bab iv metodologi penelitian 4.1 rancangan penelitianeprints.umm.ac.id/41787/5/bab iv.pdfpenelitian...
TRANSCRIPT
25
BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental untuk mengetahui
konsentrasi penambahan ekstrak etanol Bunga Marigold (Tagetes erecta L.)
terhadap uji antioksidan pada sediaan krim. Adapun tahapan yang dilakukan pada
penelitian ini sebagai berikut:
Gambar 4. 1 Desain Penelitian Optimasi Formulasi sediaan krim mengandung
ekstrak etanol bunga Marigold (Tagetes erecta) dengan basis
vanishing cream.
Analisis Data
Uji
Viskositas
Uji Tipe
Emulsi
Uji pH Uji Daya
Sebar
Uji
Organoleptis
Uji pemisahan
fase (freeze thaw)
Evaluasi Sediaan
Formulasi sediaan krim ekstrak etanol bunga marigold dengan
basis vanishing cream
Formula 1
Ekstrak Etanol Bunga
Marigold 0,5%
Formula 2
Ekstrak Etanol
Bunga Marigold 1%
Formula 3
Ekstrak Etanol
Bunga Marigold 2%
Uji DPPH
26
4.2. Variabel Penelitian
4.2.1. Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak etanol
bunga Marigold (Tagetes erecta) dalam persen yang ditambahkan pada formula
krim.
4.2.2. Variabel Tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah hasil uji organoleptis, uji
viskositas, penentuan tipe emulsi, uji daya sebar, uji pH, dan uji DPPH krim yang
mengandung Eksrak Etanol Bunga Marigold.
4.3. Tempat dan Waktu Penelitian
4.3.1 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Teknologi Sediaan Farmasi dan
Laboratorium Kimia Terpadu Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan
Universitas Muhammadiyah Malang.
4.3.2 Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni 2018 sampai dengan bulan
September 2018.
4.4. Alat dan Bahan Penelitian
4.4.1. Alat Penelitian
Alat yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari beaker gelas, spatula,
sudip, penangas air, mortir dan stamper, cawan penguap, pipet tetes, wadah krim,
spektrofotometer uv-vis, timbangan analitik , alat uji daya sebar, alat uji daya, dan
Viskosimeter.
4.4.2. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak etanol bunga
marigold, aquadest dan bahan dasar krim dengan derajat farmasetis meliputi Setil
Alkohol, Asam stearat, Trietanolamin, Gliserin, Propilen glikol, Natrium
Metabisulfit, BHT, Metilparaben, Propilparaben, Aquadest, Methanol pro
Analisis, DPPH.
27
4.5. Metode Kerja
4.5.1 Pembuatan Ekstrak Etanol Bunga Marigold
Bunga Marigold kering di blender untuk meningkatkan luas permukaan
dari simplisia. Setelah itu dimasukkan satu bagian simplisia kering kedalam
maserator lalu ditambahkan 10 bagian pelarut etanol 90%. Selanjutnya direndam
selama 6 jam pertama sambil sekali-sekali diaduk, kemudian didiamkan selama
18 jam. Lalu dipisahkan maserat dengan cara filtrasi. Proses penyarian diulangi
sebanyak tiga kali dengan jenis dan jumLah pelarut yang sama. Setelah itu semua
maserat dikumpulkan kemuadian diuapkan dengan rotavapor hingga diperoleh
ekstrak kental (Farmakope Herbal Indonesia Edisi I, 2008).
