bab iii bahan dan metode 3.1 tempat dan...
TRANSCRIPT
20
BAB III
BAHAN DAN METODE
3.1 Tempat dan Waktu
Penelitiantelah dilaksanakan mulai Februari 2013 sampai dengan Juni
2013. Pengambilan sampel lamun Enhalus acoroides dan Thalassia hemprichii
dilakukan pada bulan Februari 2013 di Perairan Pulau Pramuka Kepulauan Seribu
DKI Jakarta. Identifikasi metabolit sekunder dan ekstraksi dilakukan di
Laboratorium Bioteknologi Perikanan dan Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan
Ilmu Kelautan (FPIK) Universitas Padjadjaran (Unpad). Uji aktivitas antioksidan
dan Uji Total Kadar Polifenol dilakukan di Laboratorium Penelitian dan
Pelayanan Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
(FMIPA), Unpad. Sedangkan Uji Peroksida dilakukan di Laboratorium Kimia
Analitik, Jurusan Kimia, FMIPA Unpad.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Tabel 1. Alat dan KegunaannyaNO Alat Kegunaan
1 Global Positioning System
(GPS)
Untuk menentukan titik pengambilan sampel
2 Termometer Untuk mengukur suhu perairan sampel
3 Refraktometer Untuk mengukur salinitas perairan sampel
4 pH meter Untuk mengukur pH perairan sampel
5 Kotak Styroform Untuk menyimpan sampel selama perjalanan
6 Kantong plastik Untuk menyimpan sampel
7 Gunting Untuk memotong sampel
8 Pisau Untuk mencacah sampel
9 Talenan Untuk tempat alas saat proses pencacahan sampel
10 Blender Untuk menghaluskan sampel menjadi serbuk
11 Kertas label Untuk memberi tanda
12 Pipet tetes Untuk mengambil cairan kimia
13 Pipet volum Untuk mengambil cairan kimia
14 Tabung reaksi Untuk tempat terjadinya reaksi/pencampuran
21
Tabel 1 (lanjutan). Alat dan KegunaannyaNO Alat Kegunaan
15 Kaca arloji Untuk tempat meneteskan cairan uji
16 Penangas air Untuk memanaskan
17 Alumunium Foil Untuk menutup gelas ukur/erlenmeyer
18 Erlenmeyer Untuk maserasi
19 Gelas kimia Untuk maserasi
20 Gelas ukur Untuk mengukur volume pelarut
21 Timbangan analitik Untuk mengukur berat padatan
22 Spatula Untuk mengambil padatan
23 Orbital shaker Untuk pengadukan saat maserasi
24 Kertas saring Untuk memisahkan filtrat dan residu
25 Rotatory evaporator Untuk menguapkan pelarut
26 Botol vial Untuk menyimpan ekstrak pekat
27 Mikropipet Untuk mengambil cairan kimia dalam jumlah kecil
28 Magnetic stirrer Untuk menghomogenkan larutan
29 Spektrofotometri UV-vis Untuk mengukur serapan/absorbansi
30 Buret Untuk titrasi
31 Inkubator Untuk mempercepat oksidasi
3.2.2 Bahan
Tabel 2. Bahan yang digunakanNo Bahan No Bahan
1 Sampel daun, rimpang,, akar, buah,
bunga, lamun
13 H2SO4
Uji Fitokimia dan Ekstraksi 14 NaOH 10%
2 Pereaksi meyer 15 Etanol 70%
3 Pereaksi wagner 16 FeCl3 5%
4 Serbuk magnesium 17 Es Batu
5 Amil alcohol 18 Amil alkohol
6 Kloroform Uji Aktivitas Antioksidan
7 Metanol 19 Vitamin C (Asam askorbat)
8 Akuades 20 Kristal 2,2–difenil-2-pikrihidrazil (DPPH)
9 Asetat Anhidrida Uji Total Kadar Polifenol
10 Asam sulfat pekat 21 Asam Galat
11 Air panas 22 Na2CO3 5%
12 HCl 2N 23 Follin Ciocalteau 50%
22
Tabel 2 (Lanjutan). Bahan yang digunakanNo Bahan No Bahan
Uji Bilangan Peroksida
24 Minyak Ikan, Minyak Nabati 27 Kalium Iodida
25 Cairan Tween 20 28 Indikator pati 1%
26 Asam asetat glasial 29 Natrium tiosulfat 0,1 N
3.3 Metode Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode observasi
dengan melakukan eksperimen di laboratorium menggunakan faktor perbedaan
konsentrasi ekstrak. Penelitian ini meliputi identifikasi metabolit sekunder,
ekstraksi, uji aktivitas antioksidan, uji total kadar polifenol, dan uji bilangan
peroksida.
