BADANIA WŁAŚCIWOŚCI LIPOFILOWYCH ZWIĄZKÓW

PRZECIWUTLENIAJĄCYCH

Katedra Chemii Analitycznej, Wydział Chemiczny

Tomasz Chmiel, Agata Kot-Wasik, Jacek Namieśnik

Gdańsk 03.11.2017

Lipofilowość – definicja IUPAC*

LIPOFILOWOŚĆ – właściwość fizykochemiczna wyrażająca

powinowactwo cząsteczki lub ugrupowania chemicznego do

środowiska lipofilowego.

Jest to miara zdolności cząsteczek związku chemicznego do

rozpuszczania się w tłuszczach, olejach oraz rozpuszczalnikach

niepolarnych.

Powinowactwo – jest to tendencja cząsteczki do wiązania się z inną

Hydrofobowość – to asocjacja niepolarnych grup lub cząsteczek w

środowisku wodnym, która wynika z tendencji wody do wykluczania

cząsteczek niepolarnych. To miara zdolności cząsteczek

chemicznych do odpychania od siebie cząsteczek wody.

* Wermuth C.G. et al. Glossary of terms used in medicinal chemistry (IUPAC Recommendations 1998),

Pure & Appl. Chem. 70 (1998), 1129.

Jakie znaczenie ma lipofilowość i dlaczego

jej pomiar jest istotny?

Substancja czynna

(przeciwutleniacz, składnik

leku, witamina)

Bariera

krew-mózg

Sekrecja

przez nerki

Resorpcja

Wydzielanie

jelitowe

Wchłanianie

jelitowe

Wychwytywanie

przez wątrobę

Wydalanie z

wątroby

Wydzielanie

żółci

jedna z najważniejszych właściwości

fizykochemicznych związków biologicznie

czynnych wpływających na ich aktywność

biologiczną,

umożliwia przewidywanie profilu

wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu

i wydalania (tzw. profil ADME), czyli

zachowania się substancji w organizmie

człowieka po jej podaniu,

pozwala określić możliwości wiązania z

odpowiednim receptorem,

podział substancji między fazę wodą i

organiczną może stanowić model podziału

in vivo.

Lipofilowość – jak ilościowo jest wyrażana

Lipofilowość (zgodnie z definicją IUPAC) jest opisywana poprzez

zjawisko podziału miedzy dwie niemieszające się fazy, zarówno w

układzie ciecz-ciecz (np. octanol/woda) jak i ciało stałe/ciecz (metody

chromatograficzne).

Ilościowo lipofilowość jest wyrażana jako współczynnik podziału (P).

Współczynnik podziału – stosunek stężeń substancji w fazie

niepolarnej (organicznej) i polarnej (głównie wodnej) w stanie równowagi.

Wyrażany zazwyczaj w skali logarytmicznej (log P).

[Boct] – stężenie w fazie niepolarnej, np. 1-oktanol

[Bwater] – stężenie w fazie polarnej, np. bufor wodny

(TRIS-HCl; pH 7,4)

P – współczynnik podziału substancji występującej

wyłącznie w formie niezjonizowanej (obojętnej)

Lipofilowość – jak ilościowo jest wyrażana

Współczynnik dystrybucji (D) – stosunek sumy stężeń wszystkich

form danej substancji (zjonizowanych i niezjonizowanych) w każdej

z dwóch niemieszających się faz, niepolarnej (organicznej) i polarnej

(wodnej). Zależy od pH roztworu (głównie wodnego), a tym samym od

stałej dysocjacji substancji (pKa).

Dla substancji nieulegających jonizacji log D = log P

Wpływ lipofilowości na biodostępność

substancji

Ogólnym warunkiem dla optymalnego wchłanianie substancji z

przewodu pokarmowego na drodze dyfuzji pasywnej po doustnym

podaniu jest umiarkowana wartość log P (zakres 0 – 3).

Dobra równowaga między

przenikalnością i rozpuszczalnością

Bardziej niepolarna i słabiej

rozpuszczalna w wodzie

Bardziej polarna, słabsza przenikalność

przez dwuwarstwę lipidową

Kerns E.H. and Di L. Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods

from ADME to Toxicity Optimization

Lipofilowość – metody wyznaczania

Metody doświadczalne:

klasyczna metoda ekstrakcyjna w układzie oktanol-woda (tzw. metoda

shake-flask),

metoda elektrochemiczna,

metoda RP-TLC, tj. chromatografia cienkowarstwowa w odwróconym

układzie faz,

metoda RP-HPLC, czyli wysokosprawna chromatografia cieczowej w

odwróconym układzie faz. Badania tą metodą można prowadzić w układzie

HPLC z:

- elucją izokratyczną;

- elucją gradientową (zastosowanie odpowiednich substancji wzorcowych).

