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  • Instituto Superior Tcnico

    Mestrado Integrado em Engenharia Biomdica 2 Ano

    Bioqumica e Biologia Molecular

    Car

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    Rel

    at

    rio

    TP

    2

    Turma D - Grupo 1:

    ngelo Dias, n 65087 Mrcia Santos, n 65111

    Mariana Branco, n 65112

    30 Outubro de 2009 Prof.: Jorge Leito

  • 2

    Fig. 2 - Projeces de Fisher das formas D e L do glicerdeo.

    Resumo

    A invertase catalisa a hidrlise da sacarose nos seus monmeros constituintes. Deste modo, na

    actividade laboratorial, procedeu-se caracterizao cintica da invertase (beta-fructofuranosidase) a

    partir do estudo do efeito da concentrao de sacarose (substrato) na actividade da enzima, em seis

    ensaios. Analisados os resultados obtidos e recorrendo equao de Lineweaver-Burk obteve-se

    e .

    Introduo terica

    Hidratos de Carbono

    Os hidratos de carbono so compostos ternrios de carbono, hidrognio e oxignio, com frmula

    emprica (podendo ).

    As suas unidades estruturais so os

    monossacardeos ou oses, classificados de

    acordo com o nmero de carbonos da

    molcula (por exemplo, um monossacardeo

    de cinco carbonos denomina-se pentose) e

    que possuem vrias funes lcool e uma

    funo redutora, aldedo ou cetona. Se a

    funo carbonlica for um aldedo, como na

    glucose, o monossacardeo denomina-se

    aldose, se for uma cetona, como na frutose,

    designa-se cetose (Fig.1).

    No que diz respeito isomeria, temos de ter em conta que o

    gliceraldedo possui um tomo de carbono assimtrico ou quiral,

    apresentando duas configuraes: D e L, de acordo com as Projeces de

    Fisher. Assim, as letras D e L referem-se configurao do penltimo

    tomo de carbono do extremo da cadeia oposto ao grupo carbonilo, ou

    seja, se o grupo OH estiver do lado direito temos uma forma D, caso

    esteja do lado esquerdo L (Fig.2).

    Contudo, em soluo aquosa, e portanto no metabolismo, os

    monossacardeos esto, maioritariamente, ciclizados. A ciclizao

    ocorre, aps hidratao, atravs da eliminao de uma molcula de

    gua entre o OH que ficou ligado ao carbono 1 das aldoses (ou o

    carbono 2 das cetoses) e o OH ligado ao penltimo ou ao antepenltimo carbono da estrutura, formando-

    se um hemiacetal. De acordo com a posio do segundo OH envolvido, tratar-se- de uma forma piranose

    ou furanose (Fig.3).

    Fig. 1 - Funo aldedo e funo cetona.

  • 3

    Na representao cclica encontramos mais um carbono assimtrico (1 para as aldoses e 2 para as

    cetoses). Conforme a posio, na projeco de Fisher, do oxidrilo ligado a esse carbono do mesmo lado

    ou do lado contrrio ao do oxidrilo que determina a classificao em D ou L teremos,

    respectivamente, o ismero ou o ismero . Na representao cclica de Tollens, e para as formas D, os

    ismeros so aqueles em que o oxidrilo ligado ao carbono antissimtrico est direita, enquanto que

    os ismeros so representados com este oxidrilo esquerda. Para a representao cclica de Haworth

    os grupos oxidrilo que esto direita na representao de Tollens, so representados para baixo e os que

    figuram esquerda so representados para cima (Fig.4).

    Os monossacardeos podem ainda estabelecer ligaes

    entre si denominadas glicosdicas (Fig.5), de origem

    covalente, originando polissacardeos, classificados de

    acordo com o nmero de monossacardeos que os

    constituem (por exemplo, a ligao de trs

    monossacardeos origina um trissacardeo). No que diz

    respeito aos polissacardeos destacam-se trs

    particularmente importantes: o amido, o glicognio e a

    celulose. O amido a forma de reserva glucdica nos

    vegetais e o glicognio a forma equivalente nos animais. A

    celulose a substancia responsvel pela estrutura das

    paredes celulares dos vegetas e no hidrolisvel pelas

    enzimas presentes no nosso sistema digestivo.