4.5.2 Prosedur Pembuatan Krim
Tabel IV. 1 Formula Krim Ekstrak Etanol Bunga Marigold
No. Bahan Kegunaan Jumlah (%)
F1 F2 F3
1. Ekstrak Etanol
Bunga Marigold Bahan aktif 0,5% 1% 2%
2. Setil Alkohol Stiffening agent 2% 2% 2%
3. Paraffin Cair Basis 7% 7% 7%
4. Asam Stearat Emulsifying agent 3% 3% 3%
5. Trietanolamin Emulsifying agent 1% 1% 1%
6. Gliserin Humektan 5% 5% 5%
7. Propilen glikol Humektan 3% 3% 3%
8. Metil Paraben Pengawet 0,1% 0,1% 0,1%
9. Propil Paraben Pengawet 0,1% 0,1% 0,1%
10. BHT Antioksidan 0,1% 0,1% 0,1%
11. Natrium
Metabisulfit Antioksidan 0,1% 0,1% 0,1%
12. Aquadest Ad 200g Ad 100% Ad 100% Ad 100%
Disiapkan alat dan bahan-bahan yang akan digunakan terlebih dahulu, di
timbang masing-masing bahan yang dibutuhkan pada setiap formula, Krim dibuat
dengan mencampurkan Asam Stearat, Setil Alkohol, Paraffin cair, Propil
paraben, BHT yang kemudian dipanaskan di atas waterbath hingga suhu 70-750C
(fase minyak). Trietanolamin, Gliserin, Propilen glikol, Natrium Metabisulfit, dan
28
aquadest dipanaskan di atas waterbath pada suhu 70-750C (fase air). Siapkan
mortir panas. Setelah itu masukkan fase minyak ke dalam mortir panas. Masukkan
fase air ke dalam fase minyak di mortir panas sedikit demi sedikit sambil
dilakukan pengadukan yang konstan sampai homogen dan terakhir dimasukkan
ekstrak etanol bunga marigold aduk sampai homogen. Pada masing-masing
formula tersebut dibedakan konsentrasi ekstrak etanol bunga marigold sebesar
0,5% (FI), 1% (FII) dan 2% (FIII).
Gambar 4. 2 Skema Cara Pembuatan
Disiapkan Alat dan Bahan
Ditimbang masing-masing bahan yang dibutuhkan pada setiap formula
Asam Stearat, Setil Alkohol,
Paraffin liquidum, BHT, Propil
paraben dipanaskan di atas
waterbath hingga suhu70-750C
(fase minyak)
Trietanolamin, Metil paraben,
Gliserin, Natrium Metabisulfit dan
aquadest dipanaskan di atas
waterbath pada suhu 70-750C (fase
air)
Disiapkan mortir panas
Dimasukkan fase air ke dalam fase minyak di mortir panas sambil dilakukan
pengadukan yang konstan sampai homogen
Setelah terbentuk emulsi tambahkan ekstrak etanol bunga marigold, aduk ad
homogen
Masukkan wadah dan lakukan uji evaluasi
29
4.6 Prosedur Evaluasi Karakteristik Fisik dan Kimia
Evaluasi yang dilakukan untuk menguji karakteristik fisik dan kimia pada
sediaan krim.
4.6.1 Uji Organoleptik
Pemeriksaan terhadap warna, bau dan konsistensi krim. Ini dilakukan
untuk mengetahui krim yang dibuat sesuai dengan warna dan bau ekstrak sediaan
krim yang dikehendaki.
4.6.2 Uji Viskositas
Viskositas krim ditentukan dengan Viskosimeter Brookfield dengan
mencacat hubungan antara beban dan rpm (Sinko, 2011). Sebanyak 50g krim
diletakkan di gelas beker ditempatkan rotor ditengah-tengah gelas beker.
Kemudian alat dihidupkan dan jarum viskositas secara otomatis akan bergerak ke
kanan, kemudian setelah konstan dicatat (dilakukan replikasi tiga kali) (Aghel et
al, 2007).
4.6.3 Penentuan tipe emulsi
Dilakukan dengan metode pewarnaan menggunakan metilena biru dan
sudan merah. Pewarnaan dilakukan dengan cara sediaan krim yang akan diuji
diletakkan diatas gelas arloji, kemudian ditambahkan metilena biru, kemudian
diaduk hingga homogen. Jika setelah diaduk warna sediaan menjadi berwarna biru
yang merata maka sediaan tersebut merupakan krim tipe M/A. (dilakukan
replikasi tiga kali).
4.6.4 Uji Daya Sebar
Penentuan daya sebar dilakukan dengan alat sepasang lempeng kaca
dengan tebal masing- masing 3mm. Metode penentuan daya sebar dengan cara
menimbang krim sebanyak 0,5 gram, diletakkan diatas lempeng kaca yang bagian
bawahnya ditempeli kertas milimeter dengan diameter 20cm. selanjutnya sediaan
ditutup dengan kaca, bagian atas penutup diberi beban mulai dari terkecil sampai
dengan beban terbesar (1g, 2g, 3g, 4g, 5g, dan seterusnya) dengan diameter
konstan. Setelah itu amati penyebaran krim dan ukur diameternya (replikasi tiga
kali) (Shoviyana dan Zulkarnain, 2013).
