bases farmacológicas y moleculares de las disquinesias ... · y alentarme, por un montón de...

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Tesis Doctoral

Bases farmacológicas y molecularesBases farmacológicas y molecularesde las disquinesias inducidas por L-de las disquinesias inducidas por L-dopa en un modelo experimental dedopa en un modelo experimental de

la enfermedad de Parkinsonla enfermedad de Parkinson

Saborido, Mariano Diego

2014-07-15

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Saborido, Mariano Diego. (2014-07-15). Bases farmacológicas y moleculares de las disquinesiasinducidas por L-dopa en un modelo experimental de la enfermedad de Parkinson. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

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Saborido, Mariano Diego. "Bases farmacológicas y moleculares de las disquinesias inducidaspor L-dopa en un modelo experimental de la enfermedad de Parkinson". Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2014-07-15.

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Bases farmacológicas y moleculares de las disquinesias

inducidas por L-dopa en un modelo experimental de la

enfermedad de Parkinson

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área

Ciencias Biológicas

Mariano Diego Saborido

Director de tesis: Prof. Dr. Oscar S. Gershanik

Consejero de Estudios: Prof. Dr. Osvaldo D. Uchitel

Lugar de trabajo: Instituto de Investigaciones Farmacológicas (ININFA-UBA-CONICET)

Buenos Aires, 2014

RESUMEN

Mariano Saborido - Resumen

RREESSUUMMEENN

BBaasseess ffaarrmmaaccoollóóggiiccaass yy mmoolleeccuullaarreess ddee llaass ddiissqquuiinneessiiaass iinndduucciiddaass ppoorr LL--ddooppaa eenn uunn mmooddeelloo eexxppeerr iimmeennttaall ddee llaa eennffeerrmmeeddaadd ddee PPaarrkkiinnssoonn

La enfermedad de Parkinson se caracteriza por una deficiencia de dopamina estriatal debida a la pérdida progresiva de neuronas de la substantia nigra pars compacta. La L-dopa es el antiparkinsoniano más eficaz, aun cuando luego de algunos años de tratamiento la mayoría de los pacientes presentan complicaciones motoras como las disquinesias. Éstas reducen la calidad de vida del paciente e interfieren con el beneficio terapéutico de la L-dopa. Se sabe que la exposición repetida a agonistas dopaminérgicos, la estimulación pulsátil de receptores dopaminérgicos estriatales y una severa degeneración nigroestriatal favorecen la aparición de disquinesias. Existe consenso respecto a que la aparición de disquinesias involucra profundos y persistentes cambios moleculares en el estriado. El objetivo general del presente trabajo fue examinar los mecanismos farmacológicos y moleculares que dan origen a las complicaciones motoras que se presentan durante la terapéutica sustitutiva con L-dopa en un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Nuestros resultados avalan la participación de los receptores dopaminérgicos D1 y sugieren la participación de la proteína Fyn en el desarrollo de disquinesias. Aunque no hemos sido capaces de reducir la severidad de las disquinesias mediante la inhibición de la vía mediada por mTOR, no podemos descartar su participación en el desarrollo y consolidación del fenómeno disquinético.

Palabras clave: Enfermedad de Parkinson, L-dopa, disquinesias, Fyn, mTOR.

Mariano Saborido - Summary

SSUUMMMMAARRYY

PPhhaarrmmaaccoollooggiiccaall aanndd mmoolleeccuullaarr bbaassiiss ooff LL--ddooppaa iinndduucceedd ddyysskkiinneessiiaass iinn aann aanniimmaall mmooddeell ooff PPaarrkkiinnssoonn´ss ddiisseeaassee

Parkinson's disease is characterized by a deficiency of striatal dopamine due to the progressive loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. L-dopa is the most effective anti-Parkinsonian drug, even though after a few years of treatment, the majority of patients present motor complications such as dyskinesias. They reduce the quality of life of the patients and interfere with the L-dopa therapeutic benefit. It is known that repeated exposure to dopamine agonists, pulsatile stimulation of striatal dopaminergic receptors and a severe striatonigral degeneration favor the emergence of dyskinesias. There is consensus that the occurrence of dyskinesias involves deep and persistent molecular changes in the striatum. The general objective of this work was to examine the pharmacological and molecular mechanisms that give rise to complications that arise during substitutive therapy with L-dopa in an animal model of Parkinson´s disease. Our results support the participation of D1 dopamine receptors and suggest the involvement of the protein Fyn in the development of dyskinesias. Although we have not been able to reduce the severity of dyskinesias by inhibiting the mTOR-mediated pathway, we cannot dismiss its participation in the development and maintenance of the dyskinetic phenomenon.

Key words: Parkinson´s disease, L-dopa, dyskinesias, Fyn, mTOR.

A mis padres,

A mi hermano,

A Noe,

Con todo mi amor.

Mariano Saborido - Agradecimientos

AAGGRRAADDEECCIIMMIIEENNTTOOSS

A Oscar Gershanik, por haberme permitido realizar esta tesis bajo su dirección, por sus enseñanzas y enorme generosidad y por su constante aliento y apoyo.

A Gustavo Murer, por su consejo y ayuda permanente y sobre todo por su dedicación.

A mis queridísimas amigas Irene y Celia (Morock and Zedi), por las risas, los consejos y también por los retos. Por haberme acompañado todos estos años.

A Juan Ferrario, por su aliento permanente, su reconocimiento y por hacerme ver las cosas de manera positiva.

Al Dr. Rubio, por permitirme seguir realizando mis tareas de investigación en el ININFA.

A Marinita, por su amistad y enseñarme a hacer westerns, y sobre todo por ayudarme a empezar un nuevo camino.

A Silvy, por su cariño, buena onda y por haberme mostrado París!

A Claudia García Bonelli, por su alegría, por su dedicación y consejos.

A mis “tías” Stella Celuch, María Clara Gravielle y Gabriela Acosta por bancarme en el labo y porque me hicieron sentir querido.

A todos mis compañeros del ININFA, porque me dieron una mano en las tareas de cada día.

Al CONICET, por haberme otorgado las becas que me posibilitaron realizar este proyecto.

A mis viejitos lindos, por educarme, por enseñarme a ser una buena persona, por bancarme y alentarme, por un montón de cosas.

A Gemo, porque sos groso nene, porque sos un ejemplo de vida y porque te quiero mucho hermanito.

A Noe, por hacerme feliz cada día, por bancarme, por acompañarme, por darme tranquilidad cuando no la tengo, por enseñarme a ser mejor persona y porque la amo.

A mis queridos amigos, Pablito y Seba, porque los quiero mucho y siempre están conmigo.

A Marian, Dami, la Negra, Ari, Andy, Isa y todos aquellos con los que empecé este largo camino allá por el 2000 y que aún hoy siguen siendo mi ejemplo pero sobre todo mis muy queridos amigos!

Mariano Saborido - Agradecimientos

A Ari y Manu, por nuestra amistad.

Al “cumpa” por su cariño y entrañable amistad.

A Cristina Rilo, porque es mi mentora docente, porque la admiro y por su gran generosidad.

A mis nuevos compañeros y amigos del INAME, por recibirme y quererme.

A los animales que participaron en los experimentos, sin los cuales no hubiese sido posible esta tesis.

Mariano Saborido - Abreviaturas

AABBRREEVVIIAATTUURRAASS

AC: adenilato ciclasa

Ach: acetilcolina

AMPc: adenosín monofosfato cíclico

ANOVA: análisis de la varianza

BDNF: factor neurotrófico derivado del cerebro, del inglés brain-derived neurotrophic

factor

bFGF: factor de crecimiento fibroblástico básico, del inglés basic fibroblast growth

factor

COMT: catecol-O-metil-transferasa

DA: dopamina

DAB: 3,3’-diaminobenzidina

DARPP: fosfoproteína regulada por DA y cAMP de 32 kDa, del inglés DA and cAMP-

regulated phosphoprotein, 32 kDa

DAT: transportador presináptico de DA, del inglés dopamine transporter

DAx: distonía axial

DDC: descarboxilasa de aminoácidos aromáticos

DIL: disquinesias inducidas por L-dopa

DO: disquinesia orolingual

DOPAC: ácido 3,4-Dihidroxifenilacético

DP: disquinesia de pata delantera

EP: enfermedad de Parkinson

ERK: quinasa regulada por señales extracelulares, del inglés extracelular signal-

regulated kinase

GABA: ácido け-amino-butírico

GDNF: factor neurotrófico derivado de la glía, del inglés glial-derived neurotrophic

factor

GB: ganglios de la base

Glu: glutamato

GPe: globo pálido externo

GPi: globo pálido interno

HVA: ácido homovanílico, del inglés homovanillic acid


L-dopa: L-3,4-dihidroxifenilalanina

LTD: depresión de largo plazo, del inglés long term depression

LTP: potenciación de largo plazo, del inglés long term potenciation

MAO: monoamino oxidasa

mfb: haz de fibras del cerebro medio, del inglés medial forebrain bundle

MPTP: 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina

MSN: neuronas espinosas estriofugales, del inglés medium spiny neurons

mTOR: blanco en mamíferos para rapamicina, del inglés mammalian target of

rapamicin

NGF: factor de crecimiento nervioso, del inglés nerve growth factor

NGS: suero normal de cabra, del inglés normal goat serum

NMDA: N-metil-D-aspartato

NPP: núcleo pedunculopontino

NST: núcleo subtalámico

NT-3: neurotrofina 3, del inglés neurotrophin 3

PB: buffer fosfato, del inglés phosphate buffer

PBS: buffer fosfato salina, del inglés phosphate-buffered saline

PC: prueba del cilindro

PDC: pata delantera contralateral

PFA: paraformaldehído

PP-1: fosfatasa de proteínas 1, del inglés protein phosphatase 1

PPA: prueba de pasos de ajuste

PTN: pleiotrofina

RCD: respuesta de corta duración

RD1: receptor de dopamina de la familia D1

RD2: receptor de dopamina de la familia D2

RLD: respuesta de larga duración

RPTP: del inglés, receptor protein tyrosine phosphatase

SDS: dodecil sulfato de sodio, del inglés sodium dodecyl sulfate

S.E.M.: error estándar de la media, del inglés estandar error of the mean

SHAM: lesión simulada con ácido ascórbico

SN: substantia nigra

SNpc: substantia nigra pars compacta

SNpr: substantia nigra pars reticulata


TH: tirosina hidroxilasa

TNFα: factor necrosante tumoral alfa, del inglés tumor necrosis factor

TVL/VA: tálamo ventrolateral y ventral anterior

VMAT: transportador vesicular de monoaminas, del inglés vesicular monoamine

transporter

3-MT: 3-metoxitiramina

6-OHDA: 6-hidroxidopamina

Mariano Saborido - Índice

ÍÍNNDDIICCEE

I. INTRODUCCIÓN GENERAL

I.1. Consideraciones preliminares 1

I.2. Sistema dopaminérgico nigroestriado 2

i. Fisiología de los ganglios de la base 2

ii . Neurotransmisión dopaminérgica 6

I.3. Enfermedad de Parkinson 8

i. Etiopatogenia 9

ii . Características neuroanatómicas y neuroquímicas 10 de la enfermedad de Parkinson

iii . Adaptaciones del sistema nigroestriado en la 13 enfermedad de Parkinson

I.4. Terapéutica de la enfermedad de Parkinson 14

i. Tratamiento farmacológico 14

1. 3,4-dihidroxifenilalanina (L-dopa) 14

Efectos adversos del tratamiento crónico con L-dopa: Disquinesias 16

2. Agonistas dopaminérgicos 17

3. Otros fármacos usados en el tratamiento de la EP 18 Agentes dopaminérgicos Agentes no dopaminérgicos Nuevos fármacos en investigación

ii . Neurocirugía funcional 20

iii . Terapias de neuroprotección, neurorestauración y 21 de reemplazo celular

II. OBJETIVOS 24

III. CAPÍTULO I

III.1. INTRODUCCIÓN 25


III.2. METODOLOGÍA 28

i. Animales 28

ii . Lesión severa de la vía nigroestriada 28

iii . Pruebas comportamentales 29

1. Prueba del cilindro (PC) 29

2. Prueba de pasos de ajuste (PPA) 30

3. Conducta rotatoria 31

4. Cuantificación de disquinesias 32

5. Ensayo de exploración en campo abierto en animales naive 34

iv. Tratamiento farmacológico 35

v. Análisis histológico 36

1. Obtención y preparación del tejido 36

2. Inmunohistoquímica 37

vi. Análisis estadístico 37

III.3. RESULTADOS 38

i. Curva dosis-respuesta de antagonistas dopaminérgicos D1 y D2 38 en animales naive

ii. Efecto de antagonistas D1 y D2 sobre las disquinesias inducidas 40 por L-dopa

III.4. DISCUSIÓN 43

IV. CAPÍTULO II

IV.1. INTRODUCCIÓN 46

IV.2. METODOLOGÍA 50

i. Animales 50

ii . Cirugía estereotáxica 50

1. Lesión severa de la vía nigroestriada 50

2. Implante de cánulas guía y administración intraestriatal 51 de drogas


iii . Pruebas comportamentales 52

iv. Tratamiento farmacológico 52

v. Inmunoprecipitación y western blot 54


2. Inmunoprecipitación de Fyn 54

3. Separación electroforética e inmunodetección 55

vi. Análisis histológico 55


2. Técnica de Nissl con violeta de cresilo 56

3. Inmunohistoquímica TH/c-fos 56

vii. Análisis estadístico 57

IV.3. RESULTADOS 58

i. Caracterización comportamental y molecular del modelo de 58 disquinesias inducidas por L-dopa.

ii. Análisis de la participación de la vía mediada por mTOR en el 61 desarrollo de disquinesias inducidas por L-dopa.

1. Participación de la síntesis proteica estriatal en el 61 desarrollo de disquinesias inducidas por L-dopa.

2. Evaluación de los niveles estriatales de p-p70S6K. 66

3. Efecto de la inhibición intraestriatal de la vía 66 mediada por mTOR.

iii. Evaluación de la participación de la vía RPTP ζ/く/Fyn en el 71 desarrollo de disquinesias inducidas por L-dopa.

1. Expresión de PTN en el estriado dorsolateral 71

2. Estudio de la expresión de Fyn en el estriado de ratas que 71 desarrollaron disquinesias inducidas por L-dopa

IV .4. DISCUSIÓN 74

V. CONCLUSIONES GENERALES 78


VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 79

INTRODUCCIÓN

GENERAL

Mariano Saborido - Introducción General

1

II .. IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN GGEENNEERRAALL

I.1. Consideraciones preliminares

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa que se

caracteriza por la deficiencia de dopamina (DA) en el núcleo estriado como consecuencia

de la pérdida selectiva y progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra

pars compacta (SNpc). Entre las enfermedades degenerativas es la segunda en prevalencia

después de la enfermedad de Alzheimer y afecta aproximadamente al 1% de la población

mayor de 60 años. Aunque hoy en día mucho se sabe acerca de la etiopatogenia de la EP,

no existen todavía tratamientos preventivos efectivos, de modo que sólo existen

tratamientos sintomáticos que no impiden el avance del proceso degenerativo y resultan

insuficientes para garantizar la adecuada calidad de vida de los pacientes después de unos

pocos años de tratamiento.

Las terapias actuales incluyen el tratamiento farmacológico de remplazo y la

neurocirugía funcional. Recientemente, se han abordado estudios empleando diferentes

tratamientos de neuroprotección con la intención de retrasar o detener el proceso

degenerativo mediante la restauración de la función dopaminérgica o la protección de las

neuronas dopaminérgicas afectadas. A pesar de los esfuerzos, aún no se obtuvieron

resultados concluyentes.

Por estos motivos es importante profundizar en la comprensión de las posibles causas

de la enfermedad y en la búsqueda de terapéuticas orientadas a prevenir o detener el

proceso degenerativo o a restablecer la estructura y función del sistema nigroestriado

dañado.

Para ello es necesario revisar previamente algunos conceptos de la fisiología de los

ganglios de la base, de la función dopaminérgica, de las bases fisiopatológicas que

subyacen a la enfermedad y las terapias actuales de la EP.


2

I.2. Sistema dopaminérgico nigroestriado

i. Fisiología de los ganglios de la base

Los ganglios de la base (GB) son un conjunto de núcleos grises ubicados en la base

del encéfalo que tienen una participación fundamental en el procesamiento y ejecución de

la información motora y cognitiva, y están estrechamente vinculados con los cambios

patológicos que ocurren en una amplia variedad de trastornos del movimiento, entre ellos la

EP. Están formados por el estriado, el globo pálido interno (GPi), el globo pálido externo

(GPe), la SNpc, la substantia nigra pars reticulata (SNpr) y el núcleo subtalámico (NST).

En primates, el estriado está formado por el núcleo caudado y el putamen, constituyendo el

neoestriado, y por el estriado ventral, también conocido como estriado límbico.

Estos ganglios forman parte de un complejo circuito que recibe información de las

áreas motoras de la corteza cerebral, la procesa, y a través del tálamo la devuelve a ciertas

regiones del lóbulo frontal (revisado por Albin y col., 1989; Gerfen y Wilson 1996).

Debido a su participación en la regulación del movimiento y en los cambios

fisiopatológicos que subyacen a la EP, revisaremos los detalles de la compleja organización

anatómica y funcional de los mismos.

El núcleo más grande dentro de los GB es el estriado, que comprende el caudado, el

putamen y el estriado ventral, incluyendo al nucleus accumbens. Dentro del estriado más

del 90% de las neuronas tiene la característica morfológica de presentar espinas sobre sus

dendritas, por lo que se las conoce como neuronas espinosas estríofugales (Gerfen y

Wilson, 1996). El resto de la población celular del estriado son interneuronas que han sido

clasificadas según la expresión de diferentes neurotransmisores (revisado por Kawaguchi y

col., 1995; Mura y col., 2000). Sobre las espinas dendríticas de las neuronas estríofugales

se forman las sinapsis de las aferencias provenientes de la corteza, de la SNpc y de los

axones colaterales de las interneuronas (Figura 1). Los estudios morfológicos de la

población celular del estriado no permiten establecer límites regionales dentro de esta

estructura dado que las neuronas se distribuyen homogéneamente. Sin embrago, la

organización anatómica del estriado es heterogénea, el mismo está formado por regiones

llamadas “parches o estriosomas” los cuales se distribuyen a través de la “matriz estriada”.

Estos compartimentos también se diferencian por sus características funcionales y


3

bioquímicas. Mientras las neuronas de los estriosomas procesan fundamentalmente la

información del área límbica, las neuronas de la matriz procesan la información sensorio-

motora (Graybiel, 1990; revisado por Gerfen, 1992). Esta organización topográfica

heterogénea permitiría la compleja integración de señales motivacionales, sensoriales y

motoras provenientes de aferencias corticales y límbicas (Graybiel y col., 1994).