    Fig. 5 - Ligao glicosdica

    Fig. 3 - Ciclizao e formao hemiacetal

    Fig. 4 - Representao de Haworth

  • 4

    Enzimas

    As enzimas so protenas de grandes dimenses especializadas na catlise de reaces biolgicas, isto

    , aceleram a velocidade de reaco diminuindo a energia de activao. Podem ser totalmente proteicas

    ou constitudas por uma parte proteica (apoenzima) e outra parte no proteica, os cofactores. Estes

    ltimos podem ser ies metlicos, grupos prostticos ou coenzimas e so responsveis pela

    transformao estrutural do substrato.

    Apesar de participarem nas reaces, as enzimas no alteram o equilbrio das mesmas e encontram-se

    inalteradas no final da reaco.

    Estes biocatalisadores so compostos por um centro activo ou sitio activo que constitudo pelos

    aminocidos que esto em contacto com as molculas (substrato) que sero catalisadas. Este local divide-

    se em local de fixao onde a enzima se liga ao substrato por ligaes fracas e em centro cataltico no qual

    o substrato sofre a reaco qumica.

    As enzimas no reconhecem todas as molculas, pelo contrrio, eles reconhecem especfica e

    selectivamente os seus substratos entre todas as outras molculas. Esta especificidade controlada por

    um encaixe nico entre enzima e substrato.

    Existem dois modelos para a interaco enzima-substrato: o modelo chave-fechadura, e o modelo de

    encaixe induzido. O primeiro assume que somente um substrato com uma conformao apropriada

    consegue encaixar-se no centro activo da enzima. Ao contrrio, no modelo do encaixe induzido a enzima

    molda o seu centro activo a fim de conseguir um encaixe com a molcula.

    O trabalho enzimtico pode ser regulado atravs de inibidores e/ou activadores- regulao alostrica-

    o que pode ser benfico do ponto de vista da poupana energtica dos organismos.

    A classificao das enzimas baseia-se no tipo de reaco que catalisam, dividindo-se assim em seis

    categorias:

    Oxiredutases;

    Transferases;

    Hidrolases;

    Liases;

    Isomerases;

    Ligases.

    Das hidrolases faz parte a enzima invertase ou beta-fructofuranosidase

    (EC 3.2.1.2.6), responsvel pela hidrlise da sacarose nos seus monmeros

    constituintes, a glucose (acar redutor) e a frutose. Por definio, uma

    unidade (U) de invertase hidrolisa 1 mmol de sacarose a glucose e frutose

    por minuto a pH=4.6 e a 25C.

    Uma grande quantidade de microorganismos produz invertase (Fig.6),

    contudo comercialmente biosintetisada atravs da Sacharomices cerevisae

    ou da Sacharomices carlsbergensis. Contrariamente maioria das enzimas, a

    invertase tem uma elevada actividade no intervalo de pH 3.5-5.5 com um pH

    ptimo em 4.5 e um mximo de actividade a aproximadamente 60C. Esta

    enzima utilizada principalmente na indstria alimentar onde a frutose

    preferida em relao sacarose, porque mais doce e no cristaliza to

    facilmente. Uma outra utilizao da invertase na produo de mel artificial.

    Fig. 6 Enzima invertase.

  • 5

    Aps uma hidrlise de sacarose para se poder determinar a quantidade de glucose presente numa

    soluo utiliza-se reagente DNS e a tcnica de espectofotometria. O cido 3,5 dinitrosalicilico (DNS) na

    presena de um acar redutor, a glucose, reduzido por este a 3-amino-5-nitrosalicilico que apresenta

    uma cor laranja/vermelho. Finalmente, com o espectofotometro possvel determinar a absorvncia que

    permite calcular a concentrao do acar redutor por intermdio de um grfico de ajuste linear que

    relacione estas duas grandezas.

    Cintica Enzimtica

    A actividade enzimtica pode ser avaliada atravs de vrios modos, por exemplo com base na

    actividade molar, ou seja o nmero de moles de substrato transformado por mole de enzima por unidade

    de tempo, ou at por unidade enzimtica, que a quantidade de enzima que catalisa a transformao de

    um micromole de subtrato num minuto, a 25C, nas condies ptimas de pH e concentrao de

    substrato. Assim podem-se obter grficos substrato transformado em funo do tempo, nos quais se

    conclui que existe uma dependncia linear entre a velocidade inicial de uma reaco enzimtica e a

    concentrao de enzima na reaco.

