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Bases fondamentales: Lymphocytes B
Chaigne Benjamin 12/10/2018
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Objectifs
• Le BCR
• Un peu d’ontogénèse…
• Expliquer la diversité de la production d’anticorps
• Montrer qu’il y a plusieurs populations de lymphocytes B
• Donner quelques exemples de pathologies auto-immunes
• Introduction aux applications thérapeutiques: cibler le B...
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Immunité humorale • Les lymphocytes B, stimulés spécifiquement par l'antigène, se multiplient et se différencient en plasmocytes sécréteurs d'anticorps. • Ces anticorps, dont la structure est très proche de celle des récepteurs B, vont se lier à l'antigène.
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BCR
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Immunoglobuline G
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Lymphocyte B: récepteur, molécules de surface
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IgD/IgM
CD19 CD21
SPLEEN
Naive
IgM
CD19
CD21
MZ B cell
SECONDARY LYMPHOID TISSUE
IgD
CD19 CD21
Germinal center B cell
IgG
CD19
CD27
CD27
CD38
CD38
CD19
CD27
IgA/E/G/M
CD19
CD38
CD24
Plasma cell
Plasmablast
Memory B cell
Regulatory B cell
IL-10 TGF-β
MHC
MHC
POSITIVE SELECTION
Ig
HYPERMUTATIONS NFAT NF-κB
NF-κB
NF-κB
CD27
CD38
Plasma cell
Ig
BONE MARROW
Pre/pro B cell
Immature/transitionnel B cell
IgM
CD19
BLOOD
NEGATIVE SELECTION
MATURATION
MIGRATION MIGRATION
CD20
CD20
CD20
CD20
CD131
CD20
CD20
CD131
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VDJ recombination
RAG1/2 Artemis TdT
Insertion de n bases (multiple de 3) aléatoires
(50)
2.106 possibilities
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VJ recombination
2.106 possibilities
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Ordered V(D)J recombination during B cell development
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IgD/IgM
CD19 CD21
SPLEEN
Naive
IgM
CD19
CD21
MZ B cell
SECONDARY LYMPHOID TISSUE
IgD
CD19 CD21
Germinal center B cell
IgG
CD19
CD27
CD27
CD38
CD38
CD19
CD27
IgA/E/G/M
CD19
CD38
CD24
Plasma cell
Plasmablast
Memory B cell
Regulatory B cell
IL-10 TGF-β
MHC
MHC
POSITIVE SELECTION
Ig
HYPERMUTATIONS NFAT NF-κB
NF-κB
NF-κB
CD27
CD38
Plasma cell
Ig
BONE MARROW
Pre/pro B cell
Immature/transitionnel B cell
IgM
CD19
BLOOD
NEGATIVE SELECTION
MATURATION
MIGRATION MIGRATION
CD20
CD20
CD20
CD20
CD131
CD20
CD20
CD131
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Commutation de classe isotypique
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IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM IgA1 IgA2 IgD IgE Chaîne lourde
γ1 γ2 γ3 γ4 µ α1 α2 δ Ε
PM (Kda)
150 150 165 150 970 160 160 185 185
Sites fixation
Ag
2 2 2 2 10 2/4 2 2 2
Conc (mg/ml)
9 3 1 0,5 1,5 3,0 0,5 0,03 5x10-5
Demi-vie
(jours)
21 21 7 21 10 6 6 3 2
Caractéristiques biochimiques des immunoglobuline
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Diversité combinatoire
Assemblage des segments V et J (chaînes légères) et V, D et J (chaînes lourdes)
Assemblage chaîne légère/ chaîne lourde
Assemblage aléatoire d’une chaîne lourde avec une chaîne légère
Diversité jonctionnelle
Insertion ou délétion de nucléotides à la jonction entre les segments de gènes
Maturation d'affinité
Hypermutations somatiques : au hasard sur les gènes réarrangés des régions variables lors de la stimulation par l'antigène. Les cellules B qui ont un récepteur muté qui fixe mieux l'antigène sont sélectionnées.