Prácticamente todas las áreas corticales (sensorial, motora y asociativa) proyectan

hacia el estriado (Bolam y col., 2000, Gerfen y col., 2002). La otra aferencia principal del

estriado proviene del tálamo, particularmente del núcleo talámico intralaminar (Smith y

col., 2004; Doig y col., 2010). Ambas proyecciones son glutamatérgicas, formando de esta

manera conexiones sinápticas excitatorias con las neuronas estriofugales e interneuronas

estriatales.

Figura 1: Representación esquemática de los contactos sinápticos sobre las neuronas espinosas estríofugales. Papel modulador de la DA en la función del estriado. Las fibras glutamatérgicas corticales descendentes (naranjas) hacen sinapsis en los botones sinápticos de las espinas dendríticas. Las aferencias dopaminérgicas nígricas (verdes) terminan en el cuello de las espinas dendríticas. Las interneuronas colinérgicas (violeta) hacen contactos en espinas dendríticas y en las terminales glutamatérgicas. La acción conjunta de estas conexiones determinan la actividad de las neuronas estríofugales, la que es modulada fundamentalmente por la DA. Glu: glutamato, ACh: acetilcolina. Tomado y adaptado por la Dra. Taravini de Surmeier y col., TRENDS in Neurosciences 2007, Vol.30, No.5.

Como se mencionó anteriormente, el estriado constituye el principal núcleo de

entrada de información al circuito de los GB. La información estriatal viaja hacia el resto de

los GB a través de neuronas espinosas GABAérgicas de proyección de las vías directa e

indirecta (Gerfen & Wilson 1996) (Figura 2). Las neuronas espinosas de la vía directa

extienden sus axones hacia el GPi y la SNpr. Estos núcleos pueden ser considerados como


4

una estructura somatotópicamente organizada donde el GPi se encuentra involucrado en los

movimientos axiales y de las extremidades y la SNpr involucrada en los movimientos de la

cabeza y de los ojos. Las neuronas de la vía directa también extienden axones colaterales

hacia las neuronas GABAérgicas del GPe. A su vez, las neuronas espinosas de la vía

indirecta proyectan únicamente hacia el GPe. Las neuronas del GPe proyectan hacia las

neuronas glutamatérgicas del NST y hacia los núcleos de salida (GPi/SNpr). Las neuronas

del NST también proyectan sus axones hacia el GPi y el SNpr formando una vía paralela

hacia los núcleos de salida. De esta manera, la vía indirecta forma un circuito

multisináptico entre el estriado y los núcleos de salida de los GB. La actividad dentro del

circuito de la vía indirecta también se encuentra modulada por aferencias corticales

excitatorias hacia el NST.

Todas las neuronas en el GPe, GPi, NST y SNpr son marcapasos autónomos, es

decir, generan potenciales de acción por su cuenta, sin aportes sinápticos. Este mecanismo

genera un medio por el cual las neuronas de las vías directa e indirecta son capaces de

modular bidireccionalmente la tasa de disparo de las neuronas del GPi y de la SNpr que

proyectan hacia el tálamo, colículo superior y núcleo pedunculopontino (NPP). Por lo tanto,

sus conexiones neuroanatómicas proveen a las neuronas espinosas de las vías directa e

indirecta con distintos efectos sobre la actividad inhibitoria de los núcleos de salida. La vía

directa constituye un aporte excitatorio por medio de desinhibición mientras que la vía

indirecta constituye un aporte inhibitorio. Algunas neuronas del GPe también envían

colaterales hacia la SNpr, que proporcionan una fuente adicional de inhibición a los núcleos

de salida desde el circuito de la vía indirecta.

La descripción previa sobre los diferentes circuitos por los que transita y se procesa

la información en los GB es una forma simplificada de caracterizar dicho sistema, dado que

existen evidencias anatómicas y funcionales que demuestran la complejidad de las

interconexiones entre los diferentes núcleos de los ganglios basales. Si bien se acepta que la

información procesada en las regiones estriadas, motora, cognitiva y límbica, permanece

segregada a través de todo el circuito, es probable que exista un cierto grado de

convergencia e interacción entre la información que ingresa al estriado. Asimismo, se ha

postulado que existen proyecciones corticales directas sobre el NST sin pasar por el


5

estriado, si bien estas son cuantitativamente importantes, su significancia funcional es poco

conocida (revisado por Nambu y col., 2002).

Figura 2: Esquema de la vía directa e indirecta en los ganglios de la base. Estas vías proyectan desde las neuronas estríofugales del estriado sobre los “núcleos de salida”. Las aferencias excitatorias en el estriado provienen de la corteza cerebral (flechas verdes) y hacen sinapsis con las neuronas de la vía directa (puntos rojos) y la indirecta (puntos azules). Las neuronas “estrionígricas” de la vía directa proyectan hacia la SNpr y el Gpi (flechas rojas), mientras que las neuronas “estríopalidades” de la vía indirecta proyectan sus axones hacia el GPe y las neuronas de este núcleo proyectan hacia el GPi y la SNpr (flechas azules). Tomado y adaptado de Gerfen y Surmeier, Annu. Rev. Neurosci. 2011, Vol.34.

Dentro del circuito de los GB, la estimulación dopaminérgica tiene un papel

fundamental en la regulación de la función de todo el sistema. La DA liberada por las

terminales provenientes de la SNpc modula la actividad de las sinápsis corticoestriadas,

potenciando o reduciendo la acción del glutamato sobre las neuronas estriofugales. Cuando

la DA estimula los receptores tipo D1 de las neuronas de la vía directa, facilita la acción del

glutamato, mientras que cuando actúa sobre los receptores tipo D2 de las neuronas

estríopalidales ejerce un efecto inhibitorio sobre la neurotransmisión glutamatérgica

(Gerfen y col., 1990), resultando en un neto efecto facilitador del movimiento.


6

ii. Neurotransmisión dopaminérgica

Las neuronas cuyos somas se encuentran en la SNpc y proyectan sus axones hacia el

estriado dan origen a la vía nigroestriada. El área donde se ubican estas células se denomina

A9 y junto con las áreas A8, A10 y A12 forma parte del conjunto de vías dopaminérgicas

centrales. Como describimos previamente, la vía nigroestriada regula la función locomotora

mientras que las vías mesocortical, mesolímbica y tuberoinfundibular modulan funciones

cognitivas, emocionales y neuroendócrinas respectivamente (revisado por Lindvall y

Bjorland, 1983). El grupo de neuronas A9 presenta características particulares que permite

diferenciarlas del resto de neuronas adyacentes (A8 y A10). Son células voluminosas de

aproximadamente 33 micrómetros de diámetro con largas dendritas que se extienden por la

SNpc y por la parte dorsal de la SNpr.

La biosíntesis de DA se realiza por la hidroxilación del aminoácido L-tirosina a L-

3,4-di-hidroxi-fenil-alanina (L-dopa o levodopa) por acción de la enzima tirosina

hidroxilasa (TH) y luego la L-dopa es descarboxilada por la enzima descarboxilasa de

aminoácidos aromáticos también llamada DOPA descarboxilasa (DDC). La velocidad de la

síntesis de DA es regulada por la enzima TH que presenta muy baja actividad enzimática,

convirtiéndola en el paso limitante del proceso biosintético. La DA sintetizada es

trasportada dentro de las vesículas presinápticas por medio del transportador vesicular de

monoaminas (VMAT) para su almacenamiento, protección y secreción. Cuando un

potencial de acción alcanza el terminal nervioso se produce la fusión de vesículas

presinápticas con la membrana plasmática y la consecuente liberación de DA hacia el

espacio extracelular. La acción de la DA que se encuentra en el espacio sináptico termina

por varios procesos que ocurren en forma simultánea. La DA es recapturada por el

transportador presináptico de DA (DAT) y también metabolizada por las enzimas

monoamino oxidasa (MAO) y/o catecol-O-metil-transferasa (COMT). La DA recapturada

puede volver a almacenarse y reutilizarse o ser degradada por la MAO que se encuentra en

la membrana externa mitocondrial. La COMT se encuentra en la membrana plasmática de

prácticamente todas las células y actúa sobre la DA extracelular.

La DA ejerce su función a través de la estimulación de los receptores

dopaminérgicos D1, D2, D3, D4, D5 y sus variantes alélicas. Estos son receptores


7

metabotrópicos acoplados a proteínas G que inicialmente se habían clasificado en dos sub-

tipos, D1 y D2, en función de sus propiedades farmacológicas y sus efectos sobre la enzima

adenilato ciclasa. Mientras que los receptores D1 la activan incrementando los niveles

intracelulares de adenosín monofosfato cíclico (AMPc), los receptores D2 ejercen una

influencia inhibitoria sobre esta enzima o pueden no estar acoplados a ella. Los receptores

del subtipo D1 y D5 pertenecen a la familia D1 dado que presentan las propiedades

funcionales y farmacológicas descriptas previamente para los clásicos receptores D1. Por

otro lado, los receptores D2, D3 y D4 exhiben las propiedades funcionales y

farmacológicas descriptas previamente para los clásicos receptores D2 por lo que se los

agrupa en la familia D2 (Bunzow y col., 1988; Monsma y col., 1990; Sokoloff y col., 1990,

Sunahara y col., 1991; Van Tol y col., 1991) (Figura 3).

Figura 3: Esquema de la sinapsis dopaminérgica. DA: dopamina; TH: tirosina hidroxilasa; DDC: DOPA descarboxilasa; DAT: trasportador de dopamina; VMAT2: transportador vesicular de catecolaminas; G: proteína G; AC: adenilato ciclasa; RD1: receptor de dopamina de la familia D1; RD2: receptor de dopamina de la familia D2; DOPAC, 3MT y HVA: metabolitos de la dopamina; MAO y COMT: enzimas metabolizadoras (Esquema del Laboratorio de Parkinsonismo Experimental).


8

I.3. Enfermedad de Parkinson

En 1817 el médico británico James Parkinson sacaría a la luz su trabajo “An Essay

on the Shaking Palsy”. En este documentaría por primera vez los principales signos clínicos

de la enfermedad que posteriormente llevaría su nombre. Años más tarde, alrededor de

1860, Jean-Martin Charcot completó la descripción clínica y la redefinió como

“Enfermedad de Parkinson”. En la década del ’50 el médico sueco Arvid Carlsson

describió la presencia de DA en el cerebro de los mamíferos, principalmente su distribución

en los GB y su relación con el movimiento y la EP.

La EP es la segunda enfermedad neurodegenerativa de mayor prevalencia, luego de

la enfermedad de Alzheimer. Es una afección cosmopolita que afecta entre el 1 y el 2 % de

la población mayor a 65 años de edad y su prevalencia aumenta aproximadamente al 4 %

en aquellas personas mayores de 85 años. Sin embargo, existen casos en que el comienzo

de la enfermedad se produce alrededor de los 40 años (5-10% de los casos totales)

(Gershanik, 2003; Schrag y Schott, 2006). Esta forma de la enfermedad se la conoce como

“Parkinson de comienzo precoz” y generalmente está asociada a la transmisión hereditaria.

Asimismo, la EP puede presentarse incluso antes de los 21 años de edad (Langston y Tan,

2000; Uc y Rodnitzky, 2003) (Parkinson juvenil).

Está caracterizada por la muerte lenta y progresiva de las neuronas dopaminérgicas

de la SNpc y la concomitante reducción de los niveles estriatales de DA (revisado por

Hornykiewicz 1966). Esta pérdida de DA estriatal genera un desbalance en el

funcionamiento de los GB y tiene como resultado la aparición de los síntomas de la EP. Los

principales síntomas motores de la EP son: temblor, incremento del tono muscular

(rigidez), alteraciones posturales, dificultad para iniciar una acción motora, lentitud en los

movimientos (bradiquinesia) y en casos extremos puede producirse la pérdida total de

movimiento (aquinesia). Además se presentan síntomas no motores que comprenden

principalmente, cambios en el comportamiento y el sueño, trastornos olfatorios, disfunción

autonómica y deterioro cognitivo, que se agravan con el progreso de la enfermedad.

Sin embargo, además de la neurodegeneración nigroestriatal, existe perdida de

neuronas dopaminérgicas en otras áreas cerebrales y de neuronas de otros sistemas de


9

neurotransmisores, incluyendo la pérdida de neuronas colinérgicas, serotoninérgicas y

adrenérgicas (Olanow y Tatton, 1999).

Debido a que las neuronas dopaminérgicas remanentes tienen una gran capacidad de

compensación funcional, los signos clínicos no se manifiestan hasta que el 60% de ellas

degeneró y por lo tanto el contenido de DA disminuyó un 80% en el estriado. Se estima

entonces que el proceso degenerativo comenzó varios años antes de que se presenten las

manifestaciones clínicas, hecho que deja poco margen para la prevención.

Se han propuesto etapas secuenciales de desarrollo topográfico en la EP que serían

paralelas al desarrollo gradual de los signos clínicos (Braak H y col., 2003). Estas etapas

incluyen inicialmente al bulbo olfatorio (lo cual podría explicar el signo temprano de

hiposmia) y el núcleo motor dorsal del vago.

i. Etiopatogenia

A través de los años la mirada sobre la etiología de la EP cambió dramáticamente.

Debido a que sólo del 15 al 20% de los pacientes poseían una clara historia familiar de EP,

los investigadores predijeron que la mayoría de los pacientes con EP tenían una etiología

compleja, incluyendo tanto componentes ambientales como genéticos. En las últimas dos

décadas, se realizaron estudios de genética molecular en familias con historia de EP en los

que se obtuvieron importantes evidencias acerca de los mecanismos subyacentes a la

patología de la EP. Fueron nueve los genes identificados a través de estrategias de clonado

posicional que contribuyeron a la etiología genética de la EP familiar (Polymeropoulos y

col., 1997; Kitada y col., 1998; Bonifati y col., 2003; Paisan-Ruiz y col., 2004, 2009;

Valente y col., 2004a; Zimprich y col., 2004a; Ramirez y col., 2006; Lautier y col., 2008;

Di Fonzo y col., 2009). Dos genes más, UCH-L1 y HTRA2, fueron identificados basándose

en la relevancia funcional de su proteína a la patogénesis de la enfermedad (Leroy y col.,

1998a, b; Strauss y col., 2005). Aunque los estudios de seguimiento genético para algunos

de estos genes son inconsistentes y se necesitan datos concluyentes, existe amplia evidencia

que sostiene una asociación causal para la EP con los siguientes genes: α-sinucleína,

parkina, PINK1 (PTEN induced putative kinase 1), DJ-1 (PARK7, Parkinson protein 7) y

LRRK2 (Leucine-rich repeat kinase 2).


10

Existen teorías que intentan explicar la existencia de casos de EP no asociados a un

componente hereditario. Entre las hipótesis que se han manejado referido a la causa de la

degeneración dopaminérgica, la deficiencia de la actividad mitocondrial (Schapira y col.,

1989) y el estrés oxidativo (Jenner, 1991; Fahn y Cohen, 1992) han centrado la mayor

atención en los últimos años.

Entre los factores adquiridos que podrían tener un rol etiológico se cuentan las

toxinas ambientales (en particular algunos pesticidas como el paraquat y la rotenona dañan

las neuronas dopaminérgicas) y endógenas (se ha postulado que la oxidación de la DA

misma podría generar radicales libres) y la inflamación (algunas citoquinas, como el factor

necrosante tumoral alfa, TNFα, pueden dañar las neuronas dopaminérgicas).

La suma de evidencias presentes hasta el momento permite enunciar que el origen

de la EP sería la combinación de la acción de toxinas exógenas y/o endógenas sobre un

organismo genéticamente susceptible.

ii. Características neuroanatómicas y neuroquímicas de la enfermedad de Parkinson

Como se mencionó anteriormente, los signos clínicos de la enfermedad se presentan

cuando más del 60% de las neuronas dopaminérgicas de la SNpc han desaparecido y el

contenido de DA en el estriado ha disminuido un 80%; ésta es una evidencia que sostiene

que durante el progreso de la enfermedad se disparan mecanismos adaptativos tendientes a

compensar el déficit en la neurotransmisión dopaminérgica. Luego del diagnóstico, la

degeneración neuronal progresa gradualmente de modo que más del 90% de las neuronas

dopaminérgicas degeneran en los años siguientes a pesar del tratamiento. Las principales

características para realizar el diagnóstico patológico consisten en la pérdida de neuronas en

la SNpc y la presencia de cuerpos de Lewy. Si bien la presencia de cuerpos de Lewy ha

sido por mucho tiempo la característica patológica en la cual se basa el diagnóstico, la

principal proteína constituyente de estas estructuras ha sido identificada recientemente

(Spillantini y col., 1997). Los cuerpos de Lewy son inclusiones citoplasmáticas

eosinofílicas formadas por la agregación de α-sinucleína. Cabe resaltar que si bien la

desnervación dopaminérgica nigroestriada es suficiente para evidenciar los signos

característicos de la enfermedad, la patología de la EP involucra otras regiones del cerebro

además de la SNpc, y otros neurotransmisores además de la DA (Agid y col., 1973; Lang y


11

Lozano, 1998).

La pérdida de la innervación nigroestriada y la consecuente deficiencia en la

producción de DA se traduce en una alteración de la regulación que ejerce esta vía sobre las

neuronas GABAérgicas del estriado (Figura 4). Por un lado, se produce una disminución de

la inhibición que la vía nigroestriada ejerce sobre las neuronas GABAérgicas de la vía

indirecta, lo que provoca una excesiva inhibición del GPe y conduce a una reducción en la

inhibición del NST. Esto finalmente provoca el aumento de la liberación de GABA por

parte del GPi y la SNpr inhibiendo fuertemente las áreas corticales que inervan.

Paralelamente, la disminución de DA produce una disminución de la facilitación de la

estimulación cortical sobre las neuronas del estriado del circuito directo, lo que reduce la

inhibición del GPi y la SNpr. Como resultado de la ausencia de estimulación

dopaminérgica, se produce un desequilibrio entre ambas vías estríofugales y en

consecuencia se favorece la inhibición tálamo-cortical, lo que conduce a una inhibición del

movimiento.


12

Figura 4: Cambios en la regulación de los ganglios basales como consecuencia de la falta de neurotransmisión dopaminérgica. La disminución del control dopaminérgico sobre las neuronas estríofugales provoca un desbalance en la neurotransmisión GABAérgica de las vías directa e indirecta. La falta de estimulación a través del receptor D1 produce una disminución en la señal de la vía directa, mientras que la falta de la inhibición regulada por el receptor D2 provoca un aumento de la señal de la vía indirecta. La falta de inhibición “directa” y la estimulación del NST resultan en un aumento de la inhibición del tálamo y la consecuente disminución de la estimulación cortical. Las flechas naranjas representan las proyecciones glutamatérgicas estimulatorias y las flechas azules representan las proyecciones GABAérgicas inhibitorias. TVL/VA: Tálamo ventral lateral y ventral anterior. Esquema del Laboratorio de Parkinson Experimental.


