Beatriz Lílian da Silva Costa Souza

DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DE UMA

VACINA DE DNA INTRANASAL CONTRA

A LEISHMANIOSE CUTÂNEA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A

OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS (BIOFISICA)

Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

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DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DE UMA VACINA DE DNA INTRANASAL CONTRA A

LEISHMANIOSE CUTÂNEA.

Beatriz Lílian da Silva Costa Souza

Profª Bartira Rossi Bergmann Orientadora

Dr. Eduardo Fonseca Pinto Co-Orientador

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A

OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS (BIOFISICA)

Aprovada por:

______________________ Presidente, Prof. ______________________ Prof. ______________________ Prof. ______________________ Prof.

Rio de Janeiro Outubro/2007

FICHA CATALOGRÁFICA

Souza, Beatriz Lílian da Silva Costa Desenvolvimento tecnológico de uma vacina de DNA intranasal contra a leishmaniose cutânea / Beatriz Lílian da Silva Costa Souza – Rio de Janeiro: UFRJ/IBCCF, 2007.

Xiv, 89f: il.; 31 cm. Orientador(a): Bartira Rossi Bergmann/Eduardo Fonseca Pinto Dissertação de Mestrado – UFRJ/Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho/ Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2007. Referências Bibliográficas: f. 74-89 1- Leishmania amazonensis 2 – Sistema de liberação 3 - Vacina 4 - Mucosa nasal 5 - LACK DNA I. Rossi-Bergmann, B. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. III. Título.

RESUMO DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DE UMA VACINA DE DNA INTRANASAL CONTRA A LEISHMANIOSE CUTÂNEA Beatriz Lílian da Silva Costa Souza Orientador: Bartira Rossi Bergmann Co-Orientador: Eduardo Fonseca Pinto Resumo da dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de mestre em Ciências Biológicas

Nosso grupo demonstrou recentemente a eficácia de uma vacina gênica (LACK DNA) intranasal contra leishmaniose cutânea e visceral em camundongos (Pinto et al, 2004 e Gomes, et al, 2007). Neste estudo, nós visamos aperfeiçoar a vacina utilizando nano e microssistemas catiônicos de entrega, como lipossomas catiônicos e micropartículas de quitosana. Por serem positivamente carregados, lipossomas catiônicos e micropartículas de quitosana são capazes de complexarem com DNA plasmidial negativamente carregado. Além disso, estas partículas têm um grande potencial para vacinas de DNA em mucosa por protegerem o DNA da degradação por nucleases. Assim, o LACK DNA complexado a lipossomas catiônicos foram avaliados in vitro quanto à melhora da transfecção em macrófagos, e in vivo quanto à sua eficácia. Constatamos que a nanoformulação lipossomal não promoveu aumento da expressão de mrna LACK nos macrófagos em cultura, em comparação com o LACK DNA livre. Além disso, em camundongos BALB/c pré-vacinados com duas doses intranasais (i.n.) De 30 µg do LACK DNA antes da superinfecção com promastigotas de Leishmania amazonensis, o sistema lipossomal tampouco conseguiu resgatar a eficácia do LACK DNA livre. O outro sistema catiônico utilizado, consistindo de microesferas de quitosana reticuladas com gliceraldeído (MQR), foi avaliado primeiramente quanto à sua biocompatibilidade em camundongos. Para avaliação de sua alergenicidade, 4 mg das MQR foram administradas pelas vias s.c. E i.n. Com intervalos de 7 dias, e a hipersensibilidade cutânea e eosinofilia foram quantificadas 24 horas depois. Para avaliar sua atividade pró-inflamatória, hepatotoxidade, cardiotoxidade e nefrotoxidade, os animais receberam MQR pelas vias i.n. (4 mg), s.c. (4 mg) e i.p. (8 mg). O influxo celular local foi medido nas cavidades broncoalveolar e peritoneal, enquanto que os níveis das transaminases TGO e TGP e de creatinina foram medidos no soro. Não foi verificada alteração significativa em nenhum daqueles parâmetros, indicativo de boa biocompatibilidade. O microssistema MQR foi então usado para complexação com o LACK DNA, onde parâmetros de adsorção e liberação do DNA foram monitorados. Para a adsorção, MQR e LACK DNA foram incubados por 2 h a 37°C em ph 5.5 sob agitação, e o DNA não adsorvido presente no sobrenadante foi medido por espectrofotometria. Observamos alta complexação (86%-90%) nestas condições. Na cinética de liberação, 10% do DNA adsorvido foi liberado após 20’ e 90% após 4hs, indicando cinética adequada para vacinação. Camundongos BALB/c foram então vacinados i.n. Com LACK DNA/MQR e infectados com L. Amazonensis, como para a vacina lipossomal. Ao contrário da vacina lipossomal, a vacinação com LACK DNA/MQR reduziu significativamente o crescimento das lesões e a carga parasitária. Estes resultados demonstram que além de serem potencialmente seguros em camundongos, de apresentarem taxa adequada de complexação e disporem de uma aceitável cinética de liberação do LACK DNA, os microssistemas de quitosana utilizados foram superiores aos lipossomais, sendo eficientes em melhorar a eficácia da vacina nasal de LACK DNA contra leishmaniose cutânea. Palavras-chave: Leishmania, vacina, mucosa, lipossomas, quitosana, micropartículas, LACK

ABSTRACT

TECHNOLOGICAL DEVELOPMENT OF A INTRANASAL VACCINE OF DNA AGAINST CUTANEOUS LEISHMANIASIS Beatriz Lílian da Silva Costa Souza Orientadores: Bartira Rossi Bergmann / Eduardo Fonseca Pinto Resumo da dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de mestre em Ciências Biológicas. We have previously shown the efficacy of an intranasal (i.n.) Gene vaccine (LACK DNA) against cutaneous and visceral leishmaniasis in mice (Pinto et al. 2004; Gomes et al. 2007). Aiming at improving the vaccine, we proposed in the present study to use cationic liposomes and microparticles of chitosan as delivery systems. For their positive charge, those systems are suitable for complexation with the negatively charged DNA plasmid, and also for mucosal delivery as they can partially protect DNA from nuclease degradation. Thus, cationic liposomes were evaluated in vitro according to their capacity to improve LACK DNA transfection of macrophages, and in vivo according to vaccine efficacy. We found that nanoformulation in liposomes did not promote increased expression of LACK mrna in culture macrophages, as compared to free LACK DNA. Besides, in BALB/c mice i.n.- prevaccinated twice with 30µg of LACK DNA prior to superinfection with Leishmania amazonensis promastigotes, the liposomal system did not rescue the effectiveness of the free vaccine. The other cationic delivery system consisting of chitosan microsferes cross-linked with glyceraldehyde (CMC) was first evaluated according to its biocompatibility in mice. For allergenicity, the animals received 4 mg of empty CMC either by the s.c. Or i.n. Routes with a 7 day interval, and delayed-type hypesensitivity and eosinophilia were measured 24h later. For proinflammatory, hepatotoxic, cardiotoxic and nephrotoxic activities, the animals received CMC by the i.n. (4 mg), s.c. (4 mg) or i.p. (8 mg) routes. The local cell influx was measured in the bronchoalveolar and peritoneal cavities, while the systemic levels of TGO and TGP transaminases as well as creatinine were measured in the serum. No significant changes in those parameters were verified, indicative of good biocompatibility. The CMC microsystem was then used for LACK DNA complexation and parameters of adsorption and in vitro release were monitored. For adsorption, CMC and LACK DNA were incubated (400 rpm) for 2h ar 37°C in ph 5.5 under stirring and the non-entrapped DNA was measured in the supernatant using a spectrometer. Yields around 86%-90% demonstrated the high complexation of the LACK DNA with CMC. For release kinetics, we found that 10% of the added LACK DNA was released after 20’, and 90% was released after 4hs, suitable for vaccination. BALB/c mice were then i.n.-vaccinated with LACK DNA / CMC and infected with L. Amazonensis as for the lipossomal vaccine. In contrast to the liposomal vaccine, immunization with LACK DNA/ CMC significantly delayed the growth of the lesions and reduced the parasite burden. These results demonstrate that besides being potentially safe to mice, having an adequate yield of complexation with LACK DNA and an acceptable release kinetics, the CMC were superior to cationic liposomes in improving the efficacy of the i.n. LACK DNA vaccine against cutaneous leishmaniasis. Key-words: Leishmania, vaccine, mucosa, liposomes, chitosan, microparticles, LACK.

Lista de Abreviaturas

Ag Antígeno Bret Brometo de etídeo CD Células dendríticas Cdna DNA complementar CPG-ODN Seqüências Citosina-fosfato-Guanosina Oligodeoxinucleotídeo D-MEM Dulbecco’s minimal essential médium FML Ligante de fucose manose Gp Glicoproteína HEPES Ácido hidroxietilpiperazina etanosulfônico I.d. Intradérmica IFN-γ Interferon-gama Ig Imunoglobulina IL Interleucina Inos Óxido nítrico sintase indutível I.m. Intramuscular I.p. Intraperitoneal Laag Antígeno total de Leishmania amazonensis LACK Homólogo ao receptor de proteína quinase C ativada LACK DNA Plasmídeo pci-neo com o gene LACK LCL Leishmaniose cutânea localizada LPS Lipopolissacarídeo MQR Micropartículas reticuladas de quitosana MS Ministério da Saúde

NK Células matadoras naturais (Natural killer) OMS Organização Mundial de Saúde OVA Ovoalbumina PBS Tampão fosfato salina Sb+5 Antimonial pentavalente S.c. Subcutânea SFBI Soro fetal bovino inativado T CD4+ Linfócito T auxiliar T CD8+ Linfócito T citolítico TGO Transaminase glutâmico oxalacética TGF-β Fator de transformação e crescimento-beta TGP Transaminase glutâmico pirúvica Th1 Linfócito T auxiliar tipo 1 Th2 Linfócito T auxiliar tipo 2 TLR Receptores semelhantes a Toll TNF-α Fator de necrose tumoral-alfa

Agradecimentos

Agradeço a todos que colaboraram para a realização deste trabalho, em especial: A Deus. A Profª Bartira Rossi Bergmann, por ter me recebido em seu laboratório, pela confiança, oportunidade, exemplo, estímulo constante e por sempre me estimular a dar o melhor de mim. Ao Dr. Eduardo Fonseca Pinto, pela constância durante a realização deste trabalho, por todas as dicas, todo o apoio e presença em todas as etapas deste mestrado! A Profª Eveline Gomes Vasconcelos, por ter sido responsável por despertar em mim a paixão pela ciência e pelo constante estímulo profissional. A Drª Maria Inês Ré pela preparação das micropartículas de quitosana e pela colaboração. A Profª. Maria Helena Andrade Santana pela incorporação do LACK DNA nos lipossomas catiônicos e pela colaboração. Ao Dr. Vicente Larraga (Centro de Investigações Biológicas) por nos fornecer gentilmente o LACK DNA. Ao Prof. Ulisses Gazos Lopes pela estrutura para a realização dos experimentos de biologia molecular no Laboratório de Parasitologia Molecular. Ao Daniel Gomes pela colaboração nos experimentos de biologia molecular. E também pela companhia durante nossas intermináveis extrações de DNA. Com suas piadas até ficava menos sofrido! Ao Wallace Pacienza, companheiro de mestrado, por nossas constantes conversas sobre a vida profissional. Ao José Gomes pela torcida mútua pela eficácia de nossas vacinas! À Elaine dos Anjos, pela eterna paciência em organizar nossos elisas! A todos os amigos do Laboratório de Imunofarmacologia: Suzana, Camila, Carol, Caio, Vanessa, Herbert, Michelle, Josy, Natália, Rodrigo pelas discussões científicas, auxílio, amizade e pelos momentos de descontração! À amiga Naira Giarola, companheira de bancada na iniciação científica, pela troca de idéias sobre nossos mestrados.