Génération de la diversité des anticorps
2.106 possibilités
+ 109 possibilités
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Différents phénotypes de LB
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SS
C-H
SSC-A
SS
C-A
FCS-A
CD
19
CD21
CD
21
CD27 Ig
D
CD27
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Différents phénotypes selon la localisation
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IgD/IgM
CD19 CD21
SPLEEN
Naive
IgM
CD19
CD21
MZ B cell
SECONDARY LYMPHOID TISSUE
IgD
CD19 CD21
Germinal center B cell
IgG
CD19
CD27
CD27
CD38
CD38
CD19
CD27
IgA/E/G/M
CD19
CD38
CD24
Plasma cell
Plasmablast
Memory B cell
Regulatory B cell
IL-10 TGF-β
MHC
MHC
POSITIVE SELECTION
Ig
HYPERMUTATIONS NFAT NF-κB
NF-κB
NF-κB
CD27
CD38
Plasma cell
Ig
BONE MARROW
Pre/pro B cell
Immature/transitionnel B cell
IgM
CD19
BLOOD
NEGATIVE SELECTION
MATURATION
MIGRATION MIGRATION
CD20
CD20
CD20
CD20
CD131
CD20
CD20
CD131
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La reconnaissance de l ’antigène induit l ’expression de molécules effectrices par les LT,
qui activent les lymphocytes B
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ZONE B
Tfh
Adapté de Pissani et Streeck, Trends Immunol 2014
(Schaerli, 2000)
Lymphocytes T CD4+ folliculaires helper Tfh
Différenciation et maturation des LB dans les organes lymphoïdes IIaire
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ZONE B
CENTRE GERMINATIF
Différenciation du LB en:
Plasmocyte ou
LB folliculaireè Centre germinatif
Tfh
Adapté de Pissani et Streeck, Trends Immunol 2014
Différenciation et maturation des LB dans les organes lymphoïdes IIaire
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Régulation de la réaction du CG - LT folliculaires régulateurs (Tfr)
- LT CD8 régulateurs et cytotoxiques - LB régulateurs
Production d’anticorps
Maturation des anticorps § Commutation de classe isotypique
§ Hypermutations somatiques
Tfh
Adapté de Pissani et Streeck, Trends Immunol 2014
Différenciation et maturation des LB dans les organes lymphoïdes IIaire
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Réponse humorale
Interactions multiples
Rôle des Tfh dans la maturation des anticorps
Tfh
Adapté de Pissani et Streeck, Trends Immunol 2014
Reconnaissance de l’antigène
Costimulation
Cytokines
Maturation
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Diversité d’une réponse anticorps normale
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Diversité d’une réponse anticorps normale
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Diversité d’une réponse anticorps normale
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Diversité d’une réponse anticorps normale
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Pertubations et applications pathologiques
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Exemples de sous-populations de lymphocytes B
LBmémoirecirculants:CD19+CD27+CD38-
LBautoréac2fs:CD5+(PR)CD19++CD27++(SLE)TLR9++(SLE)
LBrégulateurs:CD19+CD24++CD38++IL-10+
LBmature
R é p a r < < o nmodifiées dansp l u s i e u r spathologies auto-immun e s ( P R ,SLE…)
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Caractérisation de la maturation des LB dans la rate
CD38
IgD
PC
Bm3/4
early Bm5
late Bm5
Bm2’
Bm2
Bm1
Cytométrie en flux
Naïfs
Pré-GC GC
Mémoires
Plasma-blastes
Maturation des LB altérée dans les rates VIH+ è Diminution des LB mémoires
(Pascual, 1994)
VIH
Collineau, Rouers et al., Plos One 2015
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Caractérisation des populations de LB ex vivo
Figure 1
A
B
% o
f B c
ells
in
lym
phoc
ytes
EC cART HIV-neg
TLM
EC HAART HIV-neg0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
B57-B57+
***
% a
mon
g C
D19
+ B
cel
ls
B*57+
B*57-
0
5
10
15
20
25 *
*
% o
f mem
ory
cells
in
B c
ells
0102030405060708090100
0102030405060708090100
0102030405060708090100
0102030405060708090100
***
AM IM RM TLM
Figure 1: Memory B cell compartments are preserved in EC. In EC (n=38), cART (n=13) and HIV-negative donors (n=12): (A) frequency of CD19+ B cells among lymphocytes and (B) frequencies of AM (CD27+CD21-), RM (CD27+CD21+), IM (CD27-CD21+) and TLM (CD27-CD21-) B cells among CD19+ B cells. Each individual is represented by a specific dot on each graph (shape and color). Circle: HLA-B*57+ EC; Square: HLA-B*57- EC. *p<0.05, **p<0.005. Bars represent median.
