bactérias fermentadoras e não fermentadoras dr. carlos emílio levy
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Bactérias Fermentadoras e não Fermentadoras
Dr. Carlos Emílio Levy
índice
NF Provas básicas Fermentadores x não fermentadoresFermentadores x Não fermentadores no meio OFglicose Bactéria fermentadoraBactérias Não fermentadoras Provas para identificação de bactérias não fermentadoras OF glicose P. aeruginosa Gelatina Hidrólise da uréia de Christensen Agar citrato Hidrólise da esculina Crescimento em caldo NaCl 6,5% Prova do indol por extração PYR (pyrrolidonyl arylamidase) Discos de PMX e IPM
NF frequentemente isolados e de importância clínica
P. aeruginosa
Acinetobacter spp
Burkholderia cepacia - complexo B. cepacia e B. pseudomallei
Stenotrophomonas maltophilia
Chryseobacterium meningosepticum e C. indologenes
Moraxella spp e Oligella spp
Achromobacter spp e Alcaligenes spp
Pseudomonas putida, P. fluorescens, P. stutzeri
P. oryzihabitans e P. luteola
NF pouco isolados
NF raramente isolados e importância clínica duvidosa
• Acidovorax spp• Brevundimonas spp• Comamonas spp• Delftia spp• Methylobacterium spp• Ralstonia picketii• Roseomonas spp• Sphingomonas spp• Sphingobacterium spp• Shewanella spp
Fontes hospitalares de NF
• P. aeruginosa - agua de torneira, superfícies, medicamentos, alimentos, equipamentos
• S. maltophilia - equipamentos, pias, superfícies germicidas
• Acinetobacter spp - pia, agua, equipamentos, medicamentos, sabões, superfícies
• Burkholderia cepacia - água, soro, sabonetes, germicidas, equipamentos e medicamentos.
Não fermentadores
• Utilizam os carbohidratos como fonte de energia por via oxidativa
• diferem das enterobactérias que utilizam os carbohidratos por via fermentativa
• são todos gram negativos, aeróbios estritos, não esporulados
Tríplice açúcar ferro (TSI)
Não Fermentador Fermentador
Esquema simplificado para caracterização dos principais gêneros e espécies de bactérias não Fermentadoras de importância clínica e em Infecção Hospitalar
Provas básicas
• tubo de OFGlicose(com vaselina)
• tubo de OFGlicose(sem vaselina)
• disco de oxidase
• caldo TSB para motilidade
• tubo com lisina
• tubo com arginina
• tubo controle de aminoácidos
• tubo com gelatina
• placa de DNAse
Fermentadores x não fermentadores
Fermentadores (enterobactérias p. ex.) utilizam a glicose por via aeróbia e anaeróbia, por isso a base do TSI é sempre amarela ou ácida
Os NF crescem e usam a glicose apenas na parte aerada do tubo, que permanece sempre vermelha ou alcalina
Fermentadores x Não fermentadores no meio OFglicose
Nos tubos de OF glicose de Leifson os fermentadores utilizam a glicose tanto no tubo aberto como no fechado com óleo, ficando os dois tubos de cor amarela
Os NF pouco ou não crescem no tubo com óleo e acidificam (amarelo) a parte superior do tubo aberto, enquanto que outros o tornam alcalino (azul)
Bactéria fermentadora:
ácidoácido
ácidoácido
óleoóleo
ácidoácido
OF glicose fermentativo TSI
Bactérias Não fermentadoras
TSI
alcalino
inerte alcalino
Provas para identificação de bactérias não fermentadoras
• Trabalhar com culturas jovens (24h)
• sempre a partir de culturas puras
• a partir de meios ricos (sangue ou chocolate) ou seletivos (Mc Conkey, CLED) ou Muller Hinton
OF glicose
Semeadura
• OFGlicose (com vaselina): retirar 1-2 colônias e picar com agulha até o fundo do tubo
• OFGlicose (sem vaselina): retirar 1-2 colônias e picar com agulha até o fundo do tubo
Incubação
• a 37oC -1a. Leitura com 24h,
• se inerte, incubar até 72h
Leitura e interpretação
• OFGlicose Fermentador: dois tubos ficam amarelos (ácido)
• OFGlicose Oxidativo: tubo sem vaselina a parte superior do agar fica amarelo, tubo com vaselina permanece verde
• OFGlicose inerte ou alcalino: dois tubos não mudam de cor (inerte) ou o tubo sem vaselina fica azulado (alcalino).