Identifikasi kandungan metabolit sekunder menggunakan uji kualitatif
fitokimia dengan prinsip reaksi warna, pengendapan, serta pembentukan busa
(Harborne 1987). Ekstraksi menggunakan metode maserasi (Quinn 1998 dalam
Agustiningrum 2004) yaitu perendaman sampel berulang dengan menggunakan
pelarut sampai tidak berwarna lagi, prinsipnya adalah proses difusi karena
perbedaan konsentrasi di luar dan di dalam sel. Uji aktivitas antioksidan
menggunakan metode DPPH (Blois 1958 dalam Molyneux 2004) pada berbagai
konsentrasi sampel serta menggunakan Vitamin C sebagai pembanding dengan
prinsip penyerapan hidrogen oleh radikal bebas dari antioksidan ditunjukkan
dengan nilai absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer. Uji total kadar
polifenol menggunakan metode total phenolic content (TPC) folin-ciocalteu
dengan prinsip reaksi oksidasi dan reduksi kolorimetrik untuk mengukur semua
senyawa fenolik dalam sampel uji (Singleton dan Rossi 1965). Uji bilangan
peroksida menggunakan prinsip oksidasi-reduksi pengurangan bilangan peroksida
pada emulsi minyak yang telah ditambahkan sampel dengan cara titrasi iodometri
(Santoso et al. 2003 dalam Prabowo 2009).
23
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Pengambilan dan Persiapan Sampel
Bahan lamun Enhalus acoroides dan Thalassia hemprichii diambil dari
lapangan secara lengkap mulai dari ujung akar sampai ujung daun, lalu dibawa ke
laboratorium. Setelah itu bagian-bagian dari tegakan yaitu daun, rimpang, akar,
bunga, daging buah, dan biji dipotong serta dipisahkan dengan menggunakan
gunting. Kemudian dicuci dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.
Selanjutnya setiap bagian yang telah dipisahkan dipotong kecil/ dicacah dengan
menggunakan gunting untuk kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender
sampai menjadi serbuk.
3.4.2 Identifikasi Metabolit Sekunder (Harborne 1987)
a. Alkaloid
Serbuk sampelditimbang sebanyak 1 g, kemudian dilarutkan dalam
kloroform, dan ditambahkan beberapa tetes amonia (NH4OH).Larutan ekstrak
disaring dalam tabung reaksi tertutup, Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi
dikocok dengan 10 tetes H2SO4 2M, ditambahkan pereaksi 2 tetes pereaksi Meyer
dan pereaksi Wagner. Perubahan ada tidaknya endapan diamati.
b. Flavonoid
Sampel serbuk 1 g diekstraksi dengan menggunakan metanol kemudian
dibagi menjadi tiga tabung reaksi. Tabung pertama ditambahkan Amil alkohol,
HCl pekat 2 tetes kemudian ditambah 0,1 g Mg serbuk. Tabung reaksi kedua
ditambahkan H2SO4 2N sebanyak 2 tetes.Tabung terakhir ditambahkan NaOH
10% sebanyak 2 tetes.Ketiga tabung dikocok kuat. Perubahan warna diamati.
c. Steroid/Triterpenoid
Sebanyak 1 g sampel diekstraksi dengan menggunakan kloroform,
disaring. Kemudian diteteskan ke dalam kaca arloji dan dibiarkan kering.
Kemudian ditambahkan pereaksi Lieberman Burchad yaitu satu tetes asam asetat
anhidrida dan satu tetes asam sulfat pekat. Perubahan warna diamati.
24
d. Fenol hidroquinon
Sebanyak 1 g serbuk sampel dilarutkan dalam 20 ml etanol 70%, setelah
dikocok kemudian diambil 1 ml, selanjutnya ditambahkan2 tetes pereaksi
FeCl35%. Perubahan warna diamati.
e. Saponin
Sebanyak 1 gserbuk sampel dimasukan dalam erlenmeyer, ditambahkan 10
ml air panas, didihkan selama 5 menit, kemudian disaring dalam keadaan panas,
larutan diambil sebanyak 10 ml kemudian dikocok kuat secara vertikal selama 10
detik. Pembentukan busa diamati.
f. Tanin
Sebanyak 1 gserbuk sampel ditambahkan air, dididihkan selama beberapa
menit dan saring, diambil 2ml hasil penyaringan (filtrat) dan ditambahkan 1
sampai 2 tetes pereaksi FeCl35 %. Perubahan warna diamati.