like semblentprovenirdirectementde la zonemarginalede la rateet sonten chargedes
réponsesTindépendantesdirigéescontrelesbactéries(Welleretal.,2004)(Tableau4).
Les CSA sontdephénotype IgD-CD27
hiCD38
hietontperdu l’expressiondumarqueurCD20
généralement exprimé par les autres populations de LB. Les CSA sont divisées en 2 sous
populations: les plasmocytes et les plasmablastes. Nous avions abordé la différenciation
dans les OLII de ces sous-populations dans les paragraphes 1.3.3.2.1 et 1.4.4.1.2. Les
plasmocytes expriment le marqueur CD138 ce qui n’est pas le cas des plasmablastes
(Tableau4).
Populations Sous-populations Phénotype
LBimmatures/naïfsT1 IgD
+CD27
-CD10
+CD24
hiCD38
hi
T2 IgD+CD27
-CD10
+CD24
+CD38
+
T3 IgD+CD27
-CD10
-CD24
+/-CD38
+/-
LBmaturesnaïfs IgD+CD27
-CD10
-CD80/86
+
LBmémoiresNonswitchés IgD
+CD27+Switchés IgD
-IgM
-CD27+MZ-like IgD
-IgM
+CD27+Cellulessécrétricesd’anticorps
(CSA)Plasmocytes CD20-IgD-
CD27hiCD38
hiCD138+Plasmablastes CD20-IgD-
CD27hiCD38
hiCD138-
Tableau4:PhénotypedesdifférentespopulationsdeLBdusang.TouteslespopulationsdeLBexpriment lemarqueurCD19.LemarqueurCD20estégalementexprimépar lesLBsaufpar les CSA. L’expression dumarqueur CD10 est perdue par toutes les populations de LBmatures.
Dans le contexte particulier de l’infection par le VIH, 4 sous-populations de LB sont
classiquementidentifiéesensebasantsurl’expressiondemarqueursCD21etCD27(Moiret
al.,2008).Cespopulationssontnommées:
• Activatedmemory(AM):CD27+CD21
-
• Restingmemory(RM):CD27+CD21
+
• Intermediatememory(IM):CD27-CD21
+
• Tissuelikememory(TLM):CD27-CD21
-
J’aborderaidansleparagraphe3.2.3ladynamiquedecessous-populationslorsdel’infection
parleVIH.
93
AM : Activated memory : cellules épuisées RM : Resting memory : maintien de la réponse humorale TLM : Tissue like memory : cellules anergiques IM : Intermediate memory
Figure 1
A
B
% o
f B c
ells
in
lym
phoc
ytes
EC cART HIV-neg
TLM
EC HAART HIV-neg0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
B57-B57+
***
% a
mon
g C
D19
+ B
cel
ls
B*57+
B*57-
0
5
10
15
20
25 *
*
% o
f mem
ory
cells
in
B c
ells
0102030405060708090100
0102030405060708090100
0102030405060708090100
0102030405060708090100
***
AM IM RM TLM
Figure 1: Memory B cell compartments are preserved in EC. In EC (n=38), cART (n=13) and HIV-negative donors (n=12): (A) frequency of CD19+ B cells among lymphocytes and (B) frequencies of AM (CD27+CD21-), RM (CD27+CD21+), IM (CD27-CD21+) and TLM (CD27-CD21-) B cells among CD19+ B cells. Each individual is represented by a specific dot on each graph (shape and color). Circle: HLA-B*57+ EC; Square: HLA-B*57- EC. *p<0.05, **p<0.005. Bars represent median.