    Foram Leonor Michaelis e Maud Menten, quem primeiro estudou estas relaes, apresentando em

    1913 um estudo quantitativo das variaes da velocidade de uma reaco de acordo com o aumento da

    concentrao de substrato na mesma (Fig.7). Assim, atravs da equao

    , em

    que E a enzima, S o substrato e E-S o complexo enzima-substrato. Do estudo desta reaco surge a

    constante de Michaelis

    , que uma constante de equilbrio para a dissociao do

    complexo E-S, onde [E] a concentrao de enzima livre, [S] a concentrao de substrato e [E-S] a

    concentrao de enzima que se ligou ao substrato. Substituindo na expresso de [E]=[E0]-[E-S], fica

    .

    Como se tinha observado que velocidade da reaco era

    directamente proporcional concentrao de enzima

    ligada, significava que (E0 a

    concentrao total de enzima ligada ao substrato, e

    velocidade mxima corresponde a do momento em que

    todas as enzimas esto ligadas ao substrato) e, portanto,

    , que substituindo na expresso de fica

    . Esta equao, denominada Equao de

    Michaelis Menten permite no s obter o valor de

    como tambm de (valores estes compreendidos entre

    10-8M e 10-2M). Note-se que esta constante permite medir a

    afinidade da enzima para o substrato, que igual a 1/ , ou

    seja, se a afinidade for elevada baixo, sendo necessria

    uma baixa concentrao de substrato para se atingir a

    velocidade mxima.

    Mais uma vez, obtendo um grfico que relacione a velocidade da reaco com a concentrao de

    substrato, deduz-se que se

    , ento =[S], por outras palavras igual concentrao de

    substrato para qual a velocidade igual a metade da velocidade mxima.

    Fig. 7 Grfico Que relaciona Velocidade da reaco com a concentrao de substrato.

  • 6

    Fig. 8 Grfico que traduz a equao de Lineweaver e Burk

    Fig. 9 Efeito da temperatura na actividade enzimtica.

    Fig. 10 Efeito do pH na actividade enzimtica.

    Por serem equaes e grficos que no eram lineares,

    Lineweaver e Burk foram os primeiros a descobrir que bastava

    inverter os valores de da concentrao de substrato e da

    velocidade, para que os clculos se tornassem mais fceis e

    simples, exigindo menos leituras experimentais. Por isso,

    isolando

    no primeiro membro da equao de Michaelis-

    Menten vem

    , designada por

    equao de Lineweaver-Burk. Note-se por fim, que se 1/v = 0

    ento temos o valor de -1/ e se 1/[S] = 0 corresponde a

    1/vmax, que so os valores necessrios para estudar a

    actividade cintica das reaces enzimticas (Fig.8).

    Influncia da temperatura e do pH na actividade enzimtica

    A velocidade da reaco enzimtica condicionada

    por diversos factores, entre os quais o pH e a

    temperatura do meio em que se d a reaco. Por um

    lado, a velocidade de todas as reaces aumenta com o

    aumento da temperatura, sendo as reaces

    endergnicas as mais favorecidas. Ao aumentarmos a

    temperatura aumentamos a constante de equilbrio, e

    por conseguinte a velocidade da reaco. No entanto, a

    partir de um determinado valor de temperatura a

    protena enzimtica comea a desnaturar, diminuindo a

    sua actividade. Verifica-se ento que existe uma

    temperatura ptima para qual a reaco tem velocidade

    mxima, e corresponde a um compromisso entre a temperatura que favorece a reaco e a temperatura

    de desnaturao da enzima.

    Por outro lado temos o pH do meio, o qual

    influencia directamente a reaco enzimtica. Assim,

    pH extremos (bsicos ou cidos) modificam

    irreversivelmente a estrutura da enzima,

    desnaturando-a ou modificando a ligao entre

    apoenzima (parte no proteica do enzima equivalente

    aos cofactores orgnicos) e coenzima (parte proteica

    da enzima). O pH influencia tambm o estado de

    ionizao do substrato e dos aminocidos do centro

    activo em geral.

    Absorvncia

    A absorvncia uma propriedade que mede a capacidade de um material de absorver radiao com

    uma frequncia especfica, avaliada atravs de aparelhos designados por espectrofotometros, que se

    baseiam na propriedade que muitas espcies tm de absorver radiao ultravioleta e visvel.

  • 7

    Fig. 11 Absorvncia de um substncia de concentrao c e coeficiente de absoro .