4.6.5 Uji pH
Pengukuran dilakukan dengan alat pH meter Basic 20+. Elektroda dicuci
dengan aquadest dan dikeringkan dengan tisu, dilakukan kalibrasi dengan larutan
buffer standar pH 7,0, kemudian elektroda dicuci dan dikeringkan kembali.
30
Ditimbang sebanyak 5 gram sediaan krim, kemudian diencerkan dengan aquadest
bebas CO2 sampai 50 mL. selanjutnya dilakukan pengukuran pH sediaan dengan
cara yang sama seperti saat melakukan kalibrasi (dilakukan replikasi 3 kali)
(Aswal et al, 2013).
4.6.6 Uji Stabilitas Krim Antioksidan
Freeze Thaw
Sediaan krim antioksidan ekstrak etanol bunga marigold ditimbang
sebanayk 5 g dari masing-masing formula, setelah itu sediaan tersebut
dimasukkan kedalam vial diletakkan pada kulkas pada suhu 4°C selama 24 jam,
kemudian dipindahkan ke oven dengan suhu 40°C ± 2°C perlakuan yang sama
dilakukn sebanyak 6 kali kemudian diamati mengenai organoleptis dan pH
sediaan krim ekstrak etanol bunga marigold (Silalahi,2015).
4.7 Uji Antioksidan
4.7.1 Uji Antioksidan Ekstrak Etanol Bunga Marigold
4.7.1.1 Pembuatan Larutan DPPH 200 ppm
Ditimbang sebanyak 10 mg DPPH, BM (394,32 g/mol). Dilarutkan dengan
methanol P.A ad 50,0 mL, kemudian ditempatkan pada botol gelap. Cara
pembuatan larutan DPPH 200 ppm dapat dilihat pada gambar skema alir dibawah
ini.
Gambar 4. 3 Skema Cara Pembuatan Larutan DPPH 200 ppm
4.7.1.2 Pembuatan Larutan Blanko
Dipipet 2 mL larutan DPPH 200 ppm, dimasukkan kedalam labu ukur 10,0
mL, ditambahkan methanol ad 10,0 mL. kemudian dikocok ad homogen. Cara
pembuatan larutan blanko dapat dilihat pada gambar skema alir dibawah ini
Timbang DPPH 10 mg + 50,0 mL methanol
p.a
Larutkan ad homogen
Botol gelap
31
Gambar 4. 4 Skema Cara Pembuatan Larutan Blanko
4.7.1.3 Pembuatan Larutan Uji
1. Pembuatan Baku Induk (BI)
Dibuat larutan baku induk dengan konsentrasi 100 ppm dengan cara
ditimbang ekstrak etanol bunga marigold sebanyak 10 mg dan dilarutkan dalam
methanol 100,0 mL pada labu ukur, kocok ad homogen.