13

iii. Adaptaciones del sistema nigroestriado en la enfermedad de Parkinson

Como consecuencia de la desnervación nigroestriada, en el estriado tienen lugar

diferentes mecanismos adaptativos tendientes a lograr incrementar los efectos de la señal

dopaminérgica (Olanow y col., 2006). Uno de estos mecanismos involucra el aumento de la

expresión de los receptores dopaminérgicos y cambios en la señalización intracelular post-

receptorial lo que provoca el desarrollo de un fenómeno conocido como supersensibilidad

desnervatoria postsináptica. En modelos animales de la enfermedad se han observado,

además de cambios funcionales, cambios morfológicos que involucran la reinervación por

fibras serotoninérgicas (Zhou y col., 1991), el aumento del tamaño de los botones sinápticos

de las neuronas encefalinérgicas (Ingham y col. 1991) y modificaciones complejas de las

fibras glutamatérgicas provenientes de la corteza y del tálamo (Ingham y col., 1993).

Como mencionamos más arriba, para que se manifiesten los síntomas motores de la

EP, es necesario que haya una pérdida de neuronas dopaminérgicas mayor al 60 % y una

reducción del contenido de DA en el estriado del 80%, lo cual sugiere que en la etapa

preclínica se pondrían en juego mecanismos compensatorios. Esto demuestra la importancia

de los mecanismos adaptativos que sufren las neuronas dopaminérgicas en la SN. Estas

neuronas experimentan cambios morfológicos caracterizados por el rebrote de sus axones

(Bjorklund y Stenevi, 1971). Dichos cambios pueden ocurrir espontáneamente en animales

con desnervación de la vía nigroestriada (Robinson y col., 1994; Hansen y col., 1995;

Blanchard y col., 1996; Finkelstein y col. 2000; Hirsch, 2000; Song y Haber, 2000; Stanic y

col., 2003) y también son inducidos o favorecidos por el tratamiento prolongado con L-dopa

(Murer y col., 1998, Datla y col., 2001). Estos cambios estructurales y morfológicos podrían

ser la base de un proceso que conlleve a una recuperación funcional, cuando menos parcial,

del sistema nigroestriado. Si bien este fenómeno es difícil de evaluar en humanos, dos

estudios demostraron la existencia del rebrote de fibras dopaminérgicas alrededor de células

catecolaminérgicas adrenales transplantadas en el estriado de pacientes con EP (Hirsch y

col., 1990; Kordower y col., 1991).


14

I.4. Terapéutica de la enfermedad de Parkinson

Un aspecto a tener en cuenta es que por el momento no existen tratamientos

preventivos o curativos. Es por esto que los tratamientos actuales están dirigidos a

proporcionar una mejoría sintomática mediante el uso de drogas que reemplazan o remedan

la acción de la DA endógena y en casos selectos la neurocirugía funcional, y prevenir o

retrasar el progreso de la degeneración neuronal a partir del momento del diagnóstico y/o

restablecer una nueva población funcional de neuronas dopaminérgicas (revisado por

Kalinderi, 2011 y Poewe y col., 2012).

i. Tratamiento farmacológico

La terapia sintomática de uso frecuente está dirigida, principalmente, a compensar el

déficit dopaminérgico administrando precursores de DA (L-dopa), derivados sintéticos o

semisintéticos que mimetizan las acciones de la DA a nivel receptorial (agonistas

dopaminérgicos) y drogas que potencian, directa o indirectamente, la neurotransmisión

dopaminérgica (agentes liberadores de DA, inhibidores de la recaptación neuronal de DA,

inhibidores de la degradación enzimática de L-dopa o DA).

1. 3,4-dihidroxifenilalanina (L-dopa)

El descubrimiento de Carlsson y colaboradores (1957) demostrando que la L-dopa

puede revertir la aquinesia inducida por la depleción de catecolaminas en el ratón y la

demostración de Ehringer y Hornykiewicz (1960) de una deficiencia de DA estriatal en esta

enfermedad, sentaron las bases para los primeros ensayos terapéuticos con L-dopa

(Birkmayer y Hornykiewicz, 1962). Posteriormente, Cotzias y col. (1967) demostraron que

el tratamiento crónico oral con D, L-dopa presentaba efectos antiparkinsonianos,

estableciendo las bases de la farmacoterapia moderna de la EP. Sin embargo, poco tiempo

después Cotzias (1969) y otros describieron los principales efectos adversos del tratamiento

con L-dopa, que incluyen movimientos involuntarios y fluctuaciones en la respuesta motora


15

y que hoy en día continúan siendo una complicación mayúscula en la terapia

antiparkinsoniana, limitando de manera significativa su efectividad.

La L-dopa es descarboxilada a DA en el sistema nervioso central por las neuronas

remanentes y probablemente por otros mecanismos celulares. Debido a que la L-dopa

también puede ser descarboxilasa y transformada en noradrenalina y adrenalina en el

sistema nervioso autónomo, se la asocia con un inhibidor de la DDC que no puede atravesar

la barrera hematoencefálica (carbidopa o benserazida) y, por lo tanto, no afecta a la

descarboxilación central de la L-dopa.

El efecto terapéutico de la L-dopa parece ser el resultado de dos acciones diferentes.

Primero, la L-dopa produce una respuesta de corta duración (RCD), que se prolonga de 2 a

3 horas, producida por la ocupación de receptores centrales (principalmente estriatales) para

DA. La RCD decae conjuntamente con la concentración de L-dopa en plasma. En segundo

lugar, produce una respuesta de larga duración (RLD) que sólo se aprecia plenamente

después de la administración repetida y tiene una vida media de varios días. En términos

generales la RLD aumenta gradualmente durante el tratamiento crónico hasta llegar a una

meseta y declina lentamente cuando el mismo se interrumpe de forma abrupta; en este caso

los pacientes tardan varios días en alcanzar su “línea de base” (Nutt y col., 1997). La RLD

contribuye sustancialmente al efecto terapéutico de la L-dopa en estadios tempranos de la

enfermedad y reduce las fluctuaciones en la respuesta motora dependiente de los cambios

rápidos en la concentración plasmática que ocurren cada vez que la L-dopa es administrada.

Si bien la magnitud de la RLD declina con la progresión de la enfermedad, contribuye a la

mejoría clínica aún en pacientes de larga evolución y severamente afectados. Debido a esto,

se ha propuesto que maximizando la RLD mientras se reduce la RCD debiera

incrementarse el beneficio obtenido por el tratamiento (revisado por Nutt, 2000). Los

mecanismos que producen la RLD no han sido aún clarificados. Durante años se ha

propuesto que la RLD es sostenida por el almacenamiento de L-dopa/DA en un

compartimiento intracerebral, debido probablemente al remanente de las terminales

presinápticas dopaminérgicas, aunque trabajos posteriores sugieren que quienes originan la

RLD son cambios farmacodinámicos postsinápticos (Barbato y col., 1997; Nutt y Carter,

2000). Como la magnitud de la RLD disminuye durante el curso de la enfermedad, los


16

pacientes fluctúan entre estados de actividad (on) y estados aquinéticos (off), que reflejan

claramente la RCD (revisado por Obeso y col., 2000).

Efectos adversos del tratamiento crónico con L-dopa: Disquinesias

El término “disquinesia” denota varios movimientos involuntarios que pueden

afectar partes discretas del cuerpo o pueden ser generalizados y severamente incapacitantes.

Al menos el 50% de los pacientes tratados con L-dopa desarrollan disquinesias. Una vez

establecidas, los mismos movimientos involuntarios aparecen con cada administración de la

medicación. Esto sugiere que existen alteraciones fundamentales en el funcionamiento de

los GB y en su respuesta frente al tratamiento farmacológico (revisado por Jenner, 2008).

Las formas en que se manifiestan las disquinesias son tan diversas como las partes

del cuerpo afectadas. Además, los procesos que subyacen al desarrollo de las mismas

(procesos de sensibilización) son diferentes de aquellos responsables de su ejecución en

respuesta al tratamiento posterior. Por otro lado, las drogas dopaminérgicas difieren en su

habilidad para iniciar las disquinesias: los agonistas dopaminérgicos directos inducen en

menor medida la aparición de estos movimientos anormales que la L-dopa. Aunque los

mecanismos que producen disquinesias de pico de dosis, el efecto adverso más común

durante la terapia crónica con L-dopa y otros agonistas dopaminérgicos no selectivos (como

la apomorfina) son poco claros, se sabe que la exposición repetida a dichos agonistas, las

fluctuaciones rápidas de su concentración plasmática (que provoca una estimulación

pulsátil de receptores estriatales) y la existencia de una severa degeneración nigroestriatal

favorecen la aparición de disquinesias (Bezard y col., 2001). También se conoce el hecho

de que los agonistas de receptores de la familia D2 son menos propensos a producir

disquinesias pero también tienen una menor efectividad terapéutica (Nutt, 2000), en tanto

que los agonistas D1/D5 son tanto o más potentes que la L-dopa como inductores de

disquinesias (Rascol y col., 2001).

Teniendo en cuenta lo dicho anteriormente se desprende que los mayores

responsables de la inducción de disquinesias son el tipo de droga administrada, el modo de

administración de la misma y la severidad de la pérdida de las neuronas dopaminérgicas de

la SNpc.


17

2. Agonistas dopaminérgicos

En los últimos veinte años la utilidad de los agonistas dopaminérgicos en

tratamiento sintomático de la EP ha sido demostrada en una gran cantidad de ensayos

clínicos (revisado por Bonuccelli y col., 2009). Su papel inicial como adyuvantes de la

terapia con L-dopa para la mejora de las fluctuaciones motoras ha dejado lugar en la

actualidad al tratamiento como monoterapia en etapas tempranas de la enfermedad. El uso

de los agonistas dopaminérgicos en los estadios tempranos de la enfermedad se basa en

retrasar o reducir la incidencia de las complicaciones motoras que surgen como resultado

del tratamiento prolongado con L-dopa, probablemente debido a una menor estimulación

pulsátil de los receptores dopaminérgicos post-sinápticos. De hecho, ensayos controlados

tanto con agonistas ergolínicos (bromocriptina, pergolida, lisurida, cabergolina) como con

no ergolínicos (ropinirol, rotigotina y pramipexol) han demostrado que estos conllevan un

menor riesgo de fluctuaciones motoras y disquinesias que la L-dopa, cuando son utilizados

como monoterapia. Sin embargo, el beneficio que poseen en cuanto a la prevención de las

complicaciones motoras se encuentra balanceado por un menor efecto sobre los síntomas

motores que el observado con L-dopa. Además, poseen una mayor incidencia de efectos

adversos no motores, particularmente somnolencia, alucinaciones y edemas de miembros

inferiores. Asimismo, debemos agregar que el tratamiento con agonistas dopaminérgicos

representa el principal factor de riesgo para el desarrollo de trastornos del control de los

impulsos (Driver-Dunckley y col., 2003; Dodd y col., 2005). Estos son un grupo de

complejos trastornos del comportamiento que se presentan más frecuentemente en

pacientes con EP que en la población general (Avanzi y col., 2006), con una prevalencia

hasta 13,6% (Weintraub y col., 2010). Dentro de los trastornos del control de los impulsos

más frecuentes podemos mencionar el juego patológico, la hipersexualidad, la compra

compulsiva y el comer compulsivamente. Teóricamente, otra ventaja del uso de los

agonistas dopaminérgicos es su potencial como neuroprotectores a través de diferentes

mecanismos de acción. Ensayos clínicos preliminares con pramipexol (Parkinson study

group, 2002) y ropinirol (Whone y col., 2003), aunque esperanzadores, no han arrojado

pruebas concluyentes respecto de su capacidad para modificar la progresión de la

enfermedad. Actualmente se están llevando a cabo numerosos ensayos clínicos controlados

de los cuales se esperan prontos resultados.


18

3. Otros fármacos usados en el tratamiento de la EP

Agentes dopaminérgicos

Inhibidores de la COMT

Luego de la administración continua de L-dopa junto a inhibidores de la DDC, el

principal catabolismo de la droga se dirige hacia la conversión de 3-MT mediante la acción

de la COMT. Debido a su larga vida media plasmática, la 3-MT compite con la L-dopa por

la absorción a nivel intestinal y por el transporte activo a través de la barrera hemato-

encefálica. Mediante la inhibición de la COMT es posible entonces prolongar la vida media

farmacológica de la L-dopa tanto en plasma como en el cerebro. Podemos mencionar dos

inhibidores de la COMT comúnmente usados en la clínica: el entacapone y el tolcapone.

Inhibidores de la MAO-B

La MAO-B cumple un papel importante en la biotransformación de la DA en el

cerebro humano. Los inhibidores de esta enzima bloquean la deaminación oxidativa de la

DA e incrementan su vida media en el cerebro. La selegilina es un inhibidor selectivo e

irreversible de la MAO-B que potencia la eficacia de la L-dopa y mejora las fluctuaciones

motoras en un porcentaje importante de pacientes (Birkmayer y col., 1975; Rinne y col.,

1978; Golbe y col., 1988). La rasagilina es otro inhibidor de la MAO-B aprobado para el

tratamiento sintomático de la EP (Parkinson Study Group, 2005; Rascol y col., 2005). Se

han observado también efectos neuroprotectores de la rasagilina en modelos animales de la

EP (Blandini y col., 2004; Bar-Am y col., 2007; Sagi y col., 2007; Stefanova y col., 2008)

y, en pacientes, cierto efecto que modifica la progresión de la enfermedad cuando es

introducida tempranamente como tratamiento (Olanow y col., 2009).

Agentes no dopaminérgicos

Anticolinérgicos

La interacción entre neuronas colinérgicas y dopaminérgicas en el estriado ha sido

largamente documentada. Sin embargo, el efecto de la deficiencia de DA estriatal en la EP

sobre la interacción entre estos tipos neuronales no se encuentra del todo dilucidado,

aunque se asume que existe una sobreactividad muscarínica (Duvoisin, 1967).


19

Antes de 1969, solo se encontraban disponibles para el tratamiento de la EP los

anticolinérgicos, los que luego dejaron su lugar a la L-dopa. Ejemplos de estos fueron el

trihexifenidilo y la benzatropina. Se cree que estas drogas son efectivas para el tratamiento

del tremor y del babeo pero son mucho menos efectivas contra la rigidez, la bradiquinesia y

los problemas de balanceo corporal. De todas maneras no existen estudios que demuestren

de manera inequívoca su mayor utilidad para el temblor. Más aún, existe evidencia que

demuestra su contribución al deterioro cognitivo y a la demencia (Perry y col., 2003; Ehrt y

col., 2010). Además de lo mencionado previamente, los anticolinérgicos frecuentemente

producen otros efectos adversos como confusión, sequedad bucal, constipación, visión

borrosa y en ocasiones retención urinaria, sobre todo en pacientes de sexo masculino.

Antagonistas glutamatérgicos

Como se ha descripto anteriormente, los signos y síntomas de la EP surgen como

consecuencia de una serie de cambios en la actividad de las vías de salida de los GB. Los

cambios en la vía indirecta llevan a una desinhibición y sobreactividad del NST resultando

en una estimulación glutamatérgica incrementada del GPi y de la SNpr. Finalmente, la

sobreactividad subtalámica conduce a una menor activación cortical produciendo el

parkinsonismo. Es por esto que los antagonistas glutamatérgicos pueden ser utilizados para

el alivio de la sintomatología parkinsoniana.

Por otro lado, varios autores han concluido que el glutamato participa en el

desarrollo y patogénesis de las disquinesias inducidas por L-dopa (DIL) (Baas, 2000;

Merims y col., 2001; Calon y col., 2003; Hadj Tahar y col., 2004). Es por esto que ciertos

antagonistas de los receptores NMDA, como la amantadina y la memantina, han

demostrado tener cierto beneficio terapéutico y son utilizados para el manejo de las DIL

(revisado por Danysz y col., 1997).

Como extensión al beneficio observado con antagonistas NMDA, varios grupos se

encuentran investigando el uso potencial de antagonistas del receptor AMPA. Sin embargo,

aún no se conoce exactamente el sitio de acción de los estos antagonistas.

Nuevos fármacos en investigación

Debido a que la L-dopa sigue siendo la droga más efectiva para el tratamiento

sintomático de la EP y dado que las fluctuaciones motoras y el desarrollo de las DIL siguen


20

siendo dificultades sin resolver, hoy en día se están realizando grandes esfuerzos para

encontrar drogas con acción fuera del sistema dopaminérgico que ayuden a sobrellevar

estas dificultades. Dentro de estas podemos mencionar a los antagonistas de los siguientes

receptores:

Adenosina A2A (Istradefylline, Preladenant, Tozadenant y ST-1535)

Metabotrópicos glutamatérgicos (Dipraglurant, AFQ056, PHCCC, VUO 155 041, VU 8506, VU 96697, VU 9397 PHCCC, VUO 155 041, VU 8506, VU 96697, VU 9397)

Adrenérgicos α2C (Fipamezole)

Acetilcolina nicotínicos (NP002, AQW051)

Serotonina 5HT1A (Eltoprazine)

(Hickey y col., 2011; Hickey y col., 2012; Marino y col., 2006; Berg y col., 2011; Johnston y col., 2004; Fox y col., 2008; Gotti y col., 2006; Schapira y col., 2010).

ii. Neurocirugía funcional

Las dificultades emergentes del tratamiento actual llevaron a la búsqueda de nuevas

terapias, entre ellas la neurocirugía funcional. La forma más difundida de neurocirugía

funcional consiste en el implante de electrodos con la finalidad de estimular de manera

crónica el NST y producir así una “inactivación funcional” del mismo, que restauraría el

balance entre las acciones de las vías directa e indirecta. Las lesiones o la inactivación

eléctrica del NST o del GP mostraron revertir muchas de las características del

parkinsonismo, sin embargo los pacientes que responden exitosamente (un 80%) tienen que

continuar bajo tratamiento farmacológico, aunque a dosis menores. A las desventajas

descriptas puede sumarse el riesgo que implica una operación de ese tipo y los costos de la

misma (revisado por Okun y Foote, 2010).


21

iii: Terapias de neuroprotección, neurorestauración y de reemplazo celular

Ninguno de los tratamientos actuales ha demostrado ser efectivo para detener o

retrasar el progreso de la EP. Desde la década del ’70 numerosos estudios en modelos

animales han investigado las posibles causas de la enfermedad en paralelo con diferentes

aproximaciones neuroprotectoras y neurorestauradoras. El empleo de moléculas anti-

oxidantes, inhibidores de la MAO-B o compuestos anti-apoptóticos; el trasplante de células

embrionarias y células modificadas genéticamente o la administración de factores tróficos

han resultado en algún beneficio en modelos animales de la EP, pero su uso clínico

demostró una eficacia pobre o nula y en ocasiones limitada por la aparición de serios

efectos adversos (Lang y Lozano, 1998; Lang y Obeso, 2004; Lewitt y Taylor, 2008;

Schapira, 2008). A pesar de los importantes avances realizados, el desarrollo de terapias

protectoras y restauradoras eficaces requiere un estudio más profundo sobre la patogénesis

de la enfermedad.