Metody teoretyczne (obliczeniowe):

programy komputerowe wykorzystujące algorytmy oparte na różnych

uwarunkowaniach (np. atomistycznych) struktury chemicznej związku (np.

ALOGPS, ChemOffice, Dragon, ChemAxon).

Pomiar lipofilowości metodą RP-HPLC

współczynnik retencji (k) substancji rozpuszczonej jest proporcjonalny do średniej liczby

cząsteczek w fazie stacjonarnej podzielonej przez średnią liczbę cząsteczek w fazie ruchomej,

retencję substancji rozpuszczonej reguluje dynamiczna stała równowagi podziału (K) związku

między fazę ruchomą i stacjonarną.

w metodzie tej substancje

eluują w kolejności od

najbardziej polarnych (ściśle

najbardziej hydrofilowych) do

niepolarnych (najbardziej

lipofilowych),

Pomiar lipofilowości metodą RP-HPLC

W metodzie HPLC jako faz stacjonarną wykorzystuje się najczęściej żel

krzemionkowy zmodyfikowaną warstwą hydrofobową złożoną z

podstawników C18 (tzw. kolumny typu C18)

Możliwe jest również zastosowanie biomimetycznych faz stacjonarnych,

np. kolumny z unieruchomioną sztuczną błoną biologiczną (tzw.

kolumny IAM).

fazę stacjonarną stanowi fosfatydylocholina (PC) związana z krzemionką,

Model dwuwarstwy lipidowej w kolumnie IAM

Polarna

„głowa”

Niepolarny

„ogon” PC

unieruchomione cząsteczki fosfolipidów naśladują środowisko

lipidowe błony komórkowej co umożliwia przewidywanie (a)

interakcji analitu z błoną biologiczną czy (b) wchłaniania przez błonę

komórkową (np. w jelicie),

współczynnik retencji (k) związku określony dla kolumny IAM jest

proporcjonalny do jego powinowactwa (współ. podziału, K) do

fosfolipidów zgodnie z równaniem:

gdzie

Wyznaczanie lipofilowości w układzie HPLC

z elucją izokratyczną – kolumna RP-C18

Procedura wyznaczania lipofilowości (parametry log kw i CHI)

Faza stacjonarna – kolumna Purospher STAR RP-C18e

Faza ruchoma – metanol/woda (zakres 40-60% MeOH)

Nazwa

związku

MeOH

[%]

tR [min] log k log kw CHI (0)

GE

NIS

TE

INA

40 15,015 1,042

2,874 62,45

45 9,085 0,799

50 5,715 0,562

55 3,652 0,343

60 2,587 0,119

Równanie Snydera-Soczewińskiego

log kw – chromatograficzny współczynnik podziału (przecięcie z osią y; odpowiada fazie zawierającej wyłącznie wodę);

– udział metanolu w fazie ruchomej; CHI (0) – indeks hydrofobowości (gdy k = 1, czyli log k = 0);

k – współczynnik retencji; tR i t0 – odpowiednio czas retencji i czas martwy

Wyznaczanie lipofilowości w układzie HPLC

z elucją gradientową – kolumna IAM

Procedura wyznaczania lipofilowości (parametry CHI i log P)

Faza stacjonarna – kolumna IAM.PC.DD2 (100 x 4,6 mm)

Fazy ruchome – (A) 50 mM octan amonu (pH 7,4) (B) Acetonitryl

Program elucji gradientowej =>

Faza stacjonarna

Indeks hydrofobowości (CHI) wyznaczony w warunkach

izokratycznych (dla substancji wzorcowych) jest liniowo

powiązany z czasem retencji tych substancji wyznaczonym w

warunkach elucji gradientowej. Subst. wzorcowa tR [min] CHI IAM

paracetamol 2.448 2.9

acetanilide 3.037 11.5

acetophenone 3.436 17.2

propiophenone 3.987 25.9

butyrophenone 4.363 32.0

valerophenone 4.673 37.3

hexanophenone 4.931 41.8

heptanophenone 5.154 45.7

octanophenone 5.356 49.4