3.4.3 Ekstraksi (Quinn 1998 dalam Agustiningrum 2004)
Tujuan dilakukan ekstraksi iniadalah untuk mengambil atau mendapatkan
senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam tegakan lamun. Bagian-
bagian sampel lamun (daun, rimpang, akar, bunga, daging buah, serta biji) yang
telah dihaluskan kemudian ditimbang sebanyak 40 g dan direndam dengan pelarut
metanol sebanyak 400 ml selama 3 x 24 jam. Hasil maserasi yang berupa larutan
kemudian disaring dengan kertas saring sehingga didapat filtrat dan residu. Filtrat
yang diperoleh di evaporasi hingga diperoleh ekstrak pekat dengan menggunakan
Rotatory evaporator pada suhu 40C-50C. Sedangkan pada residu dilakukan
pengulangan perendaman sampai tidak berwarna lagi. Dari proses ini maka
diperoleh ekstrak pekat metanol daun, rimpang, akar bunga, daging buah, serta
biji.
3.4.4 Uji Aktivitas Antioksidan (Blois 1958 dalam Molyneux 2004)
Berdasarkan penelitian Putri (2011) dan Rumiantin (2011) yang dijadikan
sebagai acuan, maka ekstrak pekat dari bagian-bagian lamun hasil ekstraksi
menggunakan pelarut metanol dilarutkan dalam metanol dengan berbagai
25
konsentrasi, dengan membuat larutan stok terlebih dahulu (Lampiran 3). Sebagai
pembanding dan kontrol positif, digunakan antioksidan yang biasa digunakan
masyarakat yaitu Vitamin C yang dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut
metanol dengan konsentrasi 0,25, 0,5, 1, 2 dan 4 ppm. Larutan DPPH 160 ppm
dibuat denganmelarutkan 1,6 mgDPPH dengan pelarut metanol sebanyak 10 ml.
Proses pembuatan larutan DPPH dilakukan dalam kondisi suhu rendah dan
terlindung dari sinar matahari.
Larutan ekstrak dan larutan antioksidan pembanding (kontrol positif)yang
telah dibuat masing-masing diambil 4,5 ml dan direaksikan dengan 500 μl larutan
DPPH dalam tabung reaksi yang berbeda serta diberi label. Larutan blanko
sebagai kontrol negatif juga dibuat dengan melarutkan 500μl larutan DPPH
ditambahkan metanol 4,5 ml. Larutan tersebut kemudian diinkubasi pada suhu
37C selama 30 menit dan diukur absorbansinya dengan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 515 nm.
3.4.5 Uji Total Kadar Polifenol (Singleton dan Rossi 1965)
Ekstrak lamun masing-masing sampel sebanyak 5 mg dilarutkan dengan 2
ml etanol 96% dalam tabung reaksi. Campuran tersebut ditambahkan 5 ml
akuades dan 0,5 ml reagen Follin-Ciocalteau (50% v/v), kemudian didiamkan
selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 1 ml larutan natrium karbonat (7.5%
b/v), dihomogenasi dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 jam dalam kondisi
tanpa cahaya (gelap). Kandungan total fenol diukur dengan spektrofotometer UV-
Visible (UV-Vis) pada panjang gelombang 765 nm.
3.4.6 Uji Bilangan Peroksida (Santoso et al. 2003 dalam Prabowo 2009)
Minyak yang digunakan dalam penelitian adalah minyak ikan yang
diperoleh dari pengumpul minyak daerah Cimahi Jawa Barat, minyak goreng yang
masih baru diperoleh dari pasaran, minyak goreng bekas pakai yang sudah dipakai
untuk menggoreng sebanyak kurang lebih tiga kali dalam skala rumah tangga.
Sistem emulsi minyak dibuat mengacu pada metode Santoso et al. (2003) yang
dimodifikasi, yaitu dengan menghomogenkan 5 g (6 ml)dan 30 ml akuades yang
telah ditambahkan 1,25 ml tween 20. Sistem emulsi lemak ditambahkan ekstrak
26
bagian lamun terbaik dari tahap sebelumnya yaitu daunEnhalus acoroides dengan
konsentrasi136,40 ppm, dan 200 ppm yang selanjutnya disebut sampel minyak.