À Sandra e ao Diogo da Pós-graduação, pela disposição em nos ajudar a resolver nossos problemas! Aos meus pais Célio e Neuza por estarem sempre presentes, mesmo quando a distância não ajuda. Aos meus irmãos Fábio e Carlos Augusto, por sempre torcerem por mim. Ao Claudio, meu amor, minha paz, por sua alegria pelas minhas vitórias. Ao Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, pela formação. Ao cnpq, pela bolsa de mestrado concedida.

SUMÁRIO

1- Introdução 1 1.1 - Leishmaniose – A doença 2 1.2 – Tratamento 6 1.3 - Aspectos Imunológicos da Leishmaniose 7

1.3.1 - Leishmaniose murina 8 1.4 - Vacinação na Leishmaniose 11

1.5 – O antígeno LACK 16

1.6 - Imunização por Via Mucosa 19 1.7 – Sistemas de entrega de vacinas 22 2- Objetivos 27 3 - Material e Métodos 29 3.1 – Animais 30 3.2 – Parasitos 30 3.3 – Imunização 30 3.4 – Infecção 31 3.5 – Carga Parasitária 31 3.6 – LACK DNA plasmidial 32 3.7 - Cultura de bactérias e extração dos plasmídeos 32

3.8 - Dosagem e pureza do LACK DNA 33 3.9 - Dosagem de LPS no LACK DNA 34 3.10 - Preparação do LACK DNA lipossomal 35 3.11 - Transfecção in vitro de macrófagos peritoneais 36 3.12 - Obtenção do cdna 37 3.13 - Reações de PCR utilizando o cdna 37 3.14 - Microesferas de quitosana reticuladas com gliceraldeído (MQR) 38 3.15 - Avaliação de toxidez aguda das MQR 38 3.16 - Ensaios de alergenicidade 41 3.17 - Adsorção do LACK DNA em MQR 42 3.18 - Cinética de liberação do LACK DNA adsorvido 43 3.19 - Análise Estatística 43

4 – Resultados 44 Parte 1 – Lipossomas catiônicos 45 Parte 2 - Microesferas de quitosana reticuladas (MQR) 49 5 – Discussão 64 6 – Referências 74

1. Introdução

1 - Introdução

1.1 - Leishmaniose – A doença

Leishmanioses são antropozoonoses causadas por diferentes espécies de

protozoários do gênero Leishmania. A doença se instala quando hospedeiros

vertebrados - incluindo o homem - são picados por fêmeas de vetores do gênero

Phlebotomus (Velho Mundo) ou Lutzomyia (Novo Mundo) infectadas. Os protozoários

na forma promastigota metacíclica recém inoculados são fagocitados por macrófagos

da pele, diferenciam-se no fagolisossomo em amastigotas, que se multiplicam e

promovem a lise dos macrófagos. As amastigotas liberadas são fagocitadas por

macrófagos adjacentes, levando ao desenvolvimento de lesão cutânea local,

podendo também se disseminar para macrófagos de outras localizações (Murray et

al., 2005).

Figura 1. Ciclo de vida da Leishmania sp.

Propriedades inerentes à espécie do parasita como infectividade e virulência,

assim como fatores e resposta do hospedeiro regulam a expressão heterogênea da

doença e as manifestações clínicas. Clinicamente, as leishmanioses podem ser

divididas em dois grandes grupos: visceral e tegumentar (Murray et al., 2005).

A leishmaniose visceral ou calazar é a forma mais grave da doença, causada

pelas espécies viscerotrópicas Leishmania (Leishmania) donovani e L. (L.) Infantum

(sin.: L. (L.) Chagasi), que parasitam macrófagos do fígado, baço e medula óssea. É

caracterizada por hepatoesplenomegalia, febre, caquexia, anemia e imunossupressão

da resposta celular, o que pode levar à superinfecção. A letalidade da leishmaniose

visceral pode chegar a 90% dos pacientes que não são submetidos ao tratamento

específico (Singh et al., 2006).

A leishmaniose tegumentar, por sua vez, pode ser causada por cerca de 17

espécies diferentes de Leishmania. No Brasil, as espécies mais importantes são a L.

(Viannia) brazilienses, L. (V.) Guyanensis e L. (L.) Amazonensis (Ministério da Saúde,

2007). Essas espécies são capazes de produzir a forma clínica mais freqüente da

doença, a leishmaniose cutânea localizada (LCL), que é caracterizada por lesões

simples ou múltiplas localizadas. A lesão, geralmente indolor, desenvolve-se em

úlcera cutânea com borda elevada e fundo granuloso limpo ou com secreção, em

moldura acompanhada ou não de linfadenopatia local. Este tipo de lesão localizada

tende à cura espontânea em 50% dos casos, com cicatrização entre três e seis

meses. A LCL responde bem ao tratamento com antimoniais. Apesar de sua menor

malignidade, deixa cicatrizes permanentes, que podem ter importância sob o aspecto

psicossocial do paciente (Murray et al., 2005).

Dependendo da espécie do parasito e da resposta imune do hospedeiro a LCL

pode evoluir para outras formas clínicas. Uma destas formas é a leishmaniose de

mucosa, que é associada à L. Braziliensis na maioria dos casos. Esta forma da

doença também se inicia com uma úlcera simples na pele que pode curar após curto

período de tratamento, mas em alguns meses ou anos, novas lesões podem aparecer

na mucosa nasal, destruindo progressivamente os tecidos do nariz e da boca. Esta

destruição tecidual, se não tratada adequadamente, pode levar a uma marcante

desfiguração da face, causando sérios problemas não só de ordem social ao doente,

mas também problemas respiratórios e digestivos. Esta forma mucocutânea é

curiosamente caracterizada por baixo número de parasitas no local das lesões e alta

resposta imune celular que resulta na destruição tecidual observada (Desjeux, 2004).

Uma outra forma clínica da leishmaniose tegumentar é a leishmaniose cutânea

difusa. No Brasil, está associada principalmente à L. Amazonensis e é caracterizada

por lesões cutâneas múltiplas não ulceradas contendo alto número de parasitos e

baixa ou inexistente reposta imune celular ao parasito (Ministério da Saúde, 2007). A

resposta à terapêutica com antimoniais é bem mais difícil que nas outras formas

clínicas e as recidivas são freqüentes (Lainson, 1983).

A leishmaniose tegumentar é um problema de saúde pública não só no Brasil,

mas também em outros 88 países, a maioria tropical, e é considerada pela

Organização Mundial de Saúde (OMS) como uma das cinco doenças infecto-

parasitárias endêmicas de maior relevância. A estimativa global dos casos de

leishmaniose é difícil de ser calculada, devido à forma passiva de notificação dos

casos e ao fato da doença ser endêmica em muitos países. Estima-se que cerca de

350 milhões de pessoas vivam em áreas de risco em todo o mundo. A incidência

global para leishmaniose visceral é de 500.000 casos por ano e de leishmaniose

tegumentar de 1,5 milhões. Mais de 90% da leishmaniose cutânea desenvolve-se no

Afeganistão, Paquistão, Síria, Arábia Saudita, Irã, Brasil e Peru, enquanto que a

maioria dos casos de leishmaniose visceral ocorre na Índia, Bangladesh, Nepal,

Sudão e Brasil (WHO, 2004).

No Brasil, vários estados têm sofrido com surtos recentes de leishmaniose. De

acordo com dados do Ministério da Saúde (MS) foram registrados no Brasil só no ano

de 2005, 26.525 casos de leishmaniose tegumentar americana. A doença é

registrada em todos os estados. A região Sul apresenta o menor número de casos,

totalizando 535 no ano analisado, enquanto as regiões Norte e Nordeste apresentam

o maior número de notificações, com 10.703 e 8.071 casos, respectivamente. A

forma visceral da doença é um importante problema de saúde pública em vários

centros urbanos brasileiros, principalmente os das regiões Norte e Nordeste

(Ministério da Saúde, 2007).

No Brasil, são observadas situações epidemiológicas distintas: uma, de doença

ligada a florestas, com aumento de sua incidência após desmatamento, expansão de

fronteiras agrícolas e implantação de áreas de garimpo. Tem vetores e reservatórios

silvestres, sendo considerada uma doença ocupacional com maior incidência em

adultos do sexo masculino que trabalham em área de risco. Esta é a situação

epidemiológica atualmente predominante na Amazônia. A outra, é relacionada à

transmissão domiciliar e peri-domiciliar por espécies de vetores adaptados ao

ambiente modificado pelo homem e reservatórios representados por animais

domésticos, principalmente cães, no caso da leishmaniose visceral. Neste caso, a

incidência é equivalente nos dois sexos, em todas as faixas etárias e é característica

da situação atual na região Sudeste (Ministério da Saúde, 2007).

1.2 - Tratamento

Por serem intracelulares, os parasitos estão mais protegidos contra a resposta

imunológica do hospedeiro e ação de fármacos. Apesar dos avanços recentes quanto

a compreensão da bioquímica e biologia molecular do parasito, a primeira escolha de

tratamento para todas as formas de leishmaniose ainda são as injeções com

antimoniais pentavalentes (Sb+5), desenvolvidos há 60 anos (Boix-Barrios and

Sancho, 1951). Entre eles estão o estibogluconato de sódio (Pentostam) e o

antimoniato de meglumina (Glucantime) (Mahajan and Sharma, 2007). O esquema

de tratamento recomendado pela OMS para o calazar é de 20 mg de

Sb+5/Kg.dia/intramuscular ou intravenoso, com a dose máxima diária de 850 mg de

Sb+5 por, no mínimo, 20 dias e até 2 semanas após a negatividade sorológica (OMS,

2004). Para a leishmaniose cutânea, a recomendação é de 10-20 mg de Sb+5/Kg.dia

por 20 dias seguidos. Caso não haja cicatrização da ferida 3 meses após o término

do tratamento, o mesmo deverá ser repetido, prolongando-se desta vez por período

de 30 dias. Para a Leishmaniose mucocutânea, o tratamento é o mesmo, por 30 dias,

sendo a eficácia terapêutica relativamente alta (OMS, 2004). No entanto, estes

esquemas de tratamento apresentam uma série de inconvenientes:

▪ a terapia é longa e requer monitoramento em centros de atendimento

médico, o que aumenta a evasão ao tratamento e o custo (Walton, 1987);

▪ embora muitas falhas possam ser atribuídas às reinfecções ou às

variabilidades individuais (farmacocinéticas ou imunológicas), a resistência aos

antimoniais em algumas áreas endêmicas tem sido reportada (Lira et al., 1999);

▪ o tratamento é quase invariavelmente acompanhado de efeitos colaterais

incluindo cardiotoxicidade e hepatotoxicidade (Berman, 1988; Hepburn et al., 1994).

Em pacientes com problemas cardíacos ou que não respondem aos

antimoniais, o tratamento de segunda escolha é a Anfotericina B que é administrada

através de infusão endovenosa. Produz febre, calafrio e dor nas articulações, além de

severa nefrotoxidez (Berman, 1997), o que faz com que o paciente seja

obrigatoriamente acompanhado em ambiente hospitalar.

O principal avanço no tratamento da leishmaniose nos últimos anos ocorreu

com a descoberta do efeito terapêutico da Miltefosina. Trata-se de uma fosfocolina

administrada por via oral, desenvolvida inicialmente para o tratamento do câncer.

Porém, a toxicidade nas doses terapêuticas necessárias para combater essa doença

limitou os testes clínicos para o câncer. Por outro lado, a Miltefosina mostrou

atividade contra L. Donovani e foi licenciada pelo governo indiano em março de 2002

(Davies et al, 2003). Embora represente um marco na luta contra a leishmaniose

visceral, sendo o primeiro medicamento de administração oral, a Miltefosina

apresenta efeitos colaterais como náusea, vômito e diarréia (Jha et al., 1999). Além

disso, é teratogênica, não devendo ser utilizada em mulheres em idade fértil (Murray

et al., 2005).

