basic and standardization in...
TRANSCRIPT
Hani Susianti
PDS PATKLIN MALANG
Advancing Urinalysis and Its Standardization with Urine
Flowcytometry
• Penelitian oleh The George Institute for Global Health (2015): setiap tahun> dua jutaorang di dunia meninggal (bisadicegah)
• Jumlah terbesar dari kematianyang dapat dicegah ini terjadi di: Cina, India, Indonesia, Pakistan
• Skrining urinalisis di Jepangmembantu mengurangi kasusCKD
1. PENDAHULUAN
( Liyanage et al,The Lancet, vol 385, 2015 )
Standardisasi urinalisis:
• Pra-analitik
• Analitik
• Pasca-analitik
(Iseki, JMAJ 54(1): 27–30, 2011)
• Pra-analitik
Pengumpulan sampel, transportasi,
penyimpanan )
• Analitik
(reagen, instrumen, QC, kalibrasi,
maintenance, staff competency)
• Pasca-analitik
(reporting , interpretasi)
STANDARDISASI : QUALITY CONTROL URINALISIS
TAHAP PRA-ANALITIK:PERUBAHAN URINE TANPA PENGAWET
TAHAP ANALITIK
1. MAKROSKOPIS
volume, warna, bau, kejernihan
2. KIMIA
3. MIKROSKOPIS
4. KULTUR
BERAT JENIS
Prinsip : pengukuran konsentrasi ion di urin (polielektrolit)Menilai kemampuan ginjal dalam mengkonsentrasikan urin
Prinsip Pemeriksaan
Perkembangan Pemeriksaan
Perlu diperhatikan
BJ cenderung meningkat : - Proteinuria (100-500 mg/dl), ketoasidosis
BJ cenderung menurun : - Glukosa > 1000 mg/dl, urea yang berlebihan
Pembacaan scr visual : BJ ditambah 0,005 jika PH urin ≥ 7
Refraktometer pada autonalyser urine
Berdasar reaksi ion H dengan tes strip
(berisi Methyl red, phenolphtalein dan bromthymol
blue)
Perhatikan
Manfaat
Prinsip
Membantu menilai kemampuan tubulus ginjal
mempertahankan kadar ion hidrogen secara
normal
( PH urin normal : 4,6 sampai 8)
PEMERIKSAAN PH
PH meningkat : urine yang dibiarkan lama,
hilangnya karbon dioksida & pertumbuhan bakteri
dalam urine
PH menurun : urin yang berlebihan pada tes strip
membawa bufer asam pada tes protein ke tes PH
Protein
Prinsip : Indikator (tetrabromphenol blue) + albumin perubahan warna (protein error of indicator)
Prinsip Pemeriksaan
Perkembangan Pemeriksaan
Perlu diperhatikan
Positif palsu : urin mengandung pus dan eritrosit, kontaminasi dg sekret vagina, menstruasi, mucus atau cairan sperma, bufer urin yang alkali, penggunaan obat tertentu
Negatif palsu : urin sangat encer
Rasio albumin/kreatinin (ACR) dan protein/kreatinin (PCR) urin dalam 1 dipstik pemeriksaan urin rutin
• Metode oksidasi glukosa spesifik & peroksidase•Glukosuria : kadar glukosa darah > 160-180 mg/dl
Kadar glukosa darah, laju filtrasi glomerular, kecepatan reabsorbsi tubular dan aliran urin
Positif palsu : deterjenNegatif palsu : sodium flourida, asam askorbat dan keton dalam jumlah banyak, urin yang dibiarkan terlalu lama & BJ yang tinggi
PRINSIP DIPENGARUHI PERHATIKAN
Pemeriksaan Glukosa
KETON
Prinsip : asam asetoasetat + senyawa nitroprusid warna ungu
Prinsip Pemeriksaan
Perlu diperhatikan
Manfaat
Pemeriksaan keton urin pada DM membantu diagnosis awal ketoasidosis dan koma diabetikBenda keton yang terdapat pada keadaan ketonuria : aseton, asam β hidroksibutirat & asam asetoasetat
Positif palsu : adanya phenilketon, captopril, grup sulfhydril dllKeadaan asidosis : penilaian keadaan ketosis terlalu rendah asidosis akan membentuk asam β hidroksibutiratNegatif palsu : urin dibiarkan terlalu lama
Bilirubin + diazonium salt kompleks berwarna coklat sampai merah(Bilirubinuria : bila bilirubin plasma > 2 mg/dl)
Perhatikan
Manfaat
Prinsip
Menilai kerusakan parenkim hati,
