basi della citofluorimetria a flusso cellule in sospensione passano in singola fila attraverso una...
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Basi della citofluorimetria a flusso
Cellule in sospensione passano in singola fila attraverso una camero di flusso
Riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza
La luce emessa viene raccolta, filtrata e convertita ad un valore digitale che viene inviato al computer
Il primo momento della analisi citofluorimetrica è rappresentato dal passaggio delle cellule in sospensione attraverso il raggio laser, in fila.
granulocito
linfocito
monocito
Nel caso del campione riportato in figura, viene analizzata una sospensione di globuli bianchi contente linfociti, monociti e granulociti
Scatter Frontale(Forward Angle Light Scatter, FALS)
Laser
granulocito
linfocito
monocito
Sensore per il FALS
Il semplice passaggio delle cellule attraverso il laser dà origine ad
un segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce
dello scatter frontale (forward), e che dà informazioni sul
volume cellulare.
Quando viene utilizzata una sorgente laser, la
quantita’ di luce “scatterata” nella direzione frontale
(lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce
laser) viene raccolta nel canale del Forward Scatter
L’intensita’ del Forward Scatter e’ proporzionale alla
dimensione, forma, ed omogeneita’ ottica delle
cellule (o delle altre particelle analizzate)
Scatter Laterale(90 Degree Light Scatter)
Il passaggio delle cellule dà anche origine ad un secondo segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello Scatter Laterale, a 90 gradi e che dà informazioni sulla densità/granularità (compreso il rapporto nucleo/citoplasma) delle cellule che passano attraverso il laser
granulocito
linfocito
Sensore FALS
Laser
monocito
Sensore per il 90O LS
Quando si utilizza una sorgente laser, la quantita’ di
luce “scatterata” lateralmente (perpendicolare all’asse
attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel
canale del Side Scatter
Anche l’intensita’ del side scatter e’ proporzionale
alla dimensione, forma ed omogeneita’ ottica
delle cellule (o delle altre particelle analizzate)
Il Forward Scatter tende ad essere piu’ sensibile
alle proprieta’ della superficie cellulare delle particelle
e pertanto puo’ essere usato per distinguere cellule
vive da cellule morte
Il Side Scatter tende ad essere piu’ sensibile alle
inclusioni presenti all’interno della cellula e pertanto
puo’ essere usato per distinguere cellule granulate
da quelle non-granulate.
Proprietà tipiche del Forward e del Side Scatter
Sistema ottico del citofluorimentro
cella di flusso filtri dicroici
filtri bandpass
Fotomoltiplicatori(PTMT)
I fotomoltiplicatori, che raccolgono ed amplificano il segnale
luminoso filtrato e ricevuto. In questo specifico caso, il PMT1
funziona come scatter a 90 gradi, e raccoglie la luce
rifratta/diffratta (“scatterata”) dalle cellule.
I filtri dicroici, i “bandpass” filtri permettono il passaggio della luce solo ad una certa lunghezza d’onda.
Filtri ottici: rilevamento dei parametri fisici
Sorgente luminosa Luce trasmessa
Forward Scatter
Filtro dicroico/specchio a 45 gradi
Esempio di analisi dei leucociti e “gating” elettronico
Forward Scatter
90 D
egre
e S
catt
er
si possono facilmente identificare tre popolazioni: - linfociti, - monociti - granulociti.
Si puo’ disegnare un “gate” elettronico che permetterà in seguito l’analisi del segnale di fluorescenza proveniente soltanto dalla popolazione scelta
Leucociti del sangue periferico
Lo studio dei parametri fisici applicato a nuclei isolati (provenienti da cellule trattate con una soluzione ipotonica) permette anche di discriminare immediatamente cellule normali da cellule apoptotiche, i cui nuclei sono infatti condensati e raggrinziti, ovvero diminuiscono il FSC ed aumentano il SSC.
Nuclei di linfociti normali o apoptotici
Forward scatter
90 D
egre
e s
catt
er
I filtri ottici hanno il compito di pemettere il passaggio della luce emessa dai fluorocromi eventualmente legati alle cellule soltanto ad una certa lunghezza d’onda.
Esempi di filtri ottici
Standard Long Pass Filters
520 nm Long Pass Filter
Sorgente luminosa Luce trasmessa
Il filtro raccoglie la luce verde (tipicamente designata FL1),
Standard Short Pass Filters
575 nm Short pass Filter
Sorgente luminosa Luce trasmessa
Il filtro raccoglie la luce arancione (FL2).
< 575 nm
Standard Band Pass Filters
630 nm Band Pass Filter
Sorgente luminosa Luce trasmessa
620-640 nm
Un terzo filtro può raccogliere la luce emessa ad una lunghezza
d’onda ancora maggiore (in questo caso, nella regione del rosso
profondo).
In questo esempio, riferito ad un paziente con infezione da HIV, sono stati identificati i linfociti in base al Forward e Side scatter, e su queste cellule è stata fatta l’analisi delle sottopopolazioni con anticorpi anti-CD3 (in FL1), anti-CD4 (in FL2) ed anti-CD8 (in FL3).
Raccolta della fluorescenza da una popolazione
Fluorescence detectors
Laser
Il “Sorting cellulare”
FALS sensor
Fluorescence detector
Piastre cariche elettricamente
Cellule singole separate dentro diverse provette
FACS:FluorescenceActivatedCellSorting