1.3 - Aspectos Imunológicos da Leishmaniose

A imunidade protetora contra leishmaniose é, em geral dependente da

capacidade do hospedeiro montar uma resposta Th1 CD4+ dirigida por IL-12,

resultando na produção de IFN- (Afonso et al., 1993). As vias imunológicas que

levam ao desenvolvimento de uma doença progressiva, ao contrário, são menos

caracterizadas e controversas. No entanto, os eventos responsáveis pela maior

resistência ou susceptibilidade ocorrem nas fases iniciais da infecção e parecem

envolver elementos do sistema imune inato, como neutrófilos, macrófagos e células

natural killer; produtos solúveis, como proteínas do complemento e citocinas (Murray

et al., 2005) ou ainda mecanismos mediados por receptores, como receptores

semelhantes a Toll (TLR), sendo o TLR2 o mais bem estudado na imunidade inata à

parasitos do gênero Leishmania (Gazzinelli and Denkers, 2006). Estes eventos

precedem o desenvolvimento de células T "helper" específicas Th1, que produz IFN-

γ, e Th2 que produz IL-4, IL-5 e IL-10 (Mosmann & Coffman, 1989).

1.3.1 - Leishmaniose murina

O modelo experimental de leishmaniose cutânea em murinos é de grande

importância, não só pela estreita correlação com a doença humana, mas também por

ser um modelo interessante para o estudo de diversos aspectos da resposta imune

celular (Andrade et al., 1984).

Em modelos murinos de leishmaniose cutânea causada por L. Major, linhagens

de células protetoras apresentam propriedades Th1 e linhagens de células

exacerbadoras apresentam propriedades Th2, com diferentes resultados na infecção.

O balanço entre esses dois sub-grupos resulta na maior susceptibilidade ou

resistência à leishmaniose experimental (Scott et al., 1988). Diferentes cepas de

camundongos possuem graus variados de susceptibilidade a uma determinada

espécie de Leishmania (Modabber, 1989). Por exemplo, camundongos BALB/c são

altamente susceptíveis à infecção com L. Major e L. Amazonensis, enquanto outras

linhagens, como C57BL/6, C3H, CBA, entre outras exibem variados graus de

resistência à doença.

Camundongos BALB/c infectados com Leishmania major apresentam uma

forte correlação entre susceptibilidade, desenvolvimento de lesões e uma resposta

imune tipo Th2 (Sacks and Noben-Trauth, 2002). Essa resposta está correlacionada

com a rápida produção de IL-4 por células T CD4+ V4 V8 (Launois et al., 1997).

Essa peculiaridade dos camundongos BALB/c é devida à proliferação de linfócitos T

CD4+ produtores de IL-4 responsivos à proteína LACK (proteína de Leishmania

homóloga à Receptores de Proteína Quinase C Ativada em mamíferos). Esta proteína

está presente em bactérias da flora intestinal destes camundongos e também nas

diferentes espécies e formas evolutivas de Leishmania. Gera-se, então, uma reação

cruzada destes linfócitos de memória com a Leishmania, resultando na forte e

precoce produção da citocina IL-4 (Julia et al., 2000). Essa produção precoce de IL-4

é precedida pela rápida expressão de transcritos de RNA mensageiro (mrna) para IL-

4 nos linfonodos de camundongos BALB/c 16 horas após infecção subcutânea com L.

Major (Launois et al., 1999). Como a susceptibilidade de mamíferos a patógenos

intracelulares é determinada durante a transição inicial da imunidade inata para a

específica (Fearon & Locksley, 1996), esses camundongos adquirem esse fenótipo

característico de susceptibilidade.

Por outro lado, a IL-4 nem sempre está associada à expansão de células Th2.

IL-4 presente em concentrações locais relativamente altas e durante a ativação inicial

de células dendríticas pode levar ao fenótipo de resistência em camundongos

normalmente susceptíveis à L. Major por levar à diferenciação dessas células em

células dendríticas produtoras de IL-12, citocina importante na diferenciação de

linfócitos virgens em linfócitos Th1 (Biedermann et al., 2001).

Os macrófagos possuem uma função central na leishmaniose. São

importantes não somente porque são as células hospedeiras dos parasitos, mas

também porque são células apresentadoras de antígenos estimulando células T

específicas (Solbach et al, 1991; Sunderkötter et al, 1993). Citocinas liberadas pelas

células T ativadas, regulam positivamente (ex: IFN-) ou negativamente (ex: IL-4,

IL-10 e IL-13) a atividade microbicida dos macrófagos (Zurawski & Vries, 1994).

Fatores como a explosão oxidativa e produção de óxido nítrico pela enzima

óxido nítrico sintase indutível (inos) são importantes para a eliminação dos parasitos

pelos macrófagos (Gantt et al., 2001). Uma forma do parasito evitar a morte por

células fagocíticas é a capacidade de regular negativamente a expressão de mrna

para inos, principalmente pela produção de citocinas anti-inflamatórias (IL-10, IL-4, e

TGF-), responsáveis diretamente pela desativação destas células (Bogdan, 2001).

Células natural killer (NK) também apresentam evidências de serem essenciais

na resposta imune inata ao parasito. Em camundongos depletados destas células, o

curso da infecção com L. Major é mais severo e a parasitemia por L. Amazonensis

não pode ser eficientemente limitada (Korbel et al., 2004).

Células dendríticas (CD) participam dos processos de eliminação do parasito e

também atuam como células hospedeiras (Garg et al., 2007). A interação de células

dendríticas e Leishmania é complexa e capaz de modular várias etapas do sistema

imune. O parasito é capaz de inibir a migração e a maturação destas células e utilizá-

las como mecanismo de evasão (Brandonisio et al, 2004). Por outro lado, têm uma

função central em determinar o tipo de resposta imune induzida (Banchereau et al.,

2000) e protocolos de imunização contra leishmaniose utilizando as próprias CD

tratadas ex-vivo têm sido desenvolvidos com sucesso em modelos murinos (Fajardo-

Moser et al., 2007).

Algumas evidências sugerem um papel importante das células CD8+ na

resposta aos parasitos em modelos murinos. A depleção destas células durante o

curso da lesão, leva à exacerbação da doença tanto em camundongos susceptíveis

quanto em camundongos resistentes demonstrando sua importância no controle da

infecção (Titus et al., 1987). Quando se inocula o parasito em doses baixas pela via

intradérmica, mimetizando a infecção natural, células CD8+ são requeridas para o

controle da infecção primária com L. Major em camundongos C57BL/6 (belkaid,

2002) e sua função parece intervir com o estabelecimento de respostas Th1 e Th2

(Uzonna et al, 2004). De maneira geral, se reconhece que a infecção por qualquer

via leva a ativação de clones específicos de células CD8+ em resposta a antígenos de

Leishmania que induzem imunidade protetora (Hernádez-Ruiz et al., 2006).

1.4 - Vacinação na Leishmaniose

Como descrito anteriormente, a quimioterapia disponível para as distintas

formas de leishmaniose apresenta vários problemas. Assim, o desenvolvimento de

vacinas preventivas é altamente desejável. Apesar de muitos pesquisadores virem há

vários anos tentando desenvolver uma vacina, inclusive com sucesso experimental,

até hoje nenhuma foi aprovada para uso clínico (Kedzierski et al., 2006).

Como tentativa de prevenção, parasitos infectantes vivos já foram (e ainda

são em alguns países do Oriente Médio) utilizados para se tentar induzir proteção

contra a doença, processo este chamado de leishmanização. Promastigotas de L.

Major são injetados em locais do corpo normalmente não expostos a fim de evitar o

estabelecimento da infecção em áreas expostas como a face. Apesar de ser

relativamente eficaz esta técnica apresenta alguns riscos que impedem seu uso em

grandes populações: 1) não há uma padronização sobre a virulência da vacina; 2)

ocorre a formação de uma lesão persistente resultante do inoculo (Sukumaran and

Madhubala, 2004).

O relativo sucesso da leishmanização e a proteção adquirida após cura

espontânea em pacientes infectados com L. Major são bons indicativos de que a

descoberta de uma vacina para a leishmaniose cutânea é viável.

As vacinas, de um modo geral, podem ser classificadas em vacinas de

primeira, segunda e terceira geração.

As vacinas de primeira geração são compostas de microorganismos mortos ou

atenuados, ou ainda de misturas não caracterizadas de antígenos. Uma vacina de 1a

geração bastante estudada em humanos é a Leishvacin®, uma vacina polivalente,

contendo lisado de promastigotas de várias espécies (L. Major, L. Guyanensis, L.

Amazonensis, L. Mexicana) (Nascimento et al., 1990). A Leishvacin® foi

desenvolvida no Brasil pelo grupo do Dr. Wilson Mayrink e produzida a partir de 1991

pela biobrás em Montes Claros (MG) mas sua produção industrial foi recentemente

descontinuada. Foram efetuados estágios clínicos de Fase I, atestando sua

segurança (Marzochi et al., 1998) e de fase II, atestando sua imunogenicidade (de

Luca et al., 1999), mas sua eficácia foi recentemente contestada em testes clínicos

realizados na Colômbia (Vélez et al, 2005). Além disso, é possível que a

imunogenicidade do próprio teste de Montenegro possa ter interferido na avaliação

da eficácia da vacina (Antunes et al., 1986).

Uma versão simplificada da vacina polivalente composta somente por L.

Amazonensis e, portanto mais definida, quando administrada por via subcutânea

(s.c.) Em macacos, exacerbou a infecção subsequente com L. Amazonensis,

mostrando alguma eficácia somente quando administrada junto com IL-12 e alúmen

(Kenney et al., 1999). Da mesma forma, estudos anteriores de nosso grupo

confirmaram o efeito contra-protetor de uma vacina equivalente (laag) quando

administrada por via s.c. Em camundongos BALB/c (Pinto et al., 2003).

Nosso grupo demonstrou recentemente que a imunização por vias de mucosa

com o mesmo antígeno laag é capaz de induzir proteção quando administrado pela

via oral, protegendo camundongos C57BL/6 e BALB/c desafiados com L.

Amazonensis, indicando que a vacina pode ter amplo espectro de ação (Pinto et al.,

2003) e também pela via nasal, em desafio realizado em camundognos BALB/c com

a mesma espécie de parasito (Pinto et al., 2004).

As vacinas de segunda geração podem ser divididas em 3 categorias de

acordo com a sua composição: vacinas vivas geneticamente modificadas,

subunidades definidas ou frações brutas. Vacinas vivas incluem promastigotas de

Leishmania geneticamente modificadas que causariam uma infecção abortiva, como

um clone de L. Major do qual foi removido o gene para a proteína diidrofolato

redutase/timidilato sintetase (Cruz et al., 1991), que induziu proteção parcial em

camundongos BALB/c contra infecção por L. Major (Titus et al., 1995). Entre as

vacinas com subunidades definidas, além do antígeno gp63 que tem sido estudado

mais extensivamente (Russo et al., 1991), tem-se ainda o leif, análogo recombinante

da proteína ribossomal eucariótica (Sheiky et al., 1998). Entre as frações brutas, o

FML, ligante de fucose e manose de L. Donovani induziu proteção na infecção por L.

Donovani, levando à redução da carga parasitária e de sinais clínicos da doença em

camundongos (Santos et al., 2002 e 2003) e em cães (Borja-Cabrera et al., 2002 e

2004) e está atualmente sendo produzida industrialmente, com o nome de

Leishmune para aplicação veterinária contra o calazar. Além disso, o FML tem

apresentado grande eficácia na proteção de camundongos conta leishmaniose

cutânea (Aguilar et al., 2005).

