bÀi 13 - ĐỊnh lƯỢng vsv bẰng phƯƠng phÁp ĐẾm trỰc tiẾp
TRANSCRIPT
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
BÁO CÁO TH C HÀNHỰBÀI 13
Đ NH L NG VI SINH V T B NGỊ ƯỢ Ậ Ằ PH NG PHÁP Đ M TR C TI PƯƠ Ế Ự Ế
( BU NG Đ M H NG C U )Ồ Ế Ồ Ầ
I. NGUYÊN T CẮ
Ph ng pháp đ m tr c ti p là ph ng pháp đ nh l ng d a trên s quan sát vàươ ế ự ế ươ ị ượ ự ự đ m tr c ti p s l ng t bào vi sinh v t b ng kính hi n vi và bu ng đ m.ế ự ế ố ượ ế ậ ằ ể ồ ế
1.Đ I T NGỐ ƯỢ
Vi sinh v t đ n bào có kích th c l n: n m men, t o đ n bào, bào t n m m cậ ơ ướ ớ ấ ả ơ ử ấ ố d quan sát d i kính hi n vi.ễ ướ ể
2. H N CHẠ Ế
Không phân bi t đ c t bào vi sinh v t s ng và ch t trong m u.ệ ượ ế ậ ố ế ẫ Không phân bi t đ c các t bào vi sinh v t và h t v t th .ệ ượ ế ậ ạ ậ ể H n ch đ i v i huy n phù có m t đ th p do l ng dung d ch đem đ mạ ế ố ớ ề ậ ộ ấ ượ ị ế
nh .ỏ Đ chính xác không cao.ộ Không thích h p m u có m t đ vi sinh v t th p.ợ ẫ ậ ộ ậ ấ
L U Ý:Ư
Tùy m c đ có m t c a vi sinh v t trong m u ban đ u, dung d ch đem đ m c nứ ộ ặ ủ ậ ẫ ầ ị ế ầ đ c pha loãng đ n m c phù h p ( s t bào ph i l n h n ho c b ng 2 vàượ ế ứ ợ ố ế ả ớ ơ ặ ằ không quá 10 t bào ). Nguyên t c pha loãng:ế ắ
Dung d ch pha loãng m u th ng là NaCl 0.9% hay photphat đ m đã đ c vôị ẫ ườ ệ ượ trùng.
1 TR N THANH TÙNG – MSSV: 10243221| Ầ
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
II. D NG C , MÔI TR NG, HÓA CH TỤ Ụ ƯỜ Ấ
D ng c phòng thí nghi m.ụ ụ ệ N c mu i sinh lý 0.9%.ướ ố N c c t vô trùng.ướ ấ C n 96ồ o. Ch ng n m men: ủ ấ Saccharomyces cerevisiae.
III. TI N HÀNH THÍ NGHI MẾ Ệ
S D NG BU NG Đ M H NG C UỬ Ụ Ồ Ế Ồ Ầ
1. C U T O BU NG Đ MẤ Ạ Ồ Ế
Bu ng đ m là m t phi n kính trong, dày,ồ ế ộ ế hình ch nh t.ữ ậ
Gi a là ph n lõm, ph ng, có k m t ho cữ ầ ẳ ẻ ộ ặ hai khung đ m g m 400 ô nh . Bên ngoàiế ồ ỏ có ghi tên lo i bu ng đ m, và ghi các thôngạ ồ ế s kĩ thu t nh hình bên.ố ậ ư
Hình 13.1 Bu ng đ m h ng c uồ ế ồ ầ
2. C U T O KHUNG Đ MẤ Ạ Ế
2 TR N THANH TÙNG – MSSV: 10243221| Ầ
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
Hình 13.2 C u t o khung đ mấ ạ ế
3. CÁCH TI N HÀNHẾ
Hình 13.3 Cách ti n hànhế
3 TR N THANH TÙNG – MSSV: 10243221| Ầ
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
QUY TRÌNH:
4. CÁCH Đ M T BÀO TRONG BU NG Đ MẾ Ế Ồ Ế
4 TR N THANH TÙNG – MSSV: 10243221| Ầ
Mẫu
Đồng nhất
Pha loãng
Chọn nồng độ pha loãng
Bơm dịch mẫu vào BĐHC
Đếm trực tiếp trên KHV
Tính kết quả
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
Hình 13.4 Cách đ m t bào trong bu ng đ mế ế ồ ế
Hình 13.5. Nh ng t bào đ c đ m ( màu đen ) và không đ c đ m ( màu xanh )ữ ế ượ ế ượ ế trong 1 ô l nớ
5. CÔNG TH C TÍNHỨ
G i A là s l ng t bào đ m đ c trong 80 ô nhọ ố ượ ế ế ượ ỏ
S l ng t bào trong 1 mmố ượ ế 3 đ c tính theo công th c:ượ ứ
S t bào trong 1 mmố ế 3 =
A×4000×ĐPL5×16
Trong đó:
A: S l ng t bào trong 80 ô nhố ượ ế ỏ 4000 = 400 x 10 ( 1/400 mm2: di n tích 1 ô nh ; 1/10 mm: chi u cao tệ ỏ ề ừ
m t bu ng đ m đ n t m lamelle )ặ ồ ế ế ấ ĐPL: đ pha loãngộ
IV. NH NG ĐI M C N L U ÝỮ Ể Ầ Ư
5 TR N THANH TÙNG – MSSV: 10243221| Ầ
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
Ch đ m đ c t ng s t bào, không th bi t t bào nào còn s ng, t bàoỉ ế ượ ổ ố ế ể ế ế ố ế nào đã ch t.ế
N ng đ d ch huy n phù pha loãng sao cho m t đ m i ô nh không quáồ ộ ị ề ậ ộ ỗ ỏ 10 t bào.ế
S d ng xong ph i r a bu ng đ m ngay và lau khô.ử ụ ả ử ồ ế Đ đ t đ chính xác cao, s t bào trung bình đ m đ c trong 1 ô nh : 2 ≤ể ạ ộ ố ế ế ượ ỏ
a ≤ 10.