    A absorvncia, para um determinado comprimento de onda,

    dada por , em que I a intensidade de luz que

    atravessa a soluo no espectrofotometro e I0 a intensidade

    de luz inicial incidente na amostra. uma grandeza

    adimensional por ser o quociente de duas intensidades. Uma

    das relaes mais importantes da absorvncia para a qumica

    atravs da Lei de Beer, que diz que a absorvncia

    directamente proporcional concentrao da amostra. Por

    outra palavras, , onde l (em cm) distncia que a luz

    percorre dentro da amostra, c (em mol L-1) a concentrao da

    amostra e o coeficiente de absoro molar (em L mol-1 cm-1)

    da substncia.

    Finalmente, assinala-se que a linearidade entre a absorvncia e concentrao limitada por diversos

    factores qumicos e instrumentais, tais como: disperso da radiao devido presena de partculas na

    soluo ou desvios nos coeficientes de absoro molar devido a interaces intermoleculares entre

    molculas muito prximas, a utilizao radiao no totalmente monocromtica e possibilidade de

    fluorescncia da amostra, assim como alteraes do ndice de refraco das cuvetes e alteraes no

    equilbrio das solues analisadas.

  • 8

    Procedimento

    Material: Foi utilizado material comum de laboratrio, tais como pipetas de preciso, copos de vidro, tubos de

    ensaio, suportes e espectrofotometro. Procedimento experimental: A experincia consiste na caracterizao cintica da

    enzima invertase, e como tal estudou-se o

    comportamento da enzima em solues com

    diferentes concentraes de sacarose: 15, 30, 45, 60,

    75 e 100 g/l. Uma vez que para cada concentrao o

    procedimento igual, apenas se vai descrever para

    uma.

    Comeou-se por numerar 9 tubos de ensaio de 0 a 7

    e um branco e colocar num suporte para tubos de

    ensaio. Colocou-se 500 l de DNS (Fig.12, lado

    esquerdo) em todos os tubos de ensaio com uma

    pipeta de preciso, adicionando-se no final 500 l de

    Tampo de acetato (Fig.12, lado direito),

    exclusivamente no tubo de ensaio branco, tapando

    com uma tampa solta e agitando no vrtice (Fig.13,

    Azul).

    Iniciou-se a experincia pela concentrao mais

    baixa de sacarose, 15 g/l, em que se colocou 25 ml de

    soluo de sacarose no vaso reaccional, com agitador,

    em contacto com o thermomix, aparelho encarregue

    de termostatizar a soluo temperatura ptima de

    45C para a enzima actuar (Fig.13, Amarelo e Verde).

    No tubo 0 depositaram-se 500 l de sacarose,

    correspondente ao instante 0 exactamente antes da

    enzima actuar (retirou-se sacarose do vaso reaccional

    antes de se colocar a enzima), tapou-se o tubo e

    agitou-se no vrtice.

    Seguidamente preparou-se os cronmetros para

    iniciar a contagem no momento em que se adiciona ao

    vaso reaccional 500 l de soluo de enzima invertase.

    Ao fim de cada minuto retirou-se 500 l de soluo

    sacarose+invertase e colocou-se no tubo de ensaio

    respectivo (1 minuto corresponde ao tubo n 1),

    tapando e agitando tambm no vrtice (Fig.14).

    Fig. 12 Frasco de DNS e Tampo de acetato.

    Fig. 13 Vaso reaccional (Amarelo), thermomix (Verde), vrtice (Azul).

    Fig. 14 Tubo de ensaio numerados de 0 a 7, e um branco, quase no final da contagem dos 7 minutos.

  • 9

    Electroforese:

    Repetiu-se o procedimento at ao minuto 7,

    momento a partir do qual se colocaram os tubos de

    ensaio num suporte, dentro de uma panela com gua a

    ferver durante 5 minutos, a fim de promover a reaco

    entre o DNS e os acares redutores (Fig.15).

    Findos os 5 minutos colocaram-se os 9 tubos em gelo

    (Fig.16) durante mais 3 minutos, e finalmente adicionou-

    se 5 ml de gua destilada em cada tubo para diluir a

    soluo.