As vacinas de terceira geração são as chamadas vacinas gênicas, onde genes

que codificam antígenos potencialmente imunizantes são inseridos em plasmídeos.

As vantagens das vacinas de DNA são a sua capacidade de codificar proteínas com

estrutura e conformação similares ou idênticas às das proteínas selvagens,

capacidade de gerar respostas humorais e celulares mais prolongadas e de permitir a

combinação de diversos imunógenos em uma preparação única. Estas características

facilitam a imunização simultânea contra doenças diversas, além de trazer vantagens

econômicas pela tecnologia do DNA recombinante, o que torna mais fácil a

elaboração e a produção de grandes quantidades da vacina, além também da

facilidade de armazenamento devido à alta estabilidade do DNA em relação às

proteínas (Weiner & Kennedy, 1999).

Existem ainda outras vantagens da imunização com plasmídeos em relação às

imunizações com proteínas recombinantes. Os plasmídeos apresentam seqüências

nucleotídicas específicas que têm papel crítico na imunogenicidade das vacinas. As

seqüências Citosina-fosfato-Guanosina Oligodeoxinucleotídeo (cpg ODN) flanqueadas

por regiões compostas de duas purinas em 5’ e duas pirimidinas em 3’ são

normalmente não metiladas em bactérias, ao contrário das mesmas sequências em

células eucariotas (Gurunathan et al., 2000). Elas são 16 a 20 vezes mais comuns em

bactérias se comparados a mamíferos e se ligam ao Receptor Tipo Toll-9 (TLR-9)

presente em macrófagos e em células dendríticas (Medzhitov et al., 2001; Vollmer et

al., 2005). Esta característica permite que elas ajam como importantes adjuvantes

nos processos de vacinação que visam o redirecionamento de resposta Th2 para

Th1, pois elas induzem a produção de IFN- e IL-12 e inibem a produção de IL-4 e

IL-5 (Klinman et al., 1996). A associação de seqüências cpg ODN com antígeno de L.

Major demonstrou ter um importante papel no redirecionamento para uma resposta

protetora, com aumento na produção de IFN- e IL-12 em camundongos BALB/c

infectados com L. Major (Zimmermann et al., 1998).

Uma série de considerações relativas à segurança das vacinas de DNA devem

ser feitas, como a possibilidade de integração ao genoma do hospedeiro

(aumentando o risco de malignidade por ativação de oncogenes ou inativação de

genes supressores de tumor) e de indução de respostas contra as células

transfectadas (levando ao estabelecimento de doenças auto-imunes) (Gurunathan et

al., 2000).

Também incluída na categoria de vacinas de 3ª geração estão as bactérias e

os vírus recombinantes, que carregam antígenos de Leishmania. Têm sido testados o

gene da protease de superfície gp63 de L. Major expresso em Salmonella

typhimurium e o vírus vaccinia expressando o gene de gp46/M-2 de L. Amazonensis

que induziram significativas repostas protetoras contra L. Major (mcmahon-Pratt.,

1993).

Um grande número de vacinas gênicas tem sido empregado em modelos

experimentais induzindo proteção contra as diferentes formas de leishmaniose. A

vacina de DNA intramuscular codificando o antígeno ORFF (proteína presente nas

formas promastigotas e amastigotas de Leishmania sp. (particularmente em

amastigotas de L. Donovani), resultou em significante proteção de camundongos

BALB/c contra infecção por L. Donovani (Sukumaran et al., 2003); a vacina com o

gene para a Proteína B1 (HASPB1) controlou a carga parasitária de L. Donovani no

baço, órgão onde os parasitos usualmente persistem e é refratário a um largo

espectro de intervenções imunológicas e quimioterápicas (Stäger et al., 2000).

Imunizações diretas com plasmídeos, ou com vetores virais contendo plasmídeos

codificando a proteína A2, mostraram significativa proteção contra infecção por L.

Donovani, associada à produção de IFN-, resposta mista Th1/Th2, forte resposta

humoral e reduzida internalização de amastigotas por macrófagos (Ghosh et al.,

2001), bem como garantiram proteção quando utilizada contra infecção por L.

Amazonensis (Coelho et al., 2003). Vacinas de DNA codificando as proteínas gp63 e

Cisteíno Proteinase b (cpb) de L. Mexicana e gp46 de L. Amazonensis protegem

parcialmente contra infecção por L. Mexicana (Dumonteil et al., 2003). A vacina de

DNA codificando um componente do FML, a nucleosídeo hidrolase NH36 de L.

Donovani, promoveu proteção cruzada em camundongos BALB/c quando desafiados

com L. Chagasi e L. Amazonensis (Aguilar et al, 2005). Além dos vetores virais,

adição de adjuvantes ou a confecção de misturas de plasmídeos têm sido utilizados

como outras alternativas para a indução de proteção contra Leishmania. A

imunização intramuscular (i.m.) Com uma mistura de plasmídeos codificando

independentemente cpb, gp46 e gp63 induziu proteção parcial contra L. Mexicana

em camundongos BALB/c (Dumonteil et al., 2003). A mistura de plasmídeos

contendo os genes lmst11, LACK e TSA por via intradérmica (i.d.), i.m. E subcutânea

(s.c) conferiu significativa proteção a camundongos C57BL6 desafiados com L. Major

(Méndez et al., 2002).

1.5 – O antígeno LACK

Recentemente foi demonstrado por nosso grupo que plasmídeos codificando a

proteína LACK administrados por via intranasal são capazes de proteger

camundongos BALB/c da leishmaniose cutânea provocada por L. Amazonensis (Pinto

et al., 2004) e da leishmaniose visceral provocada por L. Chagasi (Gomes et al,

2007). O antígeno LACK é de grande interesse para o desenvolvimento de vacinas

devido ao seu papel na imunopatogênese da infecção (Julia et al, 1996).

Estudos feitos em bibliotecas de expressão mostraram que esta proteína (36

kda e 312 aminoácidos) está presente nos diferentes estágios do ciclo de vida da

Leishmania e tem alto grau de homologia entre as diferentes espécies do parasito

(Mougneau et al., 1995; Okuno et al, 2002). Ela recebe esse nome devido à sua

homologia com as proteínas RACK (Receptores de Proteína Quinase C Ativada) de

mamíferos (Mochly-Rosen et al., 1990), e se localiza próxima ao cinetoplasto, no

citoplasma celular, provavelmente ligada a complexos multiprotéicos como as

isoformas de Proteína Quinase C (PKC) citoplasmáticas, mas não a estruturas de

membrana (Gonzales-Aseguinolaza et al., 1999). Sua versão reduzida de 24 kda

(aminoácidos 143-312) possui um epítopo imunodominante (aminoácidos 156-173)

que ativa restritamente linfócitos T CD4+ com Receptor de Célula T (TCR) V4 V8

produtores de IL-4, que se expandem nos estágios iniciais da infecção natural por L.

Major em camundongos BALB/c (Launois et al., 1997). Esta mesma linhagem de

camundongos tornou-se tolerante a LACK por expressão transgênica deste antígeno

no timo, exibindo uma diminuída resposta Th2 e fenótipo de cura, demonstrando a

associação da reatividade do LACK com a doença (Julia at al., 1996). A proteína p24

administrada com IL-12 confere proteção contra L. Major através do

redirecionamento do desenvolvimento natural de células Th2 para Th1 com elevação

da produção de IFN- e diminuição de produção de IL-4 e ige (Mougneau et al.,

1995). Assim, em camundongos susceptíveis BALB/c, a resposta imune Th2 dirigida

pela presença de LACK no patógeno, está diretamente relacionada à susceptibilidade

à doença (Launois et al., 1997).

Baseado no conhecimento sobre a imunopatogênese deste antígeno, vários

protocolos de imunização com a proteína LACK ou com seu gene codificante

passaram a ser testados contra diferentes espécies de Leishmania: a) vacinação

subcutânea com p24 LACK DNA levou à proteção quando camundongos BALB/c

foram desafiados com L. Major, de maneira similar à proteção induzida por proteína

recombinante p24 LACK mais IL-12 (Gurunathan et al., 1997); b) imunização s.c.

Com p36 LACK de L. Infantum e reforço com vírus Vaccinia com insertos dos genes

p36 LACK e IL-12 (vvp36il-12) induziu redução de 52% no tamanho de lesão e de

100 vezes na carga parasitária de lesões observadas em infecções por L. Major em

camundongos BALB/c (Gonzalo et al., 2001); c) o mesmo antígeno p36 LACK de L.

Infantum expresso por plasmídeo e por vírus Vaccinia recombinante em vacinação

heteróloga protege camundongos BALB/c após desafio por L. Major, reduzindo em

70% o tamanho da lesão e 1000 vezes a carga parasitária (Gonzalo et al., 2002); d)

vacinação por via s.c. Com p36 LACK DNA e reforço com vírus Vaccínia recombinante

com inserto do gene p36 LACK (rvv p36(LACK) protegem cães contra L. Infantum

(Ramiro et al., 2003); e) vacinação com p36 LACK DNA pelas vias i.d. Ou s.c. Induz

forte resposta do tipo Th1 com produção de IFN- mas não induz proteção após

desafio cutâneo ou sistêmico por L. Donovani (Melby et al., 2001); f) imunização

intradérmica associando p36 LACK DNA e plasmídeos expressando os genes de IL-12

e IL-18, seguido de reforço com vírus Vaccinia expressando o gene p36 LACK

conferiu significativa proteção contra L. Major em camundongos BALB/c, levando a

uma significativa redução do tamanho da lesão, diminuição da carga parasitária,

aumento na produção de IFN-γ e de igg2a (Tapia et al., 2003).

Todas as vacinas descritas acima empregaram vias parenterais, não

relacionadas às mucosas. Vias de mucosa tem sido utilizadas para vacinação com

antígenos relacionados a imunopatologia da doença para se tentar induzir tolerância

ou proteção contra as desordens provocadas pelo perfil Th2 (Mestecky et al., 2005)

O antígeno total laag, que contém a proteína LACK, quando administrado pelas vias

intranasal e oral foi capaz de induzir proteção (Pinto et al., 2003 e 2004), mas a

administração da proteína recombinate LACK por ambas vias de mucosa não afetou a

susceptibilidade de camundongos BALB/c a L. Major. Somente quando LACK foi

conjugado com subunidade β da toxina coléria (CTB) uma proteção parcial foi

exibida. (Julia et al., 1996). Trabalhos anteriores de nosso grupo mostraram que a

imunização intranasal com um plasmídeo contendo o gene LACK de Leishmania

infantum (LACK DNA) promoveu uma diminuição do tamanho da lesão e de carga

parasitária nos animais desafiados com L. Amazonensis (Pinto et al., 2004) e levou a

diminuição da carga parasitária em baço e fígado de animais desafiados com L.

Chagasi (Gomes et al., 2007).

1.6 - Imunização por via Mucosa

A maioria dos antígenos ganha acesso ao corpo através de uma superfície

mucosa como o trato gastro-intestinal ou respiratório. Com isso, as mucosas têm

associado a elas um sistema imunológico grande e complexo, anatômica e

funcionalmente distinto daqueles encontrados em outras regiões do corpo no que se

refere a processos especializados para captação, transporte, processamento e

apresentação de antígenos, bem como mecanismos imunes efetores especializados,

como a produção de iga secretória (Neutra and Kozlowski, 2006). Este sistema

compreende elementos linfóides associados com as superfícies internas do corpo,

como o trato gastro intestinal, tratos respiratórios inferior e superior, e trato

urogenital (Neutra and Kozlowski, 2006). A imunização através destes tratos com

patógenos atenuados, toxinas bacterianas bem como extratos de microorganismos

vem sendo experimentalmente explorada na tentativa de gerar respostas a

microorganismos que comumente ganham acesso ao organismo por estas vias como

Salmonella thypi, Vibrio Colerae e HIV, dentre outros (Holmgreen and Czerkinsky,

2005). Esta via também tem sido utilizada para imunização em modelos de infecção

viral como Influenza (Wang et al., 2004), Papiloma (Dupuy et al., 1999) e HIV (Vadjy

et al., 2004); modelos de infecção bacteriana com Bordetella (Kamachi et al., 2003)

e Chlamydia (Svanholm et al., 2000); e modelos de infecção por protozoários como

Plasmmodium (Wu et al., 2000), L. Amazonensis (Pinto et al., 2004) e L. Chagasi

(Gomes et al., 2007).

