng tương ứng là 51,90 và 42,39 %.

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

T0 T1 T3 T6 T10

Hàm

lư

ợn

g c

hlo

rop

hyll

a (

µg/L

)

Thời gian (ngày)

Control CuSO4-5 E- Ethanol- 500

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

Control - HL CuSO4-5 E-Ethanol - 500

Mật

độ t

ế bào

x 1

05

TB

/mL

Mẫu thực nghiệm

Microcystis sp VKL khác

Tảo lục & tảo silic Nhóm TVNA

136

Hình 3.45. Mật độ tế bào thực vật phù du nghiên cứu trên mẫu nước Hồ Láng quy

mô ngoài trời ngày T0 (A) và ngày T10 (B)

Kết quả đếm tế bào cho thấy chủng Microsystis chiếm 77,76 - 83,45 % trong

khi tảo lục chiếm 13 - 20 % và tảo silic là 5-10%. Hình 3.45, cho kết quả đếm tế bào

của mẫu nước hồ Láng tại ngày thứ 10, quan sát thấy tổng sinh khối TNV là (9,76

±1,05) × 105 TB/mL), giảm nhẹ so với ngày T0 là (13,64 ±1,85) × 105 TB/mL. Mẫu

CuSO4-5 gây độc với các loài trong quần xã với hiệu quả ức chế IE là 41,53 ÷

45,56%, không quan sát thấy sự ức chế chọn lọc lên các chủng Microcystis so với

tảo lục và tảo silic, trong khi đối với mẫu E-Ethanol-500 hiệu quả ức chế đối với

các loài Microcystis là 39,92 %, TVN là 30,63% còn đối với các loài khac thấp như

với tảo lục và tảo silic có IE là 28,55 %. Kết quả phân tích cho thấy tiềm năng sử

dụng cao chiết tổng etanol Mần tưới để kiểm soát bùng phát sinh khối VKL và vi

tảo độc.

Triển khai mở rộng từ quy mô phòng thí nghiệm ra quy mô pilot để đánh giá

tiềm năng của cao chiết sử dụng như một hoạt chất diệt tảo được nhiều nhóm nghiên

cứu tiến hành. Lirong Z và cộng sự [178] sử dụng mẫu nước phú dưỡng từ sông tại

Kofu, Shanli, Nhật Bản của để đánh giá hiệu quả kiểm soát bùng nổ sinh khối vi tảo

độc của cao chiết cây keo Acacia mimosa trong thời gian 36 ngày với nồng độ 2 mg/L

được bổ sung vào hàng tuần vào 59,4L nước hồ. 100 mL mẫu nước bề mặt được lấy

đi nghiên cứu để xác định mật độ tế bào, giá trị pH, DO, nhiệt độ, thành phần động

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

Control - HL CuSO4-5 E-Ethanol - 500

Mật

độ t

ế bào

×10

5T

B/m

L

Mẫu thực nghiệm

Microcystis sp VKL khác

Tảo lục & tảo silic Nhóm TVN

B

137

vật, thực vật nổi. Kết quả cho thấy cao chiết làm giảm mạnh sinh khối của M.

aeruginosa; giá trị IE đạt 47,3 %, giảm độc tố microcystin-LD phát sinh vào môi

trường. Sau 36 ngày mật độ sinh trưởng của các loài VKL chỉ còn bằng 33,33 % so

với mẫu đối chứng. Hậu quả của quá trình cạnh tranh sinh học khi các loài TNV bị

suy giảm dẫn đến các loài động vật kích thước nhỏ như Alonella sp., Chydorus sp.,

Trichocerca sp. và Centropyxis sp. giảm theo do sụt giảm nguồn thức ăn trong khi đó

các loài động vật kích thước lớn hơn như Simocephalus sp. có xu hướng tăng mạnh.

Thử nghiệm về độc tính cho thấy LC50 của cao chiết lên Oryzias latipes trong 96h là

67 mg/L và LC50 trên chuột là 100 mg/L. Như vậy theo tác giả, việc sử dụng cao chiết

với nồng độ từ 2 ÷6 mg/L để kiểm soát bùng nổ VKL đối với các mẫu nước tự nhiên

là an toàn với các loài không thuộc đối tượng tác động. Thực tế, cao chiết A. mimosa

đã được áp dụng triển khai với hơn 20 hồ nước phú dưỡng ở Nhật Bản và Trung

Quốc, đã góp phần cải thiện môi trường sinh thái thủy vực [180]. Dịch chiết từ rơm

lúa mạch được sử dụng trên quy mô diện rộng 1ha nước hồ tại Mỹ với nồng độ nghiên

cứu từ 5÷60g/m3 [80]. Kết quả cho thấy trong tuần đầu không thấy sự khác biệt giữa

các mẫu, đến tuần thứ 9-10, dịch chiết mới thể hiện sự ức chế mạnh nhưng đến tuần

thứ 14 thì không quan sát sự giảm sinh khối thực vật phù du so với mẫu đối chứng.

Ngoài ra ở nồng độ thấp, rơm lúa mạch còn kích thích sinh trưởng một vài loài trong

nhóm TNV như Prorcentrum minimum, điều này liên quan đến việc hình thành các

phức của kim loại, cung cấp thêm dinh dưỡng do sự phân hủy rơm. Do đó khi sử dụng

các hoạt chất diệt tảo nguồn gốc thiên nhiên thì cần lưu ý nồng độ vì yếu tố này dễ bị

tác động bởi tự nhiên như mưa hoặc tự phân hủy làm giảm nồng độ cao chiết không

mong muốn.

3.4.4. Ảnh hưởng của cao chiết thực vật đến các thông số môi trường

3.4.4.1. Ảnh hưởng của cao chiết đến các thông số thủy lý

Để đánh giá ảnh hưởng của cao chiết đến chất lượng môi trường nước khi triển

khai thử nghiệm với mẫu nước tự nhiên từ hồ Hoàn Kiếm, hồ Láng quy mô 5Lvà mẫu

nước hồ Láng quy mô 300L, các thông số thủy hóa (nhiệt độ, độ mặn, độ dẫn diện,

độ đục, oxy hòa tan..), được xác định tại thời điểm bắt đầu và liên tục trong suốt 10

ngày thực nghiệm. Các thông số thủy lý được xác định tại một thời điểm nhất định

138

trong ngày (10 giờ sáng) và đo hằng ngày bằng thiết bị đo đa chỉ tiêu WQC 22A

TOA, Nhật Bản (bảng 3.16; 3.17 và 3.18). Nhiệt độ trong mẫu nước nghiên cứu dao

động từ 21 đến 25 0C, đây là khoảng nhiệt độ phù hợp với tốc độ sinh trưởng của thực

vật phù du. Các thông số khác như độ mặn, độ dẫn điện có sự khác biệt không đáng

kể giữa mẫu đối chứng và các công thức thực nghiệm. Độ đục là một thông số vật lý

quan trọng đánh giá mức độ ô nhiễm của nguồn nước. Độ đục ảnh hưởng đến khả

năng chiếu sáng xuyên sâu qua cột nước và do đó ảnh hưởng gián tiếp đến hiệu quả

quang hợp của các loài thực vật phù du, và thồng thời ảnh hưởng đến nhiều thông số

môi trường khác (nhiệt độ, độ dẫn điện). E-Ethanol 500 đối với mẫu nước hồ Hoàn

Kiếm độ đục lên đến 210 NTU trong ngày đầu thí nghiệm. Độ đục của mẫu thực

nghiệm tăng cao so với mẫu đối chứng chủ yếu do bổ sung cao chiết có màu đặc biệt

là màu xanh của diệp lục chlorophyll a và b trong mẫu với nồng độ cao. Theo các báo

cáo, độ đục đo tại hồ Hoàn Kiếm thường dao động 50-150 NTU, tuy nhiên tại thời

điểm nước hồ có “tảo nở hoa” độ đục có thể lên tới 215 NTU [25]. Theo quan sát và

phân tích thực nghiệm thì độ đục của các mẫu cao chiết có xu hướng giảm mạnh trong

suốt quá trình thực nghiệm từ 2-3 ngày. Điều này được giải thích do sự tự phân hủy

các mẫu cao chiết trong điều kiện tự nhiên giàu oxy và các hợp chất oxi hóa khác có

trong môi trường trung bình 50% cao chiết tự phân hủy trong tuần đầu tiên và sau 02

tuần thì giá trị này đạt đến 80% [86].

Khi bổ sung cao chiết, pH của mẫu thực nghiệm (pH 6,67÷7,03) giảm nhẹ so

với mẫu đối chứng (pH 8,82 ÷ 10,46). Hiện tượng giảm pH khi bổ sung cao chiết

cũng được công bố trong các nghiên cứu trước đây [86, 178, 181]do việc bổ sung

thêm các axit hữu cơ từ cao chiết như các loại axit phenolic. pH của nước hồ Hoàn

Kiếm đo được trong năm dao động từ 6,96 ± 9,90 pH từ 8,0 đến 9,5 là điều kiện thuận

lời cho VKL phát triển nhanh và bùng nổ [25]. Điều đó giải thích tại sao pH của các

mẫu đối chứng nước hồ đo được trong các mẫu nghiên cứu đều dao động từ 8-10. Bổ

sung cao chiết làm giảm pH của môi trường xuống 6,67÷7,03 dẫn đến mất điều kiện

tối ưu cho sự phát triển bùng nổ VKL, tuy nhiên pH này vẫn đảm bảo điều kiện sinh

trưởng bình thường của các loài sinh vật khác đặc biệt là nhóm TVN. Dạng tồn tại

của cacbon dioxit (CO2) trong nước thay đổi tùy thuộc vào giá trị pH của môi trường.