2. Pembuatan Baku Kerja
Pembuatan larutan baku kerja dilakukan sebagai berikut:
BK 1 : 0,5 mL BI + 2,0 mL DPPH ad 10,0 mL methanol P.A (5 ppm)
BK 2 : 1,0 mL BI + 2,0 mL DPPH ad 10,0 mL methanol P.A (10 ppm)
BK 3 : 2,0 mL BI + 2,0 mL DPPH ad 10,0 mL methanol P.A (20 ppm)
BK 4 : 4,0 mL BI + 2 mL DPPH ad 10,0 mL methanol P.A (40 ppm)
BK 5 : 8,0 mL BI + 2 mL DPPH ad 10,0 mL methanol P.A (80 ppm)
2,0 mL larutan DPPH (200 ppm) + methanol p.a ad 10,0 mL
Masukkan dalam labu ukur 10,0 mL
Kocok ad homogen
32
Gambar 4. 5 Skema Cara Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Etanol Bunga
Marigold
4.7.1.4 Pembuatan Larutan Kontrol Positif (Vitamin C)
1. Pembuatan Baku Induk (BI) Kontrol Positif
BI 1: Timbang vitamin C 5mg+ methanol p.a ad 10,0 mL (500ppm)
BI 2: pipet BI 0,5 mL + methanol p.a ad 25,0 mL (10 ppm)
2. Pembuatan Larutan Baku Kerja Kontrol Positif
Pembuatan larutan baku kerja dilakukan sebagai berikut:
BK 1: pipet 1,0mL BI 2+2,0mL DPPH+methanol P.A ad 10,0 mL (1ppm)
BK 2: pipet 2,0mL BI 2+2,0mL DPPH+ methanol P.A ad 10,0 mL (2ppm)
BK 3: pipet 3,0mL BI 2+ 2,0mL DPPH+ methanol P.A ad 10,0mL (3ppm)
BK 4: pipet 4,0mL BI 2+ 2,0mL DPPH+ methanol P.A ad 10,0mL (4ppm)
BK 5: pipet 5,0 ml BI + 2,0mL DPPH+ methanol P.A ad 10,0mL(5ppm)
10 mg ekstrak etanol bunga marigold + methanol p.a ad 100,0 mL
Labu ukur 100,0 mL → kocok ad homogen
Larutan baku induk 100 ppm
(LBI)
LBI 0,5
mL + 2,0
mL DPPH
+
methanol
p.a ad
10,0 mL
LBI 1,0
mL + 2,0
mL DPPH
+
methanol
p.a ad
10,0 mL
LBI 2,0
mL + 2,0
mL DPPH
+
methanol
p.a ad
10,0 mL
LBI 4,0
mL + 2,0
mL DPPH
+
methanol
p.a ad
10,0 mL
LBI 8,0
mL + 2,0
mL DPPH
+
methanol
p.a ad
10,0 mL
BK 1
(5 ppm)
BK 2
(10 ppm)
BK 3
(20 ppm)
BK 4
(40 ppm)
BK 5
(80 ppm)
33
3. Skema Pembuatan Larutan Kontrol Positif
Gambar 4. 6 Skema Cara Pembuatan Larutan Uji Kontrol positif (Vitamin C)
4.7.1.5 Proses Inkubasi
Setelah selesai pembuatan larutan blanko, lakutan uji, larutan baku kerja,
dan larutan kontrol positif, maka semua larutan tersebut di inkubasi pada suhu
ruang selama 30 menit (Chivde et al., 2011).
4.7.1.6 Proses Pengukuran Absorbansi
Larutan di ukur serapannya menggunakan spektrofotometer Uv- Vis
dengan panjang gelombang 515- 520nm atau sesuai dengan panajang gelombang
yang didapatkan. Lalu aktivitas penangkal radikal bebas dihitung sebagai
presentase berkurangnya DPPH dengan menggunakan rumus: IC50
% Inhibisi
Dari harga persen penangkal radikal bebas yang diperoleh, dibuat kurva
antara persen penangkal radikal bebas terhadap konsentrasi larutan uji. Dari
persamaan regresi linier tersebut dapat ditentukan nilai IC50 yaitu konsentrasi
inhibisi larutan uji yang mampu menangkal 50% radikal bebas, dalam penelitian
ini dilakukan uji analisa menggunakan probit log (Anugrawati, 2016).
Larutan BI 1: 5 mg Vit. C+ methanol p.a ad 10,0 mL (500ppm)
Larutan B1 2: pipet 0,5 mL (BI 1) + methanol p.a 25,0 mL (10ppm)
1,0 mL (BI
2)+ 2 mL
DPPH+
methanol
p.a ad 10,0
mL
2,0 mL (BI
2)+ 2 mL
DPPH+
methanol p.a
ad 10,0 mL
3,0 mL (BI
2)+ 2 mL
DPPH+
methanol p.a
ad 10,0 mL
4,0 mL (BI
2) + 2 mL
DPPH+
methanol p.a
ad 10,0 mL
5,0 mL (BI
2) + 2 mL
DPPH+
methanol
p.a ad 10,0
mL
34
4.7.2 Uji Antioksidan Krim Ekstrak Etanol Bunga Marigold
4.7.2.1 Pembuatan Larutan DPPH 200 ppm
Ditimbang sebanyak 20 mg DPPH, BM (394,32 g/mol). Dilarutkan dengan
methanol P.A ad 100,0 mL, kemudian ditempatkan pada botol gelap. Cara
pembuatan larutan DPPH 200 ppm dapat dilihat pada gambar skema alir dibawah
ini.