A imunização por via mucosa com DNA é uma alternativa na geração de

respostas específicas, uma vez que este tipo de imunização induz uma grande

resposta sistêmica, bem como resposta em outros sítios de mucosa, longe do sítio de

administração do antígeno, o que não é observado na imunização parenteral com o

mesmo DNA, que não confere proteção em locais de mucosa (Hobson et al., 2003).

A via intranasal fornece um eficiente meio de imunização, por ser de fácil

acesso, possuir alta vascularização e numerosas microvilosidades recobrindo o

epitélio, o que gera uma grande superfície de absorção (Oh et al., 2001). Ela pode

induzir respostas imunes locais e sistêmicas, pode ser utilizada para imunização de

grandes grupos populacionais além de requerer menor quantidade de material que a

via oral, diminuindo os custos da vacinação (Neutra and Kozlowski, 2006). Além

disso, não requer agulhas e seringas (que são fontes potenciais de infecção e

requerem pessoal especializado), é uma via não invasiva e garante uma maior

estabilidade do Ag administrado, uma vez que a degradação é bem menor do que

pela via oral (Pinto et al., 2004).

O sistema imune associado ao trato respiratório superior e inferior é composto

por tecido linfóide associado ao nariz (NALT, em inglês) e aos brônquios (BALT, em

inglês), linfonodos drenantes (linfonodos cervicais), epitélio respiratório e logo

abaixo, um tecido conjuntivo contendo células do sistema imune, (Didierlaurent et al.

2007), principalmente células dendríticas plasmocitóides especializadas (Shah et al,

2003). O tecido linfóide associado é recoberto por epitélio especializado, chamado de

epitélio associado ao folículo. Possui células M, que são células especializadas em

captar macromoléculas e microorganismos e direcioná-los ao sistema linfóide

agregado (Hathaway and Kraehenbuhl, 2000). As células efetoras do sistema imune

que são produzidas em resposta a antígenos e patógenos presentes nos tecidos

linfóides das mucosas adquirem um programa específico de circulação que as

orientam a retornar aos sítios de mucosas. Após ativação no NALT, os linfócitos

diminuem sua expressão de L-selectina (molécula de adesão que proporciona

interação com o endotélio das vênulas nos linfonodos periféricos) e aumentam a

expressão de α4β7, integrina cujo ligante, madcam-1 é expresso pelos vasos

sanguíneos das mucosas (Hamann et al., 1994). Como o madcam-1 é expresso nos

vasos de todas as mucosas, pode-se explicar o conceito de sistema imune comum

das mucosas em que linfócitos primados em uma mucosa irão circular para outras

mucosas (Rott et al., 2000).

1.7 – Sistemas de entrega de vacinas

A administração de vacinas com antígenos incorporados em sistemas

partículados de entrega tem sido amplamente estudada (Castro et al., 2007). A

utilização destes sistemas nas mucosas apresenta várias vantagens, pois protege os

antígenos de degradações do meio, possibilitando o uso de doses menores; favorece

sua captação pelas células M, que transportam partículas de até 10 µm (Hathaway

and Kraehnbuhl, 2000) para o sistema imune associado à mucosa; mais de um

antígeno pode ser encapsulado em um único sistema, facilitando o desenvolvimento

de novas formulações que possam imunizar o indivíduo contra mais de uma doença

ou contra vários epítopos do mesmo ou diferente patógeno. Além disso, pode

possibilitar a redução no número de doses da vacina, reduzindo o custo de

programas de vacinação (O’Hagan, 2001).

Vários sistemas de entrega têm sido estudados para melhoramento de vacinas

de DNA por via de mucosa (Greenland et al., 2007). Os sistemas mais bem

caracterizados para entrega em mucosa são lipossomas catiônicos (Perrie et al,

2001; Wang et al, 2004;), PLGA (ácido poli-lático-co-glicólico) (Cui et al, 2003;) e

nano e microparticulas poliméricas, como partículas de quitosana (Iqbal et al, 2003).

No desenvolvimento desta dissertação, estudamos dois sistemas de entrega:

lipossomas catiônicos e micropartículas de quitosana (MQR).

Lipossomas são nanovesículas uni ou multilamelares, compostos de uma ou

mais membranas lipídicas envolvendo um compartimento aquoso, constituídos

principalmente de fosfolipídeos. Vêm sendo usadas como sistemas de liberação para

melhorar fármacos em produtos já disponíveis no mercado. Uma variedade de

formulações lipossomais têm sido estudadas como adjuvantes ou sistemas de

entrega de antígenos. Estas vesículas podem entrar nas células por fagocitose, mas

possuem a vantagem de também poderem se fundir com a membrana celular,

devido a sua constituição fosfolipídica e desta maneira liberarem o antígeno

diretamente no citoplasma celular (O’Hagan, 2001). Lipossomas catiônicos têm sido

amplamente estudados para a administração de vacinas de DNA. Eles possuem em

sua constituição um ou mais fosfolipídeos catiônicos, que geram uma carga positiva

na superfície da vesícula, onde o DNA, carregado negativamente, se liga de maneira

estável e é direcionado para o citoplasma (Ewert et al, 2005). Em um estudo de

vacinação contra vírus influenza, a administração por via intranasal do plasmídeo

sozinho não foi capaz de induzir proteção. Quando o plasmídeo foi administrado

incorporado a lipossomas catiônicos uma proteção significativa foi observada (Wang

et al, 2004).

No desenvolvimento de vacinas de mucosa, atenção especial tem também

sido dada à quitosana, um copolímero catiônico derivado da quitina, que está

presente no exoesqueleto de insetos, crustáceos e parede celular de fungos, sendo

também encontrada como componente estrutural de outros seres vivos (van der

Lubben et al., 2001). A empresa brasileira CYRBE Ltda., expandindo seus produtos,

em 2001, deu início a um projeto de extração de polissacarídeos naturais de sobras

de crustáceos, em fase de produção piloto. Procurou parcerias com instituições de

pesquisa, como o Instituto de Pesquisas Tecnológicas de São Paulo (IPT-SP), para o

desenvolvimento tecnológico de formulações farmacêuticas, como a utilizada neste

trabalho.

O uso de quitosana no desenvolvimento de sistemas de liberação controlada

tem sido muito investigado devido à sua biocompatibilidade, ausência de toxicidade

dos seus produtos de degradação e pela sua propriedade mucoadesiva que

proporciona o aumento da capacidade de penetração do antígeno através da

mucosa desencadeando respostas locais e sistêmicas aumentadas (van der Lubben

et al., 2001).

A quitosana é obtida por desacetilação alcalina da quitina (Roberts, 1992), em

geral de crustáceos tais como caranguejos, camarões e lagostas. Devido à

disponibilidade de grupos amino livres na quitosana, este polímero é positivamente

carregado e desta forma reage com muitas superfícies/polímeros negativamente

carregados. Entre as características importantes da quitosana que influenciam as

propriedades de formulações estão tamanho de partícula, viscosidade, grau de

desacetilação e peso molecular (Sinha et al., 2004).

Quitosana já é utilizada na forma de polímero ou micropartículas de uso oral

para emagrecimento por sua capacidade de captar lipídeos, sendo esta aplicação oral

aprovada por diferentes agências regulatórias, como Food and Drug Administration

(FDA – USA) e a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA – Brasil).

Partículas de quitosana têm sido investigadas como carreadores de fármacos e

macromoléculas, inclusive DNA (Oliveira et al., 2006), para vetorização, aumento de

biodisponibilidade de substâncias degradáveis e da absorção de substâncias

hidrofílicas através de camadas epiteliais (Schipper et al., 1999). Kochisch et al.

(2003) estudaram o potencial de vetorização in vitro de partículas poliméricas na

cavidade oral, avaliando o potencial mucoadesivo. No experimento in vitro

envolvendo um desafio com saliva artificial, as partículas de quitosana ficaram

retidas sobre a mucosa oral por muito mais tempo que as partículas produzidas com

poli(acrílico). Os autores atribuíram estes resultados ao comportamento do

intumescimento das partículas de quitosana e sua natureza catiônica, sugerindo um

bom desempenho destas partículas como sistemas mucoadesivos.

O potencial de aplicação da quitosana para desenvolvimento de sistemas de

liberação de vacina via mucosa tem sido muito discutido na literatura científica (Illum

et al., 2001). No entanto, na maioria destas aplicações, a quitosana precisa ser

reticulada devido à sua alta hidrofilicidade, o que gera entumescimento da partícula

impossibilitando sua administração pela via nasal. A reticulação é uma estratégia

utilizada para manipular propriedades das partículas de quitosana, podendo alterar

não só seu intumescimento, mas também sua carga superficial e hidrofobicidade e

conseqüentemente seu efeito adjuvante (Alpar et al.,1996).

Em muitos estudos a quitosana vem sendo reticulada com aldeídos como

glutaraldeído e formaldeído. No entanto, a rejeição biológica destes agentes de

reticulação limita seu uso. Neste estudo, foi desenvolvido e utilizado o gliceraldeído

como agente reticulante, por não apresentar problemas de toxidez, uma vez que é

encontrado no organismo como um produto metabólico da frutose (Oliveira et al.,

2005).

Assim, microesferas de quitosana reticuladas com gliceraldeído foram

avaliadas quanto a sua biocompatibilidade através de parâmetros de toxicidade

aguda e elergenicidade. O LACK DNA foi encapsulado neste sistema e a cinética de

liberação foi acompanhada. Foi também encapsulado em lipossomas catiônicos.

Estes dois sistemas apresentam grande potencial de aumentar a captação do LACK

DNA quando administrados pela mucosa nasal e amplificar sua eficácia na profilaxia

da leishmaniose cutânea em camundongos altamente susceptíveis a esta doença.

2. Objetivos

Objetivo geral

Melhoramento tecnológico da vacina LACK DNA intranasal contra a

leishmaniose cutânea através de sua formulação em lipossomas catiônicos e

microesferas de quitosana.

Objetivos específicos

Quanto aos lipossomas catiônicos,

1) Testar in vitro a transfecção do LACK DNA;

2) Avaliar em camundongos a eficácia da vacina de LACK DNA intranasal.

E quanto às microesferas de quitosana,

1) Avaliar em camundongos a biocompatibilidade de micropartículas reticuladas com

gliceraldeído, monitorando a toxidez aguda e a alergenicidade;

2) Avaliar in vitro a taxa de adsorção e a cinética de liberação do LACK DNA em

micropartículas reticuladas;

3) Avaliar a melhoria da eficácia da vacina de LACK DNA encapsulada em

microesferas de quitosana reticuladas no modelo murino de leishmaniose cutânea.

3. Material e Métodos

3.1 Animais

Camundongos machos da linhagem BALB/c, com 9 -10 semanas de idade

foram utilizados conforme “Princípios Básicos Para a Pesquisa Envolvendo Animais”,

aprovado e registrado pela Comissão de Avaliação do Uso de Animais em Pesquisa

(CAUAP – IBCCF/UFRJ). Os animais foram adquiridos no Biotério Central da

Universidade Federal Fluminense e mantidos no biotério do Laboratório de

Imunofarmacologia (Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho), recebendo água e

maravalha autoclavadas e ração comercial durante toda a experimentação.