139

Ở pH≤ 6, cacbon dioxit phần lớn ở dạng CO2; ở pH ≈ 9, dạng chính là ion bicacbonat

(HCO3-); và ở pH> 10, CO2 trong nước là dạng ion cacbonat (CO3

-2). Như vậy trong

dải pH 8,5 ÷10 của mẫu đối chứng, HCO3- là dạng tồn tại chính của cacbon dioxit

trong nước. Dạng HCO3- thuận lợi cho sự sinh trưởng của VKL, nhưng không phù

hợp với tảo lục và các loài thực vật bậc cao. Cao chiết thực vật được bổ sung làm hạ

giá trị pH xuống 6 hoặc 7 dẫn đến tỷ lệ mol của CO2:HCO3- dao động xấp xỉ 1: 3.

Tình trạng giàu CO2 là thuận lợi cho sự tăng trưởng của các loài TNV và nhóm thực

vật bậc cao tuy nhiên, nó không thuận lợi cho sự tăng trưởng của VKL [181].

Thực nghiệm cho thấy cao chiết gây ra ảnh hưởng đến hàm lượng oxy hòa tan

trong mẫu nước [bảng 6]. Trong thí nghiệm mẫu nước hồ Hoàn Kiếm (quy mô 5L),

chỉ số DO của các mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng đều rất thấp, dao động từ 1,89 ÷

2,71 mg/L. Giá trị DO thấp tương tự cũng quan sát thấy trong nước hồ Hoàn Kiếm năm

2009 đặc biệt vào tháng 8 ghi nhận giá trị DO là 1,40 mg/L, tăng đến 4,68-4,92 vào

tháng 3 và tháng 7, đạt cao nhất là 8,38 vào tháng 12 [25]. Đối với mẫu nước hồ Láng,

chỉ số DO của mẫu đối chứng trong suốt quá trình thực nghiệm có giá trị trung bình là

8,48 mg/L nhưng khi bổ sung cao chiết vào bình thực nghiệm, giá trị này giảm mạnh

xuống chỉ còn 4,74 mg/L đối với mẫu E-Ehanol 500 và 4,56 mg/L đối với mẫy E-Ethyl

500, đặc biệt trong những ngày đầu tiên của thực nghiệm DO chỉ còn là 3,23 ÷

3,91mg/L. Ở quy mô ngoài trời sử dụng bình thực nghiệm dung tích to hơn (300L) vẫn

quan sát thấy sự sụt giảm DO trong ngày T0 và T1 so với mẫu đối chứng, tuy nhiên

DO của mẫu tăng trở lại nhanh chóng tại ngày thứ 2 và 3, đạt giá trị trung bình 6,95

mg/L thấp hơn so với mẫu đối chứng là 8,55 mg/L. Điều này được giải thích do hai

nguyên nhân một là các loài VKL bị suy giảm số lượng, dẫn đến giảm cường độ quang

hợp kéo theo giảm hàm lượng oxy hòa tan trong mẫu, hai là do quá trình tự oxi hóa các

hợp chất hữu cơ trong cao chiết [86, 178].

Các thông số thủy lý của các mẫu nghiên cứu đo được vẫn nằm trong giới hạn

cho phép theo Quy chuẩn QCVN 08-MT: 2015/BTNMT - Quy chuẩn kỹ thuật quốc

gia về chất lượng nước mặt quy định giá trị giới hạn của một số chỉ tiêu trong nguồn

nước của các thủy vực tiếp nhận. Theo tiêu chuẩn này giá trị giới hạn cho phép của

140

pH và DO trong nước hồ tương ứng là 6,0 - 8,5 và ≥ 5 mg/L (tiêu chuẩn dùng cho

mục đích cấp nước sinh hoạt, bảo tồn các loài động thực vật thủy sinh).

3.4.4.2. Ảnh hưởng của cao chiết đến các thông số thủy hóa

Các thông số thủy hóa như tổng hàm lượng nitrit (NO2-), amoni (NH4

+), nitrit

(NO2), photpho tổng (TP), hàm lượng PO43- và silic hòa tan của môi trường là những

thông số quan trọng dự báo khả năng gây nở hoa của nước. Theo nghiên cứu của

Smith (1983) tỉ lệ N:P vượt quá 25 gây ra sự nở hoa chiếm ưu thế của VKL, sau đó

đến tảo lục và tảo silic. Nồng độ photphat là 0,01 mg/L tạo điều kiện cho các loại

thực vật phát triển và phát triển bùng nổ khi đạt 0,03 ÷ 0,1 mg/L [25].

Từ bảng 3.16; 3.17 và 3.18 cho thấy giá trị P tổng (TP) và hàm lượng photphat

(PO43-) của các mẫu đối chứng của Hồ Hoàn Kiếm, Hồ Láng quy mô 5L và Hồ Láng

quy mô 300L dao động từ 0,41 ÷1,26 mg/L và 0,015 ÷ 0,038 mg/L tương ứng, đây là

điều kiện thuận lợi để các loài thực vật phù du phát triển bùng nổ. Theo số liệu quan

trắc môi trường [17], hàm lượng photpho tổng trong các mẫu nước hồ tự nhiên dao

động mạnh trong năm, ví dụ đối với mẫu nước tự nhiên hồ Hoàn Kiếm giá trị biến

động trong khoảng từ 0,11 đến 0,51 mg/L đối với hàm lượng photpho tổng và 0,002

÷ 0,276 mg/L đối với hàm lượng photphat. Mẫu hoạt chất đồng sun phát có kết quả

tương tự với các mẫu đối chứng tuy nhiên đối với các mẫu thực nghiệm được bổ sung

cao chiết thì giá trị hàm lượng TP, PO43- tăng lên rõ rệt trong những ngày đầu tiên đạt

đến 2,18 và 0,56 mg/L, tương ứng. Giá trị NO2-, NH4

+ của các mẫu hoạt chất cũng cho

kết quả tương tự. Thành phần các hợp chất hữu cơ chứa nito và photpho trong cao chiết

đã làm cho hàm lượng TP, photphat, nitrit và amoni tăng mạnh trong những ngày đầu

và giảm dần theo quá trình thực nghiệm

Nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết lên các thông số môi trường nước của các

tác giả trước cho các kết quả khác nhau. Ví dụ ứng dụng cao chiết từ rơm lúa mạch

[80] triển khai trên mẫu nước hồ tự nhiên tại Mỹ cho thấy bổ sung cao chiết không

làm ảnh hưởng đến nồng độ của các nguyên tố dinh dưỡng trong môi trường. Cụ thể,

tại các mẫu thực nghiệm và đối chứng nồng độ N-NH4+dao động từ 0,32 ÷0,35 mg/L),

N-NO2- từ 0,17÷ 0,19 mg/L, và nồng độ P tổng từ 0,13÷ 0,16 mg/L. Ngược lại nghiên

cứu của Waybright [182] cho rằng các cao chiết từ rơm lúa mạch khi được xử lý dưới

141

các hình thức khác nhau dẫn đến hàm lượng các nguyên tố dinh dưỡng Nito (NO2-,

NO3-, NH4

-) và photpho (PO4-) trong mẫu cao chiết cũng khác nhau, dẫn đến ảnh

hưởng khác nhau đến các thông số thủy hóa của môi trường. Đặc biệt đối với các mẫu

rơm lúa mạch được ngâm chiết trong các dung môi hữu cơ thì hàm lượng các nguyên

tố dinh dưỡng N, P trong cao chiết đều cao gấp nhiều lần so với các mẫu chỉ được

ngâm và xử lý trong môi trường nước cất và điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm.

Việc bổ sung cao chiết vào môi trường làm chất lượng nước bị thay đổi rõ rệt trong

thời gian ngắn như làm tăng hàm lượng P tổng từ 0,36 to 0,50 mg/L trong ngày đầu

tiên khi xử lý mẫu nước hồ tự nhiên bằng cao chiết Solidago canadensis L nồng độ

50 mg/L, nhưng không quan sát thấy sự tăng hàm lượng nito [96]. Tuy nhiên sau 25

ngày thí nghiệm thì hàm lượng N nhìn chung giữ ổn định và ở mức cao trong khi hàm

lượng P tổng giảm xuống 46,96 đến 52,71 % so với mẫu ban đầu, điều này có thể được

giải thích bằng sự tự phân hủy các hợp chất hữu cơ trong môi trường nước tự nhiên

[86]. Như vậy việc bổ sung các cao chiết vào môi trường nghiên cứu có thể làm ảnh

hưởng tiêu cực đến chất lượng nước trong thời điểm đầu tiên vì làm tăng độ đục, tăng

hàm lượng nito, photpho. Tuy nhiên sự gia tăng tạm thời các chất dinh dưỡng trong

những ngày đầu không kích thích sinh trưởng VKL độc và chất lượng nước trong các

mẫu thực nghiệm sẽ được cải thiện nhanh chóng trong thời gian ngắn [79, 80, 96]. Tác

giả này cho thấy các thông số trên dao động so với mẫu đôi chứng nhưng vẫn nằm

trong khoảng giới hạn cho phép của Quy chuẩn QCVN 08-MT: 2015/BTNMT đối với

nguồn nước mặt.