En años recientes se han comenzado a estudiar terapias de reemplazo celular que

involucran el trasplante de células modificadas genéticamente capaces de producir DA o

células embrionarias capaces de diferenciarse en neuronas dopaminérgicas. Se han

realizado una amplia variedad de ensayos en modelos animales y en pacientes (Dunnett y

col., 2001; Mochizuki y Mizuno, 2003; Takagi y col., 2005; Astradsson y col., 2008) en los

que se observó sobrevida del implante, arborización neuronal, expresión de TH y síntesis

de DA (Lindvall y col., 1990; Kordower y col., 1995, 1998; Piccini y col., 1999; Olanow y

col., 2001). Sin embargo, en algunos ensayos clínicos se presentaron efectos adversos como

el desarrollo de disquinesias severas en un significativo número de pacientes, lo que

determinó la interrupción de dichos ensayos (Freed y col., 2001; Hagell y col., 2002;

Olanow y col., 2003). Más aun, recientemente una gran cantidad de evidencia ha

relacionado al proceso de contagio célula-célula como posible mecanismo etiopatogénico

de la EP. Este mecanismo sería similar a lo que se observa para proteínas del tipo prion

(Hawkes y col., 2007). Esta teoría comenzó a tomar fuerza cuando autopsias realizadas a

pacientes que recibieron trasplantes de células madre en el estriado, revelaron la presencia

de precipitados de α-sinucleína en las células trasplantadas (Li y col., 2008; Kordower y


22

col., 2008). Esto implica una gran limitación para los implantes de células como alternativa

terapéutica de la EP.

Entre las aproximaciones terapéuticas preventivas y restauradoras potencialmente

interesantes se encuentra el uso de factores neurotróficos que regulan la supervivencia y el

crecimiento neuronal. Cohen y colaboradores (1954) descubrieron el primer factor trófico

con efecto sobre células nerviosas denominado factor de crecimiento nervioso (NGF, del

inglés nerve growth factor). A partir de ese momento, un gran número de factores tróficos y

sus receptores fueron identificados en el sistema nervioso central. Asimismo, una gran

variedad de ellos fueron buscados e identificados en modelos animales de la EP y su acción

sobre las neuronas dopaminérgicas fue probada en cultivos celulares mesencefálicos (Alexi

y Hefti 1993; Poulsen y col. 1994; Studer y col. 1995; Murer y col. 1999) y en modelos

animales de EP (Hagg y Varon 1993; Lin y col. 1993; Altar y col. 1994; Krieglstein y col.

1995; Kirik y col. 2000). Como ejemplo de estos podemos nombrar el factor neurotrófico

derivado del cerebro (BDNF, del inglés brain-derived neurotrophic factor), el factor

neurotrófico derivado de la glía (GDNF, del inglés glial-derived neurotrophic factor),

neurotrofina 3 (NT-3, del inglés neurotrophin 3) y el factor de crecimiento fibroblástico

básico (bFGF, del inglés basic fibroblast growth factor). Entre ellos, el GDNF es el que ha

recibido más atención en relación con la EP. El factor neurotrófico GDNF promueve

fuertemente la supervivencia y diferenciación de neuronas dopaminérgicas en cultivos

primarios de mesencéfalo (Hou y col., 1996), previene la degeneración inducida por toxinas

de neuronas dopaminérgicas in vivo y promueve la recuperación anatómica y funcional del

sistema nigroestriado dañado (Tomac y col., 1995; Gash y col., 1996; Choi-Lundberg y

col., 1997; Kordower y col., 2000; Palfi y col., 2002; Eslamboli y col., 2005). En ensayos

clínicos recientes, realizados en pacientes que sufren la EP, la administración intracerebral

de GDNF demostró tener un beneficio sintomático relativo, tal vez limitado por la aparición

de efectos adversos (Gill y col., 2003; Nutt y col., 2003; Patel y col., 2005; Slevin y col.,

2005). Diversos factores, entre ellos la forma y vía de administración, los efectos del

GDNF sobre otras poblaciones neuronales, y las acciones inflamatorias que pueden

acompañar a la infusión crónica intracerebral de sustancias, pueden haber contribuido a

limitar la utilidad terapéutica del mismo en dichos estudios. Por otro lado, el bFGF es una

molécula que está involucrada en el desarrollo, mantenimiento y supervivencia neuronal y


23

ejerce una fuerte actividad neurotrófica sobre las neuronas dopaminérgicas in vivo e in

vitro. En cultivos celulares, la administración de bFGF estimula la supervivencia y la

formación de neuritas de las neuronas dopaminérgicas y las protege de la neurotoxicidad

inducida por 6-hidroxidopamina (6-OHDA) (Ferrari y col., 1989; Engele y Bohn, 1991;

Mayer y col., 1993; Bouvier y Mytilineou, 1995). Sobre sus efectos in vivo, se sabe que

bFGF aumenta la sobrevida de los transplantes de neuronas dopaminérgicas en diferentes

modelos de la EP (Takayama y col., 1995; Timmer y col., 2004) y también estimula la

recuperación de las terminales dopaminérgicas luego de una lesión (Date y col., 1993).

En un estudio de nuestro laboratorio se observó que el tratamiento crónico con L-

dopa promueve la expresión de diferentes ARNm (Ferrario y col., 2004). Interesantemente

uno de estos correspondía a un factor trófico conocido como pleiotrofina (PTN). PTN fue

inicialmente reconocida como un factor que regula el crecimiento de neuritas y que se

encuentra presente en el cerebro de ratas en estadios perinatales (Rauvala, 1989). Durante

el desarrollo, PTN se expresa en axones y se cree que promueve la diferenciación neuronal

y el establecimiento de conexiones sinápticas (Rauvala y Peng, 1997). Se ha observado

también que PTN promueve la sobrevida (Hida y col., 2003; Marchionini y col., 2007) y la

diferenciación (Mourlevat y col., 2005) de neuronas dopaminérgicas en cultivos primarios

de neuronas mesencefálicas e incrementa la diferenciación de neuronas dopaminérgicas a

partir de células madre (Jung y col., 2004). Teniendo en cuenta estas evidencias, nuestro

laboratorio se dedicó a evaluar el efecto trófico de PTN in vivo sobre las neuronas

dopaminérgicas nigroestriatales en ratas lesionadas con 6-OHDA. Como resultado

observamos que la sobreexpresión de PTN rescata parcialmente la inmunoreactividad para

TH en el soma y terminales sinápticas de las neuronas dopaminérgicas que se encuentran en

proceso degenerativo inducido por 6-OHDA (Taravini y col., 2011). Recientemente un

trabajo de Gombash y colaboradores ha demostrado que la sobreexpresión de PTN es capaz

de neuroproteger a la vía nigroestriatal lesionada con 6-OHDA (Gombash y col., 2012),

apoyando los resultados obtenidos por nuestro laboratorio. Todo esto hace pensar en PTN

como un prometedor blanco terapéutico para el tratamiento de la EP.

OBJETIVOS

Mariano Saborido - Objetivos

24

II. OBJETIVOS

Hipótesis general

Los hallazgos mencionados previamente sugieren que la L-dopa es capaz de

inducir cambios plásticos a nivel estriatal que perduran en el tiempo y que estarían

vinculados a la aparición de movimientos anormales involuntarios. Nuestra hipótesis

general es que la L-dopa en dosis capaces de generar disquinesias produce un aumento

de la expresión de factores de señalización que regulan la traducción de proteínas en el

estriado de ratas con lesión severa nigroestriatal, y estos efectos plásticos de la L-dopa

estarían mediados por el receptor D1.

Objetivos específicos

I. Establecer la participación funcional de los receptores dopaminérgicos D1 y D2

en el desarrollo de disquinesias inducidas por L-dopa mediante la evaluación de

los efectos de distintos antagonistas.

II. Determinar si las ratas con lesión nigroestriatal que desarrollan disquinesias

durante el tratamiento con L-dopa presentan cambios en las cascadas de

señalización que regulan la traducción de proteínas.

III. Interferir con el desarrollo de disquinesias mediante estrategias orientadas a

regular las cascadas de señalización que se encontrarían alteradas como

consecuencia del tratamiento con L-dopa.

CAPÍTULO I

Mariano Saborido - Capítulo I - Introducción

25

II II II ..11.. IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN CCAAPPÍÍTTUULLOO II

Estudio de la participación de los receptores dopaminérgicos D1 y D2 en la

manifestación de disquinesias inducidas por L-dopa

Mientras que los mecanismos involucrados en la aparición de DIL aún son inciertos,

la participación de los receptores dopaminérgicos ha recibido gran atención y actualmente

se sabe que juegan un papel central en su desarrollo y manifestación (Bezard y col., 2001;

Jenner, 2008).

Como se mencionó previamente, los receptores dopaminérgicos pertenecen a la

superfamilia de receptores acoplados a proteínas G. Existen cinco subtipos de receptores

que median las acciones de la DA, tres de ellos (D2, D3 y D4) pertenecen a la familia tipo-

D2 y dos de ellos (D1 y D5) a la familia tipo-D1 (Missale y col., 1998). Los efectos de la

DA a nivel estriatal son mediados principalmente a través de los subtipos D1 y D2 y la

expresión de estos receptores se encuentra segregada en las vías de proyección estriatal

directa e indirecta respectivamente (Le Moine y col., 1995).

Junto con otros laboratorios, nuestro laboratorio ha estudiado los efectos del

tratamiento crónico con L-dopa y otros agonistas de receptores dopaminérgicos durante los

últimos 10 años. Hemos estudiado la capacidad de agonistas selectivos para distintos

subtipos de receptores dopaminérgicos de inducir disquinesias en ratas con lesión

nigroestriatal (Delfino y col., 2004). Asimismo hemos hallado que los agonistas no

selectivos son, al igual que lo que ocurre en los pacientes, mayores inductores de

disquinesias que los agonistas de receptores de la familia D2, y que estos últimos solo

inducen disquinesias si las ratas parkinsonianas fueron previamente expuestas a agonistas

no selectivos. Además, los agonistas D1/D5 son tan potentes inductores de disquinesias

como los agonistas no selectivos (Delfino y col., 2007). También observamos que la

exposición a agonistas no selectivos tiene un efecto promotor de la inducción de

disquinesias por administración subsecuente de otros agonistas que perdura al menos un

mes. En un estudio reciente (Larramendy y col., 2008) encontramos que, a dosis que


26

revierten déficit motores espontáneos en ratas parkinsonianas, los agonistas selectivos de la

familia D2 de mayor vida media plasmática son menos disquinetogénicos que los de vida

media plasmática corta. Finalmente, demostramos que existe una correlación entre el grado

de activación del estriado desnervado y la corteza motora ipsilateral (evaluada mediante

resonancia magnética nuclear funcional) y la intensidad de las disquinesias desarrolladas

durante un tratamiento con la misma droga en ratas con lesión nigroestriatal en respuesta a

la administración aguda de un agonista dopaminérgico (Delfino y col., 2007).

Estos hallazgos, junto con los de otros grupos, sugieren que la señalización

aumentada corriente abajo del receptor D1 estaría relacionada con el desarrollo de DIL

(Cenci y col., 1998; Berke y col., 1998; Picconi y col., 2003; Aubert y col., 2005). Hoy en

día se sabe que existe una relación lineal entre la sensibilidad de los receptores D1 y las

DIL (Aubert y col., 2005), mientras que la relación entre la expresión de este receptor y el

desarrollo de estos movimientos anormales no es tan directa. Asimismo, toda la cascada de

señalización corriente abajo del receptor D1 se encuentra alterada. Los niveles del tipo

olfatorio de la subunidad-α de la proteína G (Go) se encuentran aumentados en el estriado

desnervado de ratas y en pacientes con EP. Este aumento en la capacidad de transducción

de las señales intracelulares mediadas por el receptor D1 conduce a una producción

incrementada de AMPc (Corvol y col., 2004) y el tratamiento crónico con L-dopa o

agonistas D1 (pero no D2/D3) normaliza estos niveles. Una fuerte evidencia que sostiene el

papel del receptor D1 en el desarrollo de DIL es el gran aumento de los niveles de la

proteína estriatal DARPP-32 (del inglés DA and cAMP-regulated phosphoprotein, 32 kDa)

y su forma fosforilada, pDARPP-32, en animales disquinéticos. Resulta de interés, que este

aumento se correlaciona con la severidad de las DIL (Picconi y col., 2003; Aubert y col.,

2005; Santini y col., 2007).

La distribución subcelular del receptor D1 también se encuentra modificada. En

ratas y monos disquinéticos existe un mayor número de receptores D1 en la membrana

plasmática neuronal que en animales control (Guigoni y col., 2007; Berthet y col., 2009),

esto sugiere que las DIL se encuentran asociadas a deficiencias en la desensibilización e

internalización del receptor (Guigoni y col., 2007; Bezard y col., 2005).


27

Además, otras cascadas de señalización generalmente no asociadas al receptor D1

podrían estar involucradas (Gerfen y col., 2002). De acuerdo a esto se ha demostrado que la

supersensibilidad anormal de los receptores D1 llevan a la hiperactivación de ERK como

consecuencia de la administración de L-dopa, y el grado de activación de ERK se

correlaciona con la severidad de las DIL en roedores lesionados unilateralmente con 6-

OHDA y en monos tratados con MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) (Santini

y col., 2007; Bezard y col., 2005; Gerfen y col., 2002; Westin y col., 2007).

Mientras que la función del receptor D1 en el desarrollo de DIL ha sido claramente

demostrado, el papel del receptor D2 ha recibido menos atención. Sin embargo, se ha

demostrado que los agonistas D2 inducen un fenómeno de sensibilización a nivel

comportamental (Morelli y col., 1987; Morelli y col., 1989) y disquinesias en animales

previamente expuestos a agonistas dopaminérgicos (Delfino y col., 2004). En animales

lesionados, la distribución subcelular y la expresión de este receptor no se encuentra

afectada por el tratamiento crónico con L-dopa (Aubert y col., 2005; Guigoni y col., 2007).

De este modo podemos pensar que el receptor D2 sólo participa indirectamente en el

desarrollo de DIL.

El capítulo I de esta tesis comprende los experimentos realizados con el objetivo de

disociar el efecto terapéutico de la L-dopa del fenómeno disquinético mediante el uso de

antagonistas dopaminérgicos selectivos.

Mariano Saborido - Capítulo I - Metodología

28

II II II ..22.. MMEETTOODDOOLLOOGGÍÍAA CCAAPPÍÍTTUULLOO II

i. Animales

Se utilizaron ratas Wistar macho (Bioterio Central, Facultad de Ciencias Exactas y

Naturales, Universidad de Buenos Aires) con un peso aproximado de 220 gramos al inicio

de los experimentos. Se alojaron 4 animales por jaula con libre acceso a comida y bebida en

una sala con temperatura controlada (22 ± 2º C), una humedad relativa de 55 ± 15% y un

ciclo de luz/oscuridad de 12 horas de acuerdo con las regulaciones locales (SENASA,

Argentina). Los procedimientos que requirieron el uso de animales se realizaron conforme

a las normativas de la comisión local y la Guía para el Cuidado y uso de los Animales de

Laboratorio (Publicación Nº 80-23/96, National Institute of Health, NIH, USA).

ii. Lesión severa de la vía nigroestriada

Con la intención de generar un modelo de parkinsonismo experimental se sometió a

los animales a una inyección estereotáxica de la neurotoxina 6-OHDA. Los animales fueron

anestesiados mediante la inyección i.p. de Ketamina (40 mg/Kg, Ketamina 50, Holliday

Scott, Argentina) y Xilazina (10 mg/Kg, Kensol, König, Argentina). El animal anestesiado

se colocó en un marco estereotáxico (Stöelting Co., USA) y por medio de una aguja 30 G x

1” se inyectaron 8 µg de 6-OHDA (6-OHDA-bromuro de hidrógeno, MP Biomedicals,

USA) disuelta en 4 µl de ácido ascórbico 0,1% a una velocidad de 0,5 µl/minuto mediante

una bomba de infusión (Stöelting Co., USA). Las coordenadas de inyección con respecto al

bregma según el atlas de Paxinos y Watson (1986) fueron: anterior: 2,0 mm; lateral: 1,5

mm; ventral: 8,3 mm y la barra incisal se colocó 3,3 mm por debajo de la línea interaural.

Al término de la infusión, la aguja permaneció en el lugar por 3 minutos y 40 segundos para

evitar el reflujo de líquido. Para prevenir la captación de 6-OHDA por neuronas

noradrenérgicas se administró desipramina (Sigma, St. Louis, MO, USA; 25 mg/kg, i.p.)

30-45 minutos previos a la inyección de la neurotoxina.

Luego de la cirugía se colocó a los animales sobre una almohadilla térmica para

disminuir la hipotermia hasta que se recuperaron completamente de la anestesia.


29

iii. Pruebas comportamentales

1. Prueba del cilindro (PC)

Mediante esta sencilla prueba es posible evaluar el uso de la extremidad anterior

contralateral a la lesión, en el presente contexto, una medida de la aquinesia en dicho

miembro. Esta prueba evalúa una conducta espontánea del animal sin intervención del

investigador durante la misma (Figura 5). Para ello el animal es colocado en un cilindro de

acrílico, de 20 cm de diámetro y 30 cm de alto, donde inicia la actividad exploratoria del

nuevo ambiente. Una de las formas de exploración que presentan los animales es la

exploración vertical, para la cual se elevan sobre sus patas traseras y apoyan las delanteras

sobre la pared del cilindro. Una de las consecuencias de la lesión unilateral de la vía

nigroestriada es un menor uso, a veces nulo dependiendo de la severidad de la

desnervación, de la pata delantera contralateral (PDC), lo que se traduce en la falta de

apoyo de la misma durante la exploración vertical. Esta asimetría en el uso de las patas

delanteras es un indicador del grado de desnervación alcanzado o, en otro contexto, del

beneficio terapéutico de la droga que está siendo administrada. El observador cuenta

durante 5 minutos el número total de veces que el animal se para sobre sus patas traseras y,

de éstas, en cuántas apoya primero una u otra pata delantera. Cabe mencionar que por la

duración de la prueba no se llega a generar habituación. Se llevaron a cabo modificaciones

de la prueba original toda vez que el animal no realizaba actividad exploratoria al ser

colocado en el cilindro. Las modificaciones consistieron en sacar y volver a introducir la

rata y/o golpear las paredes del cilindro (Schallert y col., 2000). Esta prueba fue realizada 1

hora después de la administración de L-dopa. Los valores se representan como porcentaje

de uso de la pata delantera contralateral (% uso PDC) y se calcula como (Woodle y col.,

2005):

N° de veces que apoya la PDC + ½ (N° de veces que apoya ambas patas delanteras)

N° total de subidas


30

Figura 5: Prueba del Cilindro. El animal se eleva sobre sus patas traseras y apoya la pata izquierda sobre la pared del cilindro. Nótese la retracción de la pata derecha, característica de una lesión de la vía nigroestriatal con aquinesia de la PDC (Fotografías del Laboratorio de Parkinsonismo Experimental).