Gambar 4. 7 Skema Cara Pembuatan Larutan DPPH 200 ppm
4.7.2.2 Pembuatan Larutan Blanko
Dipipet 2 mL larutan DPPH 200 ppm, dimasukkan kedalam labu ukur 10,0
mL, ditambahkan methanol ad 10,0 mL. kemudian dikocok ad homogen. Cara
pembuatan larutan blanko dapat dilihat pada gambar skema alir dibawah ini
Gambar 4. 8 Skema Cara Pembuatan Larutan Blanko
Timbang DPPH 20 mg + methanol p.a 100,0 mL
Larutkan ad homogen
Botol gelap
2,0 mL larutan DPPH (200 ppm) + methanol p.a ad 10mL
Masukkan dalam labu ukur 10,0mL
Kocok ad homogen
35
2 gram (F1), 1 gram (F2), 0,5 gram (F3) krim etanol ekstrak bunga marigold +
methanol p.a ad 100,0 ml
Dihomogenkan dengan ultrasonik selama 30 menit
BI2 1,0 ml
+ 2,0 ml
DPPH +
methanol
p.a ad 10,0
ml
BI2 2,0 ml
+ 2,0 ml
DPPH +
methanol
p.a ad
10,0 ml
BI2 4,0 ml
+ 2,0 ml
DPPH +
methanol
p.a ad
10,0 ml
BI2 8,0 ml
+ 2,0 ml
DPPH
4.7.2.3 Pembuatan Larutan Uji Krim Ekstrak Etanol Bunga Marigold
Sampel sediaan krim ditimbang sebanyak 2 gram untuk formula 1, 1 gram
untuk formula 2, 0,5 gram untuk formula 3 dimasukkan ke dalam masing-masing
lab ukur 100,0 mL, kemudian ditabahkan methanol p.a ad 100,0 mL. Setelah itu
dihomogenkan dengan ultrasonik selama 30 menit. Kemudian hasil dari ultrasonik
disaring dengan kertas saring dan ditampung filtratnya. Selanjutnya disiapkan 5
buah labu ukur 10,0 mL, Larutan Baku Induk dipipet sejumlah volume tertentu
yaitu 0,5 mL, 1,0 mL, 2,0 mL, 4,0 mL, dan 8,0 mL lalu ditambahkan dpph (200
ppm) sebanyak 2,0 mL, selanjutnya ditambahkan methanol p.a sampai dengan
tanda.
Gambar 4. 9 Skema Cara Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Etanol Bunga
Marigold
4.7.2.5 Proses Inkubasi
Setelah selesai pembuatan larutan blanko, lakutan uji, larutan baku kerja,
dan larutan kontrol positif, maka semua larutan tersebut di inkubasi pada suhu
ruang selama 30 menit (Chivde et al., 2011).
4.7.2.6 Proses Pengukuran Absorbansi
Larutan di ukur serapannya menggunakan spektrofotometer Uv- Vis
dengan panjang gelombang 515- 520nm atau sesuai dengan panajang gelombang
BI2 1,0 ml
+ 2,0 ml
DPPH +
methanol
p.a ad 10,0
ml
36
yang didapatkan. Lalu aktivitas penangkal radikal bebas dihitung sebagai
presentase berkurangnya DPPH dengan menggunakan rumus: IC50
% Inhibisi
Dari harga persen penangkal radikal bebas yang diperoleh, dibuat kurva
antara persen penangkal radikal bebas terhadap konsentrasi larutan uji. Dari
persamaan regresi linier tersebut dapat ditentukan nilai IC50 yaitu konsentrasi
inhibisi larutan uji yang mampu menangkal 50% radikal bebas, dalam penelitian
ini dilakukan uji analisa menggunakan probit log (Anugrawati, 2016).
4.8 Analisis Data
Analisis Data sediaan krim eksrak etanol bunga Marigold dilakukan dengan
program SPSS menggunakan One-way Anova. Dari data yang didapatkan
dilakukan analisa statistika dengan derajat kepercayaan α = 0,05. Untuk
mengatahui formula mana yang menunjukkan perbedaan bermakna.