137

ẢNH HƯỞNG CỦA CAO CHIẾT ĐẾN CÁC THÔNG SỐ THỦY LÝ

Bảng.3.16A. Biến động thông số thủy lý mẫu nước Hồ Hoàn Kiếm quy mô 5L bổ sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol

và etyl axetat Mần tưới

Nghiêm thức Nhiệt độ

(0C) Độ muối

Dộ dẫn điện

(µS/cm) Độ đục (NTU) pH DO (mg/L)

Control 24,45 0,011(0,011 – 0,012) 12,7 (11,5 – 14,6) 46,7 (43 ÷ 57) 10,46 (10,08 – 10,75) 2,36 (1,89 – 2,71)

CuSO4 24,41 0,011(0,011 – 0,012) 12,6 (11,2 – 14,4) 44,4 (39 ÷ 48) 10,23 (10,06 – 10,53) 2,17 (1,90 – 2,68)

E - Ethanol - 500 24,66 0,011(0,010 – 0,012) 17,5 ( 15,7 – 22,9) 157,5 (113 ÷ 210) 7,03 (6,73 – 7,67) 2,03 (1,14 – 2,50)

E - Ethyl - 500 24,78 0,011(0,09 – 0,012) 15,3 (14,9 – 16,9) 151,1(107 ÷ 192) 6,72 (6,30 – 6,97) 2,01 (1,16 – 2,34)

Bảng.3.16B. Biến động của thông số thủy hóa mẫu nước Hồ Hoàn Kiếm quy mô 5L bổ sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết

etanol và etyl axetat Mần tưới

Nghiệm thức Photpho tổng

(mg/L)

Photphat tổng

(mg/L) NH4

+ (mg/L NO2- (mg/L) Silic (mg/L

Control 1,13 (0,88 ÷ 1,26) 0,019 (0,015 – 0,038) 0,136 (0,129 – 0,235) 0,026 (0,018 – 0,035) 1,603 (1,296 – 2,404)

CuSO4 1,01 (0,96 ÷ 1,15) 0,017 (0,012 – 0,021) 0,127 (0,125 – 0,171) 0,035 (0,019 – 0,033) 1,276 (0,812 – 1,755)

E - Ethanol - 500 1,38 (0,94 ÷ 2,18) 0,028 (0,015 – 0,053) 0,172 (0,150 – 0,272) 0,023 (0,019 – 0,058) 1,827 (1,703 -1,961)

E - Ethyl - 500 1,46 (0,91÷ 1,90) 0,021 (0,025 – 0,056) 0,154 (0,128 – 0,237) 0,020 (0,018 – 0,052) 1,792 (1,779 – 1,957)

138

Bảng.3.17.A Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 5L bổ sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol và

etyl axetat Mần tưới

Nghiêm thức Nhiệt độ

(0C) Độ muối

Độ dẫn điện

(µS/cm) Độ đục (NTU) pH DO (mg/L)

Control 25,21 0,011 (0,011 – 0,012) 22,3 (22,0 – 24,1) 34,6 (47 ÷ 69) 8,82 (7,76 – 9,34) 8,48 (8,43 – 9,05)

CuSO4 25,06 0,011 (0,010 – 0,011) 21,6 (21,1 – 22,0) 33,9 (41÷ 63) 7,61 (6,55 – 8,70) 6,85 (5,9 – 7,37)

E - Ethanol - 500 25,25 0,014 (0,014 – 0,015) 28,0 ( 27,9 – 28,3) 118,4 (106 ÷ 204) 6,67 (5,61 – 7,56) 4,74 (3,91 – 6,67)

E - Ethyl - 500 25,37 0,012 (0,011 – 0,012) 23,1 (22,7 – 23,3) 115,6 (104 ÷ 207) 6,63 (6,30 – 6,87) 4,56 (3,23 – 6,01)

Bảng.3.17 B. Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 5L bổ sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol và

etyl axetat Mần tưới

Nghiêm thức Photpho tổng

(mg/L)

Photphat tổng

(mg/L) NH4

+ (mg/L NO2- (mg/L) Silic (mg/L

Control 0,46 (0,36÷ 0,58) 0,013 (0,010 – 0,016) 0,096 (0,093 – 0,186) 0,046 (0,013 – 0,063) 2,018 (1,557 – 2,983)

CuSO4 0,38 (0,28÷ 0,43) 0,011 (0,006 – 0,015) 0,99 (0,087 – 0,176) 0,035 (0,011 – 0,051) 2,02 (1,735 – 2,399)

E - Ethanol - 500 0,52 (0,48 ÷ 0,84) 0,015 (0,013 – 0,025) 0,112 (0,097 – 0,189) 0,037 (0,016 – 0,084) 2,404 (1,990 – 2,343)

E - Ethyl - 500 0,49 (0,42 ÷ 0,77) 0,016 (0,012 – 0,029) 0,105 (0,090 – 0,167) 0,032 (0,258 – 0,0750) 1,945 (1,465 -1,998)

139

Bảng.3.18.A. Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 300L bổ sung

hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol Mần tưới

Nghiêm thức Nhiệt độ

(0C) Độ muối

Độ dẫn điện

(µS/cm) Độ đục (NTU) pH DO (mg/L)

Control 22,46 0,009 (0,008 – 0,010) 18,06 (17,0 – 19,6) 9,72 (7 - 10) 9,12 (8,74 – 9,56) 8,55 (7,70 – 8,06)

CuSO4 22,32 0,009 (0,009 – 0,010) 18,6 (18,1 – 19,5) 9,26 (7. - 10) 8,59 (7,67 – 9,41) 8,43 (6,73 – 8,04)

E - Ethanol - 500 22,33 0,014 (0,013 – 0,016) 28,7 (25,6 – 31,1) 86,72 (55 - 158) 6,95 (5,89 – 8,67) 6,95 (3,70 – 7,63)

Bảng.3.18B. Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 300L bổ sung

hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol Mần tưới

Nghiêm thức Photpho tổng

(mg/L)

Photphat tổng

(mg/L) NH4

+ (mg/L NO2- (mg/L) Silic (mg/L

Control 0,41 (0,397÷ 0,478) 0,013 (0,012 – 0,013) 0,045 (0,013 – 0,072) 0.01 (0,008 – 0,012) 0,908 (0,563 – 1,691)

CuSO4 0,43 (0,478 ÷ 0,595) 0,012 (0,010 – 0,019) 0,065 (0,053 – 0,123) 0.017 (0,008 – 0,021) 0,886 (0,540 – 1,193)

E - Ethanol - 500 0,42 (0,406 ÷ 0,572) 0,017 (0,015 – 0,038) 0,058 (0,050 -0,131) 0.027 (0,022 – 0,035) 1,188 (0,932 – 1,450)

140

Tóm tắt kết quả đạt được của phần 3.4.

- Đã khảo sát ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới đối với mẫu nước hồ thực tế quy

mô phòng thí nghiệm và quy mô ngoài trời. Ở quy mô phòng thí nghiệm cao

chiết ethyl axetat nồng độ 500 µg/mL ức chế sinh trưởng TVN với tỉ lệ 49,91 -

58,8 % trong khi đối với cao chiết etanol thì giá trị này dao động từ 34,70 ÷

48,41% theo hàm lượng chlorophyll a. Kết quả đếm tế bào cho thấy cao chiết

phân đoạn ethyl acetat tại 500 µg/mL có hiệu quả ức chế sinh trưởng nhóm

TNV dao động từ 43,13 ÷ 51,37 %. Mẫu cao chiết ethanol có giá trị IE chỉ

đạt 37,33 ÷ 46,44 % (Hồ Láng).

- Với quy mô ngoài trời, cao chiết ethanol Mần tưới 500 µg/mL ức chế sinh

khối TVN tới 39,90 ÷ 42,39 % trong khi cao chiết etanol lại thể hiện khả

năng ức chế chọn lọc khi giá trị IE trên tảo lục và tảo silic là 27,67 - 34,68

%, tương ứng.

- Ảnh hưởng của cao chiết lên chỉ tiêu chất lượng môi trường nước cho thấy:

- Các thông số thủy lý: So với các mẫu đối chứng thì hoạt chất làm tăng độ

đục của mẫu lên đến 210 NTU, làm giảm giá trị pH xuống 6-7 và hàm lượng

oxy hòa tan thấp hơn 5-6 mg/L. Các thông số khác như độ mặn, độ dẫn điện,

nhiệt độ bị ảnh hưởng không đáng kể và nằm trong khoảng giới hạn cho

phép của QCVN 08-MT: 2015/BTNMT đối với chất lượng nguồn nước mặt.

- Các thông số thủy hóa: việc bổ sung các cao chiết vào môi trường nghiên

cứu làm gia tăng hàm lượng nitơ, phốtpho trong thời gian đầu, tuy nhiên sự

thay đổi này nhanh chóng được cải thiện vì các hoạt chất dễ dàng bị oxy hóa

trong môi trường tự nhiên và hàm lượng các thông số thủy hóa trên nhanh

chóng trở về mức độ an toàn nằm trong giới hạn cho phép của QCVN 08-

MT: 2015/BTNMT đối với chất lượng nguồn nước mặt.

141

KẾT LUẬN

Kết quả tạo cao chiết thực vật và thử nghiệm đánh giá tác dụng diệt và ức chế Vi

khuẩn lam độc cho phép rút ra một số kết luận chính như sau:

1. Tách chiết được 07 hợp chất từ cao chiết etyl axetat Mần tưới với hai chất mới là

8,10-didehydro-7,9-dihydroxythymol (EfD4.7) và 7,8,9-trihydroxythymol

(EfD4.8. Tại nồng độ 50 µg/mL, hợp chất 8,9,10-trihydroxythymol EfD 5.1 có

hiệu quả ức chế sinh trưởng cao nhất tính theo mật độ quang và mật độ tế bào là

45,6 và 49,0 % sau 72 giờ phơi nhiễm. EfD 4.8 cho hiệu quả ức chế sinh trưởng

là 39,1 -41,2 % trong khi giá trị này đối với EfD 4.7 là 20-25%.

2. Cao chiết etanol Mần tưới tác động lên VKL Microcystis aerugniosa và tảo lục

Chlorella vulgaris có tính chọn lọc. Hiệu quả ức chế của cao chiết etanol tại nồng độ

500 µg/mL lên chủng VKL độc đạt từ 68,60 ÷ 90,13 % trong khi giá trị này đối với

chủng tảo lục là 55,61 ÷ 70,59 %. Cao chiết phân đoạn etyl axetat có độc tính mạnh

hơn cao chiết phân đoạn nước đối với cả hai loài M. aeruginosa và Ch. vulgaris tại

nồng độ 500 µg/mL với giá trị IE từ 55,6 ÷ 96,16 % trong khi cao chiết phân đoạn

nước có chỉ số IE tương ứng là 31,34 ÷ 58,62 % (p<0,05).