2. Prueba de pasos de ajuste (PPA)

Esta prueba no farmacológica, junto con la prueba del cilindro, fue realizada con el

fin de seleccionar los animales con lesión severa de la vía nigroestriada. La prueba de pasos

de ajuste (PPA) involucra la manipulación directa del animal por parte del investigador. El

experimentador sujeta con una mano las patas traseras del animal y eleva levemente la parte

posterior del cuerpo. Con la otra mano sujeta la pata delantera que no será monitoreada

momentáneamente y permite apoyar sobre la superficie la otra pata. El animal es inducido a

recorrer una distancia de 90 cm en 5 segundos mientras que el investigador cuenta el

número de pasos que realiza hacia la derecha y luego hacia la izquierda, con una u otra pata

delantera alternativamente (Olsson y col., 1995) (Figura 6). La PPA se realiza durante 3

días seguidos, dos veces al día. Se obtiene un valor promedio del número de pasos de ajuste

para cada pata delantera en dirección derecha y en dirección izquierda. Cuando fue

necesario evaluar el desempeño del animal en esta prueba bajo los efectos de alguna droga,

hemos modificado el protocolo de evaluación, realizando la prueba 3 veces consecutivas en

una misma sesión.

Previamente, los animales fueron entrenados durante 3 días de manera que al

momento del experimento se encuentren familiarizados con el procedimiento y el

experimentador.


31

Figura 6: Prueba de pasos de ajuste. Fotografías que ilustran la secuencia de pasos de ajuste de la pata ipsilateral (panel superior) y de la pata contralateral (panel inferior) de una rata lesionada con 6-OHDA en el hemisferio izquierdo. El animal arrastra la pata contralateral pasivamente cuando es trasladado mientras que con la pata ipsilateral realiza pasos frecuentes (Fotografías del Laboratorio de Parkinsonismo Experimental).

3. Conducta rotatoria

La conducta rotatoria es una característica distintiva del modelo de rata con lesión

hemilateral de la vía nigroestriada y sirve tanto para seleccionar los animales correctamente

desnervados mediante pruebas farmacológias (prueba con apomorfina o anfetamina) como

para evaluar el efecto de distintas drogas sobre el sistema dopaminérgico nigroestriado.

Esta característica se basa en el hecho que luego de una desnervación severa comienzan a

emerger cambios adaptativos tendientes a compensar la falta de DA estriatal. Dentro de

estos, podemos mencionar la sobreexpresión en membrana de receptores dopaminérgicos y

cambios en las cascadas de señalización intracelular que, de forma conjunta, promueven el

fenómeno de supersensibilidad. Teniendo en cuenta que la desnervación es hemilateral, la

respuesta postsináptica obtenida frente a la administración de un agonista dopaminérgico

será desigual y, como consecuencia de esto, se observará una actividad rotatoria neta. En

caso de administrarse un agonista de tipo directo, como la apomorfina, los animales rotarán

hacia el lado contralateral a la lesión. Distinto es lo que ocurre cuando el agonista es

indirecto, como el caso de la anfetamina, donde el animal rotará hacia el lado ipsilateral a la

lesión. Considerando lo descripto anteriormente, una manera de seleccionar los animales

correctamente lesionados es mediante la administración de apomorfina y anfetamina, a las


32

2 y 3 semanas post-cirugía respectivamente y cuantificando las rotaciones efectuadas por el

animal.

Con el objetivo de cuantificar la conducta rotatoria de los animales, los mismos

fueron colocados dentro de esferas de acrílico (rotámetros) y sujetos a un sensor mediante

el uso de arneses diseñados para este fin. Los sensores se encuentran conectados a una PC

con un software diseñado exclusivamente (RotoV 2.0) que permite el registro de las vueltas

tanto hacia la derecha como hacia la izquierda. Los animales fueron evaluados cada 30

minutos durante 2 horas.

4. Cuantificación de disquinesias

La evaluación de las disquinesias se realizó de manera simultánea a la

cuantificación de la conducta rotatoria. Para esto los animales fueron colocados dentro de

los rotámetros y evaluados durante 1 minuto cada 30 minutos por un período total de 2

horas.

Durante las sesiones experimentales se evaluaron tres tipos de disquinesias (Figura

7), a saber (Cenci y Lundblad, 2007):

i. Disquinesia de pata delantera (DP)

Casos no severos: movimientos hiperquinéticos, desiguales de escalonamiento del

miembro contralateral a la lesión, o pequeños movimientos circulares del miembro a y

desde el hocico. Mientras que la severidad de la disquinesia aumenta (que ocurre

generalmente con la administración repetida de L-DOPA), los movimientos anormales

aumentan en amplitud, y asumen características distónicas e hiperquinéticas mezcladas. Los

movimientos distónicos son causados por la co-contracción continua de los músculos

agonista/antagonista; son lentos y fuerzan un segmento del cuerpo en posiciones

artificiales. Los movimientos hiperquinéticos son rápidos e irregulares en velocidad y

dirección.

ii. Distonía Axial (DAx)

Casos no severos: flexión lateral del cuello o movimientos torsionales del tronco

superior hacia el lado contralateral a la lesión. Con la inyección repetida de L-DOPA, este

movimiento puede convertirse en una pronunciada y continua distonía como la torsión

axial.


33

iii. Disquinesia Orolingual (DO)

Esta forma de disquinesia afecta los músculos faciales, de la lengua y los

masticatorios. Es reconocible como explosiones de movimientos masticatorios vacíos,

acompañados a un grado variable de la apertura de la quijada, desplazamientos laterales de

la quijada, el crispar de músculos faciales, y profusión de la lengua hacia el lado

contralateral a la lesión. En su severidad extrema, este subtipo de disquinesia involucra la

contracción con fuerza notable de todos los grupos de músculos antedichos, y puede

también llegar a ser empeorado por auto-mutilación al morderse la piel del miembro

delantero contralateral a la lesión.

Estos movimientos involuntarios fueron cuantificados de acuerdo a la siguiente

escala:

0 = ausencia de disquinesia

1 = signos ocasionales de disquinesias, que se presentan durante menos de la mitad del

tiempo de observación.

2 = signos frecuentes de disquinesias que están presentes durante más de la mitad del

tiempo de observación.

3 = la disquinesia se encuentra presente durante todo el período de observación pero es

interrumpida por un estímulo externo (Ej. golpe suave en la jaula).

4 = disquinesia continua que no es interrumpida por un estímulo externo.

Figura 7: Secuencias fotográficas de

ratas afectadas por distonía axial (a-

a´´´), disquinesia orolingual (b-b´´) y

disquinesia de pata delantera (c-c´´´).

Tomado y modificado de Winkler y

col., 2002. Neurobiol Dis. 2002 Jul;

10(2):165-86.


34

5. Ensayo de exploración en campo abierto (open field) en animales naïve

Con el objetivo de establecer la mínima dosis de antagonista con efecto inhibidor de

la conducta motora normal se procedió a realizar una curva dosis-respuesta de los

antagonistas dopaminérgicos sch-23390 (antagonista D1) y raclopride (antagonista D2) en

animales naive. Los experimentos descriptos a continuación fueron realizados entre las 8

pm y 2 am en condiciones de oscuridad con el propósito de realizar la intervención

farmacologica en períodos en los que los animales presentan mayor actividad. Una semana

antes del comienzo de los experimentos, los animales fueron sometidos a 3 sesiones de

habituación a la exploración en el campo abierto. Cada animal recibió dosis crecientes de

antagonistas. Es importante remarcar que entre cada dosis de antagonista evaluada se

realizó un washout de 3 días de manera de evitar cualquier efecto residual de la

administración anterior. Asimismo, la noche previa a cada administración, es decir, en el

día 3 de washout, se realizó una nueva prueba de campo abierto y se evaluó si el

desempeño de los animales era similar al demostrado en la etapa de habituación, en otras

palabras, si los animales regresaban al nivel basal de motricidad.

Los animales se colocaron en el centro de la superficie del campo abierto (Acti-

track LE 8811 IR, Panlab s.l., España (Figura 8) y se registró su actividad locomotora en 4

intervalos de 5 minutos cada uno (20 minutos de evaluación total). Se cuantificó tanto la

actividad exploratoria horizontal como la vertical. Los sensores destinados a la detección de

la actividad horizontal fueron fijados a 3,5 cm de altura mientras que aquellos destinados a

al registro de la actividad vertical fueron fijado a 9,5 cm con respecto al piso del equipo.

Los datos generados fueron luego transformados a su raíz cuadrada para un mejor manejo

de los mismos (Isacson et al., 2004).


35

Figura 8: Sistema de registro de conducta locomotora utilizado para ensayos de exploración en campo abierto.

iv. Tratamiento farmacológico

La administración de L-dopa (Lebocar, levodopa-carbidopa 250/50, Pfizer,

Argentina) comenzó a los 35 días posteriores a la lesión estereotáxica con 6-OHDA. La

dosis utilizada de L-dopa fue 50 mg/kg de acuerdo a estudios previos en nuestro laboratorio

(Larramendy y col., 2008). Cabe destacar que la disolución de la misma fue realizada con

agua corriente y la administración fue intragástrica (gavage gástrico), de manera de

remedar lo que ocurre en la clínica.

Los distintos antagonistas utilizados fueron: sch-23390 (antagonista D1, Sigma-

Aldrich, USA ) y raclopride (antagonista D2, Sigma-Aldrich, USA) diluidos con agua

destilada estéril hasta la concentración de trabajo y administrados intraperitonealmente. La

administración de los mismos fue realizada 15 minutos antes de la administración de L-

dopa.

El protocolo experimental se detalla en la Figura 9:


36

Figura 9: Protocolo experimental diseñado para la evaluación del efecto de los antagonistas dopaminérgicos sobre las DIL. Quince días después de la lesión con 6-OHDA los animales son sometidos a test conductuales y farmacológicos con el objetivo de seleccionar los correctamente lesionados. Los animales seleccionados reciben una dosis diaria de L-dopa (50 mg/kg) durante 12 días hasta el desarrollo de DIL severas. A partir del día 38 post-lesión comienza la administración del antagonista con un washout de 3 días entre cada dosis. Durante el washout del antagonista los animales continúan recibiendo L-dopa. La evaluación conductual (PC, PPA, DIL y conducta rotatoria) de los animales se realizó durante el período de establecimiento de DIL severas y en cada sesión de tratamiento con antagonista dopaminérgicos.

v. Análisis histológico

1. Obtención y preparación del tejido

Para obtener el tejido sobre el cual se realizaron las determinaciones

inmunohistoquímicas los animales se anestesiaron con Ketamina (40 mg/Kg, Ketamina 50,

Holliday Scott, Argentina) y Xilazina (10 mg/Kg, Kensol, König, Argentina) y se

perfundieron transcardíacamente con solución fisiológica heparinizada fría (NaCl 0,9%,

1000 UI heparina/litro), seguida por paraformaldeído (PFA) 4% en buffer fosfato (PB) 0,1

M (pH 7,4). El cerebro se removió y post-fijó por inmersión en la misma solución fijadora

durante 30 minutos, luego permaneció en solución criopreservadora de sacarosa 30% en PB

0,1 M a 4º C hasta su procesamiento. Posteriormente, se cortó el cuerpo estriado y la SNpc

en micrótomo de congelación. Se realizó un muestreo seriado obteniendo secciones

coronales de 25 µm de espesor a nivel estriatal y 40 µm de espesor a nivel mecensefálico.

El tejido permaneció a 4°C en una solución conservadora de azida de sodio 0,1% en buffer

fosfato salina (PBS) 0,1 M.


37

2. Inmunohistoquímica

Para determinar la magnitud de la desnervación dopaminérgica post-mortem se

realizó la determinación inmunohistoquímica de TH. A lo largo de toda la determinación se

utilizó PBS 0,1%, Tritón X-100 0,15% (PBS-T) como buffer de lavado y como buffer de

dilución de todos los reactivos. Entre todas las incubaciones con anticuerpos y reactivos se

realizaron lavados con dicho buffer. Secciones coronales de tejido libre en solución se

incubaron en H2O2 0,3% por 30 minutos para inhibir la peroxidada endógena y luego en

suero normal de cabra (NGS, del inglés: normal goat serum) 2% por 30 minutos para

disminuir las reacciones de unión inespecífica. Seguidamente el tejido se incubó en

presencia del antisuero primario (Pel Freez, USA, dilución 1:2000) overnight (ON) a 4°C y

posteriormente se expuso a un anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con biotina

(dilución 1:250, Vector Laboratories, USA) por 2 horas a temperatura ambiente. La

presencia del anticuerpo primario se visualizó por incubación con el complejo avidina-

biotina-peroxidasa (dilución 1:125, Vectastain, Vector Laboratories, USA) el cual se reveló

con γ,γ’-diaminobenzidina 0,5 mg/ml (DAB, Sigma, USA), H2O2 0,015% en buffer Tris

0,1 M (pH 7,4). Las secciones se montaron sobre portaobjetos gelatinizados, se

deshidrataron por pasajes sucesivos en soluciones de concentración creciente de etanol y

finalmente xilol y se cubrieron con medio de montaje en base a xilol (PMYR, Argentina).

vi. Análisis estadístico

Se utilizó el paquete estadístico GraphPad Prism versión 5.00 para Windows.

(GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com). En todos los casos

un valor de p<0,05 se consideró estadísticamente significativo.

En todos los casos se realizó un ANOVA de medidas repetidas seguido por el test a

posteriori de Tukey.

Al momento de comparar los parámetros comportamentales (PC y PPA) antes y

después de la lesión con 6-OHDA se realizó una prueba de T para muestras pareadas.

http://www.graphpad.com/

Mariano Saborido - Capítulo I - Resultados

38

II II II ..33.. RREESSUULLTTAADDOOSS CCAAPPÍÍTTUULLOO II

i. Curva dosis-respuesta de antagonistas dopaminérgicos D1 y D2 en animales naïve

Con el objetivo de establecer la mínima dosis de antagonista con efecto inhibidor de

la conducta motora normal se procedió a realizar una curva dosis-respuesta de los

antagonistas dopaminérgicos sch-23390 (antagonista D1) y raclopride (antagonista D2) en

animales naïve.

Los resultados obtenidos con el antagonista sch-23390 demostraron que una dosis

de 0,01 mg/kg es suficiente para disminuir la conducta motora normal de los animales en

un campo abierto. Esta inhibición resultó ser dosis dependiente, observándose el máximo

efecto con una dosis de 0,1 mg/kg. Cabe destacar que no se observó un bloqueo total de la

motricidad de los animales, aún al elevar la dosis a 0,5 mg/kg, lo que avala la participación

de otros tipos de receptores de DA en la ejecución de los movimientos (Figura 10)

(Rubinstein y col., 1988).

En el caso del antagonista dopaminérgico D2, raclopride, se observó una tendencia

a aumentar la conducta motora normal a dosis bajas del mismo y sólo se observó una

disminución estadísticamente significativa de la conducta motora con la mayor dosis

evaluada (0,5 mg/kg). Estos resultados se condicen con resultados previos de nuestro

laboratorio que demuestran un efecto bimodal de los antagonistas D2 sobre la expresión del

movimiento (Figura 10) (Rubinstein y col., 1988).

Teniendo en cuenta estos resultados pudimos corroborar una vez más la

participación de los receptores de DA D1 y D2 en la ejecución del movimiento y establecer

las dosis de sus respectivos antagonistas capaces de disminuir la conducta motora normal

de los animales.


39

Figura 10: Actividad exploratoria en un campo abierto de animales naïve tratados con dosis crecientes del agonista D1 sch-23390 (a, c y e) o D2 raclopride (b, d y f). (a,b) actividad horizontal, (c,d) actividad vertical y (e,f) actividad total. ANOVA de medidas repetidas, (* p<0,05 respecto del vehículo). Media ± S.E.M.


40

ii. Efecto de antagonistas D1 y D2 sobre las disquinesias inducidas por L-dopa

Cómo primera aproximación para entender los fenómenos que subyacen a la

inducción de disquinesias nos planteamos los siguientes objetivos: 1) Comparar la

capacidad de antagonistas dopaminérgicos de las familias D1 y D2 de bloquear las

disquinesias inducidas por el tratamiento crónico con L-dopa en ratas con lesión severa de

la vía nigroestriada y 2) Encontrar una dosis de antagonista capaz de bloquear la inducción

de disquinesias por L-dopa sin alterar la respuesta terapéutica a la misma ni la conducta

motora normal de los animales.

De acuerdo a lo mencionado en el apartado Metodología de esta primera parte, los

animales recibieron una inyección de 6-OHDA en el haz de fibras del cerebro medio (mfb,

del inglés medial forebrain bundle) de manera unilateral. Entre la semana 2 y la semana 3

post-cirugía los animales fueron sometidos a la prueba del cilindro, prueba de pasos

ajustados, test de anfetamina y al test de apomorfina con el objetivo de seleccionar aquellos

que fueron correctamente lesionados (Figura 11). Posteriormente, los animales

seleccionados fueron separados al azar en dos grupos experimentales: (1): sch-23390 y (2):

raclopride. Ambos grupos fueron tratados con L-dopa (50mg/kg) durante 12 días de

manera de inducir el desarrollo de DIL severas. A partir del día 13, 15 minutos antes de la

administración de L-dopa, los animales recibieron una determinada dosis de antagonista.

Esto se repitió con dosis crecientes de antagonista cada 3 días. Los días en los que se

administró el antagonista evaluamos la conducta rotatoria, el grado de aquinesia de la PDC

al hemisferio lesionado y el nivel de disquinesias. Una vez finalizado el experimento, los

animales se sacrificaron por perfusión con PFA 4 %. El cerebro se removió y se realizaron

cortes seriados coronales del estriado y la SN en un micrótomo de congelación. Sobre este

tejido se determinó, mediante inmunohistoquímica, la presencia de TH a nivel de la SNpc y

del estriado para determinar de manera precisa el grado de desnervación dopaminérgica

(Figura 11).

El criterio de selección de los animales correctamente lesionados fue el siguiente:

menos de 10% de uso de PDC en la prueba del cilindro, menos de 8 pasos en la prueba de

pasos de ajuste y al menos 100 vueltas contralaterales o ipsilaterales en las pruebas de


41

apomorfina y anfetamina respectivamente. Aquellos animales que no cumplieron con

alguno de los criterios anteriores fueron excluidos de los experimentos subsiguientes.