    Neste momento o grupo de alunos dividiu-se em dois,

    uns iniciaram novamente o procedimento anterior para

    outra concentrao de sacarose, e os restantes foram ler

    os valores de absorvncia no espectrofotometro a

    540nm (valor mximo de absorvncia para os compostos

    alaranjados Fig.17 formados por DNS e acares

    redutores). Para isso, utilizou-se uma clula fotomtrica

    ou cuvete para colocar a soluo de cada tubo, uma de

    cada vez. Primeiro utilizou-se a clula com soluo do

    tubo de ensaio branco, para calibrar a mquina,

    colocando-a no espectrofotometro nunca esquecendo

    de por as faces lisas viradas para os locais onde a luz iria

    incidir. Entre cada medio lavou-se a cuvete com a nova

    soluo do tubo seguinte, para certificar que os valores

    obtidos seriam os mais correctos (Fig.18).

    Depois de repetido o protocolo 6 vezes, para cada

    concentrao de sacarose, reuniram-se os dados sobre

    absorvncia e trocaram-se valores entre os grupos.

    Fig. 16 Tubos de ensaio em gelo durante 3 minutos.

    Fig. 15 Tubos de ensaio na panela durante 5 minutos.

    Fig. 17 Aspecto das solues depois de promovida a reaco com DNS.

    Fig. 18 Medio das absorvncias no espectrofotometro.

  • 10

    43,167188,167

    331,5446,5

    659,833801,5

    941,51078,167

    y = 150,42x + 34,833R = 0,9973

    0

    200

    400

    600

    800

    1000

    1200

    0 2 4 6 8[A

    ca

    res

    red

    uto

    res]

    (m

    g/l)

    Tempo decorrido (min)

    15g/l

    103,167

    358,167

    674,833

    668,167

    843,1671026,5

    1216,500

    1333,167

    y = 168,23x + 189,14R = 0,9737

    0200400600800

    1000120014001600

    0 2 4 6 8[A

    care

    s re

    du

    tore

    s] (

    mg/

    l)

    Tempo decorrido (min)

    30g/l

    Resultados Experimentais

    Apresentam-se as tabelas e os grficos construdos a partir dos valores registados e dos clculos efectuados. Primeiramente os grficos de acares redutores em funo do tempo decorrido, para cada uma das seis concentraes estudadas. De seguida construiu-se o grfico do inverso da velocidade em funo do inverso da concentrao.

    Concentrao: 15g/l

    Concentrao: 30g/l

    Tempo decorrido

    (min) Absorvncia

    Concentrao de acares redutores

    (mg/l)

    0 0,016 43,167

    1 0,103 188,167

    2 0,189 331,500

    3 0,258 446,500

    4 0,386 659,833

    5 0,471 801,500

    6 0,555 941,500

    7 0,637 1078,167

    Tabela 1 - Valores de absorvncia, tempo e concentrao de acares redutores para a concentrao inicial de 15g/l.

    Tempo decorrido

    (min) Absorvncia

    Concentrao de acares redutores

    (mg/l)

    0 0,052 103,167

    1 0,205 358,167

    2 0,395 674,833

    3 0,391 668,167

    4 0,496 843,167

    5 0,606 1026,500

    6 0,720 1216,500

    7 0,790 1333,167

    Grfico 1 - Concentrao de acares redutores por minuto, a partir de uma concentrao inicial de 15g/l de sacarose.

    Grfico 2 - Concentrao de acares redutores por minuto, a partir de uma concentrao inicial de 30g/l de sacarose.

    Tabela 2 - Valores de absorvncia, tempo e concentrao de acares redutores para a concentrao inicial de 30g/l.

  • 11

    134,833324,833

    523,167

    754,833

    973,167

    1201,5

    1433,167

    1786,5

    y = 230,44x + 84,972R = 0,9933

    0

    500

    1000

    1500

    2000

    0 2 4 6 8[A

    ca

    res

    red

    uto

    res]

    (m

    g/l)

    Tempo decorrido (min)

    45g/l

    181,5

    389,833573,167

    764,833948,167

    1124,8331319,833

    1518,167

    y = 188,63x + 192,33R = 0,9997

    0200400600800

    1000120014001600

    0 2 4 6 8[A

    care

    s re

    du

    tore

    s] (

    mg/

    l)

    Tempo decorrido (min)

    60g/l

    Concentrao: 45g/l

    Concentrao: 60g/l

    Tempo decorrido

    (min) Absorvncia

    Concentrao de acares redutores

    (mg/l)

    0 0,071 134,833

    1 0,185 324,833

    2 0,304 523,167

    3 0,443 754,833

    4 0,574 973,167

    5 0,711 1201,500

    6 0,850 1433,167

    7 1,062 1786,500

    Tabela 3 - Valores de absorvncia, tempo e concentrao de acares redutores para a concentrao inicial de 45g/l.