3. Phân tích ảnh hưởng của các cao chiết đến siêu cấu trúc tế bào M. aeruginosa cho

thấy cao chiết etyl axetat gây phân hủy nguyên sinh chất, phá hủy các bào quan và

tạo ra cấu trúc rỗng bên trong tế bào trong khi cao chiết etanol làm tế bào bị biến

dạng co rút và thu nhỏ kích thước.

4. Nghiên cứu ảnh hưởng của các cao chiết Mần tưới lên hai nhóm sinh vật chuẩn để

đánh giá độc tính là Daphnia magna và bèo tấm Lemna minor cho thấy cao chiết etyl

axetat có độc tính mạnh đối với cả hai loài: đối với bèo phá hủy hoàn toàn cánh bèo,

chuyển màu của lá, làm rụng rễ bèo và ức chế sinh trưởng tới 80%, đối với D.magna

giá trị LC50 trong 24 và 48 h là 47,40 và 13,60 µg/mL. Giá trị này đối với cao chiết

etanol Mần tưới tương ứng là 247,80 và 183,2 µg/mL trong khi cao chiết etanol có

ảnh hưởng thấp đến Bèo tấm trong dải nồng độ khảo sát.

5. Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới đối với mẫu nước hồ thực tế ghi nhận cao chiết

tổng etanol Mần tưới có khả năng ức chế chọn lọc. Cao chiết etanol nồng độ 500

µg/mL ức chế sinh trưởng nhóm Microcystis với giá trị IE 46,44 % (trong phòng

142

thí nghiệm) và 51,90 % (quy mô ngoài trời) và thể hiện khả năng ức chế chọn lọc

đối với tảo lục và tảo silic với IE là 27,67 ÷ 34,68%. Các thông số thủy lý, thủy

hóa nước hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng trong quá trình xử lý bằng cao chiết thực vật

nằm trong khoảng giới hạn cho phép của QCVN 08-MT: 2015/BTNMT đối với

chất lượng nguồn nước mặt.

KIẾN NGHỊ

Do khuôn khổ nghiên cứu của luận án Tiến sỹ có hạn, các kết quả của luận án là những

nghiên cứu cơ bản và thử nghiệm bước đầu. Để có thể áp dụng, triển khai rộng rãi kết

quả này vào quy mô thực tế cần phải có thêm những nghiên cứu sau hơn và toàn diện

hơn. Một số những đề nghị được tác giả đưa ra như sau:

1. Nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết lên các loài sinh vật chỉ thị khác như vi sinh vật,

thực vật bậc cao hoặc các loài cá, tôm, cua.

2. Đánh giá ảnh hưởng của các tác nhân môi trường lên hoạt tính ức chế của cao chiết,

khảo sát thời gian tồn tại và tốc độ phân hủy sinh học của cao chiết trong môi trường

tự nhiên

3. Khảo sát tính toán hiệu quả kinh tế để ứng dụng các chế phẩm ở quy mô rộng hơn

143

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đặng Đình Kim, Dương Thị Thủy, Nguyễn Thị Thu Liên, Đào Thanh Sơn, Lê

Thị Phương Quỳnh, Đỗ Hồng Lan Chi, Vi Khuẩn Lam Độc nước ngọt. Nhà xuất

bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ, 2014, 326.

2. Nguyễn Tiến Đạt, Dương Thị Thủy, Lê Thị Phương Quỳnh, Hồ Tú Cường, Vũ Thị

Nguyệt, Phạm Thanh Nga, Đặng Đình Kim, Nghiên cứu tác dụng diệt vi khuẩn lam

độc Microcystis aeruginosa. Tạp chí Hóa học, 2013, 51(2C), 737-739.

3. Phạm Thanh Nga, Dương Thị Thủy, Đặng Đình Kim, Nghiên cứu tác dụng diệt

vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa của dịch chiết cây mần tới Eupatorium

fortunei TURCZ. Journal of science of HNUE, 2014, 59 (6BC), 104-109.

4. Rajasekhar P, Fan L, Nguyen T, Roddick FA, Impact of sonication at 20 kHz on

Microcystis aeruginosa, Anabaena circinalis and Chlorella sp. Water Research,

2012, 46, 1473-1481.

5. Rajasekhar P, Fan L, Nguyen T, Roddick FA, A Review of the Use of Sonication

to Control Cyanobacterial Blooms. Water Research, 2012, 46, 4319-4329.

6. Cheung MY, Liang S, Lee J, Toxin-producing cyanobacteria in freshwater: a

review of the problems, impact on drinking water safety, and efforts for

protecting public health. Journal of Microbiology, 2013, 51(1), 1-10.

7. Phạm Thanh Lưu, Nguyễn Thanh Sơn, Đào Thanh Sơn, Motoo Utsumi, Độc tố

tảo lam trong nước hồ Dầu Tiếng: mối nguy hại tiềm ẩn cho sức khỏe cộng đồng.

Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 6, 2012,

175

8. Ortiz-Rodriguez, R., Dao T S, Wiegand C, Transgenerational effects of

microcystin-LR on Daphnia magna. Journal of Experimental Biology, 2012, 215,

2795-2805.

9. Chen W, Song L, Ou D, Gan N, Chronic toxicity and responses of several

important enzymes in Daphnia magna on exposure to sublethal microcystin-LR.

Environmental Toxicology, 2005, 20(3), 323-330.

10. Zanchett G, Oliveira-Filho E.C, Cyanobacteria and cyanotoxins: from impacts

144

on aquatic ecosystems and human health to anticarcinogenic effects. Toxins

(Basel), 2013, 5(10), 1896-1917.

11. Campos A, Vasconcelos V, Molecular Mechanisms of Microcystin Toxicity in

Animal Cells. International Journal of Molecular Sciences, 2010, 11(1), 268-287.

12. Mousa A A M., A. El-Ashram M M , Hamed M, Effect of Neem Leaf Extract on

Freshwater Fishes and Zooplankton Community. 8 th International Symposium

on Tilapia in Aquaculture 2008, 307-317.

13. Håkanson L, Bryhn AC, Hytteborn JK, On the issue of limiting nutrient and

prediction of cyanobacteria in aquatic systems. Science of The Total

Environment, 2007, 379(1), 89 – 108.

14. Carlson, R.E, A Trophic State Index for Lakes. Limnology and Oceanography,

1977, 22, 361-369

15. Mahakhant A, Pannarat R, Tomoharu S, Kunimitsu K, Detection of microcystins

from cyanobacterial water blooms in Thailand fresh water. Phycological

Research, 2006, 46(s2), 25 – 29

16. Le Thu Ha, The eutrophication and phytoplankton biodiversity of some lakes in

Hanoi, Vietnam. World Lake Conference, Wuhan, China, 2009, 391.

17. Nguyễn Thị Bích Ngọc, Vũ Duy An, Lê Thị Phương Quỳnh, Nguyễn Bích Thủy,

Lê Đức Nghĩa , Dương Thị Thủy, Hồ Tú Cường, Đánh giá mức độ phì dưỡng

của một số hồ nội thành Hà Nội. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 2017, 55 (1),

84-92.

18. Đào Thanh Sơn, Võ Thị Mỹ Chi, Bùi Thị Như Phượng, Đỗ Hồng Lan Chi,

Nguyễn Thanh Sơn, Bùi Lê Thanh Khiết, Suy giảm chất lượng nước và độc tính

sinh thái vi khuẩn lam từ hồ Xuân Hương, Đà Lạt. Tạp chí Khoa học và Công

nghệ, 2014, 52, 91-99.

19. Jancula, D, Marsalek B, Critical review of actually available chemical

compounds for prevention and management of cyanobacterial blooms.

Chemosphere, 2011, 85(9), 1415-1422.

20. Ndlela LL, Oberholster PJ, Van Wyk JH, Cheng PH, An overview of

145

cyanobacterial bloom occurrences and research in Africa over the last decade.

Harmful Algae, 2016, 60, 11-26

21. Paerl H W, Otten TG, Harmful cyanobacterial blooms: causes, consequences,

and controls. Microbial Ecology, 2013, 65(4), 995-1010.

22. Oberholster, P.J, Botha A.M, and Ashton P J, The influence of a toxic

cyanobacterial bloom and water hydrology on algal populations and

macroinvertebrate abundance in the upper littoral zone of Lake Krugersdrift,

South Africa. Ecotoxicology, 2009, 18(1), 34-46.

23. Oberholster P., Botha A M, Cloete T, An Overview Of Toxic Freshwater

Cyanobacteria In South Africa With Special Reference To Risk, Impact And

Detection By Molecular Marker Tools. Biokemistri, 2005, 17(2), 57-71

24. Dodds W K, Bouska W W, Eitzmann J.L, Pilger, T J, Pitts K L, Riley A J,

Schloesser J T, Thornbrugh D J, Eutrophication of U.S. Freshwaters: Analysis

of potential economic damages. Environmental Science & Technology, 2009,

43(1), 12–19.

25. Đặng Thị Thơm, Hoàng Trung Kiên, Vũ Thị Nguyệt, Đặng Đình Kim, Nghiên

cứu một số yếu tố môi trường và hệ vi tảo tại hồ Hoàn Kiếm trước khi ứng dụng

công nghệ hút bùn. Tuyển tập báo cáo Hội nghị Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

lần thứ 3, 22/10/2009 - Viên ST&TNSV - Viện KH&CN Việt Nam, 2009.

26. Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Thị Bích Đào, Phạm Thị Mai, Trần Đăng Khoa,

Thăm dò khả năng phân giải độc tố của một số chủng Micrycystis bằng vi khuẩn

Sphingomonas phân lập ở Hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội. Tạp chí Công nghệ sinh học,

2010 8(3A), 885-890.

27. Dương Thị Thủy, Hồ Tú Cường, Đặng Đình Kim, Lê Thị Phương Quỳnh, Biến

động hàm lượng Microcystin trong môi trường nước hồ Hoàn Kiếm. Tạp chí sinh

học, 2012, 34(1), 94-98.

28. Nguyen TTL, Hoang TH, Nguyen TK, Duong TT, The occurrence of toxic

cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii and its toxin

cylindrospermopsin in the Huong River, Thua Thien Hue province, Vietnam.

Environmental Monitoring and Assessment, 2017, 189(10), 490, 1-11

29. Đặng Đình Kim (chủ nhiệm đề tài) cùng cộng sự, Bước đầu xây dựng phương

146

pháp đánh giá, sàng lọc các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên ứng dụng vào

việc diệt và giảm thiểu tảo độc nước ngọt. Đề tài KC- Viện Hàn lâm Khoa học

Viêt Nam, Viện Công nghệ Môi trường.Mã số: VAST.CTG 05/12-13, 2013.

30. GD Cooke E. W, Peterson SA, Neworth PR, Restoration and Management of

Lakes and Reservoirs. Book 2005, 591.

31. van der Westhuizen, A.J., Krüger G H J, Eloff JN, Effect of culture age and pH

of the culture medium on the composition of the toxin of the cyanobacterium

Microcystis aeruginosa (UV-006). South African Journal of Botany, 1988, 54(4),

372-374.

32. Rajasekhar P, Fan L, Nguyen T, Roddick FA, A review of the use of sonication

to control cyanobacterial blooms. Water Research, 2012, 46(14), 4319-4329.

33. Ou H, Gao N, Deng Y, Wang H, Zhang H, Inactivation and degradation of Microcystis

aeruginosa by UV-C irradiation. Chemosphere, 2011, 85(7), 1192-1198.

34. Sakai H, Oguma K, Katayama H, Ohgaki S, Effects of low or medium-pressure

UV irradiation on the release of intracellular microcystin. Water Research, 2007,

41(15), 3458-3464

35. De Julio M, Fioravante D A, De Julio T S, Oroski F I, Graham N J , A methodology

for optimising the removal of cyanobacteria cells from a brazilian eutrophic water.

Brazilian Journal of Chemical Engineering, 2010, 27(1), 113-126

36. Deppe T, Benndorf J, Phosphorus reduction in a shallow hypereutrophic

reservoir by in-lake dosage of ferrous iron. Water Resource, 2002, 36 (1), 4525–

4534.

37. Murray-Gulde CL1, Heatley JE, Schwartzman AL, Rodgers JH Jr, Algicidal

effectiveness of Clearigate, Cutrine-Plus, and copper sulfate and margins of

safety associated with their use. Archives of Environmental

Contamination and Toxicology, 2002, 43(1), 19-27.

38. García-Villada L, Rico M, Altamirano MM, Sánchez-Martín L, López-Rodas

V, Costas E, Occurrence of copper resistant mutants in the toxic cyanobacteria

Microcystis aeruginosa: characterisation and future implications in the use of

copper sulphate as algaecide. Water Research, 2004, 38 (8), 2207–2213

39. Sondergaard, M., Wolter, K.D., Ripl, W, Chemical Treatment of Water and

147

Sediments with Special Reference to Lakes. Handbook of Ecological Restoration:

Principle of Restoration, vol 1 Cambridge University Press, 2002, 184-205.

40. Fan J, Hobson P, Ho L, Daly R, Brookes J, The effects of various control and

water treatment processes on the membrane integrity and toxin fate of

cyanobacteria. Journal of Hazardous Materials, 2014, 264, 313-322.

41. Coral LA, Zamyadi A, Barbeau B, Bassetti FJ, Lapolli FR, Prévost M,

Oxidation of M. aeruginosa and A. flos-aquae by ozone: impacts on cell integrity

and chlorination by-product formation. Water Research, 201, 47, 2983–2994.

42. Martinez-Ruiz, E.B, Martinez-Jeronimo F, Exposure to the herbicide 2,4-D

produces different toxic effects in two different phytoplankters: A green

microalga (Ankistrodesmus falcatus) and a toxigenic cyanobacterium

(Microcystis aeruginosa). Science of The Total Environment, 2018. 619-620,

1566-1578.

43. Wu L, Qiu Z, Zhou Y, Du Y, Liu C, Ye J, Hu X, Physiological effects of the

herbicide glyphosate on the cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Aquatic

Toxicology, 2016, 178, 72-79.

44. Park MH, Kim KH, Lee HH, Kim JS, Hwang SJ, Selective inhibitory potential

of silver nanoparticles on the harmful cyanobacterium Microcystis aeruginosa.

Biotechnology Letters, 2010, 32(3), 423-428.

45. Sankar R, Prasath BB, Nandakumar R, Santhanam P, Shivashangari

KS, Ravikumar V, Growth inhibition of bloom forming cyanobacterium

Microcystis aeruginosa by green route fabricated copper oxide nanoparticles.

Environmental Science and Pollution Research, 2014, 21(24), 14232-14240.

46. Marsalek B, Jancula D, Marsalkova E, Mashlan M, Safarova K, Tucek J, Zboril

R, Multimodal Action and Selective Toxicity of Zerovalent Iron Nanoparticles

against Cyanobacteria. Environmental Science & Technology, 2012, 46, 2316-

2323.

47. Chang SC, Li CH, Lin JJ, Li YH, Lee MR, Effective removal of Microcystis

aeruginosa and microcystin-LR using nanosilicate platelets. Chemosphere,

2014, 99, 49-55.

148

48. Selvarani M, Prema P, Evaluation of antibacterial efficacy of chemically

synthesized copper and zerovalent iron nanoparticles. Asian Journal of

Pharmaceutical and Clinical Research, 2013, 6, 223-227.

49. Kluijver, A. de; Yu, J.; Houtekamer, M.; Middelburg, J.J.; Liu, Z, Cyanobacteria

as carbon source for zooplankton in eutrophic Lake Taihu, China, measured by

13C labeling and fatty acid biomarkers. Limnology and Oceanography, 2012, 57

(4), 1245-1254.

50. Liu YM, Chen MJ, Wang MH, Jia RB, Li L, Inhibition of Microcystis aeruginosa

by the extracellular substances from an Aeromonas sp. Journal of

Microbiology and Biotechnology, 2013, 23(9), 1304-1307.

51. Mulderij G, Mau B, Donk E v, Gross EM, Allelopathic activity of Stratiotes

aloides on phytoplankton - Towards identification of allelopathic substances.

Hydrobiologia, 2007, 584, 89-100.

52. Nakai S, Inoue Y, Hosomi M, Algal growth inhibition effects and inducement

modes by plant-producing phenols. Water Research, 2001, 35(7), 1855-1859.

53. Li FM, Hu HY, Isolation and characterization of a novel antialgal

allelochemical from Phragmites communis. Applied and Environmental

Microbiology, 2005, 71(11), 6545-6553.

54. Gross ME, Eniko I, Erhard D.,Allelopathic activity of Ceratophyllum demersum

L. and Najas marina ssp. intermedia (Wolfgang) Casper. Hydrobiologia, 2003,

506 (1-3), 583-589.

55. Jancula D, Gregor JSJ, Smutná M, Marsálek B, Táborská E. Effects of aqueous

extracts from five species of the family Papaveraceae on selected aquatic

organisms. Environmental Toxicology, 2007, 22(5), 480-486.

56. Cantrell CL, Schrader KK, Mamonov LK, Sitpaeva GT, Kustova TS, Dunbar C,

Wedge DE, Isolation and identification of antifungal and antialgal alkaloids

from Haplophyllum sieversii. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005,

53(20), 7741-7748.

57. Meepagala KM, Schrader KK, Burandt CL, Wedge DE, Duke SO, New class of

algicidal compounds and fungicidal activities derived from a chromene amide of

Amyris texana. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(17), 9476-

149

9482.

58. Meepagala KM, Schrader KK, Wedge DE, Duke SO, Algicidal and antifungal

compounds from the roots of Ruta graveolens and synthesis of their analogs.

Phytochemistry, 2005, 66(22), 2689-2695.

59. Yan R, Ji H, Wu Y, Kerr PG, Fang Y, Yang L, An investigation into the kinetics

and mechanism of the removal of cyanobacteria by extract of Ephedra equisetina

root. PLoS One, 2012. 7(8), 42285

60. Shao J, Li R, Lepo JE, Gu JD, Potential for control of harmful cyanobacterial

blooms using biologically derived substances: problems and prospects. Journal

of Environmental Management, 2013, 125, 149-155.

61. Duong TT, Le TS, Tran TTH, Nguyen TK, Ho TC, Dao TH, Le TPQ, Nguyen

HC, Dang DK, Le TTH, Ha PT, Inhibition effect of engineered silver

nanoparticles to bloom forming cyanobacteria. Advances in Natural Sciences:

Nanoscience and Nanotechnology, 2016, 7, 1-7.

62. Vũ Thị Nguyệt, Trần Văn Tựa, Nguyễn Trung Kiên, Đặng Đình Kim, Nghiên

cứu sử dụng bèo tây Eichhornia crassipes (Mart.) solms để xử lý nitơ và phôtpho

trong nước thải chăn nuôi lợn sau công nghệ biogas. Tạp chí sinh học 2015,

37(1), 53-59.

63. Nguyễn Thúy Lan Chi, Hoàng Khánh Hòa, Trương Văn Hiếu, Đề xuất giải phấp

ngăn chặn hiện tượng tảo nở hoa ở Hồ Xuân Hương, Thành phố Đà Lạt. Khoa

học & Ứng dụng, 2015, 21, 72-75.