Figura 11: Selección de los animales correctamente desnervados mediante pruebas no farmacológicas (a,b) y farmacológicas (c, los valores negativos corresponden a vueltas hacia la izquierda mientras que los valores positivos corresponden a vueltas hacia la derecha). Confirmación post-mortem del grado de desnervación nigroestriatal mediante inmunohistoquímica para TH (d). (Prueba de T para muestras pareadas, *p<0,05). Media ± S.E.M.

Los resultados mostraron que una dosis de sch-23390 de 0,01 mg/kg fue capaz de

disminuir el nivel de disquinesias inducidas por L-dopa y además, provocó una

disminución de la conducta rotatoria. Los mismos resultados se obtuvieron con dosis

mayores a 0,01 mg/kg (Figura 12). Mediante la evaluación del grado de reversión de la

aquinesia de la PDC (indicador de beneficio terapéutico) observamos que la menor dosis

capaz de disminuir el grado de disquinesias también redujo el porcentaje de uso de la PDC

con respecto al obtenido con vehículo, sin embargo, este efecto no fue observado con las

dosis mayores de antagonista D1. A diferencia de lo observado con el antagonista D1, el

raclopride no produjo cambios significativos en el nivel de disquinesias o rotaciones

contralaterales inducidas por L-dopa en ninguna de las dosis evaluadas (Figura 12).


42

Figura 12: Efecto de antagonistas dopaminérgicos D1 y D2 sobre las disquinesias inducidas por L-dopa (a,b), efecto terapéutico de la misma (c,d) y conducta rotatoria (e,f) en animales con lesión severa nigroestriatal. ANOVA de medidas repetidas, (* p<0,05). Media ± S.E.M.

Mariano Saborido - Capítulo I - Discusión

43

II II II ..44.. DDIISSCCUUSSIIÓÓNN CCAAPPÍÍTTUULLOO II

En la primera parte de esta tesis estudiamos la participación funcional de los

receptores dopaminérgicos D1 y D2 en el desarrollo de DIL mediante la evaluación de los

efectos de distintos antagonistas.

Nuestros resultados muestran que:

Dosis iguales o mayores a 0,01 mg/Kg de sch-23390 fueron capaces de disminuir el

nivel de DIL y, además, provocaron una disminución de la conducta rotatoria,

La menor dosis capaz de disminuir el grado de disquinesias también redujo el

porcentaje de uso de la PDC con respecto al obtenido con vehículo, sin embargo, este

efecto no fue observado con las dosis mayores de antagonista D1,

Raclopride no produjo cambios significativos en el nivel de disquinesias, rotaciones

contralaterales o uso de la PDC en ninguna de las dosis evaluadas.

Como describimos en la Introducción de esta primera parte de la tesis, la DA

modula la señalización glutamatérgica proveniente de la corteza a través de los receptores

D1 y D2 localizados en las neuronas de la vías estríofugales directa e indirecta

respectivamente (Le Moine y col., 1995). Además, existe fuerte evidencia que demuestra

alteraciones en la vía de señalización mediada por el receptor D1 en pacientes y en modelos

animales que desarrollaron DIL (Cenci y col., 1998; Berke y col., 1998; Picconi y col.,

2003; Aubert y col., 2005). Estas alteraciones comprenden una mayor sensibilidad de los

receptores D1 (Aubert y col., 2005) y de la cascada intracelular corriente abajo de éste

(Picconi y col., 2003; Corvol y col., 2004; Aubert y col., 2005; Santini y col., 2007),

alteraciones en la distribución del receptor (Guigoni y col., 2007; Berthet y col., 2009) y el

cambio a cascadas de señalización usualmente no asociadas a este receptor (Gerfen y col.,

2002; Bezard y col., 2005; Santini y col., 2007; Westin y col., 2007).

En nuestro intento por entender mejor la serie de cambios intracelulares

quesubyacen al desarrollo y expresión de las disquinesias observamos que es posible

disminuir los niveles de estas mediante la administración de un antagonista D1. A su vez,

observamos que esta disminución en las DIL es acompañada por una disminución en la


44

conducta rotatoria de los animales. Esto nos lleva a pensar que el efecto antidisquinético

observado es un fenómeno secundario a una inhibición generalizada de la actividad motora

y no a un efecto selectivo sobre los sustratos disquinetogénicos. Contrariamente a esto, no

observamos una disminución en el uso de la PDC a dosis mayores a 0,1 mg/Kg de sch-

23390 como esperaríamos como resultado de una inhibición motora general. Esto podría

deberse a una sobrestimación de las veces que el animal apoya su PDC sobre la pared del

cilindro al ser confundida con movimientos disquinéticos del miembro anterior. En otras

palabras, en ciertos casos es imposible distinguir movimientos voluntarios de aquellos que

no lo son dado que son de naturaleza muy similar.

Diversos estudios se han realizado para evaluar el efecto de antagonistas de los

receptores D2 sobre la aparición de DIL. En algunos de ellos se observó algún efecto, pero

siempre de menor magnitud que los observados con antagonistas D1 (Montville y col.,

2005; Taylor y col., 2005; Kumar y col., 2009). Es necesario destacar que en algunos de los

ensayos realizados por otros autores, la administración de L-dopa fue reducida a solo dos

veces por semana de manera de no inducir DIL demasiado severas (Montville y col., 2005)

por lo que consideramos que este hecho pudo haber influido en la observación de algún

efecto reductor de DIL, y, en otros casos (Taylor y col., 2005), los autores no evaluaron la

conducta rotatoria de los animales ni el grado de reversión de la aquinesia de la PDC de

modo alguno. En nuestro caso, es posible que no hayamos observado efecto alguno del

antagonista D2 debido a que las dosis utilizadas hayan sido muy bajas e insuficientes.

Por todo lo dicho y lo observado en la literatura, consideramos que no es posible

disociar, al menos mediante la administración de antagonistas dopaminérgicos, el efecto

terapéutico de la L-dopa del efecto disquinético de esta. Entendemos que estos dos aspectos

del tratamiento con L-dopa necesariamente son fenómenos estrechamente relacionados,

dado el carácter de paso iniciador que tiene la participación de un receptor en una vía de

señalización intracelular. Dicho de otro modo, la interacción entre un ligando y su receptor

es el paso primordial que luego, intracelularmente, puede dar lugar a efectos diversos.

Estos resultados sugieren que los efectos motores adversos de la L-dopa estarían

íntimamente ligados a los efectos benéficos de la misma y, por ende, es difícil su

disociación, al menos mediante la administración de antagonistas dopaminérgicos.


45

Asimismo, la no observación de efectos ante la administración de raclopride avalaría una

participación preponderante de los receptores D1 en la manifestación de DIL. Sin embargo,

no podemos descartar la necesidad de utilizar dosis mayores del antagonista D2 para la

manifestación de los efectos a nivel motor.

CAPÍTULO II

Mariano Saborido - Capítulo II - Introducción

46

IIVV..11.. IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN CCAAPPÍÍTTUULLOO II II

Estudio de la participación de las vías mediadas por mTOR y Fyn en el desarrollo de

disquinesias inducidas por L-dopa

Actualmente existe consenso respecto a que la aparición de disquinesias involucra

profundos y persistentes cambios moleculares en el estriado (Calabresi y col., 2000). Tal es

así que si se suspende un tratamiento crónico con agonistas dopaminérgicos directos o

indirectos que originaron disquinesias, semanas o meses más tarde una única nueva

exposición a un agonista puede desarrollar disquinesias (Delfino y col., 2004). En roedores

con lesión nigroestriatal severa, las disquinesias inducidas por el tratamiento crónico con L-

dopa tienen mayor correlación con cambios en la expresión de genes en neuronas estriatales

que con marcadores de la desnervación dopaminérgica presináptica, como el número de

neuronas dopaminérgicas remanentes o la densidad de DA estriatal (Lee, 2000; Cenci,

2002; Winkler, 2002). Entre los cambios postsinápticos examinados hasta el momento, la

expresión estriatal del ARNm de prodinorfina y de los factores de transcripción

FosB/ΔFosB se encuentran fuertemente correlacionados con la severidad de las

disquinesias (Cenci, 1998; Anderson, 1999; Winkler, 2002; Lundblad, 2004; Sgambato-

Faure, 2005; Pavón, 2006). Los mecanismos intracelulares responsables de la sobre

expresión de FosB/ΔFosB (y secundariamente de prodinorfina) en el estriado desnervado

no han sido dilucidados, pero diferentes líneas de investigación sugieren la participación de

una vía de señalización a través del receptor D1 sobre-activada (Picconi, 2003; Konradi,

2004; Aubert, 2005). Además de alterar la expresión génica en neuronas estriatales, la sobre

activación de la vía de señalización mediada por el receptor D1 afecta también la potencia

de las sinapsis glutamatérgicas corticoestriatales. Estas sinapsis sufren cambios

dependientes de la actividad sináptica que son claves para el aprendizaje y almacenamiento

de conductas adaptativas y maladaptativas (revisado por Calabresi y col., 1996; Gerdeman,

2003a) incluyendo a las disquinesias (Chase and Oh, 2000; Picconi, 2003). Las sinapsis

glutamatérgicas córticoestriatales son pasibles de sufrir potenciación de largo plazo (LTP)


47

dependiente de la activación de receptores NMDA (Calabresi y col., 1992). Esta forma de

LTP córticoestriatal requiere de la presencia de DA y de la activación de receptores D1/D5

y no puede ser inducida en rodajas de cerebro de ratas que sufrieron una lesión de la vía

nigroestriatal (Centonze y col., 1999). La administración crónica de L-dopa provoca una

recuperación de la capacidad de inducir LTP en rodajas de cerebro (Picconi y col., 2003).

En ratas con lesión nigroestriatal en las que el tratamiento con L-dopa indujo disquinesias,

la capacidad para inducir LTP fue restablecida, pero la capacidad de inducir depotenciación

sináptica (revertir la LTP) resultó estar abolida (Picconi y col., 2003). También se ha

observado que la estimulación de receptores D1/D5 inhibe la depotenciación de la

transmisión córticoestriatal a través de un mecanismo que involucra la inhibición de la

fosfatasa de proteínas 1 (PP-1) (Picconi et al, 2003), enzima que es esencial para procesos

de depotenciación en el hipocampo (revisado por Malenka y Bear, 2004).

En los fenómenos de potenciación y depresión de la actividad sináptica se

reconocen una fase de inducción, una fase temprana y otra tardía. La fase de inducción

típicamente involucra receptores para glutamato y activación de proteín-quinasas. Los

resultados resumidos anteriormente sugieren alteraciones en las fases de inducción de la

LTP y de la depotenciación en las disquinesias. Por lo tanto, la falta de depotenciación

podría llevar a una “saturación” de sinapsis córticoestriatales por excesiva LTP que debería

verse reflejada en incrementos de los factores involucrados en distintas fases de sostén de la

LTP.

La pérdida de las neuronas de la vía nigroestriada se encuentra acompañada de

modificaciones en la respuesta de las neuronas espinosas estriofugales (MSN, del inglés:

medium spiny neurons) a drogas que modulan la señalización dopaminérgica, incluyendo a

la L-dopa (Guigoni y col., 2005; Cenci, 2007; Santini y col., 2008). Entre estos cambios se

encuentra la activación de ERK 1 y ERK 2 (Gerfen y col., 2002; Pavón y col., 2006;

Santini y col., 2007; Westin y col., 2007), que están involucradas en varios tipos de

plasticidad sináptica (Thomas y Huganir, 2004). La activación persistente de ERK en las

MSN estriatales provoca el desarrollo de disquinesias, lo que limita el uso de la L-dopa

como terapia antiparkinsoniana (Thomas y Huganir, 2004; Santini y col., 2007; Westin y


48

col., 2007). Es por esto que el desarrollo de estrategias para interferir con la maquinaria de

señalización mediada por ERK es de gran interés para el diseño de nuevas terapias.

Numerosas evidencias señalan a ERK como partícipe importante en la activación

del blanco en mamíferos para rapamicina, mTOR, un regulador clave en la síntesis de

proteínas (Costa-Mattioli y col., 2009). mTOR regula la traducción luego de la formación

de un complejo llamado mTORC1, formado por mTOR y la proteína adaptadora sensible a

rapamicina, Raptor (Costa-Mattioli y col., 2009). En el hipocampo, la vía de señalización

mediada por mTORC1 se encuentra implicada en el desarrollo de la fase tardía de la LTP, a

través de una mayor actividad de la maquinaria de traducción dendrítica (Tang y col., 2002;

Tsokas y col., 2005).

Todo esto nos permite suponer que el tratamiento con L-dopa provoca cambios en la

vía mediada por mTOR que en última instancia seria, al menos en parte, responsable del

desarrollo de DIL.

Por otro lado, un trabajo de nuestro laboratorio demostró un aumento en la

expresión de ARNm relacionados con diferentes cascadas de señalización en ratas con

lesión nigroestriatal tratadas durante 6 meses con L-dopa (Ferrario y col., 2004). Entre

ellos, centramos nuestra atención en un neuropéptido llamado Pleiotrofina (PTN), el cual es

expresado en el estriado exclusivamente en algunos tipos de interneuronas (Taravini y col.,

2005) y sobre-expresado en las interneuronas colinérgicas como consecuencia de la

desnervación dopaminérgica (Salin y col., 2009). Resulta interesante destacar que el

receptor de PTN, RPTP-ζ/く, se expresa en las neuronas GABAérgicas estríofugales y es

sobre-expresado como resultado del tratamiento con L-dopa en animales con lesión de la

vía nigroestriatal a dosis capaces de inducir disquinesias (Ferrario y col., 2008). RPTP-ζ/く

forma parte del complejo post-sináptico donde interactúa fuertemente con PSD95

(Kawaguchi y col., 1999) y regula Fyn (Pariser y col., 2005b), く-aducina (Pariser y col.,

2005a) y く-catenina (Meng y col., 2000) entre otras, todas moléculas relacionadas con la

estabilidad y reestructuración del citoesqueleto (Shapiro y Weis, 2009).

Fyn es una proteína citoplasmática que pertenece a la familia de quinasas de tirosina

y se encuentra concentrada en la fracción de densidad post-sináptica. Además, ha sido


49

asociada con los procesos de formación de memoria, aprendizaje y LTP (Kawachi y col.,

1999). En todos los casos las funciones atribuidas a Fyn son ejercidas a través de la

regulación del receptor NMDA mediante la fosforilación en tirosina de las subunidades

NR2A y NR2B (Yagi, 1999). Es interesante resaltar que estos procesos también han sido

asociados al desarrollo de disquinesias (Jenner, 2008). Asimismo, Fyn es determinante en

la redistribución subcelular de los receptores NMDA que ocurre en el estriado desnervado

frente al tratamiento con L-dopa (Dunah, 2004). PSD95 forma parte del mecanismo de

señalización intracelular mediado por el receptor D1 (Zhang y col., 2007), y su expresión

está aumentada por el tratamiento con L-dopa en animales lesionados con 6-OHDA (Nash

y col., 2005). Estas evidencias sugieren que la vía RPTP-ζ/く/Fyn podría estar asociada al

desarrollo de DIL, no obstante, las cascadas de señalización que las conectan y su

contribución al desarrollo de las DIL no han sido establecidas.

El capítulo II de esta tesis comprende los experimentos realizados con el objetivo de

evaluar la participación de las vías intracelulares mediadas por mTOR y Fyn en el

desarrollo de las DIL.

Mariano Saborido – Capítulo II - Metodología

50

IIVV..22.. MMEETTOODDOOLLOOGGÍÍAA CCAAPPÍÍTTUULLOO II II

i. Animales

Se utilizaron ratas Wistar macho (Bioterio Central, Facultad de Ciencias Exactas y

Naturales, Universidad de Buenos Aires) con un peso aproximado de 220 gramos al inicio

de los experimentos. Se alojaron 4 animales por jaula con libre acceso a comida y bebida en

una sala con temperatura controlada (22 ± 2º C), una humedad relativa de 55 ± 15% y un

ciclo de luz/oscuridad de 12 horas de acuerdo con las regulaciones locales (SENASA,

Argentina). Los procedimientos que requirieron el uso de animales se realizaron conforme

a las normativas de la comisión local y la Guía para el Cuidado y uso de los Animales de

Laboratorio (Publicación Nº 80-23/96, National Institute of Health, NIH, USA).

ii. Cirugía estereotáxica

Los animales sometidos a cirugía estereotáxica fueron anestesiados mediante la

inyección i.p. de Ketamina (40 mg/Kg, Ketamina 50, Holliday Scott, Argentina) y Xilazina

(10 mg/Kg, Kensol, König, Argentina). Asimismo, para prevenir cualquier tipo de

infección, los animales sometidos al implante de cánulas guía recibieron dos

administraciones de penicilina G/dihidroestreptomicina (Fort-E-Pen, Brouwer, Argentina)

48 horas antes y 24 horas después del procedimiento quirúrgico.

Luego de la cirugía se colocó a los animales sobre una almohadilla térmica para

evitar la hipotermia hasta que se recuperaron completamente de la anestesia.

1. Lesión severa de la vía nigroestriada

La denervación severa de la vía nigroestriada se realizó de igual manera a lo

descripto en el capítulo I.

Además, un grupo de animales recibió una inyección intracerebral de ácido

ascórbico en lugar de 6-OHDA (animales con lesión simulada de la vía nigroestriada,

Sham).


51

2. Implante de cánulas guía y administración intracerebral de drogas

Se construyeron cánulas guía de 12 mm de longitud a partir de agujas 22 G. Las

cánulas guía se implantaron en el estriado dorsolateral o en el ventrículo cerebral izquierdo

y se fijaron al cráneo mediante tornillos y acrílico dental. Las coordenadas utilizadas para el

posicionamiento de la cánula según el atlas de Paxinos y Watson fueron: estriado

dorsolateral: anterior 1,3 mm; lateral: 3,3 mm; ventral (desde duramadre): 2,9 mm;

ventrículo: anterior 0,4 mm; lateral 1,2 mm; ventral 2,9 mm (desde duramadre). Estas

coordenadas fueron elegidas luego de realizar una serie de ensayos con el objetivo de

evaluar el mejor posicionamiento de las cánulas según se muestra en la tabla 1. De manera

de evitar la obstrucción de las cánulas se les colocó un estilete de su misma longitud el cual

fue retirado al momento de la infusión de la droga y vuelto a colocar al finalizar la misma.

La correcta posición de la cánula fue corroborada mediante la observación del trazo

generado por la misma en cortes coronales de cerebro teñidos con violeta de cresilo (figura

13).

Coordenadas (mm) AP LT DV

Estriado Sitio 1 +1,0 +3,3 -3,3*

Estriado Sitio 2 +1,0 +3,3 -2,96■

Estriado Sitio 3 +1,3 +3,3 -2,9■

Ventrículo Sitio 1 +0,2 +1,2 -2,6■

Ventrículo Sitio 2 +0,4 +1,2 -2,6■

Tabla 1: Coordenadas evaluadas para el implante intracerebral de cánulas guía. * desde el cráneo; ■ desde la duramadre. Las coordenadas seleccionadas se encuentran

resaltadas.