    Tempo decorrido

    (min) Absorvncia

    Concentrao de acares redutores

    (mg/l)

    0 0,099 181,5

    1 0,224 389,833

    2 0,334 573,167

    3 0,449 764,833

    4 0,559 948,167

    5 0,665 1124,833

    6 0,782 1319,833

    7 0,901 1518,167

    Tabela 4 - Valores de absorvncia, tempo e concentrao de acares redutores para a concentrao inicial de 60g/l.

    Grfico 3 - Concentrao de acares redutores por minuto, a partir de uma concentrao inicial de 45g/l de sacarose.

    Grfico 4 - Concentrao de acares redutores por minuto, a partir de uma concentrao inicial de 60g/l de sacarose.

  • 12

    174,833

    421,5613,167

    784,833983,167

    1246,5

    1479,8331598,167

    y = 206,59x + 189,69R = 0,996

    0200400600800

    10001200140016001800

    0 2 4 6 8[A

    ca

    res

    red

    uto

    res]

    (m

    g/l)

    Tempo decorrido (min)

    75g/l

    476,5686,5

    901,51068,167

    1206,5

    1486,51651,5

    1713,167

    y = 183,04x + 508,17R = 0,9895

    0200400600800

    100012001400160018002000

    0 2 4 6 8

    [A

    care

    s re

    du

    tore

    s] (

    mg/

    l)

    Tempo decorrido (min)

    100g/l

    Concentrao: 75g/l

    Concentrao: 100g/l

    Tempo decorrido

    (min) Absorvncia

    Concentrao de acares redutores

    (mg/l)

    0 0,095 174,833

    1 0,243 421,5

    2 0,358 613,167

    3 0,461 784,833

    4 0,580 983,167

    5 0,738 1246,5

    6 0,878 1479,833

    7 0,949 1598,167

    Tabela 5 - Valores de absorvncia, tempo e concentrao acares redutores para a concentrao inicial de 75g/l.

    Tempo decorrido

    (min) Absorvncia

    Concentrao de acares redutores

    (mg/l)

    0 0,276 476,500

    1 0,402 686,500

    2 0,531 901,500

    3 0,631 1068,167

    4 0,714 1206,5

    5 0,882 1486,500

    6 0,981 1651,500

    7 1,018 1713,167

    Tabela 6 - Valores de absorvncia, tempo e concentrao de acares redutores para a concentrao inicial de 100g/l.

    Grfico 5 - Concentrao de acares redutores por minuto, a partir de uma concentrao inicial de 75g/l de sacarose.

    Grfico 6 - Concentrao de acares redutores por minuto, a partir de uma concentrao inicial de 100g/l de sacarose.

  • 13

    0,006480,00594

    0,00434

    0,00530

    0,00484

    0,00546

    y = 26,563x + 0,0047R = 0,5377

    0,0E+0

    1,0E-3

    2,0E-3

    3,0E-3

    4,0E-3

    5,0E-3

    6,0E-3

    7,0E-3

    0,0E+0 1,0E-5 2,0E-5 3,0E-5 4,0E-5 5,0E-5 6,0E-5 7,0E-5 8,0E-5

    1/V

    elo

    cid

    ade

    ((l

    .min

    )/m

    g gl

    uco

    se)

    1/[Sacarose] (l/mg sacarose)

    Lineweaver-Burk

    Lineweaver-Burk

    [Sacarose] (g/l)

    [Sacarose] (mg/l)

    (l/mg)

    Velocidade (mg/(l.min))

    ((l.min)/mg)

    15 150,42

    30 168,23

    45 230,44

    60 188,63

    75 206,59

    100 183,04

    Tabela 7 - Concentraes de sacarose e velocidades.

    Grfico 7 - Grfico de Lineweaver-Burk para a experincia realizada.

  • 14

    Clculos

    A partir dos valores de absorvncia medidos no espectofotmetro e da equao de ajuste do grfico

    de absorvncia em funo da concentrao de acares redutores: dado,

    retiraram-se as concentraes de acares redutores, substituindo em os valores de absorvncia e

    resolvendo em ordem a .

    Recorrendo Equao de Lineweaver-Burk,

    deduzida no Fundamento Terico e notando que

    corresponde ordenada na origem do grfico 7,

    construdo com os valores experimentais e que

    corresponde ao declive. Substituindo vem:

    , tendo em conta

    que a massa molar da glucose 180,16 g/mol.