64. Le Hung Anh, Celia Hahn, PeterWerner, Dang DinhKim, Christian

Richtere Frank Panning, Lothar Paulg, Leonhard Fechterh Anh.

Environmentally Sound Desludging Concept for Hoan Kiem Lake in Hanoi

Vietnam. Procedia CIRP, 2016, 40, 97-102.

65. Duong, T.T, S Jähnichen, TPQ Le, CT Ho, TK Hoang, TK Nguyen, TN Vu, Dang

DK, The occurrence of cyanobacteria and microcystins in the Hoan Kiem Lake

and the Nui Coc reservoir (North Vietnam). Environmental Earth Sciences, 2014,

150

71 (5), 2419–2427.

66. Phùng Thị Quỳnh Trang. Mô hình xử lý ô nhiễm môi trường nước ao, hồ vùng

nông thôn bằng các loài thủy sinh vật. Tạp chí Môi trường, 2014, 2.

67. Altemimi A, Lakhssassi N, Baharlouei A, Watson DG, Lightfoot DA.

Phytochemicals: Extraction, Isolation, and Identification of Bioactive

Compounds from Plant Extracts. Plants (Basel), 2017, 6(4), 42 (1-23).

68. Suffredini IBS, Gonçalves HS, Reis AG, Gales A O, Varella AC, Younes AD.

Screening ofantibacterial extracts from plants native to the brazilian amazon rain

forest and atlantic forest. Brazilian Journal of Medical and Biological Research,

2014, 37, 379-384.

69. Do QD, Angkawijaya AE, Tran-Nguyen PL, Huynh LH, Soetaredjo FE, Ismadji

S, Ju YH, Effect of extraction solvent on total phenol content, total flavonoids

content, and antioxidant activity of Limnophila aromatic. Journal of Food and

Drug Analysis, 2014, 22(3), 296-302.

70. Qiao T, J.S., Antibacterial activity of ethanol extract and fractions obtained from

Taraxacum mongolicum flower. Research Journal of Pharmacognosy, 2014, 1(4),

35-39.

71. Wu Y, Ge H, Zhou Z. Effects of Fructus ligustri lucidi on the growth, cell

integrity, and metabolic activity of the Microcystis aeruginosa. Environmental

Science and Pollution Research, 2015, 22(11), 8471-8479

72. Koffi E, Sea T, Dodehe Y, Soro S. Effect of solvent type on extraction of

polyphenols from twenty three Ivorian plants. Journal of Animal & Plant

Sciences, 5, 550-558

73. Dave G, Blanck H, Gustafsson K. Biological Effects of Solvent Extraction

Chemicals on Aquatic Organisms, 2007, 29, 249-257

74. Hutchinson TH, Winter M, Pickford DB. Acute and chronic effects of carrier

solvents in aquatic organisms:A critical review. Aquatic Toxicology, 2006, 76

(1), 69–92.

75. Park MH, Han MS, Ahn CY, Kim HS, Yoon BD, Oh HM. Growth inhibition of

bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa by rice straw extract.

Letters in Applied Microbiology, 2006, 43(3), 307-312.

151

76. Gibson M T, Welch I MP. Barrett R. F. Ridge I. Barley Straw As an Inhibitor of

Algal Growth II: Laboratory Studies. Journal of Applied Phycology, 1990, 2,

241-248.

77. Pillinger JM., Cooper JA, Ridge I. Role of phenolic compounds in the antialgal

activity of barley straw. Journal of Chemical Ecology, 1994, 20(7), 1557-1569.

78. Newman J, Barrett PRF, Control of Microcystis aeruginosa by decomposing

barley straw. Journal of Aquatic Plant Management, 1993, 31, 203-206

79. Everall NC, Lees DR, The identification and significance of chemicals released

from decomposing barley straw during reservoir algal control. Water Research,

1997, 31(3), 614-620

80. Boylan D, Joseph E M, Limited Effects of Barley Straw on Algae and

Zooplankton in a Midwestern Pond. Lake and reservoir management, 2003, 19,

265-271.

81. Ferrier MD, Butler BR Sr, Terlizzi DE, Lacouture RV, The effects of barley

straw (Hordeum vulgare) on the growth of freshwater algae. Bioresource

Technology, 2005. 96(16), 1788-1795

82. Waybright T, Terlizzi D, Ferrier D, Chemical Characterization of the Aqueous

Algistatic Fraction of Barley Straw (Hordeum vulgare) Inhibiting Microcystis

aeruginosa. Journal of Applied Phycology, 2009, 21 (3), 333-340

83. Park MH, Chung M, Ahmad A, Kim BH, Hwang SJ, Growth inhibition of

unicellular and colonial Microcystis strains (Cyanophyceae) by compounds

isolated from rice (Oryza sativa) hulls. Aquatic Botany, 2009, 90(4), 309-314.

84. Park MH, Kim BH, Chung IM, Hwang SJ, Selective bactericidal potential of rice

(Oryza sativa L. var. japonica) hull extract on Microcystis strains in comparison

with green algae and zooplankton. Bulletin of Environmental

Contamination and Toxicology, 2009, 83(1), 97-101.

85. Ahmad A, Kim SH, Ali M, Park I, Kim JS, Kim EH, Lim JJ, Kim SK, Chung

IM, New chemical constituents from Oryza sativa straw and their algicidal

activities against blue-green algae. Journal of Agricultural and Food Chemistry,

152

2013, 61(34), 8039-8048.

86. Zhou L, Bi Y, Jiang L, Wang Z, Chen W. Effect of black wattle (Acacia mearnsii)

extract on blue-green algal bloom control and plankton structure optimization:

a field mesocosm experiment. Water Environment Research, 2012, 84(12), 2133-

2142.

87. Nakai S, Hosomi M, Inoue Y, Murakami A, Myriophyllum spicatum-released

allelopathic polyphenols inhibiting growth of blue-green algae Microcystis

aeruginosa. Water Research, 2000, 34(11), 3026-3032.

88. Nakai S, Yamada S, Hosomi M, Anti-cyanobacterial fatty acids released from

Myriophyllum spicatum. Hydrobiologia, 2005, 543(1), 71-78.

89. Cheng W, Xuexiu C, Hongjuan D, Li Difu, Liu J, Allelopathic inhibitory effect

of Myriophyllum aquaticum (Vell.) Verdc. on Microcystis aeruginosa and its

physiological mechanism. Acta Ecologica Sinica, 2008, 28(6), 2595-2603.

90. Chen J, Liu Z, Ren G, Li P, Jiang Y, Control of Microcystis aeruginosa TH01109

with batangas mandarin skin and dwarf banana peel. Water SA, 2004, 30, 279-

282.

91. Xian Q, Chen H, Liu H, Zou H, Yin D, Isolation and identification of antialgal

compounds from the leaves of Vallisneria spiralis L. by activity-guided fractionation.

Environmental Science and Pollution Research, 2006, 13(4), 233-237.

92. Park MH, Hwang SJ, Ahn CY, Kim BH, H-M O, Screening of seventeen oak

extracts for the growth inhibition of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa

Kutz em. Elenkin. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,

2006, 77(1), 9-14.

93. Yi Y-L., Lei Y, Yin Y-B, Zhang H-Y, Wang G-X, The antialgal activity of 40

medicinal plants against Microcystis aeruginosa. Journal of Applied Phycology,

2012, 24(4), 847-856.

94. Zhang C, Yi YL, Hao K, Liu GL, Wang GX, Algicidal activity of Salvia

miltiorrhiza Bung on Microcystis aeruginosa--towards identification of algicidal

substance and determination of inhibition mechanism. Chemosphere, 2013,

153

93(6), 997-1004.

95. Lu Y, Wang J, Yu Y, Su W, Kong F, Inhibition of Camellia sinensis (L.) O.

Kuntze on Microcystis aeruginosa and isolation of the inhibition factors.

Biotechnology Letters, 2013, 35(7), 1029-1034.

96. Huang Y, Wang Y, Kong H, Solidago Canadensis L. Extracts To Control Algal

(Microcystis) Blooms In Ponds. Ecological Engineering, 2014, 70(1), 263-267.

97. Bittencourt-Oliveira MC, Hereman TC, Macedo-Silva I, Cordeiro-Araújo

MK, Sasaki FF, Dias CT, Sensitivity of salad greens (Lactuca sativa L. and

Eruca sativa Mill.) exposed to crude extracts of toxic and non-toxic

cyanobacteria. Brazilian Journal of Biology, 2015, 75(2), 273-278.

98. Meng P, Pei H, Hu W, Liu Z, Li X, Xu H, Allelopathic effects of Ailanthus

altissima extracts on Microcystis aeruginosa growth, physiological changes and

microcystins release. Chemosphere, 2015, 141, 219-226.

99. Wang H, Kang H; Zhang L; Cheng S; Liu H; Liu H; Sun B, Composition of Ethyl

Acetate Extracts from Three Plant Materials (Shaddock Peel, Pomegranate Peel,

Pomegranate Seed) and Their Algicidal Activities. Polish Journal of

Environmental Studies, 2015, 24 (4), 1803-1807.

100. Li J, Liu Y, Zhang P, Zeng G, Cai X, Liu S, Yin Y, Hu X, Hu X, Tan X, Growth

inhibition and oxidative damage of Microcystis aeruginosa induced by crude

extract of Sagittaria trifolia tubers. Journal of Environmental Sciences (China),

2016, 43, 40-

101. Yakefu Z, Huannixi W, Ye C, Zheng T, Chen S, Peng X, Tian Z, Wang J, Yang

Y, Ma Z, Zuo Z, Inhibitory effects of extracts from Cinnamomum camphora

fallen leaves on algae. Water Science and Technology, 2018, 77(11), 2545-2554.