Figura 13: Verificación del sitio de canulación por observación macroscópica de secciones histológicas coloreadas con violeta de cresilo. El diagrama de la izquierda indica la coordenada de inyección (círculo rojo, plano coronal estereotáxico

0,15 mm anteriores al bregma, Paxinos y Watson, 1986). En la fotografía de la derecha se visualiza la zona donde se posicionó la cánula.


52

iii. Pruebas comportamentales

A excepción de la PPA, se realizaron las mismas pruebas comportamentales

presentadas en el capítulo anterior. Es necesario aclarar que la evaluación de las DIL y de la

conducta rotatoria en los experimentos de sensibilización con apomorfina, a diferencia de

lo realizado en los experimentos donde se utilizó L-dopa, fue realizada durante 40 minutos,

esto se debe a la menor vida plasmática de la apomorfina. Además cabe destacar que en

esta serie de experimentos los animales correctamente desnervados fueron seleccionados

únicamente mediante la PC. Las pruebas farmacológicas con anfetamina y apomorfina no

fueron realizadas para evitar efectos de sensibilización postsinápticos (Delfino y col., 2004)

que pudieran interferir en la interpretación de los resultados.

iv. Tratamiento farmacológico

La administración de L-dopa (Lebocar, levodopa-carbidopa 250/50, Pfizer, Argentina)

comenzó a los 21 días posteriores a la lesión estereotáxica con 6-OHDA. La dosis utilizada

de L-dopa fue 50 mg/kg de acuerdo a estudios previos en nuestro laboratorio (Larramendy

y col., 2008), excepto en los experimentos en los que se intentó interferir con el desarrollo

de DIL donde la dosis de L-dopa utilizada fue 25 mg/kg. Cabe destacar que la disolución de

la misma fue realizada con agua corriente y la administración fue intragástrica (gavage

gástrico), de manera de remedar lo que ocurre en la clínica. En los experimentos donde se

utilizó apomorfina como agente inductor de disquinesias las dosis utilizadas fueron: 0,025

mg/kg en las sesiones de sensibilización y 0,05 mg/kg en el día 4 de administración. Los

esquemas de administración utilizados en los ensayos de sensibilización con L-dopa o

apomorfina se muestran en la Figura 14.


53

Figura 14: Esquema de administración utilizado en los experimentos de interferencia sobre el

período de sensibilización. Tres semanas después de la lesión con 6-OHDA los animales son

sometidos a la PC con el objetivo de seleccionar los correctamente lesionados. Los animales

seleccionados recibieron tres dosis de L-dopa (25 mg/kg) o apomorfina (0,025 mg/kg), una cada 48

horas. Dos días después, día 28, recibieron una última dosis de L-dopa (25 mg/kg) o apomorfina

(0,05 mg/kg). La evaluación conductual (PC, DIL y conducta rotatoria) de los animales se realizó

en cada sesión de administración.

Para evaluar la dosis a utilizar de anisomicina (Sigma-Aldrich, USA), un inhibidor

de la síntesis proteica, se tuvo en cuenta que en animales con lesión de la vía nigroestriada,

la administración de agonistas de los receptores D1 induce la expresión del factor de

transcripción c-Fos en el estriado desnervado. Por lo tanto se realizaron dos inyecciones

estereotáxicas de 80 μg de anisomicina en el estriado desnervado (coordenadas: anterior 0,6

mm; lateral: 3,0 mm; ventral: 4,0 mm y 5,5 mm). Quince minutos después se administró el

agonista D1 SKF-38393 (5mg/Kg; i.p., Sigma-Aldrich, USA). Luego de una hora los

animales fueron perfundidos intracardíacamente con PFA 4 %, se removió el cerebro y se

cortó en un micrótomo de congelación. Finalmente se realizó la inmunohistoquímica para

c-Fos en cortes coronales de estriado con el fin de evaluar el grado de inhibición de la

expresión de esta proteína.

La dosis de anisomicina inyectada por vía intraestriatal en los experimentos

destinados a interferir con el desarrollo de disquinesias fue de 160 µg (1,6 µl de una

solución 100 µg/µl a una velocidad de 0,5 µl/min). En los experimentos realizados para

evaluar el papel de la vía mediada por mTOR en el desarrollo de disquinesias se


54

administraron intraestriatalmente, a través de cánulas guía previamente posicionadas, 0,5 µl

de las siguientes soluciones de rapamicina (Cell signaling, USA): 30 nM, 60 nM, 120 nM y

10 µM. En el experimento donde se administró rapamicina por la vía

intracerebroventricular, se inyectaron 2,5 µl de una solución 10 µM de la misma a una

velocidad de 2,5 µl/min.

v. Inmunoprecipitación y Western blot

1. Obtención del tejido

Con el objeto de preparar extractos proteicos de cuerpo estriado se adormeció

levemente a los animales en una atmósfera de CO2 y se procedió a la decapitación de los

mismos. Se removió rápidamente el cerebro y se disecó el cuerpo estriado. El tejido se

homogenizó a 4º C en una solución Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, Tritón X-100 1%,

SDS 0,05% (del inglés sodium dodecyl sulfate) y EDTA 2 mM conteniendo además una

mezcla de inhibidores de proteasas (Aprotinina 1 µg/ml, Leupeptina 1 µg/ml, Pepstatina 1

µg/ml, PMSF 100 µg/ml) y el inhibidor de fosfatasas Metavanadato de sodio 100 mM. La

concentración de proteínas totales en el homogenato se determinó mediante el método de

Bradford (Bradford, 1976).

2. Inmunoprecipitación de Fyn

Se incubó una solución conteniendo 500 µg de proteínas totales con 2 µg de

antisuero dirigido contra la proteína Fyn (sc-16, Santa Cruz Biotechnology, USA) en un

volumen final de 500 µl en un agitador rotatorio a 4º C, ON. A continuación se agregaron

20 µl de proteína A-agarosa (Santa Cruz Biotechnology, USA) y se volvió a incubar la

mezcla de la misma manera que en el procedimiento anterior. Posteriormente, la mezcla fue

centrifugada durante 5 minutos a 4º C a 2000 g y el sobrenadante obtenido fue descartado

mientras que el precipitado fue lavado con una solución Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150

nM, Tritón X-100 1%, SDS 0,05% y EDTA 2 mM. Este procedimiento se repitió un total

de 3 veces. Finalmente, se resuspendió el inmunoprecipitado en 40 µl de buffer de siembra

para electroforesis (Tris 62,5 mM (pH 6,8), glicerol β0%, SDS β%, く-Mercaptoetanol 5%)

y se reservó a -70° C hasta el momento de su uso.


55

3. Separación electroforética e inmunodetección

Las proteínas fueron separadas electroforéticamente en un gel de poliacrilamida

12% en condiciones reductoras con SDS y luego fueron transferidas a una membrana de

nitrocelulosa (Hybond-ECL, Amersham Biosciences, UK). Una vez finalizada la

transferencia de las proteínas se lavó la membrana con buffer Tris 0,1 M, NaCl 0,15 M

(TBS, del inglés Tris-buffered saline), Tween-20 0,1% y se incubó con una solución de

bloqueo TBS Tween-20 0,1%, leche libre de grasas 5% durante 1 hora a temperatura

ambiente y agitación. A continuación, se incubó la membrana con los diferentes antisueros

diluidos en la misma solución utilizada para el bloqueo de los sitios inespecíficos a 4º C,

ON en agitación. Luego se lavó la membrana en TBS 0,1 M y posteriormente se incubó con

un anticuerpo anti-IgG conjugado con peroxidasa (dilución 1:4000, Cell Signaling

Technology, USA) durante 2 horas a temperatura ambiente. El revelado se realizó mediante

el uso de un reactivo quimioluminiscente de acuerdo a un procedimiento estándar (ECL,

Amersham Biosciences, UK).

Anticuerpos primarios utilizados:

- Mouse anti-phospho-Tyr, anticuerpo monoclonal (1:500, Millipore, USA)

- Rabbit anti-Fyn, anticuerpo policlonal (1:500, Santa Cruz Biotechnology, USA)

- Rabbit anti-FosB, anticuerpo policlonal (1:2000, Santa Cruz Biotechnology, USA)

- Rabbit anti-phopho-p70S6K, anticuerpo policlonal (1:2000, Santa Cruz Biotechnology,

USA)

- Rabbit anti-actin, anticuerpo policlonal (1:2000, Sigma-Aldrich, USA).

vi. Análisis histológico

1. Obtención y preparación del tejido

Para obtener el tejido sobre el cual se realizaron las determinaciones

inmunohistoquímicas los animales se anestesiaron con Ketamina (40 mg/Kg, Ketamina 50,

Holliday Scott, Argentina) y Xilazina (10 mg/Kg, Kensol, König, Argentina) y se

perfundieron transcardíacamente con solución fisiológica heparinizada fría (NaCl 0,9%,

1000 UI heparina/litro), seguida por PFA 4% en PB 0,1 M (pH 7,4). El cerebro se removió


56

y post-fijó por inmersión en la misma solución fijadora durante 30 minutos, luego

permaneció en solución criopreservadora sacarosa 30% en PB 0,1 M a 4º C hasta su

procesamiento. Posteriormente, se realizaron cortes del cuerpo estriado y la SNpc en

micrótomo de congelación. Se realizó un muestreo seriado obteniendo secciones coronales

de 25 µm de espesor a nivel estriatal y 40 µm de espesor a nivel mecensefálico. El tejido

permaneció a 4°C en una solución conservadora de azida de sodio 0,1% en PBS 0,1 M.

2. Técnica de Nissl con violeta de cresilo

El violeta de cresilo es un colorante básico que interacciona con los ácidos

nucleicos y se utiliza para la tinción del núcleo celular y la visualización de los cuerpos de

Nissl en el citoplasma de las neuronas (retículo endoplasmático rugoso) (Finn Geneser, 3º

Ed. Capítulo 14, Tejido nervioso).

La tinción se realizó sobre secciones histológicas previamente dispuestas sobre

portaobjetos. Las mismas se incubaron en etanol 70% y luego en violeta de cresilo 0,8%

(Sigma, USA) por 5-10 minutos. Posteriormente se realizó la diferenciación por inmersión

en etanol 96%, se deshidrataron por pasajes sucesivos en etanol 96% y 100%, se aclararon

en xilol 100% y se cubrieron con bálsamo sintético.

3. Inmunohistoquímica de TH y c-Fos

A lo largo de toda la determinación se utilizó PBS-T 0,15% como buffer de lavado y

como buffer de dilución de todos los reactivos. Entre todas las incubaciones con

anticuerpos y reactivos se realizaron lavados con dicho buffer. Secciones coronales de

tejido libre en solución se incubaron en H2O2 0,3% por 30 minutos para inhibir la

peroxidasa endógena y luego en NGS 2% por 30 minutos para disminuir las reacciones de

unión inespecífica. Seguidamente el tejido se incubó en presencia del antisuero primario

ON a 4° C y posteriormente se expuso a un anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con

biotina (dilución 1:250, Vector Laboratories, USA) por 2 horas a temperatura ambiente. La

presencia del anticuerpo primario se visualizó por incubación con el complejo avidina-

biotina-peroxidasa (dilución 1:125, Vectastain, Vector Laboratories, USA) el cual se reveló

con γ,γ’-diaminobenzidina 0,5 mg/ml (DAB, Sigma, USA), H2O2 0,015% en Tris 0,1 M

(pH 7,4). Las secciones se montaron sobre portaobjetos gelatinizados, se deshidrataron por


57

pasajes sucesivos en soluciones de concentración creciente de etanol y finalmente xilol y se

cubrieron con medio de montaje en base a xilol (PMYR, Argentina).

Anticuerpos primarios utilizados:

- Rabbit anti-TH, anticuerpo policlonal (1:2000, Pel freez, USA)

- Rabbit anti-c-Fos, anticuerpo policlonal (1:2000, Santa Cruz Biotechnology, USA)

vii. Análisis estadístico

Se utilizó el paquete estadístico GraphPad Prism versión 5.00 para Windows.

(GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com). En todos los casos

un valor de p<0,05 se consideró estadísticamente significativo.

En los experimentos que se listan a continuación se realizó ANOVA de 2 vías,

seguido por test a posteriori de Bonferroni:

Caracterización comportamental del modelo de DIL

Evaluación de los niveles estriatales de FosB/∆FosB mediante western blot

Evaluación de los niveles de p-p70S6K mediante western blot

Evaluación de los niveles de Fyn mediante western blot

Evaluación de los niveles de p-Fyn mediante western blot

En los siguientes experimentos se realizó ANOVA de 1 vía:

Efectos de la administración intraestriatal de rapamicina

Cuantificación de neuronas PTN inmunoreactivas en el estriado dorsolateral

Se realizó prueba de T para muestras independientes en los siguientes casos:

Caracterización comportamental del protocolo de sensibilización con

apomorfina

Efecto de la inhibición intraestriatal de la síntesis proteica sobre el desarrollo

de disquinesias

Caracterización comportamental del protocolo de sensibilización con L-dopa

Efectos de la administración intracerebroventricular de rapamicina.

http://www.graphpad.com/

Mariano Saborido - Capítulo II - Resultados

58

IIVV..33.. RREESSUULLTTAADDOOSS CCAAPPÍÍTTUULLOO II II

i. Caracterización comportamental y molecular del modelo de disquinesias inducidas por L-dopa.

Según lo detallado en el apartado Metodología de este capítulo, se llevó a cabo una

serie de experiencias con el objetivo de validar conductual y molecularmente el modelo

sobre el que se pusieron a prueba las hipótesis planteadas en esta segunda parte de la tesis.

Para esto, animales severamente desnervados y aquellos con lesión simulada (Sham) fueron

distribuidos al azar y sometidos a un tratamiento de 10 días con L-dopa o vehículo, dando

lugar entonces a cuatro grupos experimentales: 1) Sham + Vehículo, n=11; 2) Sham + L-

dopa, n=19; 3) Lesión + Vehículo, n=21; y 4) Lesión + L-dopa, n=29. Los parámetros

comportamentales (aquinesia de la PDC, conducta rotatoria y disquinesias) fueron

evaluados los días 2, 4, 6, 8 y 10 de tratamiento. Cabe destacar que la evaluación de la

aquinesia de la PDC además fue realizada previa y posteriormente a la inyección

estereotáxica de 6-OHDA. En el día 11, los animales recibieron una última administración

de L-dopa o vehículo, según corresponda, y 30 minutos después fueron sacrificados. La

mitad de los animales se perfundieron con PFA 4% y el cerebro se extrajo y procesó para

posterior análisis histológico mientras que el resto de los animales fue sacrificado, el

cerebro se extrajo inmediatamente y el estriado se disecó y reservó para su posterior

análisis mediante western blot.

Como esperábamos, sólo los animales lesionados con 6-OHDA mostraron un uso

disminuido de la PDC, el cual sólo fue revertido en aquellos que fueron tratados con L-

dopa (Figura 15 b, b´). Asimismo, se observó un claro efecto disquinetogénico únicamente

en el grupo de animales con desnervación severa nigroestriatal tratados con L-dopa (Figura

15 a, a´). Además, en este grupo experimental, a diferencia de lo observado en el resto de

los grupos, también fue evidente un aumento de la conducta rotatoria (Figura 15 c, c´).


59

Figura 15: Caracterización comportamental del modelo de DIL. (a,a ) desarrollo de disquinesias durante y al final del tratamiento. (b,b´) evaluación de la aquinesia de PDC mediante la PC durante y al final del tratamiento. (c,c ) desarrollo de la conducta rotatoria durante y al final del tratamiento. (ANOVA 2 vías, seguido por test a posteriori de Bonferroni, *p<0,05. Media ± S.E.M.).


60

Una vez caracterizado el aspecto comportamental del modelo de DIL, evaluamos si

este también presentaba los rasgos moleculares que han sido fuertemente asociados al

fenómeno disquinético. Por lo tanto, decidimos evaluar los niveles estriatales de la proteína

FosB/∆FosB en cada uno de los grupos experimentales mediante western blot. Pudimos

observar que, conforme a la literatura (Andersson y col., 1999; Pavón y col., 2006), los

niveles de FosB/∆FosB se encontraron aumentados en el estriado de ratas que desarrollaron

disquinesias con respecto a los demás grupos experimentales (Figura 16).

De acuerdo a estos resultados podemos concluir que nuestro modelo experimental

representa fidedignamente las características comportamentales y moleculares que han sido

asociadas a las DIL.

Figura 16: Evaluación de los niveles estriatales de FosB/∆FosB mediante western blot. El gráfico de barras representa la cuantificación de las bandas obtenidas para cada grupo experimental que se muestran en el panel inferior. (ANOVA 2 vías, seguido por test a posteriori de Bonferroni, *p<0,05. Media ± S.E.M.).


61

ii. Análisis de la participación de la vía mediada por mTOR en el desarrollo de

disquinesias inducidas por L-dopa.

1. Participación de la síntesis proteica estriatal en el desarrollo de disquinesias

inducidas por L-dopa.

En una primera instancia fue necesario desarrollar un protocolo de sensibilización que

permitiera interferir con los mecanismos moleculares que podrían estar involucrados en la

generación de disquinesias. En esta etapa decidimos trabajar con apomorfina como agente

inductor de disquinesias en lugar de L-dopa ya que es sabido que esta última es muy

variable en cuanto al nivel de disquinesias que induce en los animales. Luego de realizar

una serie de ensayos con diferentes protocolos de sensibilización elegimos el siguiente: un

mes después de la lesión con 6-OHDA los animales se separaron en dos grupos: 1)

Sensibilización y 2) No sensibilización. Los animales recibieron apomorfina en una dosis

de 0,025 mg/kg (grupo sensibilización) o vehículo (no sensibilización) cada 48 horas un

total de 3 veces (etapa de sensibilización). Dos días después ambos grupos experimentales

recibieron 0.05 mg/kg de apomorfina y se evaluó el nivel de disquinesias alcanzado. Este

protocolo de sensibilización nos permitió observar diferencias en el grado de disquinesias

alcanzado entre ambos grupos experimentales en un período corto de tiempo (Figura 17 a,

a ). Además, pudimos observar diferencias significativas en el porcentaje de uso de la PDC

(Figura 17 b, b ) y en la conducta rotatoria entre ambos grupos experimentales (Figura 17 c,

c´).


62

Figura 17: Caracterización comportamental del protocolo de sensibilización con apomorfina. (a,a ) severidad de disquinesias desarrolladas durante y al final del tratamiento. (b,b´) evaluación de la aquinesia de PDC mediante la PC durante y al final del tratamiento. (c,c ) desarrollo de la conducta rotatoria durante y al final del tratamiento. (Prueba de T para muestras independientes, *p<0,05. Media ± S.E.M.).