• Aguardar no mínimo 72 h para definir como inerte pois pode ocorrer a oxidação tardia ou lenta.
Meio OF glicose de Leifson
alcalino fermentativo oxidativo
azul
CQ do OFglicose
• Repetir procedimento com cepa E. coli ATCC e P. aeruginosa ATCC
• E. coli após 24h de incubação deverá apresentar os dois tubos aberto e fechado(cm óleo) de cor amarela
• P. aeruginosa após 24h de incubação deverá apresentar o tubo fechado de cor verde com crescimento na linha de picada e amarelo na parte superior do tubo aberto
• Reagente: disco de oxidase, papel impregnado ou reativo na forma líquida a ser pingado em papel de filtro
• Técnica: com alça retirar 2-3 colônias semelhantes e esfregar sobre o disco ou tira de papel (pode-se umedecer o papel com 1 gota de salina estéril)
Prova da oxidase
Leitura, interpretação e CQ
• Leitura: é feita em 15 a 20 segundos. A cor violeta forte aparece rapidamente.
• Cor violeta = oxidase positivo
• Após este intervalo, cores violeta pálido são falso positivos.
• Cor branco-acinzentado = oxidase negativo
Obs: A B. cepacia pode dar reação fraca.
• Controle:
• P.aeruginosa ATCC 27853 = positivo
• A. baumannii ATCC = negativo
Prova da oxidase
Pigmento
• Amarelo : P. oryzihabitans, P. luteola Chryseobacterium spp
• verde: P. aeruginosa (no M. Hinton)• metálico: P.aeruginosa (em ágar sangue)• marron: P. aeruginosa (M. Hinton)• roseo: Roseomonas spp e Methylobacterium spp
P. aeruginosa
Prova da motilidade
• Material: caldo TSB ou BHI para motilidade
• Semeadura: inocular 2 a 3 colônias no caldo
• Incubação: 37oC durante 4 horas e repetir com 24h se negativo
• Teste: • agitar o tubo;• retirar uma gota do caldo com pipeta com
ponteira estéril ou alça bacteriológica estéril;• depositar sobre uma lâmina, cobrí-la com
lamínula; • levar ao microscópio.
Leitura, interpretação e CQ
• Observar com aumento de 400 vezes e condensador baixo.
• A presença de muitas ou poucas bactérias cruzando o campo é significativo de motilidade positiva.
• Movimentos vibratórios fracos = negativo.
• CQ: realizar o teste com cepas :
• P. aeruginosa ATCC 27853 =motilidade positiva
• Acinetobacter baumanni ATCC + motilidade negativa
Utilização de aminoácidosdescarboxilação de Moeller
São utilizados 3 tubos:• 1.-lisina• 2.-arginina:• 3.-controle de aminoácidos
Para cada tubo:• semear inóculo denso e volume pequeno de meio (1-2mL)• adicionar 2 mL de vaselina líquida
incubar a 37oC por 24h • se todos negativos, incubar pelo menos mais 24 h
Leitura e interpretação
leitura: comparar os tubos testes dos aminoácidos com o controle negativo.
• tubo controle negativo: azul-esverdeado; • provas negativas: azul esverdeado pálido;• provas positivas: cor púrpura.
Se negativo aguardar entre 48-72 h.
