31

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1. Lokasi Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Sintesis, Laboratorium Formulasi

Sediaan Farmasi, Laboratorium Mikrobiologi serta Laboratorium Kimia Terpadu

II, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Malang.

4.2. Alat Penelitian

4.2.1. Pembuatan Serbuk Simplisia

1. Mesin penggiling

2. Ayakan berukuran 20 dan 40

3. Analytic Balance Scout Pro

4. Oven BINDER

4.2.2. Proses Fraksinasi

1. Timbangan Analytic Balance Scout Pro

2. Timbangan Analytical Balance Mettler Toledo

3. Gelas ukur

4. Beaker glass

5. Erlenmeyer

6. Pipet tetes

7. Batang pengaduk

8. Sudip

9. Corong Buchner

10. Cawan porselen

11. Oven binder

12. Rotary evaporator vacuum

32

4.2.3. Identifikasi Profil KLT

1. Chamber

2. Lempeng KLT

3. Cawan porselen

4. Hotplate

5. Pinset

6. Pipa kapiler 5 𝜇l

7. Sinar UV

8. Timbangan analytic balance scout pro

9. Vortex

4.2.4. Identifikasi bakteri Escherichia coli

1. Object glass

2. Bunsen

3. Kawat ose

4. Mikroskop cahaya

4.2.5. Pengujian Difusi Cakram

1. Autoklaf

2. Inkubator

3. Laminar Air Flow

4. Tabung Reaksi

5. Mikro pipet

6. Erlenmeyer

7. Cawan petri

8. Kawat ose

9. Hotplate

10. Bunsen

11. Pinset

12. Eppendorf

13. Timbangan analitik

14. Beaker glass

15. Yellow tip

33

16. Blue tip

17. Vortex

18. Cotton swab

19. Sterile blank disc

20. Jangka sorong

4.3. Bahan Penelitian

4.3.1. Bahan Uji

Tanaman uji yang digunakan pada penelitian kali ini yaitu daging buah

Limonia acidissima L. yang diperoleh dari Kec. Rasanae Barat Kota Bima, NTB.

Identifikasi tanaman dilakukan di UPT Materia Medika Batu. Bakteri uji adalah

Escherichia coli diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Parasitologi

Universitas Muhammadiyah Malang.

4.3.2. Proses Ekstraksi

1. Pelarut Etanol teknis

2. Daging buah kinca (Limonia acidissima L.)

4.3.3. Identifikasi Senyawa dengan KLT

1. Etil asetat teknis

2. N-heksan teknis

3. Asam sulfat 10%

4. Pereaksi FeCl3

5. Dragendorf

6. Anisaldehida asam sulfat

7. KOH 10%

4.3.4. Identifikasi Bakteri Escherichia coli

1. Peremajaan bakteri Escherichia coli

2. Crystal violet

3. Lugol

4. Alkohol 96%

5. Safranin

34

4.3.5. Pengujian Difusi Cakram

1. Fraksi Etanol daging buah Limonia acidissima L.

2. Nutrient agar (NA)

3. Aquadest steril

4. DMSO 1%

5. Hasil peremajaan bakteri Escherichia coli

6. Kloramfenikol 30 μg/disk

4.4. Variabel Penelitian

4.4.1. Variabel Bebas

Pada penelitian ini menggunakan variabel bebas yaitu komponen senyawa

kimia dari fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L. dengan konsentrasi

fraksi sebesar 10%, 15 %, dan 20 %.

4.4.2. Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah diameter zona hambat yang

dihasilkan oleh senyawa uji.

4.5. Definisi Operasional

1) Senyawa uji pada penelitian ini adalah senyawa yang terdapat pada fraksi etanol

buah Limonia acidissima L. yang dipisahkan dengan teknik pewarnaan.

2) Diagonal zona hambat adalah zona bening yang dihasilkan oleh aktivitas

senyawa uji fraksi etanol buah Limonia acidissima L. dimana besarnya diagonal

zona bening tersebut menandakan daya hambat dari aktivitas senyawa uji fraksi

etanol buah Limonia acidissima L.