3.2 Parasitos

Formas promastigotas de Leishmania amazonensis (MHOM/BR/75/Josefa)

foram mantidas em cultura a 26°C em meio de cultura 199 (Cultilab, Brasil)

suplementado com gentamicina 50 µg/ml (Schering-Plough), HEPES a 20 mm (Sigma

Aldrich) e 10% de soro fetal bovino inativado (SFBI) (Cultilab). Para garantir a

infectividade, os parasitos foram usados no máximo até a quarta passagem quando

eram então re-isolados por punção de lesões de camundongos experimentalmente

infectados. Para infecção, foram lavados 3 vezes em tampão fosfato salina (PBS)

para remoção total do SFBI.

3.3 Imunização

Camundongos BALB/c em decúbito dorsal, mantidos com a cabeça levemente

retrovertida receberam por instilação nasal 30 µg LACK DNA livre ou 30 µg LACK DNA

complexados com lipossomas ou MQR em 30 µl PBS ou somente PBS (15 µl em cada

narina) usando uma ponteira e uma micropipeta. Os animais receberam 7 dias

depois a mesma dose como reforço.

3.4 Infeccção

Os animais foram infectados no coxim plantar da pata traseira direita

utilizando microseringa de 50µL (Hamilton) e agulha Ultrafine (Becton, Dickinson and

Company), 1 semana após a segunda dose da vacina, com 2 x 105 promastigotas de

L. Amazonensis em um volume de 20 µl de PBS. O curso da infecção foi

acompanhado pela medida da espessura da pata com um paquímetro (Mitutoyo,

Brasil). O tamanho da lesão foi calculado pela diferença entre a espessura das patas

infectadas e a medida das mesmas patas antes da infecção.

3.5 Carga Parasitária

Para determinação da carga parasitária os animais foram eutanasiados e as

patas infectadas foram cortadas na articulação com a tíbia e homogeneizadas

individualmente em 1ml de meio D-MEM (Cultilab, Brasil) contendo 10% de SFBI.

Ensaio de diluição limitante foi realizado como descrito previamente (Marques-da-

Silva et al., 2005): alíquotas duplicadas de 200 µL da suspensão de células foram

diluídas seriadamente a 1:4 em placas de 96 poços (Nalgene Nunc-USA) contendo o

mesmo meio de cultura, por 12 diluições. As células foram incubadas em estufa a

25°C por 10 dias. Ao final, foi calculado o número de Leishmanias por pata,

tomando-se como referência a última diluição em que se verificou o crescimento do

parasito.

3.6 LACK DNA plasmidial

Culturas de bactérias Escherichia coli DH-5αTM (Invitrogen) transformadas com

o plasmídeo pci-neo com inserto p36lack foram cedidas pelo Dr. Vicente Larraga

(Centro de Investigaciones Biológicas, Madrid, Espanha) (Ramiro et al., 2003).

3.7 Cultura de bactérias e extração dos plasmídeos

E. Coli da linhagem DH-5αTM (Invitrogen) transformadas com pci-neo-p36lack

foram armazenadas à -70oc em meio líquido Luria-Bertaine (LB) contendo 30% de

glicerol estéril. As culturas foram expandidas a partir de um pré-inóculo de 5 ml em

meio LB, ph 7,0 (nacl 0,5%) (Becton Dickinson-USA) 1%, extrato de levedura

(Becton Dickinson- USA) 0,5% e 100 µg/ml de ampicilina (Schering-Plough). O pré-

inóculo foi incubado em agitador orbital a 150 rpm/37°C/16h e posteriormente

transferido para um erlenmeyer contendo 500 ml de LB sob rotação por mais 16h.

A extração do DNA plasmidial livre de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) foi

feita de acordo com o método de lise alcalina (Sambrook et al., 1989) utilizando-se

um kit para extração de DNA livre de LPS (Quiagen Giga-Prep - USA) de acordo com

instruções do fabricante. Resumidamente, a cultura foi centrifugada a 6000g/4°C/15

min. O pellet foi ressuspendido em um tampão constituído de 50 mm de Tris-Cl - ph

8,0 e 10 mm de EDTA contendo rnase. Foi adicionado uma solução de lise alcalina

com 200mm naoh e 1% de SDS. Após a lise, o ph foi neutralizado pela adição de

solução de 3 M de acetato de potássio - ph 5,5 e o material foi filtrado. A solução

filtrada, contendo o DNA foi tratada com ER (formulação é propriedade intelectual do

fabricante do kit) e incubada no gelo por 30 min. Após este tratamento, a solução foi

aplicada em uma coluna de troca iônica para retenção do DNA plasmidial, de carga

negativa. A coluna foi então lavada com uma solução 1 M de nacl, 50 mm de MOPS -

ph 7,0 e 15% de isopropanol para remoção de outras substâncias, incluindo LPS. O

DNA plasmidial foi então eluído pela aplicação na coluna de uma solução 1,6 M nacl,

50mm de MOPS – ph 7,0 e 15% de isopropanol, precipitado com isopropanol a

temperatura ambiente e imediatamente centrifugado a 15.000 g/30 min/4°C. O

pellet foi ressupendido em etanol 70% livre de LPS e centrifugado novamente a

15.000g/10min. O pellet obtido foi ressupendido em água livre de LPS para posterior

dosagem e controle de qualidade.

3.8 Dosagem e pureza do LACK DNA

O DNA obtido da extração foi quantificado e avaliado quanto à pureza em

espectrofotômetro (Biofotometer-Eppendorf-USA) sob os comprimentos de onda de

260 e 280 nanômetros.

Para confirmar a identidade, a cada nova extração eram feitos ensaio de PCR

com os plasmídeos, utilizando oligonucleotídeos iniciadores (Forward-

ATGAACTACGAGGGTCACCT e Reverse-ACGTCCTTGGTGTGCTTCA), obtidos a partir

da seqüência codificante do gene LACK, bem como foram submetidos ao tratamento

com endonucleases de restrição (ecori/sali), visando liberar o fragmento de DNA

relativo ao gene.

A reação de PCR foi realizada utilizando-se 30 ng de DNA plasmidial tampão

contendo contendo Tris-hcl 200 mm (ph 8,4), kcl (500 mm), cloreto de magnésio (1

mm), dinucleotídeos dntp (0,2 mm) (Promega Corporation-USA), Taq DNA

polimerase (1,5 unidades) (Invitrogen Cororation-USA), (10 pmol) de

oligonucleotídeos iniciadores Forward e Reverse (conforme descrito anteriormente),

e água deionizada, para um volume de 50 microlitros. As condições da reação foram:

35 ciclos de 95oc por 1 minuto, 56oc por 2 minutos e 72ºC por 3 minutos.

Posterior à reação, as amostras foram aplicadas em gel de agarose 1,5%

(ultra PURE - Invitrogen Corporation-USA) para análise da migração dos fragmentos

aplificados.

O tratamento com endonucleases de restrição foi realizado utilizando 5 g de

DNA, 12 unidades de cada enzima (ecori e xbai) (Promega Corporation-USA) e

tampão “multi-core” (Promega Corporation-USA). O material foi incubado em banho-

maria a 37°C/2 h e posteriormente foi realizado uma eletroforese em agarose 0,8%

(ultra PURE - Invitrogen Corporation - Carlsbad, CA, USA) para do perfil de migração

das bandas.

3.9 Dosagem de LPS no LACK DNA

Antes de iniciar os trabalhos in vitro ou in vivo com o LACK DNA, precisávamos

nos certificar que o plasmídeo extraído de E. Coli pelo Giga-Prep (Quiagen - USA)

não continha quantidades significativas de lipopolissacarídeo (LPS), uma endotoxina

presente em grandes quantidades na parede celular de bactérias gram-negativas,

como a E. Coli. Para isso, a concentração de LPS nas amostras de DNA extraídos foi

dosada com o uso do kit QCL 1000 – LAL (biowhittaker). Para a dosagem, 50 µL de

amostra e 50 µL de LAL (Lisado de Amebócitos de Limulus) foram incubados a 37°C

por 10 minutos. A seguir, foram adicionados 100 µL de substrato e foi incubado

novamente a 37°C por mais 6 minutos. Após este tempo foi adicionado 50 µL de

solução bloqueadora (ác. Acético 25% v/v). A concentração de LPS foi determinada

pela leitura imediata em espectrofotômetro a 405 nm. A dosagem de LPS em 1 mg

de DNA das amostras obtidas na extração foram de 0,3 – 0,8 EU/ml. Para a

concentração de DNA que administramos no protocolo de vacinação – 30 µg LACK

DNA – a concentração de LPS é de 0,02 – 0,01 EU/ml. A concentração de LPS

encontrada na amostra é baixa e considerada segura (Hartmann and Krieg, 1998).

3.10 Preparação do LACK DNA lipossomal

As estruturas lipídicas contendo o LACK DNA foram preparadas no

Departamento de Processos Biotecnológicos da Faculdade de Engenharia Química,

UNICAMP, coordenado pela Profª. Maria Helena Andrade Santana.

Os lipossomas catiônicos foram preparados com protocolo elaborado por Torre

(2006). Basicamente, os lipídios (Fosfatidilcolina natural de ovo – EPC, 1,2-Dioleoil-

sn-Glycero-3-Fosfoetanolamina - DOPE e 1,2-Dioleoil-3-Trimetilamônio-Propano –

DOTAP, em proporção sugerida por Perrie e colaboradores (2001), foram

solubilizados em clorofórmio, em balão de fundo redondo, sendo em seguida

promovida a evaporação do solvente sob vácuo para a formação do filme seco. A

seguir, o filme foi hidratado com água de padrão para injeção. Estas estruturas

lipossomais foram extrudadas, através de membrana de policarbonato com diâmetro

nominal de poros de 100 nm. Os lipossomas foram liofilizados e em seguida

rehidratados em solução salina (Kirby and Gregoriadis, 1984). A incorporação do

LACK DNA foi realizada através de incubação de DNA com os lipossomas catiônicos.

A formulação final contém 2,86 g/L de LACK DNA. Detalhes da preparação não

serão fornecidos pois a patente do processo está sendo requerida.

3.11 Transfecção in vitro de macrófagos peritoneais

Macrófagos peritoneais residentes foram retirados do peritônio pela injeção e

posterior punção de 5 ml de meio de cultura D-MEM (Cultilab, Brasil) gelado. As

células (3 x 106) foram plaqueadas em placas de 6 poços (Nalgene Nunc-USA) em

2,5 ml de meio de cultura D-MEM + 5% de SFBI e foram incubadas a 37°C/5% CO2

por 2 h para aderência. Após lavagem com PBS a 37°C para retirada das células não

aderentes adicionou-se 2,5 ml de D-MEM + 5% de SFBI contendo 3 µg de LACK DNA

ou 3 µg LACK DNA lipossomal. As células foram incubadas por 6 horas a 37°C/5%

CO2 para transfecção. Após este tempo o DNA foi removido por lavagem com PBS

37°C, e incubadas por mais 18 horas. O RNA total foi então extraído com Trizol

seguindo instruções do fabricante (Invitrogen Cororation-USA): as células foram

lisadas com Trizol e mantidas à temperatura ambiente por 5 minutos. Ao material

obtido foi adicionado 0,2 ml de clorofórmio, seguido de uma forte agitação por 1

minuto e descanso a temperatura ambiente por 3 minutos. O material foi então

centrifugado à 12.000/15 min/4°C. A fase aquosa obtida foi coletada e foi realizada

uma nova extração com a fase fenólica restante, adicionando-se 100 µL de água

deionizada tratada com dietyl pirocarbonato (DEPC) ao precipitado, seguido de

centrifugação a 12.000 rpm/15 min/4°C.