Resultados esperados:• ambas provas negativas• ou apenas 1 prova pode ser positiva, pois nenhum
NF é arginina + e lisina +
CQ
Cepa P. aeruginosa ATCC27853 - lisina negativa e arginina positiva
A maioria das cepas de B. cepacia e S. maltophilia são lisina positivas e todas são arginina negativas
lisina ornitina controle
+
negativo negativo
CQ
Gelatina
Reagentes: salina e uma tira de filme Raio-X revelado
• Semeadura: inocular 2-3 colônias na salina e deixar o fragmento imerso
• incubar 30oC, 24horas • leitura: se positivo ocorre precipitado cinza no
fundo do tubo e filme fica transparente.• se negativo aguardar no mínimo 72 h.
• CQ: cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 gelatina + e A. baumannii gelatina negativo.
Prova da utilização da gelatina
negativa++
DNAse
Semear 2 a 3 colônias em spot (círculo de 0,5 cm de diâmetro) deixando espaço entre os testes para avaliar a presença de halo;
Incubar 37oC por 24h• adicionar ácido clorídrico 1N e aguardar 5 minutos;• observar a presença de halo transparente em volta do
inóculo e o restante do meio fica leitoso; • QC: S. maltophilia = positivo e A baumannii negativo.
Prova da DNase
negativa positiva
Provas complementares
• agar uréia • caldo TSB para crescimento 42oC • ágar citrato• ágar esculina• caldo NaCl 6,5%• caldo indol• disco de PYR• disco de polimixina/imipenem
Hidrólise da uréia de Christensen
Material: Ágar inclinado com uréia
Semeadura: com alça, inóculo denso na superfície do meio
Leitura: a cor pink (rosa forte) aparece em parte do ápice ou em todo o meio após 24 a 72 h de incubação; ligeira mudança de cor rósea no ápice que não progride com maior incubação é considerado negativo. Bordetella bronchiseptica pode dar reação positiva em 4 h.
CQ: • S. maltophilia = uréia negativa • usar cepa de P. aeruginosa urease positiva
Prova da hidrólise da uréia
negativa positiva
Crescimento a 42oC ou 44oC
• Material: 2 tubos com caldo TSB ou BHI para avaliar crescimento 42/44oC • Semeadura: semear 2 colônias em cada tubo com caldo verificando
leve turbidez• incubar em estufa regulada ou em banho-maria• Leitura: ocorre acentuada turbidez no meio ou é nítido o aumento da
densidade bacteriana. • Comparar com controle mantido a temperatura ambiente.• Para espécies de Acinetobacter testa-se 44oC e para as demais
bactérias 42oC• CQ -
• A baumannii ATCC = crescimento 42 e 44oC positivo• A. lwoffii = crescimento 42 e 44oC negativo
Prova do crescimento a 42/44oC
+ negativo
Ágar citrato
• Material: tubo com agar citrato de Simmons
• Semear com agulha na superfície do meio
• Incubação: 37oC por 24 a 72h
• Leitura: a cor azul forte aparece inicialmente no bico e com maior incubação estende-se a todo o meio
• CQ:
• P. aeruginosa ATCC 27853 ou A baumannii= citrato positivo
• A lwoffii - citrato negativo
Utilização do citrato
positivonegativo
• Material: tubo com agar esculina inclinado
• semeadura: 2 a 3 colônias na superfície do meio
• incubação: 24h a 37oC
• Leitura e interpretação: ocorre precipitado negro intenso nas provas positivas a partir de 6 horas de incubação até 48 h. Cor castanho escuro é prova negativa
• Obs: não usar ágar bile-esculina
• CQ:
• P. aeruginosa ATCC 27853 = negativa
• P. luteola ou cepa de B. cepacia positiva
Hidrólise da esculina
Hidrólise da esculina
negativa positiva
Crescimento em caldo NaCl 6,5%
• Material: tubo contendo caldo NaCL 6,5% com indicador purpura de bromocresol (roxo)
• semear: 2 a 3 colônias no caldo NaCL 6,5%
• Incubar: 24h a 37oC
• Leitura: a presença de turbidez e mudança de cor de roxo para amarelo indicam crescimento.