gangguan ekskresi bilirubin
PEMERIKSAAN BILIRUBIN
Negatif palsu : vitamin C , asam salisilat, sampel yang terpapar sinar matahari Positif palsu : rifampisin dan piridium
Urobilinogen + diazonium salt warna merahUrobilinogen dibentuk bakteri usus dari bilirubin terkonjugasi
•Hasil tes positif : urobilinogen padakadar abnormal dalam sirkulasi karena kerusakan/disfungsi hati
Positif palsu : warna urin merah oranye, urin asam & adanya senyawa azo GantrisinNegatif palsu : terdapat formalin, urin yang dibiarkan terlalu lama urobilinogen tidak stabil jika terpapar cahaya dan udara
Urobilinogen
PRINSIP MANFAAT PERHATIKAN
DARAH
Heme akan mengkatalisis oxidized chromogen warna hijau(Prinsip : reaksi peroksidase, deteksi kadar hb 0,015 – 0,062 mg/dl)Tes positif : jml eritrosit abnormal (hematuria), hemoglobinuria atau mioglobinuria
Prinsip Pemeriksaan
Perlu diperhatikan
Manfaat
Penyebab hematuria: renal, postrenal, ekstra renal
Negatif palsu : urin tidak dikocok baik saat preparasi ,
adanya formalin
Positif palsu : urin terkontaminasi deterjen/pemutih
(hipokhlorit ), mikrobal peroksidase krn ISK
LEKOSIT ESTERASE
Prinsip : esterase di leukosit akan memecah indoxyl ester bereaksi dengan diazonium salt membentuk warna violet
(mendeteksi kadar hemoglobin 0,015 – 0,062 mg/dl urin)
Prinsip Pemeriksaan
Perlu diperhatikan
Manfaat
Mendeteksi leukosit esterase yang dihasilkan sel granulosit(Leukosit yang utuh/lisis dapat terdeteksi dengan tes ini)
Positif palsu : formaldehid, imipenam, meropenam, asam clavulanic , nitrofurantoin, bilirubin urin yang positif Negatif palsu : protein urin > 500 mg/dl, glukosa > 2 g/dl, penggunaan obat cefalexin dan gentamisin dosis tinggi
Reaksi nitrit + tetrahidrobenzoquinoline warna merah jambu
• Hasil positif : terdapat bakteri yg mereduksi nitrat nitrit
• Sebagian besar enterobactericeae mengubah nitrat menjadi nitrit, tidak semua bakteri di kandung kemih mengubah nitrat nitrit
Positif palsu : kontaminasi sampel, proliferasi bakteri krn sampel lama, sampel berwarna merahNegatif palsu : bakteri yang tidak mengubah nitrat menjadi nitrit, vitamin C, urobilinogen atau PH rendah (< 6)
Nitrit
PRINSIP MANFAAT PERHATIKAN
Hal yang perlu diperhatikan pada pemeriksaan dipstik
• Volume, waktu reaksi & pembacaan harus tepat
• Cahaya ruangan pembacaan
• Kemampuan staf berbeda utk membaca
• Warna intrinsik urin
• Kesalahan pelaporan hasil
• Sampel urin diperiksa kurang dari 1 jam
• Perbedaan nilai pada dipstik
URINE PARTICLES OF NEPHROLOGICAL IMPORTANCE
17
PEMERIKSAAN ERITROSIT
• Eritrosit berbentuk bikonkaf, Ø ± 7 mm, warna agak kekuningan
• Nilai normal <3/LPB
• Bentuk eritrosit : normal (eumorfik) atau dismorfik (autoanalyzer membantumembedakan)
• Eritrosit dismorfik kemungkinan terjadi pada kelainan glomerular (glomerulonefritis) terjadi destruksi eritrosit saat melewati struktur glomerular yang abnormal
• Bentuk : bulat, padat dan bergranula• Jumlah normal : kurang dari 5/LPB• Kelainan morfologi lekosit : Sel Gliter• Leukosit yang berbentuk clumping,
kemungkinan infeksi akut (pielonefritis, sistitis, atau urethritis), dalam pelaporanpenting disebutkan
• Leukosit akan menuju ke area peradangan, karena bersifat ameboiddapat menembus daerah yang berdekatan dengan tempat peradangan
PEMERIKSAAN LEUKOSIT
• Terdiri : sel tubuler, sel transisional & sel skuamus
• Sel tubuler : dari ginjal, > leukosit , inti besar berbentuk oval atau bulat.
