basistechnieken van de recombinant-dna-technologie

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

door Peter RoelsMonitoraat Wetenschappen

K.U. Leuven

Deel 1

Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

• DNA-dubbelhelix• inleiding: 3 pijlers• restrictiefragment-lengtepolymorfisme• Southern-vlektechniek• genkloning• polymerase-kettingreactie• DNA-sequentiebepaling



DNA-dubbelhelix


DNA-dubbelhelix

5’ TGA 3’3’ ACT 5’


3 pijlers in derecombinant-DNA-technologie

• complementaire basenparing• restrictie-enzym of restrictie-endonuclease• DNA-polymerase


complementaire basenparing

steeds:adenine – thymine(2 H-bruggen)

guanine – cytosine(3 H-bruggen)

van groot belang in biologische werking, o.a.:- DNA-replicatie- RNA-synthese

cruciaal in vele technieken!



temperatuur

absorbantie

DENATURATIE

ds DNA

es DNA



temperatuur

absorbantie

Ts



temperatuur

absorbantie

Ts < Ts< Ts

GC-gehalte



temperatuur

absorbantie

RENATURATIE

es DNA

ds DNA



• ook tussen niet perfect complementaire strengen is renaturatie (hybridisatie) mogelijk

• algemene regel:- smelttemperatuur van deze dubbelhelix lager naarmate aantal complementaire basen afneemt - hoe meer de strengen complementair aan elkaar, hoe hoger de temperatuur van het medium vóór denaturatie


restrictie-enzymen

• herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp)

• herkenningssequentie is palindroom

5’...GAATTC...3’3’...CTTAAG...5’


restrictie-enzymen

...G AATTC...

...CTTAA G...

• herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp)

• herkenningssequentie is palindroom

• vaak met vorming “kleverige eindjes”

5’...GAATTC...3’3’...CTTAAG...5’


DNA-polymerase

• maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs

• steeds dubbelstrengs DNA nodig als start

3’...CTTAAG... 5’5’...GA 3’

• steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan 3’-uiteinde


DNA-polymerase

• maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs

• steeds dubbelstrengs DNA nodig als start

3’...CTTAAG... 5’5’...GA 3’ ATTC...

• steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan 3’-uiteinde


restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)

• digestie van DNA met restrictie-enzym



• digestie van DNA met restrictie-enzym• gelelektroforese (met agarosegel)


gelelektroforese: opzet stalen

1 2 3


gelelektroforese: opzet stalen 1 2 3


-

+

gelelektroforese: spanning


-

+

gelelektroforese: visualisatie

1000

500

300

200

100


-

+

gelelektroforese: visualisatie



• digestie van DNA met restrictie-enzym• gelelektroforese (met agarosegel)• interpretatie


gelelektroforese: interpretatie 1 2 3

400

50


gelelektroforese: interpretatie

5’…CAACTG…3’3’…GTTGAC…5’

5’…CAATTG…3’3’…GTTAAC…5’

5’…CAATT 3’3’…G 5’

5’ G…3’3’ TTAAC…5’

1 2 3

400

50



400

50


gelelektroforese: interpretatie

5’…CGGTCTAGGTG…3’3’…GCCAGATCCAC…5’

5’…CGGGGTG…3’3’…GCCCCAC…5’

5’…CGGTCTAGGTG…3’3’…GCCAGATCCAC…5’

1 2 3

400

50



400

50


resultaat na digestie van totaal genomisch DNA

1 2 3

400

50


Southern-vlektechniek

nylondrager

blotting

autoradiogram

+ sonderadiografie

5’…AACTCAGCTG … 3’

5’ … AACTC 3’

5’ AGCTG … 3’

3’ GAGTCG 5’

3’ GAGTCG 5’

3’ GAGTCG 5’

agarosegel


Southern-vlektechniek:afkomst sonde (probe)

• uit gekende aminozuursequentie van eiwit (degeneratie code!)

• uit mRNA, na omzetting in cDNA• sonde gebruikt in een ander, verwant

organisme (voldoende complementair!)


5’ GAATTC 3’3’ CTTAAG 5’

genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment

lacZ-gen (enzym katalyseert omzetting “X-gal” naar blauwe kleurstof)

ampicillineresistentiegenpUC18



5’ GAATTC GAATTC 3’3’ CTTAAG CTTAAG 5’




5’ GAATTC GAATTC 3’3’ CTTAAG CTTAAG 5’

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG




+ ampicilline+ X-gal

bacterie – plasmide = niet-AB-resistent

plasmide zonder donor-DNA = blauw



blotting radiografie

basistechnieken van de recombinant-dna-technologie

Documents