• CQ:
• Alcaligenes faecalis = positivo
• cepa de S. maltophilia negativa
Crescimento em Na Cl 6,5%
negativo positivo
Prova do indol por extração
Material: caldo triptona, xilol e Kovaks ou EhrlichSemeadura: inocular 2 colônias no caldoIncubação: 24h, se negativo repetir com 48hTeste:
• colocar 5 gotas de xilol e agitar vigorosamente o tubo.
• Adicionar 5 gotas do reagente de Ehrlich ou Kovacs. • Observar a presença de anel púrpura pálido ou
intenso que revelam prova positiva.CQ:
• Chryseobacterium spp = positivo • Acinetobacter baumannii = negativo
Prova de indol por extração
+ neg
PYR (pyrrolidonyl arylamidase)
• Material: discos de PYR e reagente cinnamaldehyde
• Incubação: colocar um disco de PYR sobre crescimento bacteriano de cerca de 24h de incubação e deixar por 4 h
• retirar o disco da placa de cultura, colocar sobre uma lâmina e depositar uma gota do reagente que acompanha o teste.
• Leitura: cor alaranjada é prova positiva; cor amarela é prova negativa.
• CQ:• B. cepacia ou S. maltophilia = negativo
• Chryseobacterium spp e P. luteola = positivos
Prova do PYR
+negativo
Discos de PMX e IPM
• Material: discos de Imipenem e polimixina ou colistina
• Semeadura: ágar Mueller Hinton
• Técnica: colocar os discos de polimixina e/ou Imipenem usando a mesma técnica para fazer antibiograma
• Incubar: 35oC por 16-18h para P. aeruginosa e Acinetobacter spp e 20 a 24h para S. maltophilia e B.cepacia
• Interpretação: • disco de polimixina - qualquer halo em torno do disco
significa sensibilidade
• disco de imipenem - P. aeruginosa e Acinetobacter 16mm e B. cepacia 20mm
• CQ: P. aeruginosa ATCC 27.853
Tabelas de identificação das bactérias não fermentadoras
TABELA .1B - Prova opcional
Microrganismos Hemólise*A. baumannii neg
A. calcoaceticus neg
A. haemolyticus pos
A. lwoffii neg
*hemólise em agar sangue
Tabelas de identificação das bactérias não fermentadoras
TABELA .2 - Cocos Gram negativo, oxidase positivo, motilidade negativa, OF-Glicose Inerte
Microrganismos / Provas Urease Gelatina Dnase MacConkey
Moraxella(B). catarrhalis Neg Neg Pos Neg
Moraxella canis Neg Neg Pos Pos
M. fenilpiruvica/ureolytica Pos Neg Neg Pos
Moraxella lacunata Neg Pos Neg Neg
Moraxella spp* Neg Neg Neg Var
Moraxella spp: nonliquefaciens, lincolnii, osloensis, atlantae e Oligella urethralis
Tabelas de identificação das bactérias não fermentadoras
TABELA .3 A – Bacilos Gram negativo, oxidase negativa, motilidade positiva, OF-Glcose Oxidativo ou Inerte
Microrganismos / Provas Arginina Dnase Lisina Polimixina *
Pseudomonas luteola Pos Neg Neg S
Pseudomonas oryzihabitans Neg (14+) Neg Neg S
B. cepacia Neg Neg 80%+ R
S. maltophilia Neg Pos 93%+ S
* Fazer antibiograma com polimixina
Tabelas de identificação das bactérias não fermentadoras
TABELA 3 B - Provas opcionais
Microrganismos / Provas Esculina PYR Imipenem*
Pseudomonas luteola Pos Pos S
Pseudomonas oryzihabitans Neg Pos S
B. cepacia Var Neg Var
S. maltophilia Var neg R * Fazer antibiograma com imipenem
Tabelas de identificação das bactérias não fermentadoras