4.6. Sterilisasi Alat dan Bahan

Semua alat yang akan digunakan terlebih dahulu disterilkan melalui proses

sterilisasi yaitu dengan cara sterilisasi kering dan sterilisasi basah. Alat dan bahan

yang akan disterilkan antara lain yaitu cawan petri, penjepit, erlenmeyer, spatula,

Nutrient agar (NA) dan alat serta bahan lain yang akan digunakan pada sterilisasi

di autoklaf.

35

4.6.1. Sterilisasi Kering

Sterilisasi kering mencakup cara sterilisasi dengan menggunakan api

langsung dan dengan oven pemanas.

a. Sterilisasi dengan api langsung

Sterilisasi ini dilakukan pada alat seperti jarum ose, spatel, pinset, mulut tabung

dan batang pengaduk.

b. Sterilisasi dengan oven pemanas

Oven pemanas digunakan untuk sterilisasi peralatan gelas yang tidak berskala

seperti cawan petri, pipet, penjepit serta tabung reaksi. Alat-alat yang disterilkan

dimasukkan kedalam oven setelah mencapai suhu 160ºC selama 1-2 jam

4.6.2. Sterilisasi Basah

Sterilisasi basah dilakukan dengan memakai autoklaf. Peralatan yang

disterilkan antara lain media pertumbuhan bakteri Escherichia coli, erlenmeyer,

gelas ukur, dan pipet tetes. Proses sterilisasi basah ini dilakukan selama 15 sampai

20 menit dengan suhu 121ºC.

4.7. Metode Penelitian

4.7.1. Rancangan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri senyawa

dalam fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L. terhadap pertumbuhan

bakteri Escherichia coli dengan metode difusi cakram secara in vitro yang

ditunjukkan dengan zona hambat serta untuk mengetahui golongan senyawa yang

terkandung pada fraksi etanol.

Dilakukan dengan menggunakan dua perlakuan yakni kelompok uji yaitu

fraksi etanol dan kelompok kontrol yaitu kloramfenikol. Dalam penelitian ini

jugadilakukan melewati beberapa tahap yaitu:

1) Penyiapan simplisia

2) Untuk menarik komponen senyawa (fraksinasi bertingkat)

3) Identifikasi kandungan kimia

4) Menggunakan metode difusi cakram dalampengujian antibakteri

36

4.7.2. Kerangka Operasional

Gambar 4.1. Skema Kerangka Operasional

4.8. Prosedur Kerja

4.8.1. Preparasi Simplisia

Sampel yang akan diteliti adalah daging buah Limonia acidissima L.

Terlebih dahulu buah dicuci dengan air hingga bersih lalu dipisahkan bagian daging

buah dari cangkangnya dan dikeringkan pada suhu 40°C dengan cara diangin-

anginkan tanpa terkena paparan sinar matahari. Kemudian, jika sudah kering daging

buah dihaluskan dengan mesin penggiling, sehingga didapatkan serbuk yang

memiliki tekstur halus. Selanjutnya diayak memakai Shieve Shaker dengan derajat

kehalusan tertentu.

Penyiapan simplisia daging buah Limonia acidissima L.

Pembuatan fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L.

Optimasi eluen

Eluasi

Identifikasi senyawa dengan KLT

Sterilisasi alat dan bahan

Preparasi media Na

Preparasi bakteri Escherichia coli

Pengujian antibakteri dengan metode difusi cakram

Kelompok uji

Pembuatan fraksi etanol daging

buah Limonia acidissima L.

dengan konsentrasi 10 %, 15 %,

20 %

Kelompok kontrol

Kontrol (+) : Kloramfenikol

(30µg/disk)

Kontrol (-) : 0,1 ml DMSO 1% +

aquadest ad 1 ml

Analisis data

37

4.8.2. Proses Fraksinasi Bahan Uji dengan Pelarut Etanol

Proses pada penelitian ini akan dilakukan dengan metode fraksinasi

bertingkat memakai 3 macam pelarut sesuai kepolarannya yakni pelarut n-heksan,

etil asetat dan etanol.