EC : Elite Controller cART : VIH+ traités HIV-neg : VIH- (EFS)
Les EC préservent naturellement leur compartiment B mémoire
(Moir et al., 2008)
Cytométrie en flux
Collineau, Rouers et al., Plos One 2015
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Perturba2onsinBcellhomeostasisinautoimmunedisorders
HCV-related MC Healthy donors Sjögren’s syndrome
40%
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Perturba2onsinBcellhomeostasisinautoimmunedisorders
Bohnhorst et al, JI 2001
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HCVAntigen-insensitive B cell proliferation
Oligo/Monoclonal proliferation
Uncontrolled proliferation
Antigen-sensitive B cell proliferation
Polyclonal proliferation
B-cell lymphoma
Cytokines BAFF
Hyperγglobulinemia Cryoglobulinemia Vasculitis
B-cell lymphoma IgH-bcl2? Other
oncogenic events ?
CD81
HCV (E2)
B cell
Anti-E2 IgM/Rheumatoid factor
IgG
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CharlesED,Blood,2008
ClonalexpansionofIgM+CD27+marginalzoneBcellsinHCV-MCpa2ents
Bias in the repertoire of clonal MZ B cells: VH1-69, JH4 and Vkappa 3-20 gene segment restriction
IgM+ CD27+ CD21-/lo B cells
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Expansion of an unusual CD21-/low marginal zone B cell population in HCV-MC patients
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ANTI-INFLAMMATORY
INFLAMMATION
IL-6 IL-21 TNF-α CD25
CD38
ANCA
CD5
CTLA-4 IL-10 TGF-β
BAFF
Treg induction
Th1 Th17
Treg
IL-17 IL-21
IFN-γ TNF-α
Perivascular DC and EC activation
Neutrophils activation and degranulation
Th17-Th1 imbalance
Auto-reactive B cells Regulatory B cells
Th2
L’exemple de la GPA
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Les lymphocytes B balancent également la réponse immune
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Systemic sclerosis
• To identify a potential B lymphocytes
dysregulation that could correlate with disease
severity in patients with systemic sclerosis
• To investigate the role of B lymphocytes in the
pathogenesis of systemic sclerosis
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Patients and Methods
• 80 untreated patients (9 males) with SSc fulfilling the ACR/EULAR criteria
- 22 diffuse SSc (dSSc) - 58 limited cutaneous SSc (lSSc) - 21 healthy controls (HC)
• Phenotyping of peripheral blood B cell subpopulations, activating and inhibitory receptor expressions, IL-6 and TGF-β production: flow cytometry and multiplex assay
• Fibroblasts proliferation rate & collagen production upon
incubation with supernatants of B cells from patients or HC were assessed using XTT, BrdU, Ki67 staining and collagen assay
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B lymphocyte maturation status in patients with SSc
HC: Healthy controls; SSc: systemic sclerosis; dSSc: diffuse SSc; lSSc: limited SSc
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** ***
HC: Healthy controls; SSc: systemic sclerosis; dSSc: diffuse SSc; lSSc: limited SSc
%of
CD
86+ w
ithin
CD
19+
HCSSc
dSSclcS
Sc0
20
40
60
80
100
% o
f CD
95+ w
ithin
CD
19+
HCSSc
dSSclcS
Sc0
20
40
60
80
100
%of
CD
69+ w
ithin
CD
19+
HCSSc
dSSclcS
Sc0
10
20
30
40
%o
f C
D5
+ w
ith
in C
D1
9+
H CS S c
d S S c
lcS S c
0
1 0
2 0
3 0
4 0
**** ** *
**
**** ** ***
* *
CD5 CD86
CD69 CD95
Increased expression of activation markers at the surface of B cells from patients with SSc