Tabela .4 - Oxidase positiva, Motilidade negativa e OFG Oxidativo, Bacilos c/ pigmento amarelo e Crescimento em MC variável
Microrganismos / Provas Indol Dnase Polimixina Uréia
Chryseobacterium meningosepticum Pos Pos R Neg
C. indologenes Pos Neg R Neg
Sphingomonas paucimobilis Neg Neg S Neg
Sphingobacterium spp* Neg Variável R Pos
*S. multivorum, S. spiritivorum
Tabelas de identificação das bactérias não fermentadoras
TABELA .5A - Bacilos Gram negativo, oxidase positiva, motilidade positiva, OF GLICOSE Oxidativo - vide fluxograma para facilitar interpretação
Microrganismos POL LIS ARG NaCl 6,5% GEL 42ºC Característica
A. xilosoxidans S Neg Neg Neg Neg Pos (86)
P. aeruginosa S Neg pos 82 Pos Pigmento
P. fluorescens S Neg pos Pos Neg
P. putida S Neg pos Neg Neg
P. stutzeri S Neg Neg Pos Neg v Seca
B. pseudomallei R Neg pos +79% pos
B. cepacia R 80%+ Neg 20%+ 83%+
S. paucimobilis* S Neg Neg Pos Neg Pigm.Amarelo
Shewanella spp S Neg Neg V V v
* Mot += Temperatura ambiente
Tabelas de identificação das bactérias não fermentadoras
TABELA 5B -Provas complementares 1, 2
Microrganismos Esculina* PYR*
A. x. xilosoxidans Neg Pos
P. aeruginosa neg V
P. fluorescens Neg V
P. putida Neg Neg
P. stutzeri neg Neg
B. pseudomallei V Neg
B. cepacia V Neg
Sphingomonas paucimobilis pos 25+
Shewanella spp neg Pos
Provas da esculina e PYR úteis apenas para diferenciar as bactérias lisina e arginina negativas
Tabelas de identificação das bactérias não fermentadoras
TABELA.5C - Bacilos Gram negativos não fermentadores oxidase positiva, motilidade positiva, com H2S no TSI, OF Glicose Variável, DNAse positivos
Bactéria/prova Cresc. 42oC Cresc NaCl 6,5%Shewanella putrefaciens Neg Neg
Shewanella alga Pos Pos
Tabelas de identificação das bactérias não fermentadoras
TABELA. 6 A - Bacilos oxidase (+), Motilidade (+) OFG Alcalino - incubar 72h.
Microrganismos Uréia NaCl 6,5% DNAseA x. denitrificans negativa 75% Neg neg
Alcaligenes faecalis Neg Pos Neg
B. bronchiseptica Pos++ Neg Neg
S. malthophilia * Neg 78%neg Pos
*raramente pode ser oxidase +
Tabelas de identificação das bactérias não fermentadoras
TABELA 6B - Prova complementar 2
Microrganismos PYRA. denitrificans positivo
Alcaligenes faecalis negativo
B. bronchiseptica negativo
S. malthophilia negativo
Tabelas de identificação das bactérias não fermentadoras
TABELA .7- Bacilos e coco-bacilos Gram negativos, Não fermentadores, oxidase positiva, OF glicose variável, com pigmento róseo(1)
Microrganismos Motil. Morfo- logia Urease Mc
Conkey 42oC Observação
Methylobacterium spp pos B Pos Neg neg colônia seca coral
Roseomonas spp Var CB Pos Pos pos colônias mucóidesrosadas
Tabelas de identificação das bactérias não fermentadoras
FLUXOGRAMA AUXILIAR PARA TABELA 5
Lisina positiva Burkholderia cepacia
Polimixina R
negativa
negativa Arginina positiva
polimixina polimixina
R S R S
B. cepacia esculina B. pseudomallei crescimento a 42oC
positivo negativo positivo negativo
S. paucimobilis NaCl 6,5% P. aeruginosa Gelatina
negativo positivo negativo positivo
DNAse P.stutzeri P. putida P. fluorescens
positivo negativo
S. putrefaciens Achr. xylosoxidans