Dalam pembuatan fraksi etanol digunakan serbuk daging buah Limonia acidissima

L. sebanyak 1300 gram yang telah di fraksinasi terlebih dahulu dengan pelarut n-

heksan, etil asetat kemudian dilanjutkan dengan pelarut etanol dengan

menggunakan metode maserasi (perendaman) selama 24 jam dengan cara sebagai

berikut :

1. Masukkan residu serbuk daging buah Limonia acidissima L. yang sebelumnya

telah di fraksinasi terlebih dahulu dengan pelarut n-heksan dan etil asetat ke

dalam sebuah bejana bermulut besar.

2. Serbuk daging buah ditambahkan dengan 13000 ml (Perbandingan 1:10) etanol

direndam selama 24 jam dan disaring dengan corong buchner dan tampung

filtratnya (filtrat 1 dan residu 1).

3. Residu 1 dimaserasi kembali dengan etanol sebanyak 6500 ml (Perbandingan

1:5) direndam selama 24 jam. Saring dan tampung filtratnya (filtrat 2 dan residu

2).

4. Residu 2 dimaserasi kembali dengan etanol sebanyak 6500 ml (Perbandingan

1:5) direndam selama 24 jam. Saring dan tampung filtratnya (filtrat 3 dan residu

3).

5. Metode ini dikerjakan secara berulang sampai filtrat tidak lagi menunjukkan

adanya komponen yang tertarik dengan pelarut etanol. Pada pengujian KLT

dilakukan penotolan sebanyak 5 µl pada masing-masing filtrat untuk melihat

kepekatan dari filtrat yang didapat. Hal ini ditandai dengan tidak adanya lagi

pembentukan noda pada plat KLT.

6. Filtrat digabungkan kemudian dipekatkan dengan Rotary evaporator vacuum

memakai suhu 40°C hingga didapatkan larutan ekstrak kental. Lalu ekstrak

kental dipindahkan ke cawan porselen. Ekstrak kental dikeringkan di oven

dengan suhu 40ºC sampai bobot konstan.

7. Setelah konstan, ekstrak disimpan dilemari pendingin sampai siap digunakan.

38

4.8.3. Pemisahan Senyawa dengan KLT

Fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L. ditimbang sebanyak 0,5 g

ditambah 5 ml HCL 2N, didihkan dan tutup dengan corong berisi kapas yang telah

dibasahi dengan aquadest selama 50 menit. Setelah dingin, tambahkan ammonia

sampai basa, kemudian di ekstraksi dengan 4-5 ml n-heksan sebanyak 2x, lalu

uapkan sampai tinggal 0,5 ml. Totolkan sebanyak 10 μl pada lempeng KLT,

kemudian di eluasi dengan berbagai macam fase gerak. Eluen yang memiliki

kemampuan terbaik dalam memisahkan komponen senyawa, selanjutnya akan

dipakaiuntuk pengujian antibakteri menggunakan metode difusi cakram (Depkes

RI, 2008).

1) Fase Diam : Silica Gel TLC 60 F254

2) Optimasi fase gerak : n-heksan : etil asetat = 2 : 8

n-heksan : etil asetat = 5 : 5

n-heksan : etil asetat = 7 : 3

n-heksan : etil asetat = 3 : 7

4.8.4. Identifikasi Komponen Senyawa

Terhadap komponen senyawa yang telah dipisahkan dengan metode KLT,

dilakukan identifikasi senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada fraksi etanol

dengan penampak noda sebagai berikut:

a. Alkaloid : dragendorff

Hasil positif alkaloid ditunjukkan dengan adanya noda berwarna jingga

b. Terpenoid : anisaldehida-asam sulfat.

Panaskan lempeng pada suhu 100°C selama 5-10 menit. Hasil positif terpenoid

di tunjukkan dengan adanya noda berwarna ungu

c. Flavonoid : uap amonia atau asam sulfat 10 %

Hasil positif flavanoid di tunjukkan dengan adanya noda berwarna kuning

intensif

d. Polifenol dan Tanin: besi (III) klorida 1%

Hasil positif polifenol di tunjukkan dengan adanya noda berwarna hitam

e. Antrakuinon: larutan kalium hidroksida 10% dalam metanol

Hasil positif antrakuinon di tunjukkan dengan adanya noda berwarna kuning,

kuning coklat, merah ungu atau hijau ungu (Harborne, 1987).