Jumlah (>15 per 10 LPB) : ggn renal / trauma tubular, sindroma nefrotik (oval fat bodies)
• Sel transisional : dari ureter , kandung kemih, inti besar, ukuran sel lebih kecil dari sel skuamus.
SEL EPITEL
• Sel epitel skuamus : dari kulit atau uretra distal, vagina, perineum dan preputium
Diameter 30-50 μm, bentuk persegi/ bulat dg inti ditepi
Jumlah sangat meningkat kontaminasi dari kulit
• Silinder terbentuk di tubulus kontartus distal
• Faktor pendukung terbentuknya adalah aliran urin yang lambat, kadar garam yang tinggi, PH yang rendah, dan terjadinya denaturasi/presipitasi protein
• Silinder hialin terutama terbentuk dari mukoprotein ( protein Tamm Horsfall ) yang disekresi oleh sel tubulus dapat timbul pada orang yang sehat
PEMERIKSAAN SILINDER
• Silinder granular dan silinder lilin diperkirakan terbentuk dari sel tubulus renal yang berada dalam silinder yang mengalami degenerasi
• Silinder eritrosit : nampak pada glomerulonefritis.
• Silinder leukosit : nampak pada pyelonefritis akut
• Adanya bermacam-macam silinder kerusakan & dilatasi tubulus (tahap akhir penyakit ginjal kronik)
• Bakteri sering terdapat di dalam sampel urin krn adanya flora normal di vagina atau meatus eksternal urethra dan juga kemampuan bakteri untuk berkembang dengan cepat.
• Diagnosis bakteriuria ditegakkan dengan kultur.
• Adanya bermacam-macam jenis bakteri kemungkinan menunjukkan adanya kontaminasi, kecuali pada sampel pasien yang dipasang kateter
PEMERIKSAAN BAKTERI
Pemeriksaan Jamur (mikroskopis)
• Adanya jamur di urin kemungkinan suatu kontaminasi atau benar-benar suatu infeksi jamur.
• Jamur kadang sulit dibedakan dengan eritrosit dan kristal, namun jamur cenderung membentuk suatu budding
• Jamur yang sering adalah jenis kandida, yang kemungkinan membentuk kolonisasi di kandung kencing, urethra atau vagina.
• Kristal yang sering nampak pada orang sehat adalah kalsium oksalat, tripel phosphat dan amorf phosphat.
• Kristal yang jarang nampak adalah sistin, tirosin dan leusin
PEMERIKSAAN KRISTAL (MIKROSKOPIS)
1. Persiapan sampel
NCCLS : 12 ml urin disentrifugasi 450g (5 menit), buang
supernatan, sisakan 0,4 ml
JCCLS : 10 ml urin disentrifugasi 500g (5 menit), buang
supernatan, sisakan 0,2 ml
2. Unsur sedimen dalam supernatan setelah sentrifugasi
500g (5 menit) : bakteri 43%, eritrosit 28%, leukosit 18%, silinder 16% dan
epitel 3% (Ishii, 2005)
HAL PENTING PADA PEMERIKSAAN URINE
PERLU STANDARDISASI
PERBEDAAN PRESISI AUTOANALYZER (UF-1000)DAN MIKROSKOPIS MANUAL
Xiang et al, Clin. Lab. 2012;58:1-5
PEMERIKSAAN SEDIMEN URIN DENGAN
AUTOANALISER
Kelemahan pemeriksaan mikroskopis : Presisi kurang (variasi hasil pemeriksaan antar
pemeriksa)Membutuhkan waktu cukup banyak
Pemeriksaan secara mikroskopik masih diperlukan, khususnyauntuk mengevaluasi sel dan silinder yang terdapat di urin
CONVENTIONAL vs AUTOMATED
No CONVENTIONAL AUTOMATED (UF 500i)
1 Minimum 10 ml samples Minimum 4 ml samples
2 Needs a centrifuge No centrifuge needed
3 Needs decanting No decanting needed
4 Observer findings variance No variance in findings
5 No quality control Quality control available
30
• Format pelaporan berisi nilai normal (standard internasional : /uL) dan metodepemeriksaan
• Prosedur tertulis untuk melaporkan, mengevaluasi, dan mengoreksi kesalahan harusada.