    , tendo

    em conta que a massa molar sacarose 342,296 g/mol.

  • 15

    Discusso

    Atravs da anlise e comparao dos valores de absorvncia determinados pelo espectofotmetro,

    verificou-se, tal como espectvel, que a concentrao glucose resultante da hidrlise da sacarose,

    aumentou com o decorrer do tempo. Todavia, a correspondncia do tempo com a concentrao de

    glucose no est totalmente correcta, visto que a partir do momento que retirada a soluo do vaso

    reaccional at esta ser colocada no tubo em contacto com a soluo tampo de acetato decorrem alguns

    segundos, durante os quais a enzima invertase continua a actuar. Assim, as concentraes

    correspondentes aos tempos das tabelas sero um pouco mais baixas que aquelas que esto

    apresentadas.

    A variao da concentrao de produtos em funo do tempo apresenta uma correlao

    aproximadamente linear, no entanto teoricamente os valores de concentrao deveriam tender, aps um

    intervalo de tempo suficientemente grande, para o valor de concentrao inicial de sacarose. Como os

    valores de concentrao de glucose ao final de sete minutos so muito inferiores ao seu valor final, os

    grficos acima construdos no permitem chegar a essa concluso.

    A partir do grfico de Lineawer-Burk construdo para esta experincia verifica-se que, apesar de alguns

    valores estarem relativamente em desacordo com o expectvel (longe da recta de ajuste ou decrescerem

    ao invs de crescerem) o seu declive positivo, donde se conclui que, na generalidade, um aumento da

    concentrao de substrato corresponde a um aumento na velocidade. Idealmente, medida que a

    concentrao de substrato aumenta, a velocidade deveria aumentar. Porm, os resultados obtidos

    distanciam-se ligeiramente da cintica enzimtica descrita por Lineweaver-Burk, evidenciando os erros

    sistemticos e acidentais presentes na realizao do trabalho laboratorial.

    O valor de KM calculado ( M) est dentro do limite terico previsto (10-8 a 10-2M, como

    explicitado no Fundamento Terico). Contudo, no existem valores de referncia que permitam comparar

    os valores de velocidade mxima da reaco e de KM, pelo que no se pode inferir quanto aos erros

    analticos cometidos, nem exactido dos resultados experimentais. Note-se ainda que este valor,

    16,5mM, corresponde concentrao para a qual, a velocidade da reaco metade da velocidade

    mxima.

    Os erros dos resultados obtidos advm de diversos factores. No s das condies ambientais do

    laboratrio, como a temperatura e presso, mas tambm as condies do meio de cultura influenciam,

    tanto positiva como negativamente, a reaco. Alm disso, a determinao da concentrao das solues

    por espectofotometria indirecta (relembre-se que foi feita atravs da equao do grfico dado),

    podendo apresentar erros que influenciam directamente a aplicao da equao de Lineweaver-Burk.

  • 16

    Bibliografia

    FIALHO, Arsnio; MOREIRA, Leonilde; TAVARES, lvaro; LEITO, Jorge; MATEUS, Marlia; S-CORREIA, Isabel; Protocolos das Aulas Laboratoriais de Bioqumica e Biologia Molecular, Instituto Superior Tcnico, 1 Semestre, 2008/2009, pg. 10 - 12;

    CAMPOS, Lus S.; Entender a Bioqumica (5.Ed.) , 2009, Escolar Editora, Lisboa, pg. 153 161, 241 249, 258 - 260;

    G. M. Copper, R. E. Hausman, The Cell, a molecular approach (4 Ed.) , 2007, ASM Press-Sinauer-Associates Inc., Washington, D.C., pg. 44 46, 73 - 80;

    Diapositivos das aulas tericas de Bioqumica e Biologia Molecular, FIALHO, Arsnio, aulas 6,7 e 8;

    http://plato.if.usp.br/1-2004/fap0181d/Lei%20de%20Beer.htm, visitado em 31 de Outubro 2009;

    http://virtualabs.ist.utl.pt/ERI/cine.html, visitado em 31 de Outubro 2009;

    http://labvirtual.eq.uc.pt/siteJoomla/index.php?Itemid=201&id=96&option=com_content&task=view, visitado em 31 de Outubro 2009;

    http://www2.dq.ua.pt/qne/doc/AL1.5_Colorimetria.pdf, visitado em 31 de Outubro 2009;