39

4.8.5. Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji

Pembuatan konsentrasi larutan uji dibuat dengan cara sebagai berikut:

1) Timbang fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L. sebanyak 100 mg

larutkan dalam 0,1 ml DMSO 1%, ditambahkan aquadest steril sampai 1,0 ml.

Sehingga diperoleh larutan uji 10 %.

2) Timbang fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L. sebanyak 150 mg

larutkan dalam 0,1 ml DMSO 1%, ditambahkan aquadest steril sampai 1,0 ml.

Sehingga diperoleh larutan uji 15 %.

3) Timbang fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L. sebanyak 200 mg

larutkan dalam 0,1 ml DMSO 1%, ditambahkan aquadest steril sampai 1,0 ml.

Sehingga diperoleh larutan uji 20 %.

4.8.6. Preparasi Media

Dalam penelitian ini media yang digunakan yaitu media Nutrient Agar (NA)

dengan komposisi 5 gram peptone, 3 gram beef extract, 5 gram NaCl, 15 gram bacto

agar per liter (Mew, Borromeo, Hardy, 2001). Media Nutrient agar dibuat dengan

melarutkan bahan NA sebanyak 28 gram kedalam 1 liter aquadest. Setelah larut,

lalu dituang ke labu erlenmeyer, disumbat dengan kapas yang selanjutnya ditutup

dengan aluminium foil kemudian disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit

pada suhu 121°C. Setelah steril, media NA dituang ke dalam cawan petri (Astiani,

Afghani, & Savante, 2014).

Pada penelitian kali ini, akan dibuat media NA sebanyak 200 ml, sehingga

digunakan bahan NA sebanyak 5,6 gram (1 gram peptone, 0,6 gram beef extract,

1gram NaCl dan 3 gram bacto agar).

a. Kultur Pada Media Selektif Nutrient agar

Diambil satu ose bakteri Escherichia coli yang berasal dari biakan murni,

kemudian ditanamkan pada cawan petri yang berisi media pembenihan Nutrient

agar, lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 12-24 jam.

b. Identifikasi Bakteri Escherichia coli

- Pewarnaan Gram

Diambil 1 ose biakan yang tumbuh pada Nutrient agar miring diletakkan pada

object glass kemudiaan dilakukan fiksasi. Sediaan ditetesi larutan crystal

violet, didiamkan 1 menit, dibilas dengan air.Selanjutnya ditetesi dengan

40

larutan lugol, diamkan 1 menit. Setelah itu dibilas dengan alkohol 96% selama

5-10 detik sambil digoyang-goyangkan hingga tidak terdapat zat warna yang

mengalir diatas sediaan, lalu dibilas lagi dengan air. Kemudian ditetesi lagi

dengan larutan safranin sebagai warna pembanding, didiamkan selama 30

detik, dibilas dengan air, keringkan, lalu diamati dibawah mikroskop (Tim

Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, 2003).

4.8.7. Preparasi Bakteri

Bakteri diambil dari hasil peremajaan bakteri menggunakan jarum ose steril,

dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml aquadest steril. Kemudian

divortex agar suspensi bakteri Escherichia coli homogen. Untuk melihat kekeruhan

bakteri dapat dibandingkan dengan standart McFarland. McFarland adalah

penyetaraan konsentrasi mikroba dengan menggunakan larutan BaCl21% dan

H2SO4 1%. Standar kekeruhan McFarland dimaksudkan untuk menggantikan

perhitungan mikroba satuper satu secara visual mendekati konsentrasi sel dalam

suspensi dengan menggunakan skala mewakili konsentrasi tertentu dari CFU/ml

dan untuk memperkirakan kepadatan sel yang akandigunakan pada prosedur

pengujian antimikroba (Sutton, 2011). Apabila kekeruhan masih belum sama, dapat

ditambahkan aquadest steril atau bakteri Escherichia coli lagi, hingga didapatkan