• Laporan hasil mudah untuk ditafsirkan
STANDARDISASI PASCA ANALITIK
Pelaporan Hasil
AUTOANALYZER : Urine Flowcytometry
Laser Diode
Collimating Lens
Condenser
Lens
Condenser
Lens
Condenser
Lens
Flow cell
Photo Multiplier
Photo
Diode
Photo
Diode
Pin
Hole
Beam
Stopper
Dichroic
Mirror
Spectrum
Filter
Side Fluorescent
Light System
Side Scattered
Light System
Forward Scattered
Light System
Material genetik
Kompleksitas
Ukuran
Analysis ParameterRBCWBC
ECCASTBACT
Research Parameters X’TALYLCSRC
PATH.CASTMUCUSSPERMCond
• Pengenalan laser biru : meningkatkan kemampuan skrining bakteri
• Parameter diagnostik tambahan : casts and epithelial
• Pemeriksaan kimia UC-3500: menawarkan hingga 11 parameter strip uji
(termasuk albumin dan kreatinin dan lima parameter, dan membedakan
warna abnormal antara RBC dan hemoglobin)
Urine Flowcytometry
Staining in Surface Channel(UF-Fluorocell SF)
Following material is stained by the Lipid Bilayer MembranePorous Protein Agglutinate ( CASTs )
HYALINE CASTLipid Bilayer Membrane
THE POWER OF BLUE RESULTS
Nucleic acid specific
staining
Point 1Minute holes are made in the cell membrane while maintaining the morphology of the cells.
Point 2The dye enters the cell through these minute holes.
Point 3The nucleic acids are specifically stained. Screened on the basis of the stainability of
components containing nucleic acids
Cell membrane
DNA
36
THE POWER OF BLUE RESULTS
Deteksi ISK dengan Urine Flow cytometry analyzers
• Berdasarkan deteksi leukosit dan bakteri.
• Mengurangi jumlah sampel yang perlu dikultur (28% to 60%)
• Mengurangi resep antibiotikempiris yang tidak perlu
• Membantu membedakankemungkinan bakteri gram positifatau gram negatif
FLOWCYTOMETRY METHOD ON URINALYSIS : Scattergram B1
• Can be used to estimate gram type of bacteria
• Based on angle 30˚
• Can reduce inappropriate antibiotic using
Low Angle Pattern High Angle Pattern Board Angle Pattern
Gram negative bacteria Gram positive bacteria Mixed, or
Unclassified clearly
39
41
UTI STUDIES USING URINE FLOWCYTOMETRY
SIMPULAN
• Standarisasi urinalisis meliputi pra-analitik, analitik dan pasca-analitik
• Pemeriksaan kimia urine perlu memperhatikan manfaat, positif palsudan negatif palsu
• Pemeriksaan sedimen urine perlu melaporkan eritrosit dismorfik/ eumorfik, jenis epitel (sel tubulus), jenis silinder
• Flowcytometry urine autoanlyzer membantu standardisasipemeriksaan urine pada tahap pra-analitik, analitik dan pasca-analitik
• Flowcytometry urine autoanlyzer membantu memperkirakan ISK
TerimaKasih
Resume of essential differences between
BLD/RBC, LE/WBC, NIT/BACT and PRO/CAST
44
Blood v RBC Leucocyte esterase v WBC
Nitrite v Bacteria Protein v Cast
Blood RBC LE WBC Nit Bact Pro Cast
Different compounds are measured
Hemo globin
Intact RBC
LE which is released by PMN-WBC
All intact WBCs
Produced by gram negative bacteria
Gram negative and gram positive
Most sensitive to albumine
Comprised of different protein
Sensitivity 5-20 RBC/uL
1 RBC /ul
5-15 WBC/uL
1 WBC/uL
Depend on dietary nitrate and time of chemical conversion to occur
5 bacteria/uL
low levels of albumin not detected
1 cast/uL