As fases aquosas foram reunidas e precipitadas com 1 volume de isopropanol

e acetato de sódio (300 mm) durante 12 horas a -70°C. As amostras foram

centrifugadas a 12.000g/15 min/4°C, o precipitado de RNA foi lavado com etanol

75%, centrifugado novamente e o RNA foi ressuspendido em água deionizada

tratada com DEPC (Dietil pirocarconato) para dosagem por espectrofotometria a 260

nm.

3.12 Obtenção do cdna

Amostras de 2 µg do RNA total obtido acima foram tratadas com 2 unidades

de dnase (Promega Corporation-USA), por 30 min a 37°C. As amostras foram

incubadas a 65°C por 10 minutos para inativação da dnase, seguido de adição de

oligo DT (500 ng/reação) (Invitrogen Cororation-USA), dntp (0,2 mm) e

aquecimento por 10 min a 70°C. Após o aquecimento, as amostras foram mantidas

em gelo seguido de adição do tampão da enzima, DTT (10mm) e transcriptase

reversa (200 unidades) (Superscript II - Invitrogen Corporation-USA). A reação foi

incubada a 42°C por 50 minutos, seguido de inativação pelo calor a 70°C por 15

minutos. O cdna obtido foi armazenado a -70°C para utilização nas reações de PCR.

3.13 Reações de PCR utilizando o cdna

Para a reação de PCR foram utilizados 5 µg de cdna em 200 mm de Tris-hcl

ph8,4, 500 mm kcl, cloreto de magnésio 1 mm, dinucleotídeos dntp 0,2mm

(Promega Corporation - USA), 1,5 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen

Corporation - USA), e oligonucleotídeos iniciadores Forward

(ATGAACTACGAGGGTCACCT) e Reverse (ACGTCCTTGGTGTGCTTCA) (10 pmol) e

água deionizada para um volume de 50 µL.

Posterior a reação de PCR, as amostras foram aplicadas em gel de agarose

1,5% (ultra PURE - Invitrogen Cororation - USA) para análise através da mobilidade

eletroforética dos fragmentos amplificados.

3.14 Microesferas de quitosana reticuladas com gliceraldeído (MQR)

Microesferas de quitosana foram produzidas pela técnica de “spray-drying” no

ipt-sp a partir de solução de quitosana pura (cyrbe ltda.), que foi dissolvida em água

deionizada contendo 0,7% (p/v) de ácido acético. Para a reticulação, microesferas de

quitosana foram suspensas em uma solução acetona:água (2:1) contendo o agente

reticulante gliceraldeído a 1,5% (0,15 kggal/kgquitosana) (oliveira et al., 2005) e foram

mantidas em agitação a 500 rpm/30 min/5°c . Após o processo de reticulação, as

microesferas foram filtradas e secas em vácuo a temperatura ambiente por 24 horas.

3.15 Avaliação de toxidez aguda das MQR

Os protocolos de avaliação de biocompatibilidade foram desenvolvidos

baseados em “Testes de segurança Não-Clínicos” (TDR/WHO, 2004).

- vias intranasal (i.n.) E subcutânea (s.c.)

Para a avaliação de toxidez por estas vias foi administrada uma dose de 2 mg

de microesferas de quitosana, dose esta superior à ser utilizada para a vacinação

(1,5 mg).

Figura 2. Avaliação de toxidez aguda induzida por MQR: vias intranasal e

subcutânea.

2 mg MQR

controles LPS (i.n.)

CCl4 (i.p.)

BALB/c

sc

in

7 dias

1a dose 2a dose

BAL

(infiltrado

celular)

Soro

(TGO, TGP,

creatinina )

2 h

24 h

Os camundongos foram injetados pela via s.c. Na base da cauda com 2 mg

MQR dissolvidas em 150 µL PBS ou foram administradas via i.n. Com 2 mg MQR

dissolvidos em 40 µL de PBS. Após 7 dias a mesma dose foi repetida. Controles

receberam PBS somente. Como controles positivos os animais receberam 10 µg de

LPS (indutor de resposta inflamatória) por via i.n. E tetracloreto de carbono (ccl4)

(hepatotóxico e nefrotóxico) a 1% em óleo de amendoim por 3 dias pela via

intraperitoneal. Duas horas após a última dose os camundongos foram eutanasiados

por inalação de éter etílico (Vetec-Brasil) e foi feito um lavado bronco-alveolar para

avaliação de infiltrado celular local. PBS gelado (500 µL) foram injetados nos

pulmões dos camundongos com uma cânula acoplada a uma seringa. O volume

aspirado e o processo foi repetido. A celularidade no volume final (1 ml) foi

quantificada em câmara de Neubauer. Os animais vivos restantes (n=3) foram

eutanasiados 24 h após a última dose, o sangue foi colhido e o soro separado para

dosagem de transaminases TGO (indicativos de toxidez cardíaca e hepática) e TGP

(indicativo de toxidez hepática) e de creatinina (indicativo de toxidez renal). As

dosagens foram realizadas com o uso de kits de diagnóstico laboratorial

colorimétricos (Doles - Brasil).

- via intraperitoneal (i.p.)

Para os ensaios de toxicidez sistêmica, os camundongos foram injetados em

dose única pela via intraperitoneal com 8 mg mqr dissolvidas em 200 µl pbs ou pbs

somente.

Figura 3. Avaliação de toxidez aguda induzida por MQR: via

intraperitoneal.

Como controles foram utilizados tioglicolato de sódio a 3% e tetracloreto de

carbono (ccl4) a 1% em óleo de amendoim por 3 dias pela via intraperitoneal. Três

dias após a ùltima dose, os camundongos foram eutanasiados e o exsudato

peritoneal foi colhido pela injeção de 2 ml de pbs gelado e agitação antes da

aspiração. A quantidade de células peritoneias totais foi medida por contagem em

câmara de neubauer. O sangue dos animais foi colhido e o soro foi separado para

dosagem de transaminases tgo e tgp e creatinina como pelas vias i.n. E s.c..

3.16 Ensaios de alergenicidade

Camundongos foram injetados na base da cauda pela via s.c. Com 2 mg MQR

dissolvidas em 150 µL PBS ou 50 µg de OVA GRAU V (Sigma-Aldrich) (como controle

positivo) ou foram administradas por via i.n. Com 2 mg MQR em 40 µL de PBS ou

PBS somente.

1 dose ip

3 dias

8 mg MQR

controles Tioglicolato( i.p.)

CCl4 (i.p.)

Exsudato per. (infiltrado celular)

Soro

(TGO, TGP,

creatinina)

Figura 4. Avaliação da alergenicidade induzida por MQR.

Após 7 dias, a mesma dose foi repetida. Uma semana após a última dose os

animais foram desafiados com 50 µg de MQR em 10 µL de PBS. O grupo controle

OVA foi desafiado com 50 µg de OVA em 10 µL de PBS no coxim da pata direita

(controle positivo) ou 10 µL de PBS na pata esquerda (controle negativo). A

formação de edema foi avaliada pela espessura das patas com um paquímetro 20,

40, 120 min e 24 h após o desafio nas respectivas patas. Vinte e quatro horas após o

desafio, o sangue dos animais foi colhido para realização de um esfregaço que foi

corado pelo corante Panótico rápido (Instant-Prov, Newprov) e eosinófilos (células

relacionadas à resposta alérgica) foram contados em microscopia ótica de imersão

(100x).

BALB/c

sc

in

MQR - 2 mg

MQR - 2 mg

controle OVA - 50 µg

7 dias

1a dose (i.n ou s.c)

7 dias

2a dose (i.n. ou s.c)

Desafio (pata) 50 µg MQR

50 µg OVA

eosinofilia Edema de pata

24 h

3.17 Adsorção do LACK DNA em MQR

A adsorção foi realizada misturando-se 50 mg de MQR e 1 mg de LACK DNA

dispersos em 25 ml de etanol e tampão fosfato 0,05 M (1:2) ph 5,5. Foram

incubados por 2h a 37oc sob agitação de 400rpm. As microesferas foram separadas

por centrifugação a 3000 rpm por 10 min e lavadas com tampão. A taxa de adsorção

do antígeno (LACK DNA) foi determinada por dosagem por espectrofotometria

(Power Wave XS – BIO-TEC) a 260 nm do LACK DNA livre no sobrenadante após o

processo de adsorção. O DNA adsorvido foi calculado subtraindo-se a concentração

do DNA livre no sobrenadante do DNA total adicionado no início do processo.

Para obtenção das imagens em microscopia de fluorescência do LACK DNA

adsorvido à MQR, após o processo de adsorção as partículas foram ressuspendidas e

ajustadas para 1mg/ml. Alíquota de 100 µL da suspensão de partículas foi diluída

duas vezes para obtenção de imagem mais homogênea e foram adicionados 125 µM

de brometo de etídeo (bret) (marcador fluorescente para DNA). Partículas na mesma

diluição sem LACK DNA adsorvido também foram tratadas com bret e foram

utilizadas como controle negativo. As imagens foram analisadas através do software

Image Pro Plus (Media Cybernetics).

3.18 Cinética de liberação do LACK DNA adsorvido

Para determinação da cinética de liberação do LACK DNA, as microesferas com

o LACK DNA adsorvido foram incubadas sob agitação (400rpm) a 37°C, em tampão

fosfato ph 5,5. As alíquotas foram colhidas em diferentes tempos e a dosagem do

LACK DNA liberado no sobrenadante a cada tempo foi determinada por

espectrofotometria a 260 nm (Power Wave XS – BIO-TEC).

3.19 Análise Estatística

A análise estatística foi empregada utilizando-se One-Way ANOVA e pós-teste

Dunnett para comparação entre os diferentes grupos e Two-way ANOVA com pós-

teste Bonferroni para análise das cinéticas de crescimento das lesões. Os

experimentos foram considerados estatisticamente significantes para o nível de

significância (p< 0,05).

4. Resultados

Os resultados serão apresentados em duas partes, segundo o sistema

utilizado: lipossomas ou microesferas de quitosana reticuladas (MQR).

Parte 1 - Lipossomas catiônicos

4.1.1 Avaliação da expressão de mrna LACK em macrófagos peritoneais

Para avaliar a potencialização da capacidade transfectante do LACK DNA pela

formulação lipossomal, a expressão de mrna LACK foi avaliada em macrófagos.

Macrófagos peritoneais foram incubados com 3 µg de LACK DNA livre ou 3 µg LACK

DNA lipossomal por 6 horas para permitir a transfecção. Após este tempo as células,

foram lavadas e incubadas por mais 18 horas então foi realizado RT-PCR com

primers específicos para a amplificação do cdna LACK.

Os resultados na Fig. 5 mostram que o LACK DNA tanto na forma livre, como

na forma lipossomal induziu a expressão de mrna LACK pelos macrófagos em

cultura. No entanto, a formulação lipossomal não melhorou a expressão e até

aparentemente reduziu. Estes dados foram também observados na análise das

bandas por densitometria (Fig. 6), indicando que nas condições de formulação

testadas, os lipossomas catiônicos não favoreceram uma maior entrega do DNA na

célula.

Figura 5: Avaliação da transfecção de LACK DNA livre e LACK DNA lipossomal in vitro. Eletroforese em gel de agarose 1,5% da reação de RT-PCR mostrando os amplicons de cdna referentes ao mrna LACK. Controle: macrófagos não tratados. (+) e (-) representam respectivamente a adição ou não de transcriptase reversa para obtenção do cDNA.

Figura 6. Análise dos amplicons de cdna por densitometria: A imagem do gel de agarose foi digitalizada e analisada pelo programa de computador “imagemaster totallab v1.11”.