kekeruhan yang sama. Dari kekeruhan yang sama dengan standar McFarland

tersebut, maka didapatkan suspensi bakteri dengantingkat kekeruhan 108 CFU/ml

(colony forming unit/mililiter) dan sesuai dengan standart McFarland. Kemudian

disiapkan 2 tabung kosong masing-masing di isi 9 ml aquadest steril (tabung 2 dan

tabung 3). Selanjutnya, di pipet 1 ml pada tabung 1 dan di masukkan pada tabung

2 kemudian di vortex hingga homogen. Hasil dari tabung 2 tersebut didapatkan

tingkat kekeruhan bakteri 107 CFU/ml. Kemudian dari tabung 2 di pipet 1 ml dan

di masukkan dalam tabung 3 lalu di vortex hingga homogen. Hasil dari tabung 3

didapatkan tingkat kekeruhan bakteri 106 CFU/ml.

41

Tabel 4.1. Standar Kekeruhan McFarland (Sutton, 2011)

Skala McFarland CFU (x108 ml) 1% BaCl2/ 1% H2SO4(ml)

0.5

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

<300

300

600

900

1200

1500

1800

2100

2400

2700

3000

0.05/9,95

0,1/9,9

0,2/9,8

0,3/9,7

0,4/9,6

0,5/9,5

0,6/9,4

0,7/9,3

0,8/9,2

0,9/9,1

1,0/9,0

Kemudian diambil dengan cotton bud steril yang telah ditiriskan terlebih dahulu

pada dinding tabung, kemudian ditanam pada media agar dengan metode streak

plate (metode cawan gores) dengan cara digoresan secara kontinyu sampai setengah

permukaan agar, membentuk garis horizontal disatu cawan petri. Kemudian putar

cawan 180° dan lanjutkan goresan sampai habis. Dilanjutkan goresan dari arah yang

berlawanan dengan cara yang sama, dan diakhiri dengan memutar cotton bud pada

tepi cawan membentuk arah 180°. Goresan yang bersinambung bertujuan untuk

peremajaan ke cawan atau medium baru. Setelah itu, media dibiarkan selama 15

menit agar bakteri dapat berdifusi ke media.

4.8.8. Pengujian Difusi Cakram

Proses pengujian antibakteri untuk metode difusi cakram antara lain sebagai

berikut:

1) Disiapkan eppendorf yang telah berisi larutan uji dengan konsentrasi 10 mg/ml,

20 mg/ml dan 40 mg/ml.

2) Disiapkan disk cakram dengan diameter 5 mm sebanyak 3 buah. Totolkan

sebanyak 10 µL untuk setiap larutan uji 10%, 15%, dan 20%. Keringkan dalam

oven dengan suhu 37°C selama 20 menit. Ulangi proses tersebut hingga larutan

42

yang ditotolkan dalam disk sebanyak 50 µL. Konsentrasi pada disk untuk larutan

uji 10% yaitu 5 mg/disk, pada konsentrasi 15% yaitu 7,5 mg/disk, dan pada

konsentrasi 20% yaitu 10 mg/disk. Untuk sterilisasi disk dilakukan dengan

pemancaran sinar UV selama 1 jam.

3) Disiapkan suspensi bakteri Escherichia coli dengan tingkat kekeruhan 107

CFU/ml, yang telah dibandingkan dengan standar McFarland. Bakteri yang telah

dipreparasi diambil dengan cara mencelupkan cotton swab steril satu kali, lalu

diletakkan pada tepi tabung reaksi, kemudian cotton swab steril tersebut diputar

agar bakteri yang akan dioleskan tidak terlalu banyak. Setelah itu inokulum

diratakan ke seluruh permukaan media sebanyak 3x dengan memutar cawan

dengan sudut 60º untuk setiap pengolesan. Lalu oleskan cotton swab steril ke

sekeliling pinggiran permukaan agar. Biarkan inokulum mengering selama

beberapa menit pada suhu ruang dengan cara tertutup (WHO, 2009).