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CD
22
MF
I w
ith
in C
D1
9+
HC
S S c
d S S c
lcS S c
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
CD
32
MF
I w
ith
in C
D1
9+
H CS S c
d S S c
lcS S c
0
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
CD
72
MF
I w
ith
in C
D1
9+
H CS S c
d S S c
lcS S c
0
2 0 0 0
4 0 0 0
6 0 0 0
8 0 0 0
Inhibitory markers and increased expression of IL6R and IL21R at the surface of B lymphocytes in patients
with diffuse SSc
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IL-6 IL-10 TGF-β
HC: Healthy controls; SSc: systemic sclerosis; dSSc: diffuse SSc; lSSc: limited SSc
Flow
cyt
omet
ry
Cyt
okin
e do
sage
Increased IL-6 and TGF-β secretion and decreased
IL-10 secretion by B lymphocytes in patients with SSc
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Increase proliferation and collagen production by fibroblasts after stimulation with B cell supernatant
from patients with SSc
UNS: unstimulated B cell; CpG: 3 days stimulation with CpG; PMA: 4h stimulation with PMA/ionomycin
CpG stimulation: high TGF-β secretion PMA/ionomycyn stimulation: high IL-6 secretion
UNS
UNS
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UNS: unstimulated B cell; CpG: 3 days stimulation with CpG; PMA: 4h stimulation with PMA/ionomycin
V im e n tin / H C fib ro b la s ts
Re
lati
ve
ex
pre
ss
ion
vs
b2m
B a s a l
C p G
C p G +
an t i-
T GF - b
P MA
P MA +
toc ili
z u mab
0 .6
0 .8
1 .0
1 .2
1 .4* *
* *
V im e n tin / S S c f ib ro b la s ts
Re
lati
ve
ex
pre
ss
ion
vs
b2m
B a s a l
C p G
C p G +
TG
FP M
A
P MA +
toc ili
z u mab
0 .6
0 .8
1 .0
1 .2
1 .4* *
* *
UNS
UNS
« Myofibroblast phenotype-like » after stimulation with B cell supernatant from patients with SSc
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§ B lymphocytes from patients with SSc
§ Increased expression of activation markers § Increased membrane expression of IL-6R and
IL-21R § Increased intracellular staining and release of
IL-6 and TGF-β
§ B cell supernatants from patients with SSc § Increase proliferation of fibroblasts § Increase collagen production of fibroblasts (after
treatment of B cells with CpG)
B cell and SSc: conclusions
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Cibler le B….
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Quelle cible à quel interface?
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BAFF
![Page 55: Bases fondamentales: Lymphocytes B...Objectifs • Le BCR • Un peu d’ontogénèse… • Expliquer la diversité de la production d’anticorps • Montrer qu’il y a plusieurs](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041907/5e6478c5366c9d206161cba8/html5/thumbnails/55.jpg)
![Page 56: Bases fondamentales: Lymphocytes B...Objectifs • Le BCR • Un peu d’ontogénèse… • Expliquer la diversité de la production d’anticorps • Montrer qu’il y a plusieurs](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022041907/5e6478c5366c9d206161cba8/html5/thumbnails/56.jpg)
Conclusions • Grande diversité d’anticorps chez le sujet sain
• Mécanismes multiples à l’origine de l’émergence d’autoanticorps ou de dérégulation des lymphocytes B
• Lymphocytes B: se différencient en plasmocytes, présentent l’antigène, produisent des cytokines pro- et anti-inflammatoires.
• Sous populations émergentes : B autoréactifs, B régulateurs.
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Hôpital Cochin Paris
Uth rs DHU