V. BÁO CÁO TH C T PỰ Ậ
Trình bày nguyên t c và cách ti n hành c a ph ng pháp đ nh l ng viắ ế ủ ươ ị ượ sinh v t b ng ph ng pháp đ m tr c ti p.ậ ằ ươ ế ự ế
NGUYÊN T C:Ắ
Ph ng pháp đ m tr c ti p là ph ng pháp đ nh l ng d a trên s quan sát vàươ ế ự ế ươ ị ượ ự ự đ m tr c ti p s l ng t bào vi sinh v t b ng kính hi n vi và bu ng đ m.ế ự ế ố ượ ế ậ ằ ể ồ ế
Đ m s l ng t bào vi khu n có trong m t đ n v th tích c aế ố ượ ế ẩ ộ ơ ị ể ủ phòng đ m, t đó suy ra s l ng t bào có trong 1ml dung d ch, nhân v i đ pha loãngế ừ ố ượ ế ị ớ ộ để bi t s t bào cóế ố ế trong dung d ch ban đ u.ị ầ
CÁCH TI N HÀNH:Ế
Pha loãng huy n phù t bào vi sinh v t sao cho trong m i ô l n ch t 10 -ề ế ậ ỗ ớ ỉ ừ 50 t ế
bà o ). L c m nh d ch huy n phù t bào (đã pha loãng), dùng pippet Pasteur đắ ạ ị ề ế ể
hút d ch ị huy n phù này.ề Đ y bu ng đ m b ng m t phi n kính m ng.ậ ồ ế ằ ộ ế ỏ Nh nhàng dùng đ u pippet (ch a m t gi t huy n phù vi sinh v t), đ tẹ ầ ứ ộ ọ ề ậ ặ
vào c nh ạ bu ng đ m (n i ti p giáp v i phi n kính m ng). D ch huy n phù sẽồ ế ơ ế ớ ế ỏ ị ề đi vào bu ng ồ đ m nh c ch mao d n. Bu ng đ m đ c chu n b đúngế ờ ơ ế ẫ ồ ế ượ ẩ ị khi ch có vùng ỉ không gian n m gi a lá kính và bu ng đ m đ c ph b iằ ữ ồ ế ượ ủ ở d ch huy n phù t bào, ị ề ế c ò n c á c r ã n h c h u n g q u a n h thì k h ô n g b d í n h t.ị ướ
Di chuy n nh nhàng khung đ m đ d ch huy n phù tràn đ y các khoang.ể ẹ ế ể ị ề ầ Khi đó, d c h n m tr o n g k h o a n g c ó đ d à y k h o n g 0 .1 m m.ị ằ ộ ả
Đ t bu ng đ m lên kính hi n vi, s d ng v t kính x10 đ tìm bu ng đ m.ặ ồ ế ể ử ụ ậ ể ồ ế Ch nh ỉ
th t rõ, sau đó chuy n qua v t kính x40 đ đ m.ậ ể ậ ể ế Đ i u c h n h c n g đ á n h sá n g b n g c a s p đ c ó th q u a n s á t r õ r à nề ỉ ườ ộ ằ ử ậ ể ể
g c t b à o ả ế l n các đ ng k . Tuỳ vào s l ng t bào mà có th ch n cáchẫ ườ ẻ ố ượ ế ể ọ đ m t t c các t ế ấ ả ế bào có trong ô trung tâm hay ch đ m các t bào có trongỉ ế ế
6 TR N THANH TÙNG – MSSV: 10243221| Ầ
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
m t s ô vuông l n đ i ộ ố ớ ạ di n . Thông th ng ta ch n 1 ô trung tâ m và 4 ô n mệ ườ ọ ằ ngoài bìa.
B t đ u đ m t bào sau khi nh gi t d ch t 3 - 5 phút; ph i đ m các tắ ầ ế ế ỏ ọ ị ừ ả ế ế bào n m ằ t r ê n 2 đ n g k k n h a u đ c c h n c a t n g ô .ườ ẻ ề ượ ọ ủ ừ
Ph ng pháp đ nh l ng vi sinh v t b ng cách đ m tr c ti p th ng ápươ ị ượ ậ ằ ế ự ế ườ d ng cho nh ng đ i t ng vi sinh v t nào? Gi i thíchụ ữ ố ượ ậ ả
Đ I T NGỐ ƯỢ
Vi sinh v t đ n bào: n m men, t o đ n bào, bào t n m m c,...ậ ơ ấ ả ơ ử ấ ố
GI I THÍCH:Ả
Nh ng vi sinh v t nêu trên có kích th c l n.ữ ậ ướ ớ D quan sát d i kính hi n vi.ễ ướ ể Chúng th ng t n t i v i m t đ cao trong m u v t c n ki m tra.ườ ồ ạ ớ ậ ộ ẫ ậ ầ ể Đa s không c n nhu m màu ( n u là vi khu n th ng nhu m xanhố ầ ộ ế ẩ ườ ộ
metylen ho c màu phù h p v i vi khu n đó ).ặ ợ ớ ẩ Do quan sát b ng kính hi n vi v t kính x40, nghĩa là đ phóng đ i lênằ ể ở ậ ộ ạ
400 l n nên ch có th đ m đ c nh ng vi sinh v t có kích th c l n.ầ ỉ ể ế ượ ữ ậ ướ ớ
7 TR N THANH TÙNG – MSSV: 10243221| Ầ