Kemudian sampel minyak disimpan selama empat belas hari untuk minyak ikan
dan satu hari untuk minyak goreng dalam inkubator bersuhu 40C untuk
mempercepat oksidasi. Sampel minyak selanjutnya ditimbang sebanyak 5 g (6 ml)
di dalam labu erlenmeyer kemudian ditambahkan 30 ml pelarut (60% asam asetat
glacial dan 40% kloroform). Setelah larut kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan
KI jenuh dan didiamkan 10 menit sambil dikocok. Iodin yang terbentuk dititrasi
dengan larutan Na2S2O3 0,1 N dengan penambahan indikator pati 1%. Titrasi
dihentikan saat larutan sampel berubah dari berwarna biru setelah ditambahkan
indikator pati menjadi tidak berwarna. Hasil pengurangan volume akhir terhadap
volume awal larutan Na2S2O30,1 N yang ditunjukkan oleh skala buret merupakan
volume total larutan Na2S2O30,1 N yang digunakan untuk titrasi sampel. Cara
yang sama seperti prosedur diatas ddibuat juga untuk penetapan blanko sebagai
kontrol negatif namun tidak dilakukan penambahan sampel (0 ppm). Kemudian
dilakukan analisa perhitungan nilai bilangan peroksida.
3.5 Parameter yang diamati
Parameter yang diamati dari penelitian ini adalah meliputi identifikasi
metabolit sekunder dan uji aktivitas antioksidan
3.5.1 Identifikasi Metabolit sekunder
Tabel 3. Parameter uji fitokimiaUji Fitokimia Parameter yang diamati
Uji Alkaloid + jika adanya endapan putih kekuningan
+ jika adanya endapan cokelat
Uji Flavonoid + jika terbentuk warna orange/kuning/merah/cokelat
Uji Steroid/ Triterpenoid + jika terbentuk warna merah/biru/ungu
Uji Saponin + jika terbentuk busa stabil 1-10cm, tidak hilang pada
penambahan HCl 2 N
Uji Fenol Hidrokuinon + jika terbentuk warnahijau-biru/ungu
Uji Tanin + jika terbentuk warna biru/hijau kehitaman
Sumber tabel : Harborne (1987)
27
3.5.2 Inhibisi antioksidan
Perhitungan yang digunakan adalah nilai EC50 (Effecient Concentration
50%) untuk menggambarkan besarnya konsentrasi senyawa uji yang dapat
menangkal radikal sebesar 50%. Berikut perhitungannya (Molyneux 2004)
% Inhibisi = absorbansi blanko − absorbansi sampelabsorbansi sampel x 100%Nilai EC50 diperolehdengan menggunakan persamaan regresi linier, diplotkan
dalam sumbu x dan y.
EC50Y=a+bx
Semakin kecil nilai EC50maka semakin tinggi aktivitas antioksidan yang
dimilikinya (Molyneux 2004)
3.5.3 Kadar Total Fenol
Kandungan total fenol diinterpretasikan sebagai milligram ekivalen asam
galat (GAE= Galic Acid Equivalent) per gram sampel (mg GAE/g sampel)
kemudian dipersentasikan (Singleton 1965).
Kadar polifenol % = Pengukuran kadar polifenol rata − ratakonsentrasi awal sampel x 10003.5.4 Evaluasi Aktivitas Antioksidan (Penghitungan Bilangan Peroksida)
Tahapan ini bertujuan untuk menentukan seberapa besar konsentrasi
ekstrak terpilih yang mampu menghambat pembentukan peroksida dalam emulsi
minyak dinyatakan dengan nilai peroksida. Nilai bilangan peroksida dinyatakan
miliequivalen per 1 kg minyak atau lemak dapat dihitung dengan rumus berikut
(Ketaren 1986) :
ℎ = A x N x 1000G x100%A = Jumlah ml larutan Na2S2O3 untuk titrasiN= Normalitas larutan Na2S2O3
G=Berat sampel (g)
Semakin tinggi bilangan peroksida maka semakin tinggi pula tingkat ketengikan
suatu minyak (ASA 2000 dalam Wildan 2002).
28
3.6 Analisa Data
Data yang diperoleh berupa reaksi perubahan warna, terbentuknya
endapan, dan adanya busa pada identifikasi metabolit sekunder , nilai daya
inhibisi EC50, total kadar polifenol, serta nilai bilangan peroksida pada uji
aktivitas antioksidan kemudian dianalisis secara deskriptif dan ditampilkan dalam
bentuk tabel dan gambar.