102. Suzuki Y, Takahashi K, Saijo H, Ashitani T, Growth-inhibitory components in

Sugi (Cryptomeria japonica) extracts active against Microcystis aeruginosa.

Cogent Environmental Science, 2018, 4, 1-9

103. Tebaa L, Tazart D, Douma M, Loudiki M, Assessment of the potentially

algicidal effects of Thymus satureioides Coss. and Artemisia herba alba L.

against Microcystis aeruginosa. Applied Ecology and Environmental Research,

2018, 16(1), 903-912

154

104. Churro C, Fernandes AS, Alverca E, Sam-Bento F , Effects of tryptamine on

growth, ultrastructure, and oxidative stress of cyanobacteria and microalgae

cultures. Hydrobiologia, 649, 2010, 195-206.

105. Jancula D, Gregorová J, Marsálek B, Algicidal and cyanocidal effects of

selected isoquinoline alkaloids. Aquaculture Research, 2009, 41, 598-601.

106. Chrysayi-Tokousbalides M1, Machera K, Kyriakopoulou K, Aliferis

KA, Schrader KK, Tsoutsanis I, Anastasiadou P, Comparative toxicity of the

phytotoxins (8R,16R)-(-)-pyrenophorin and (5S,8R,13S,16R)-(-)-pyrenophorol

on aquatic organisms. Bulletin of Environmental

Contamination and Toxicology, 2007, 79(5), 499-503.

107. Murray D, Jefferson B, Jarvis P, Parsons SA, Inhibition of three algae species

using chemicals released from barley straw. Environmental Technology, 2010,

31(4), 455-66.

108. Zhu J, Liu B, Wang J, Gao Y, Wu Z, Study on the mechanism of allelopathic

influence on cyanobacteria and chlorophytes by submerged macrophyte

(Myriophyllum spicatum) and its secretion. Aquatic Toxicology, 2010, 98(2),

196-203.

109. Choe S, Jung I.H, Growth inhibition of freshwater algae by ester compounds

released from rotted plants. Journal of Industrial and Engineering Chemistry,

2002, 8, 297-304.

110. Hehmann A, Kaya K, Watanabe MM, Selective control of Microcystis using an

amino acid – a laboratory assay. Journal of Applied Phycology, 2002, 14(2),

85-89.

111. Cheng L, He Y, Tian Y, Liu B, Zhang Y, Zhou Q, Wu Z, Comparative

biotoxicity of N-Phenyl-1-naphthylamine and N-Phenyl-2-naphthylamine on

cyanobacteria Microcystis aeruginosa. Chemosphere, 2017, 176, 183-191.

112. Liu Z, Zhou L, Liu D, Zhu Q, Chen W, Inhibitory mechanisms of Acacia

mearnsii extracts on the growth of Microcystis aeruginosa. Water

Science and Technology, 2015, 71(6), 856-61.

113. Đặng Đình Kim (chủ biên), Công nghệ sản xuất và ứng dụng vi tảo. Sách

155

chuyên khảo tài nguyên thiên nhiên và môi trường Việt Nam, 2018, 379.

114. Huang Y. Wang Y, Kong H, Allelopathic effects of the extracts from an invasive

species Solidago canadensis L. on Microcystis aeruginosa. Letters in Applied

Microbiology, 2013, 57(1), 451-458.

115. Lê Kim Liên, Thực vật chí Việt Nam tập 7, Họ Cúc. NXB Khoa học và Kỹ

thuật 2007, 746

116. Tori M, Ohara Y, Nakashima K, Sono M, Thymol Derivatives from

Eupatorium fortunei. Journal of Natural Products, 2001, 64(8), 1048-1051.

117. Hai-Xia J, Jing P, Kun G, Terpenoids from Eupatorium fortunei TURCZ.

Helvetica Chimica Acta, 2006, 89(3), 558-566.

118. Hai X, Kun G, Benzofuran derivatives from Eupatorium fortunei. Natural

Product Letters, 2008, 22(11), 937-941.

119. Tran Thi Hong Hanh, Dan Thi Thuy Hang, Chau Van Minh, Lee Dong Ho,

Nguyen Tien Dat, Thymon consituents from Eupatorium fortunei. Journal of

Medicinal Materials, 2011, 16(3), 193-196.

120. Trần Hồng Hạnh, Đan Thúy Hằng, Châu Văn Minh, Trần Huy Thái, Nguyễn

Tiến Đạt, Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây Mần tưới

(Eupatorium fortunei). Tạp chí hóa học, 2011, 49(2ABC), 264-266.

121. Wang Y, Wang H, Li J, Thymol derivatives from Eupatorium fortunei and their

inhibitory activities on LPS-induced NO production. Phytochemistry Letters,

2014, 7, 190-193.

122. Nguyễn Tường Vy, Nguyễn Tiến Đạt, Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt

tính ức chế enzym tyrosinase của cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz).

Tap chí dược học, 2012, 440(52), 34-37.

123. Liu P Y, Li W H, Zhao T, Sauriol F, Gu Y C, Shi Q W, Zhang M L, Chemical

Constituents of Plants from the Genus Eupatorium (1904-2014). Chemistry &

Biodiversity, 2015, 12(10), 1481-1515.

124. Choi JG, Lee H, Hwang Y-H, Lee J-S, Cho W-K, Ma J Y, Eupatorium fortunei

and Its Components Increase Antiviral Immune Responses against RNA

Viruses. Frontiers Pharmacology, 2017, 8, 511 (1-12).

125. Antonio C, Nogueira S, Elnatan B, Raquel O, dos Santos Fontenelle, The

156

genus Eupatorium L. (Asteraceae): A review of their antimicrobial activity.

Journal of Medicinal Plants Research, 2017, 11(3), 43-47.

126. Kim A, Im M, Yim NH, Ma JY, Reduction of metastatic and angiogenic

potency of malignant cancer by Eupatorium fortunei via suppression of MMP-

9 activity and VEGF production. Scientific Reports, 2014,4, 6994.

127. Zhou C, Huang M, Xie L, Shen J, Xiao T, Wang R. IVIG inhibits TNF-α-

induced MMP9 expression and activity in monocytes by suppressing NF-κB and

P38 MAPK activation. International Journal of Clinical and Experimental

Pathology, 2015, 8(12), 15879-15886.

128. Ushiki J, Yoshihiko H, Hayakawa T T, Medicinal plants for suppressing soil-

borne plant diseases. Soil Science and Plant Nutrition, 1996, 42, 423-426.

129. Li MY, Wang J, Xu ZT, Effect of a variety of Chinese herbs and an herb-

containing dentifrice on volatile sulfur compounds associated with halitosis: An

in vitro analysis. Current Therapeutic Research, Clinical and Experimental,

2010, 71(2), 129-140.

130. Kim JH, Cho IS, So YK, Kim HH, Kim YH, Kushenol A and 8-

prenylkaempferol, tyrosinase inhibitors, derived from Sophora

flavescens. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2018.

33(1), 1048-1054.

131. Joo T, Sowndhararajan K, Hong S, Lee J, Park SY, Kim S, Jhoo JW, Inhibition

of nitric oxide production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells by stem bark of

Ulmus pumila L. Saudi Journal of Biological Sciences, 2014, 21(5), 427-435.

132. Kanoun-Boulé M, Vicente JA, Nabais C, Prasad MN, Freitas H,

Ecophysiological tolerance of duckweeds exposed to copper. Aquatic

Toxicology, 2009, 91(1), 1-9.

133. Thi Hoai Ha Nguyen, Thanh Loan Dang, Ngoc Thanh Nguyen, Dinh Tuan

Nguyen, Thi Mai Pham, Dang Khoa Tran, Microalgae as indicators of

eutrophication in Hoan Kiem lake, Hanoi, Vietnam. Journal of Biotechnology,

2015. 13(2), 355-365.

134. Dao TS, Do-Hong LC, Wiegand C, Chronic effects of cyanobacterial toxins on

157

Daphnia magna and their offspring. Toxicon, 2010, 55(7), 1244-1254.

135. Hong Y, A Sakoda, Hu Y-H, Sagehashi, Isolation and characterization of

antialgal allelochemicals from Arundo donax L. Allelopathy Journal, 2009, 00

(25), 357-368.

136. Wu T. Eupatriol, a New Monoterpene from Eupatorium tashiroi HAYATA.

Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1985, 33(9), 4005-4006.

137. Xu Q, Xie H, Xiao H, Wei X, Phenolic constituents from the roots of Mikania

micrantha and their allelopathic effects. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 2013, 61(30), 7309-7314.

138. Kowczyk-Sadowy M, Świsłocka R, Lewandowska H, Piekut J, Lewandowski

W, Spectroscopic (FT-IR, FT-Raman, 1H- and 13C-NMR), theoretical and

microbiological study of trans o-coumaric acid and alkali metal o-coumarates.

Molecules, 2015, 20(2), 3146-3169.

139. Szeleszczuk L, Zielińska-Pisklak M, Pisklak M, Wawer I, Effects of structural

differences on the NMR chemical shifts in cinnamic acid derivatives:

Comparison of GIAO and GIPAW calculations. Chemical Physics Letters,

2016, 653, 35-41.

140. Abu Bakar, Makahleh A, Saad B, In-vial liquid-liquid microextraction-

capillary electrophoresis method for the determination of phenolic acids in

vegetable oils. Analytica Chimica Acta, 2012, 742, 59-66.

141. Chon S-U, Kim J D, Biological Activity and Quantification of Suspected

Allelochemicals from Alfalfa Plant Parts. Journal of Agronomy and Crop

Science 2002, 188, 281-285.

142. Guowei Z, Xu Z, Fujuan Z, Shihong L Shenghong Li, Weiqi L. o-Coumaric

acid from invasive Eupatorium adenophorum is a potent phytotoxin.

