bases teÓricas da dosagem de biomolÉculas · 2020. 9. 4. · princípios de bioquímica de...
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Qual é o frasco que contém a solução mais concentrada?
Como medir ?
BASES TEÓRICAS DA DOSAGEM
DE BIOMOLÉCULAS
Carolina Manchola
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PROTEÍNAS
São as biomoléculas com a maior diversidade de estrutura
e função, e são o componente mais abundante das células.
Bioquímica Básica. Marzzoco & Torres
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AMINOÁCIDOS
Princípios de Bioquímica de Lehninger
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Proteínas: heteropolímeros de aminoácidos unidos
por ligações peptídicas.
DETECÇÃO E DOSAGEM DE PROTEÍNAS
Princípios de Bioquímica de Lehninger
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1. Método Kjeldahl
Proteína + H2SO4 → CO2 + H2O + NH4+
Desvantagens: quantidade, erro, quantifica indiretamente a
quantidade de proteína, de acordo com a quantidade de
Nitrogênio na amostra.
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LEI LAMBERT BEER
A = ε . C . L
Absorbância
Coeficiente de absortividade molar
M-1 cm-1
cm-1
Princípios de Bioquímica de LehningerPrincípios de Bioquímica de Lehninger
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O ESPECTROFOTOMETRO
Princípios de Bioquímica de Lehninger
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Tipos de dosagem de proteínas através de espectrofotometria
da ligação peptídica (210-
220 nm)
de grupos presentes nas
cadeias laterais dos aminoácidos
que a constituem
(aromáticos, p. ex., a ~ 280
nm)
de produtos coloridos
resultantes de reações
entre a proteína e compostosquímicos
específicos (400-700 nm)
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Cadeias laterais contendo aromáticos absorvem luz em λ 280nm.
A absorbância de uma proteína dependerá do seu conteúdo de Tyr,
Phe e Trp, sem modificar químicamente a amostra.
2. Absorção de luz UV
Desvantagem:
Para a quantificação de uma
proteína sem o uso de
referências é necessário
conhecer a sua sequência de
aminoácidos (calcular o ε).
Compostos que absorvem em λ
280 nm interferem.
A diferença de conteúdo de
aminoácidos aromáticos
entre o padrão e a amostra
pode introduzir erros na
quantificação.Princípios de Bioquímica de Lehninger
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2. Absorção de luz UV
A260/A280 = 1,8 -2,0
https://www.eppendorf.com/product-media/doc/en/59828/Eppendorf_Detection_Application-Note_279_BioPhotometer-D30_Detection-
contamination-DNA-protein-samples-photometric-measurements.pdf
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3. Reação de Biureto
Baseia-se em uma reação entre CuSO4 e os grupos amino da
proteina em meio alcalino. É um método específico para proteínas.
O produto desta reação (um cátion Cu+2 coordenado com 4 grupos
amino) absorve em λ 540nm.
Desvantagens: a) baixa sensibilidade (> 1 mg prot.)
b) somente para proteínas simples
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4. Reagente de Folin-Ciocalteu – Método de Lowry
Após a reação do Biureto, o complexo formado e as Cys, Tyr e
Trp, sofrem uma reação de oxido-redução com o Reagente de
Folin (mistura de ácidos fosfotúngstico e fosfomolíbdico).
Sensibilidade 0.01 – 1 mg / mL.
A presença do complexo tetradente reduz uma (reagente de Folin)
formando tunsgtato e molibdato, os quais absorvem em λ 720 –
750nm.Desvantagem:
1) a quantidade de produto colorido
formado é fortemente dependente da
quantidade de Asn, Trp e His
presentes na proteína.
2) apresenta um grande número de
interferentes (fenóis, p.ex.)
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4. Reagente de Folin-Ciocalteu – Método de Lowry
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5. Método de BCA (bicinchonic acid)
Começa com a formação do
complexo entre cátion Cu+2 e a
proteina,
Esse complexo cuproso reage
com o BCA (2 moleculas por ion
cuproso) o qual pela sua vez
forma uma cor violeta que pode
ser medida a λ 562 nm
sensibilidade 0.5 µg/mL.
Desvantagens:
alguns compostos como
fructose e lactose podem
interferir na leitura.
A coloração não se mantem
estável por muito tempo.
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6. Reagente de Bradford
(Comassie Brilliant Blue G-250)
Este corante forma complexos com proteínas por meio de
interações iônicas com aminoácidos básicos e interações de
van der Waals. A formação do complexo proteína-CBBG altera
o espectro de absorção do corante, mudando o seu máximo de
absorção de λ 465 nm para 595 nm. < 5 µg/mL.
Desvantagens:
a)o corante não liga
igualmente em todas as
proteínas.
b)lipídeos, fenóis,
polissacarídeos e glicerol
interferem neste método.
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6. Reagente de Bradford (Comassie Brilliant
Blue G-250)
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Enzimas são catalisadores biológicos.
Apresentam especificidade em relação aos
produtos e reagentes
E + S E + P
A presença de uma enzima específica pode ser
detectada através da ocorrência da reação
(formação do produto a partir de substrato específico)
k
E SE A PROTEÍNA TAMBÉM FOR ENZIMA?
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E + S E + Pk
Como quantificar a enzima?
v = k [E] [S]
Assim, se [S] ~ constante, a velocidade é diretamente
proporcional a concentração de enzima
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[P]
tempo
V = D[P]/Dt
Qual V usar?
inclinação = Dy/Dx
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v = k [E] [S]
Assim, se [S] ~ constante (igual à inicial; muito S e pouca E
saturada), a velocidade é diretamente proporcional a
concentração de enzima
[P]
tempo
Se menos de 5% de
S for consumido,
podemos assumir
v ~ constante (v0)
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Medida de velocidade inicial
Construir uma curva de [P] x tempo e verificar se é linear.
[P]
tempo
[P]
tempo
vários tempos x 1 único tempo
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y=mx+b
m= inclinação= produto
produzido/tempo= Velocidade
inicial = Unidade enzimática.
1 U de atividade enzimática
corresponde a formação de 1
micromol de produto/min
1 U = 1 mmol P / min
[P]
tempo
y=mx + b
m= inclinação = velocidade média
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Determinação da Atividade Enzimática do lisado
α- Glicosidase
Hidrolise das ligações glicosídicas em
açúcares complexos
P-nitrofenil-alfa-
glicosídeo
P-nitrofenolato
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Curva padrão p-nitrofenolato para determinar
a atividade da α- Glicosidase
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Curva padrão ou curva de calibração
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Referências
Proteins – Structure and Molecular Properties, Thomas E. Creighton, Segunda edição –
1993 -Capítulo 1
M. M. Bradford (1976). Anal. Biochemistry 72, 248 – 254 (Comassie Blue)
G. L. Peterson (1979). Anal. Biochemistry 100, 201 – 220 (Reagente de Folin)
S.C. Gill e P.H. von Hippel (1989). Anal.Biochemistry 182, 319 – 326. (Absorção na
região de luz UV)
H. Ahmed (2005). Principles and reactions of protein extraction, purification and
characterization (todos os métodos)
Lehninger principles of biochemistry. 3rd. ed. New York: Worth Publishers, 2000. 1152p.
il.
Livro de bioquímica básica (Anita Marzzoco e Bayardo B. Torres).