4) Media Nutrient agar yang telah dioleskan bakteri Escherichia coli dibiarkan

dahulu 2 menit agar mengering. Kontrol uji dan kontrol positif kloramfenikol 30

µg yang telah siap kemudian diletakkan pada media pembenihan dengan jarak

tiap cakram 3 cm dan dari tepi lempeng sebesar 2 cm. Disk kertas saring ditekan

lembut dengan menggunakan pinset pada permukaan lempengan sehingga

terdapat kontak yang baik antara disk lempengan agar. Jarak diatur sedemikian

rupa sehingga satu disk dengan disk lainnya berjauhan.

5) Kemudian letakkan disk cakram untuk kontrol negatif (Aquades + DMSO 1%)

diatas permukaan agar. Kontrol negatif dibuat dengan mencampurkan DMSO

1% sebanyak 100 µL dengan aquadest steril sebanyak 900 µL.

6) Selanjutnya semua media Nutrient agar yang telah diberikan disk larutan uji,

kontrol positif, dan kontrol negatif diinkubasi 24 jam dengan suhu 37°C.

7) Pengujian senyawa antibakteri dilakukan dengan pengamatan setiap 24 jam

dengan melihat adanya zona (area) jernih disekitar disk cakram. Zona (area)

hambatan yang terbentuk diukur dengan penggaris dalamsatuan millimeter (mm)

dan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.

43

4.9. Bagan Alur Penelitian

a) Proses Pembuatan Fraksi Etanol Daging Buah Limonia acidissima L.

Gambar 4.2. Bagan Alur Pembuatan Fraksi Etanol Daging Buah Limonia

acidissima L.

Dimaserasi kembali dengan etanol sejumlah 6500 ml

(1:5) di rendam selama 24 jam. Tampung dan saring

filtrat.

Ditimbang serbuk daging buah Limonia acidissima L. sebanyak 1300 gram

yang telah difraksinasi terlebih dahulu dengan pelarut n-heksan dan etil asetat

kemudian dilanjutkan dengan pelarut etanol dengan menggunakan metode

maserasi (perendaman) selama 24 jam.

Residu serbuk daging buah ditambahkan dengan 13000 ml

(Perbandingan 1:10) etanol direndam selama 24 jam dan disaring dengan

corong buchner dan tampung filtratnya.

Residu 1

Residu 2

Dimaserasi kembali dengan etanol sebanyak 6500 ml

dengan perbandingan 1:5 direndam selama 24 jam. Saring

dan tampung filtratnya.

Gabungan filtrat

Pekatkan seluruh filtrat dengan rotary evaporator

vacuum sampai diperoleh larutan ekstrak kental dan

dikeringkan di oven pada suhu 40°C Fraksi etanol

Proses maserasi ini dilakukan dengan metode yang sama

secara berulang sampai pada filtrat tidak lagi

menunjukkan adanya komponen yang tertarik dengan

pelarut etanol, ditandai dengan tidak ada noda yang

terbentuk pada plat KLT.

Residu 3

44

b) Proses Pengujian Antibakteri dengan Metode Difusi Cakram

Gambar 4.3. Prosedur Pengujian Antibakteri dengan Metode Difusi Cakram

4.10. Analisis Data

Analisis data dilakukan secara deskriptif dengan melakukan pengamatan

terhadap pengukuran diameter zona hambat dari daerah berwana bening dari

masing-masing komponen senyawa yang telah dipisahkan dari daging buah

Limonia acidissima L. dengan fraksi etanol.

1 2 3 KN

KP

2 cm

3 cm Sampel uji,

kontrol positif,

dan kontrol negatif

diteteskan pada

disk cakram

dengan diameter

6 mm yang telah

ditanam pada

media NA dengan

jarak tiap cakram

3 cm dan 2 cm

dari tepi cakram.

(Kurniawan,

2015).

Permukaan Nutrient agar yang telah diolesi bakteri

Eschericia coli

Diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam

Diukur zona hambat

Analisis data

10% 15 % 20% 0,1 ml DMSO 1%

+ aquadest 1 ml

Kloramfenikol 30 µg/disk

Replikasi sebanyak 3x untuk tiap-tiap ekstrak yang

di uji