Chemoecology, 2012. 22(1), 131–138.

143. Binev Y, Corvo M, Aires-de-Sousa J. The impact of available experimental data

on the prediction of 1H NMR chemical shifts by neural networks. Journal of

Chemical Information and Computer Sciences, 2004, 44(3), 946-949.

144. Lin L-j, Huang X-b, Z.-c. Lv. Isolation and identification of flavonoids

158

components from Pteris vittata L. Springer Plus, 2016, 5(1), 1649.

145. Singh D, Singh V. Isolation and Characterization of Flavonoids in Urena lobata

Leaves. European Journal of Medicinal Plants, 2016, 11(1), 1-6.

146. Owolabi, M, Yusuf KO, Ogundajo AL, Setzer WN, Chemical Composition and

Bioactivity of the Essential Oil of Chromolaena odorata from Nigeria. Records

of Natural Products, 2010, 4, 72-78.

147. Avlessi F, Djenontin ST, Alitonou G, Sohounhloue D KC, Chemical

composition and biological activities of the essential oil extracted from fresh

leaves of Chromoleana odorata (L. Robinson) growing in Benin. ISCA Journal

of Biological Sciences, 2012, 1(3), 7-13.

148. Wang X, Szeto YT, Jiang C, Wang X, Tao Y, Tu J, Chen J, Effects of

Dracontomelon duperreanum Leaf Litter on the Growth and Photosynthesis of

Microcystis aeruginosa. The Bulletin of Environmental

Contamination and Toxicology, 2018, 100(5), 690-694.

149. Grodowska K, Parczewski A, Organic solvents in the pharmaceutical industry.

Acta Poloniae Pharmaceutica, 2010, 67(1), 3-12.

150. Nguyễn Tiến Toàn, Nguyễn Xuân Duy, Ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến

hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa của cây diệp hạ châu

(Phyllanthus amarus) trồng tại Phú Yên. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 2014,

12(3), 412-42.

151. Taylor C, Matzke M, Kroll A, Read S D, Svendsen C, Crossley A, Toxic

interactions of different silver forms with freshwater green algae and

cyanobacteria and their effects on mechanistic endpoints and the production of

extracellular polymeric substances. Environmental Science: Nano, 2016, 3(2),

396-408.

152. Barrett R F P, Littlejohn JW, Curnow J, Long-term Algal Control in a Reservoir

Using Barley Straw. Hydrobiologia, 1999, 415, 309-313.

153. Rouco M, López-Rodas V, González R, Huertas IE, García-Sánchez

MJ, Flores-Moya A, Costas E, The limit of the genetic adaptation to copper in

159

freshwater phytoplankton. Oecologia, 2014, 175(4), 1179-1188.

154. Lurling M, van Oosterhout F, Effect of Selected Plant Extracts and D- and L-

Lysine on the Cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Water Environmental

Resource, 2014, 6, 1807-1825.

155. Hong Y, Hu HY, Xie X, Li FM, Responses of enzymatic antioxidants and non-

enzymatic antioxidants in the cyanobacterium Microcystis aeruginosa to the

allelochemical ethyl 2-methyl acetoacetate (EMA) isolated from reed (Phragmites

communis). Journal of Plant Physiology, 2008, 165(12), 1264-1273.

156. Jančula D, Maršálek B., Review Critical review of actually available chemical

compounds for prevention and management of cyanobacterial blooms.

Chemosphere 2011, 85, 1415–1422.

157. Wu ZX, Gan NQ, Huang Q, Song LR, Response of microcystis to copper stress:

do phenotypes of microcystis make a difference in stress tolerance?

Environmental Pollution, 2007, 147(2), 324-330.

158. Zhang t-t, Hu W, Zheng CY, Wang HF., The allelopathy and allelopathic

mechanism of phenolic acids on toxic Microcystis aeruginosa. Journal of

Applied Phycology, 2010, 22, 71-77.

159. Ni L, Acharya K, Hao X, Li S, Isolation and identification of an anti-algal

compound from Artemisia annua and mechanisms of inhibitory effect on algae.

Chemosphere, 2012, 88(9), 1051-1057.

160. Yu XB, Hao K, Ling F, Wang GX, Aquatic environmental safety assessment

and inhibition mechanism of chemicals for targeting Microcystis aeruginosa.

Ecotoxicology, 2014. 23(9): p. 1638-47

161. Linrong CH, Li J, Plant-Originated Kaempferol and Luteolin as Allelopathic

Algaecides Inhibit Aquatic Microcystis Growth Through Affecting Cell

Damage, Photosynthetic and Antioxidant Responses. Journal of Bioremediation

& Biodegradation, 2018. 9(2), 1-6

162. Shafek RE, Shafik NH, Michael HN, Antibacterial and Antioxidant Activities

of Two New Kaempferol Glycosides Isolated from Solenostemma argel Stem

Extract. Asian Journal of Plant Sciences, 2012, 11, 143-147.

163. Passreiter C, Matthiesen U, Willuhn G, 10-Acetoxy-9-chloro-8,9-

160

dehydrothymol and further thymol derivatives from Arnica sachalinensis. Plant

chemistry, 1998, 49, 777-781.

164. Wang H-Q, Qiao N, Dong J-X, Zhang L-Y, Guo Y-F, Chemical Composition

of Volatile Oil from Two Emergent Plants and Their Algae. Polish Journal of

Environmental Studies, 2014, 23(6), 2371-2374.

165. Nakai S, Zou G, Okuda T, Nishijima W, Hosomi M, Polyphenols and fatty

acids responsible for anti-cyanobacterial allelopathic effects of submerged

macrophyte Myriophyllum spicatum. Water Science and Technology, 2012,

66(5), 993-999.

166. Zhou S, Shao Y, Gao N, Deng Y, Qiao J, Ou H, Deng J, Effects of different

algaecides on the photosynthetic capacity, cell integrity and microcystin-LR

release of Microcystis aeruginosa. Science of The Total Environment, 2013,

463, 111-119.

167. Ogawa S, Yazaki Y, Tannins from Acacia mearnsii De Wild. Bark: Tannin

Determination and Biological Activities. Molecules. 2018, 23, 837

168. Oukarroum A, Zaidi W, Samadani M, Dewez D, Toxicity of Nickel Oxide

Nanoparticles on a Freshwater Green Algal Strain of Chlorella vulgaris.

BioMed Research International, 2017, 2017, 1-8.

169. Wu S, Zhang H, Yu X, Qiu L, Toxicological Responses of Chlorella vulgaris to

Dichloromethane and Dichloroethane. Environmental Engineering Science,

2014, 31(1), 9-17.

170. Montassir L, Berrebaan I, Mellouki F, Zkhiri F, Acute toxicity and reprotoxicity

of aqueous extract of a Moroccan plant (Tetraclinis articulata) on freshwater

cladoceran Daphnia magna. Journal of Materials and Environmental Science,

2017, 8(2), 770-776.

171. Homer DH, Waller WT, Chronic effects of reduced dissolved oxygen on

Daphnia magna. Water, Air, and Soil Pollution, 1983, 20(1), 23-28.

172. El-Deeb Ghazy, Habashy M.M, Mohammady EY, Effects of pH on survival,

growth and reproduction rates of the crustacean, Daphnia Magna. Australian

Journal of Basic and Applied Sciences, 2011, 5, 1-10

173. Huang AG, Yi YL, Ling F, Lu L, Zhang QZ, Wang GX, Screening of plant

161

extracts for anthelmintic activity against Dactylogyrus intermedius

(Monogenea) in goldfish (Carassius auratus). Parasitology Research, 2013,

112(12), 4065-4072.

174. Zaltauskaite J, Čypaitė A, Sujetoviene G, Aužbikavičiūt A, Lemna minor as a

tool for wastewater toxicity assessment and pollutants removal agent. The 9th

International Conference “Environmental Engineering”, 2014, 1-6.

175. Ramirez Toro, Leather G.R, Einhellig F, Effects of three phenolic compounds

on Lemna gibba G3. Journal of Chemical Ecology, 1988, 14(3), 845-853.

176. Portier D, Influence of allelochemicals and aqueous plant extracts on growth of

duckweed. Journal of Aquatic Plant Management 1989, 27(1), 90-95.

177. Pęczuła, W. and M. Suchora, The influence of barley straw extract addition on

the growth of duckweed (Lemna valdiviana Phil.) under laboratory conditions.

Knowledge and Management of aquatic Ecosystem, 2014, 415, 1-7.

178. Lirong Zh, L.H., Yunyan Hu, Jingguo S, Wenqing Ch, Effects of wattle extract

on Microcystic aeruginosa growth and the simulated mini fresh water

ecosystem. Journal of environmental biology, 2010, 31(6), 1023-1030.

179. Fierer N, Cates RG. Schimel JP, Cates RGand Zou JP, Influence of balsam

poplar tannin fractions on carbon and nitrogen dynamics in Alaskan taiga

floodplain soils. Soil Biology &amp; Biochemistry, 2001, 33,(1), 1827-1839.

180. Ding YL, Chen YH, Zhu BY, Zhao JH, Application of physical, biological and

ecological remediation techniques (BIOSS system) on the lake of Yanzhong

Park in Shanghai. Modern Fish. Info, 2007. 7(1), 3-8.

181. Kaya K, Liu YD, Shen YW, Xiao BD, Sano T, Selective control of toxic

Microcystis water blooms using lysine and malonic acid: an enclosure

experiment. Environmental Toxicology, 2005. 20(2), 170-178.

182. Waybright TJ, Ferrier D, Terlizzi, Chemical characterization of the aqueous

algistatic fraction of barley straw (Hordeum vulgare) inhibiting Microcystis

aeruginosa. Journal of Applied Phycology, 2009 21(3), 333-340.

162