63

Teniendo en cuenta los antecedentes mencionados en la Introducción de esta segunda

parte de la tesis, decidimos que como primera aproximación para modular la expresión de

disquinesias debíamos evaluar la participación de la síntesis estriatal de proteínas. Para esto

utilizamos el agente inhibidor de la síntesis proteica anisomicina. Por lo tanto, una vez

obtenido el protocolo de sensibilización adecuado nos propusimos determinar la dosis de

anisomicina a utilizar. Es sabido que en animales con lesión de la vía nigroestriada, la

administración de agonistas de los receptores D1 induce la expresión del factor de

transcripción c-Fos en el estriado desnervado. Teniendo en cuenta esto, evaluamos la dosis

de anisomicina a utilizar mediante el grado de inhibición de la expresión de c-Fos inducida

por la administración del agonista dopaminérgico D1 SKF-38393, mediante

inmunohistoquímica para este factor de transcripción. Pudimos observar, de acuerdo a lo

esperado, que el agonista D1 SKF-38393 indujo la expresión de c-Fos únicamente en el

estriado lesionado (Figura 18 a, a´ y b, b´). A diferencia de lo observado con la

administración de vehículo, la administración de anisomicina 15 minutos antes de la

administración de SKF-38393, fue capaz de inhibir la expresión de c-Fos inducida por éste

en el área alcanzada por la difusión del inhibidor de la síntesis proteica (Figura 18 c, c´ y d,

d´).

Figura 18: Detección colorimétrica de c-Fos para la evaluación de la dosis de anisomicina sobre secciones histológicas de animales inyectados intraestriatalmente con vehículo (a,b) o con anisomicina (c,d). (a´, b´, c´y d´) muestran a mayor aumento los recuadros en (a, b, c y d).


64

Luego de poner a punto el protocolo de sensibilización con apomorfina y la dosis de

anisomicina a utilizar evaluamos los efectos de la inhibición de la síntesis proteica sobre la

inducción de disquinesias. Los resultados indican que en el día 4 los animales que

recibieron anisomicina durante las sesiones de sensibilización con apomorfina desarrollaron

un nivel menor de disquinesias que aquellos que recibieron vehículo. Cabe remarcar que no

se observaron diferencias significativas en el uso de la PDC ni en la conducta rotatoria

entre ambos grupos (Figura 19).


65

Figura 19: Efecto de la inhibición intraestriatal de la síntesis proteica sobre el desarrollo de disquinesias. (a,a ) severidad de disquinesias durante y al final del tratamiento. (b,b´) evaluación de la aquinesia de PDC mediante la PC durante y al final del tratamiento. (c,c ) desarrollo de la conducta rotatoria durante y al final del tratamiento. (Prueba de T para muestras independientes, *p<0,05. Media ± S.E.M.).


66

2. Evaluación de los niveles estriatales de p-p70S6K.

Dado que mTOR es un regulador clave de la síntesis proteica y teniendo en cuenta

el resultado anterior, nos propusimos determinar la participación de la vía mediada por

mTOR en el desarrollo de disquinesias. Para esto determinamos los niveles de la proteína

p70S6K fosforilada (p-p70S6K) como indicador de la activación de la vía intracelular

mediada por mTOR. De acuerdo a nuestra hipótesis, pudimos observar un aumento

significativo de los niveles de p-p70S6K en el grupo de animales lesionados tratados con L-

dopa con respecto a los grupos control (Figura 20).

Figura 20: Evaluación de los niveles de p-p70S6K mediante western blot. El gráfico de barras corresponde a la cuantificación de las bandas obtenidas por western blot como se muestra en la parte inferior de la figura. (ANOVA 2 vías, seguido por test a posteriori de Bonferroni, *p<0,05. Media ± S.E.M.).

3. Efecto de la inhibición intraestriatal de la vía mediada por mTOR

Habiendo observado niveles aumentados de p-p70S6K en el estriado de animales

que desarrollaron DIL, nos propusimos interferir con la vía mediada por mTOR a través de

la administración intraestriatal de rapamicina. Para esto se utilizó un protocolo de

sensibilización similar al usado en la evaluación del bloqueo de la síntesis proteica, pero

utilizando como agente disquinetogénico L-dopa en lugar de apomorfina.

De manera similar a lo ocurrido con el protocolo de sensibilización con apomorfina,

pudimos observar diferencias significativas entre el grupo de animales sensibilizados y el

grupo no sensibilizado con L-dopa en los tres parámetros comportamentales evaluados:


67

disquinesias, uso de la PDC y conducta rotatoria (Figura 21), por lo que decidimos utilizar

este esquema de sensibilización para los experimentos subsiguientes.

Figura 21: Caracterización comportamental del protocolo de sensibilización con L-dopa. (a,a ) severidad de disquinesias durante y al final del tratamiento. (b,b´) evaluación de la aquinesia de PDC mediante la PC durante y al final del tratamiento. (c,c ) desarrollo de la conducta rotatoria durante y al final del tratamiento. (Prueba de T para muestras independientes, *p<0,05. Media ± S.E.M.).


68

Posteriormente, realizamos una serie de experimentos en los que se administraron

diferentes concentraciones de rapamicina a través de la vía intraestriatal, con el fin de

establecer la participación de la vía mediada por mTOR durante el período de

sensibilización. En este caso no observamos diferencias significativas en la severidad de

DIL desarrolladas en el día experimental 4 con ninguna de las dosis de rapamicina

evaluadas (Figura 22 a, a´). Tampoco pudimos observar diferencias en el porcentaje de uso

de la PDC (Figura 22 b, b ) ni en la conducta rotatoria (Figura 22 c, c´).

Con la intención de estudiar la participación de otros núcleos cerebrales fuera de los

GB, decidimos realizar experimentos en los que la rapamicina se administró por la vía

intracerebroventricular. Al día 4 de tratamiento no pudimos observar diferencias

significativas en el grado de disquinesias desarrolladas entre los grupos experimentales. Sin

embargo, fue evidente una tendencia a un desarrollo más rápido de disquinesias y de un

mayor uso de la PDC y de la conducta rotatoria en el grupo de animales a los que se les

administró rapamicina. (Figura 23).


69

Figura 22: Efectos de la administración intraestriatal de rapamicina. (a,a ) severidad de disquinesias durante y al final del tratamiento. (b,b´) evaluación de la aquinesia de PDC mediante la PC durante el y al final del tratamiento. (c,c ) desarrollo de la conducta rotatoria durante y al final del tratamiento. (ANOVA de 1 vía, *p<0,05. Media ± S.E.M.).


70

Figura 23: Efectos de la administración intracerebroventricular de rapamicina. (a,a ) severidad de disquinesias durante y al final del tratamiento. (b,b´) evaluación de la aquinesia de PDC mediante la PC durante el y al final del tratamiento. (c,c ) desarrollo de la conducta rotatoria durante y al final del tratamiento. (Prueba de T para muestras independientes, *p<0,05. Media ± S.E.M.).


71

iii. Evaluación de la participación de la vía RPTP ζ/β/Fyn en el desarrollo de

disquinesias inducidas por L-dopa

1. Expresión de PTN en el estriado dorsolateral

Como primera aproximación al estudio de la participación de la vía RPTP ζ/く/Fyn en el

desarrollo de DIL nos propusimos evaluar la expresión de PTN en el estriado dorsolateral

mediante inmunohistoquímica. Pudimos observar un mayor número de células PTN

inmunorreactivas en el estriado dorsolateral de los animales con lesión nigroestriatal

tratados con L-dopa con respecto a los animales Sham que recibieron el mismo tratamiento.

Este aumento no fue observado en el grupo de animales lesionados que fueron tratados con

vehículo (Figura 24).

Figura 24: (a) Cuantificación de neuronas PTN inmunorreactivas en el estriado dorsolateral. Los resultados se encuentran expresados como porcentaje de células con respecto al número de neuronas inmunorreactivas en el estriado dorsolateral control (ANOVA 1 vía, *p<0,05. Media ± S.E.M.). (b-e) Microfotografías donde se observan las neuronas PTN inmunorreactivas.

2. Estudio de la expresión de Fyn en el estriado de ratas que desarrollaron

disquinesias inducidas por L-dopa.

En primer lugar, para poner a prueba nuestra hipótesis acerca de la participación de Fyn en

el establecimiento de las DIL, evaluamos los niveles de esta proteína en los homogenatos

mencionados en el apartado anterior mediante western blot. En este experimento no


72

observamos diferencias significativas en los niveles estriatales de Fyn en ninguno de los

grupos evaluados (Figura 25).

Figura 25: Evaluación de los niveles de Fyn mediante western blot. El gráfico de barras representa la cuantificación de las bandas obtenidas para cada grupo experimental que se muestran en el panel inferior. (ANOVA 2 vías, seguido por test a posteriori de Bonferroni, *p<0,05. Media ± S.E.M.).

Dado que este resultado no descarta la participación de la vía mediada por RPTP

ζ/く/Fyn en el fenómeno disquinético, ya que por las características de esta vía intracelular

no necesariamente se esperan cambios en los niveles de expresión, sino de activación de

Fyn, decidimos evaluar cambios en el estado de fosforilación de ésta última (Fyn

fosforilada, p-Fyn) mediante inmunoprecipitación y posterior detección de residuos de

tirosina fosforilados. Es importante destacar que la actividad fosfatasa del receptor de PTN,

RPTP ζ/く, promueve la desfosforilación de Fyn. Sin embargo, la interacción de PTN con su

receptor inhibe la actividad fosfatasa de éste, resultando en mayores niveles de Fyn

fosforilada en residuos de tirosina. En este caso encontramos una disminución en los

niveles de p-Fyn en el grupo de animales lesionados tratados con vehículo (Lesión + Veh).

Por otro lado, esta disminución fue restablecida con el tratamiento con L-dopa (Lesión + L-

dopa) en aproximadamente un 100% respecto al grupo Lesión + Veh (Figura 26).


73

Figura 26: Evaluación de los niveles de p-Fyn mediante western blot. El gráfico de barras representa la cuantificación de las bandas obtenidas para cada grupo experimental que se muestran en el panel inferior. (ANOVA 2 vías, seguido por test a posteriori de Bonferroni, *p<0,05. Media ± S.E.M.).

Mariano Saborido - Capítulo II - Discusión

74

IIVV..44.. DDIISSCCUUSSIIÓÓNN CCAAPPÍÍTTUULLOO II II

En la segunda parte de esta tesis, luego de evaluar la participación de los receptores

dopaminérgicos D1 y D2 en el desarrollo de DIL, estudiamos la participación de las vías de

señalización intracelular mediadas por Fyn y mTOR en el fenómeno disquinético en un

modelo animal de la EP.

Los resultados obtenidos indican que:

Nuestro modelo animal de DIL representa fidedignamente las características

comportamentales y moleculares asociadas a disquinesias,

Existe un mayor número de células PTN inmunoreactivas en el estriado dorsolateral de

los animales que desarrollaron DIL respecto a los animales de los grupos control,

El nivel de expresión estriatal de Fyn no se modifica por la lesión severa de la vía

nigroestriada ni por el tratamiento crónico con L-dopa,

La lesión severa de la vía nigroestriada promueve la disminución de la activación

estriatal de Fyn y ésta es restablecida en su totalidad luego del tratamiento crónico con

L-dopa,

La inhibición de la síntesis proteica estriatal durante el período de sensibilización

provoca la disminución de la severidad de las disquinesias,

Los animales que desarrollan DIL presentan un mayor nivel estriatal de p-p70S6K que

los animales de los grupos control,

La administración intraestriatal de rapamicina no altera el desarrollo de DIL en nuestro

modelo experimental,

La administración intracerebroventricular de rapamicina no altera el desarrollo de DIL

en nuestro modelo animal.

En una primera etapa nos dedicamos a caracterizar el modelo sobre el que

pondríamos a prueba las hipótesis planteadas en esta segunda parte de la tesis. Para esto

realizamos experimentos donde evaluamos los diferentes parámetros comportamentales


75

(disquinesias, aquinesia de la PDC y conducta rotatoria) y moleculares que presenta el

modelo de DIL. Observamos que el tratamiento con L-dopa en animales con lesión severa

de la vía nigroestriada promueve el desarrollo progresivo de disquinesias al mismo tiempo

que restablece el uso de la PDC a la lesión. Estos resultados no fueron observados en

animales con lesión severa nigroestriatal tratados con vehículo ni en animales Sham

tratados con L-dopa o vehículo. Estas observaciones sustentan la necesidad de contar con

una desnervación dopaminérgica severa conjuntamente con el tratamiento con L-dopa

como factores asociados imprescindibles para el desarrollo de disquinesias. Además, en

este grupo experimental, a diferencia de lo observado en el resto de los grupos, también fue

evidente un aumento de la conducta rotatoria, fenómeno asociado a la supersensibilización

de los receptores dopaminérgicos ante la depleción de DA estriatal (Delfino y col., 2004).

Por otra parte, evaluamos si nuestro modelo experimental presentaba también

ciertos aspectos moleculares que han sido asociados al desarrollo de disquinesias. En

nuestro caso pudimos observar la sobreexpresión de FosB/∆FosB en el estriado de animales

disquinéticos respecto al resto de los grupos experimentales. Este resultado se condice con

observaciones previas descriptas ampliamente en la literatura (Andersson y col., 1999;

Pavón y col., 2006).

Además, dado que el desarrollo de disquinesias involucra cambios plásticos

persistentes en el tiempo (Calabresi y col., 2000), y estos son dependientes de la síntesis de

nuevas proteínas, decidimos evaluar la posibilidad de disminuir el nivel de disquinesias

desarrolladas mediante la inhibición de la síntesis proteica a nivel estriatal durante el

período de sensibilización. Como resultado observamos que los animales que fueron

inyectados por la via intraestriatal con anisomicina, durante el período de sensibilización

con apomorfina, desarrollaron un menor grado de disquinesias que aquellos que recibieron

vehículo. Este resultado, si bien esperado, avala fuertemente el hecho que en la génesis de

las disquinesias se encuentran involucrados necesariamente cambios plásticos, y que éstos,

a su vez, son altamente dependientes de la síntesis de nuevas proteínas. Asimismo, este

hallazgo sugiere la participación de algún factor intracelular modulador de la síntesis de

proteínas en el desarrollo de disquinesias, el cual podría eventualmente ser un blanco de

intervención terapéutica para el tratamiento antidisquinético. De acuerdo a esto decidimos


76

evaluar la participación de la vía mediada por mTOR en el desarrollo de DIL. Pudimos

observar una mayor activación de esta vía, representada por un mayor nivel de p-p70S6K

(blanco directo de mTOR) en el estriado de animales con DIL severas, sugiriendo la

participación de la vía mediada por mTOR en el desarrollo de DIL. Sin embargo, no fuimos

capaces de observar disminución alguna en la severidad de las DIL cuando intentamos

bloquear esta vía, tanto por la vía intraestriatal como por la vía intracerebroventricular. Es

necesario mencionar que mientras realizábamos esta serie de experimentos Santini y

colaboradores (Santini y col., 2009) demostraron la participación de esta vía en el

fenómeno disquinético. Al igual que nosotros, pudieron observar un mayor nivel de p-

p70S6K en el estriado de animales con DIL severas pero, a diferencia de nuestros

resultados, fueron capaces de disminuir la severidad de las mismas mediante la

administración de rapamicina. Respecto a esto último creemos necesario remarcar una serie

de diferencias entre nuestro paradigma experimental y el de Santini y colaboradores que

pensamos pueden ser la causa de las diferentes observaciones. En primer lugar los autores

utilizaron ratones como modelo experimental; segundo, la inyección de 6-OHDA realizada

por los autores fue a través de la vía intraestriatal y, tercero, los autores administraron

rapamicina de manera intraperitoneal. Esto último es de especial importancia dado que muy

probablemente los autores hayan logrado inhibir sustratos, no solo en el SNC, sino también

periféricos y extranerviosos que serían responsables de la disminución de la DIL observada.

Asimismo, es importante remarcar que los autores comenzaron la administración de

rapamicina tres días antes de iniciar el tratamiento con L-dopa.

En otra serie de experimentos hemos podido demostrar un mayor número de células

inmunoreactivas para PTN en el estriado dorsolateral de animales disquinéticos lo que

podría suponer un aumento en la secreción de PTN y una consecuente mayor estimulación

de sus cascadas blanco, entre ellas, RPTP ζ/く/Fyn. Además, observamos una disminución

en la activación de Fyn en animales con lesión severa de la vía nigroestriada que es

restablecida por el tratamiento crónico con L-dopa. Si bien la L-dopa genera la activación

de Fyn hasta niveles similares a los observados en animales sin lesión del sistema

nigroestriado, creemos que este restablecimiento en la actividad de la vía mediada por Fyn

puede, de alguna manera estar relacionada con el desarrollo de DIL. Ambas observaciones


77

parecerían vincular PTN, su receptor RPTP ζ/く y su molécula blanco Fyn con el desarrollo

de DIL. Como mencionamos oportunamente, Fyn ha sido asociada con procesos de

formación de memoria, aprendizaje y LTP (Kawachi y col., 1999), y estas acciones serian

ejercidas mediante la regulación del receptor NMDA (Yagi, 1999). Todos estos procesos

han sido relacionados al desarrollo de DIL (Jenner, 2008), sin embargo, al momento no

existen evidencias concretas acerca de la participación de Fyn en este fenómeno. Por tal

motivo nuestro trabajo es el primero en demostrar dicha participación. Aunque somos

conscientes que aún queda mucho por hacer, consideramos que Fyn puede representar un

importante blanco terapéutico que permita controlar el desarrollo de disquinesias asociadas

a la terapia farmacológica de la EP. Es por tal motivo que en nuestro laboratorio se están

desarrollando actualmente experimentos destinados a corroborar esta hipótesis.

CONCLUSIONES

Mariano Saborido - Conclusiones Generales

78

VV.. CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS GGEENNEERRAALLEESS

Del presente trabajo se desprenden las siguientes conclusiones:

El receptor dopaminérgico D1 media los cambios intracelulares relacionados con

el desarrollo de DIL pero no es posible disociar el efecto terapéutico del efecto

disquinetogénico de la L-dopa mediante el uso de antagonistas.

El modelo animal utilizado en este trabajo representa fidedignamente las

caracteríaticas comportamentales y moleculares del desarrollo de las DIL.

El desarrollo de DIL involucra cambios plásticos a nivel estriatal que dependen

de la síntesis de proteínas, esto hace que los factores intracelulares que modulan este

proceso se conviertan en posibles blancos de intervención terapéutica para el

tratamiento de las DIL.

Las vías intracelulares mediadas por mTOR y Fyn estarían vinculadas al proceso

disquinetogénico. Es por esto que resulta imprescindible realizar nuevos y más

profundos estudios de estas vías para comprender de qué manera modularlas y que este

hecho se constituya en un enfoque terapéutico novedoso para el tratamiento de las

complicaciones motoras de la terapia farmacológica antiparkinsoniana.

REFERENCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

Mariano Saborido - Referencias Bibliográficas

79

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