-CONTROLE

lipossom + - + - + - ++ -+ -

350 pb ����

LACK DNA livre

--CONTROLE

LACK DNAlipossomal

+ - + - + - ++ -+ -

350 pb ����

LACK DNA livre

-

LACK DNA LACK DNA lipossomal

LACK DNA LACK DNA lipossomal

0

0,5 10 15 20 25

30 35

Un

idad

es a

rbit

rári

as (

x10

2)

4.1.2 Efeito da formulação lipossomal de LACK DNA na eficácia da vacina

intranasal.

Após a avaliação da transfecção in vitro, o passo seguinte foi administrar o

LACK DNA lipossoma in vivo pela via intranasal. Neste modelo, as condições são bem

mais adversas, devido à presença de dnases na mucosa e outros fatores que

poderiam levar à degradação parcial do LACK DNA livre. Assim, mesmo com uma

menor capacidade transfectante in vitro, o encapsulamento em lipossomas poderia

proteger contra a degradação na mucosa, resultando em melhor eficácia vacinal.

Assim, 30 µg de LACK DNA livre ou complexado em lipossomas foram

administrados por via intranasal em camundongos BALB/c em duas doses, com

intervalo de 7 dias, conforme protocolo anterior (Pinto et al., 2004; Gomes et al.,

2007). Uma semana após a última dose da vacina, os camundongos foram

desafiados com L. Amazonensis na pata e o curso da lesão foi acompanhado por 110

dias.

Figura 7. Efeito do encapsulamento do LACK DNA em lipossomas na vacinação intranasal. Camundongos BALB/c foram imunizados pela via intranasal com 30 µg de LACK DNA livre ( ) ou 30 µg de LACK DNA lipossomal ( ) em duas doses com intervalo de 7 dias. Controles receberam PBS ( ). Uma semana após a segunda dose os animais foram infectados com L. Amazonensis na pata e o crescimento da lesão foi acompanhado por medidas com paquímetro. Média ± DP, n= 6 animais por grupo. Os resultados na Fig. 7 mostram que a dose de LACK DNA livre administrada,

ao contrário de resultados anteriores com infecções mais brandas com L.

Amazonensis (Pinto et al., 2004) e consistentemente obtidos em nosso laboratório,

não foi suficiente para proteger os animais contra a infecção anormalmente mais

severa. No dia 75 a lesão já estava em 2 mm, enquanto a lesão normalmente

encontrada para este tempo de infecção é de cerca de 0,2 mm.

0 25 50 75 100 125 0

1

2

3

4

5

LACK DNA

LACK DNA lipossomal

PBS

tempo (dias)

lesão

(m

m)

Parte 2 – Microesferas de quitosana reticuladas (MQR)

Em paralelo aos estudos com os lipossomas catiônicos como sistemas de

carreamento e entrega, estudamos também o uso de microesferas de quitosana

reticuladas com gliceraldeído a 1,5%.

Tendo em vista o menor entumescimento das mqr em relação às microesferas

convencionais, que pelo menor tamanho (< 10 µm) podem ser captadas pelas

células m da mucosa, foram feitos alguns ensaios para atestar a segurança para

essas partículas. Isso se justifica uma vez que para essa finalidade usamos o

agente reticulante gliceraldeído (oliveira et al., 2005), mais aceitável que agente

comumente usado glutaraldeído.

4.2.1 Biocompatibilidade das MQR

4.2.1.1 Ensaios de toxidez aguda

– vias intranasal e subcutânea

O primeiro parâmetro de biocompatibilidade avaliado foi a toxidez aguda. Para isso,

as MQR foram administradas pela via i.n. Ou pela via subcutânea s.c.. A via i.n. Foi

avaliada por ser a via por onde a vacina de lack dna é administrada; a via s.c. Foi

avaliada como uma via alternativa, como forma de se validar uma outra forma de

utilização das partículas para a administração de outras vacinas ou medicamentos.

Camundongos balb/c receberam 2 doses de 2 mg de mqr com intervalo de 7 dias

pelas vias i.n. Ou s.c.. Como controle negativo receberam pbs e como controle

positivo de inflamação receberam lps (via i.n.) Ou tetracloreto de carbono (ccl4) (via

i.p.). Foram avaliados como parâmetros de toxidez aguda o influxo celular local

(bal) como indicativo de processo inflamatório e dosagens séricas das

transaminases TGO, TGP e creatinina como indicativos de toxidez cardíaca, hepática

e renal, respectivamente.

Conforme mostra a fig. 8, a administração das MQR por via i.n. Não aumentou o

infiltrado celular no trato respiratório inferior, indicando ausência de efeito pró-

inflamatório, o qual foi observado com LPS.

Da mesma forma, seja por via i.n. Ou s.c. A administração das MQR não foi

capaz de induzir aumento nos níveis séricos basais de transaminases ou creatinina

(Fig. 9 a, b e c), indicando ausência de efeitos tóxicos sistêmicos detectáveis.

Figura 8. Infiltrado celular no BAL (via i.n.) Camundongos BALB/c receberam 2 doses de 2 mg de MQR ou 10µg de LPS em 30 µl ou de PBS pela via intranasal . Duas horas após a segunda dose foi realizado um lavado bronco-alveolar (BAL) para quantificação do infiltrado celular. Média ± sd, (n=3 animais por grupo). ** p< 0,01 em relação ao PBS.

**

PBS MQR in LPS0.0

2.5

5.05.0

7.5

10.0

(x 1

05

ce

ls/m

L)

A)

B)

C)

Figura 9. Avaliação de toxidez cardíaca, hepática e renal. Camundongos receberam 2 doses 2 mg de MQR pela via i.n. Ou s.c.. O sangue foi retirado 24 h após a segunda dose para dosagens no soro. Controle negativo: PBS. Controle positivo: ccl4 i.p.. Média ± Sd, (n=3 animais por grupo). *** p< 0,001 em relação ao PBS. A) níveis séricos de TGO; b) níveis séricos de TGP; c) níveis séricos de creatinina.

TGO

***

TGP

***

creatinina ***

PBS MQR sc MQR in CCl 4

0

20

40

60

80100

150

200

U/m

L

PBS MQR sc MQR in CCl 4

0

10

2030

40

50

60

U/m

L

PBS MQR sc MQR in CCl 4

0

100

200

µµ µµg

/mL

– via intraperitoneal

Com os resultados satisfatórios em relação à biocompatibilidade pelas vias i.n.

e s.c., o passo seguinte foi avaliar a toxidez destas microesferas quando

administradas pela via intraperitoneal (i.p.), uma via mais invasiva, onde existe a

possibilidade de administrar uma quantidade muito maior de partículas, tornado-as

potencialmente mais tóxicas.

Para isso, camundongos balb/c receberam 8 mg de mqr pela via

intraperitoneal em 200 µl de pbs. Como controle negativo receberam pbs e como

controle positivo receberam tioglicolato de sódio 3% ou tetracloreto de carbono.

Após 3 dias os animais foram sacrificados e foram avaliados como parâmetros de

toxidez aguda o influxo celular local (lavado peritoneal), indicativo de processo

inflamatório e dosagens das transaminases tgo, tgp e creatinina no soro como

indicativo de toxidez sistêmica.

Conforme a fig. 10, a administração das mqr i.p. Também não induziu

infiltrado celular local. Tampouco foram observados sinais de toxidez sistêmica,

uma vez que a administração de mqr por via i.p. Não levou a alterações nos níveis

séricos de transaminases tgo e tgp ou de creatinina (fig. 11 a, b e c), mostrando

que mesmo utilizando esta via mais invasiva as mqr ainda assim foram seguras e

não causaram danos cardíacos, hepáticos ou renais detectáveis.

Figura 10. Avaliação da indução de infiltrado celular por MQR administradas por via intraperitoneal. Camundongos BALB/c receberam 8 mg de mqr pela via intraperitoneal. Após 3 dias foram sacrificados para contagem de número de células totais no exsudato peritoneal. Controle negativo: pbs. Controle positivo: tioglicolato de sódio 3% i.p. (1 ml). Média ± SD, (n=3 animais por grupo). ** p< 0,01 em relação ao PBS.

cels

/mL

(x1

06)

PBS MQR ip 0

1

2

3

4

5

6

7

8 **

TIOGLIC. 3%

a)

b)

c)

Figura 11. Avaliação de toxidez cardíaca, hepática e renal. Camundongos receberam 8 mg de MQR pela via i.p. Em dose única. O sangue foi retirado 3 dias após para dosagens no soro. Controle negativo: PBS. Controle positivo: CCl4 i.p.. Média ± SD, (n=3 animais por grupo). *** p< 0,001 em relação ao PBS. A) níveis séricos de TGO; b) níveis séricos de TGP; c) níveis séricos de creatinina.

TGO ***

TGP ***

creatinina

***

PBS MQR ip CCl 4

0

10

20

30

40

50100

150

200

U/m

L

PBS MQR ip CCl 4

0

5

10

1530

40

50

60

U/m

L

PBS MQR ip CCl4

0

100

200

µµ µµg

/mL

4.2.1.2 ensaios de alergenicidade

após os ensaios de toxidez aguda, as mqr foram avaliadas também quanto à

sua alergenicidade. Para tal, camundongos balb/c foram sensibilizados com 2 mg

mqr em duas doses, como feito anteriormente para os ensaios de toxidez, pelas vias

i.n. E s.c.. Uma semana após a última dose, foram desafiados na pata com 50 µg de

mqr. Como controle positivo, um grupo de animais foi sensibilizado e desafiado com

ova. Pbs foi utilizado como controle negativo na sensibilização em ambos os casos,

mqr e ova. A ocorrência de hipersensibilidade cutânea (edema) na pata foi

acompanhada por até 24 horas, quando os animais foram eutanasiados. O sangue

foi coletado para a contagem de eosinófilos no esfregaço sanguíneo.

O edema de pata induzido pelas MQR i.n. E s.c. Foi semelhante ao induzido

pelo controle pbs até 120 min após o desafio (fig. 12), indicando ausência de

hipersensibilidade cutânea imediata. No grupo que recebeu ova s.c. Foi observado

edema nos primeiros minutos após o desafio, indicando hipersensibilidade cutânea

imediata (controle positivo).

No entanto, 24 horas após o desafio (fig. 12), todos os camundongos

desafiados com mqr desenvolveram edema na pata, inclusive os que receberam

pbs durante a sensibilização.

Para avaliar se o aumento da espessura da pata foi devido ao intumescimento

lento das mqr injetadas no local, animais não sensibilizados receberam MQR somente

para medida de sua espessura por até 72 horas.

Conforme a fig. 13, a espessura regride para níveis normais em 72 h. É

possível que o aumento em 24 h tenha sido devido ao intumescimento da partícula

no local, com posterior diminuição do volume por degradação ou fagocitose da

mesma. Será necessária uma avaliação histopatológica para confirmar esta hipótese.

Outro parâmetro de alergenicidade avaliado foi a eosinofilia. A sensibilização e

posterior desafio com mqr não foi capaz de induzir eosinofilia (fig. 14).

Em conjunto, todos esses dados apontam para ausência de toxidez local e

sistêmica, assim como ausência de efeito alergênico das mqr. Neste último caso, é

preciso estudar melhor os fenômenos envolvidos no aumento da reação com 24

horas e sua rápida regressão posterior.

Figura 12. Hipersensibilidade cutânea. Camundongos BALB/c foram sensibilizados com MQR pelas vias i.n. ou s.c. Uma semana após a última dose foram desafiados com 50 µg de MQR na pata. A formação de edema nas patas foi acompanhada por 24 horas por medidas com paquímetro. Controle negativo: sensibilização com PBS. Controle positivo: sensibilização e desafio com ova s.c.. média ± sd, (n=3 animais por grupo).

PBS

MQR sc

MQR in

OVA sc

0 20 120

0

2

4

6

8

minutos

24

horas

Ed

em

a (

mm

x 1

0)

MQR sc

OVA sc

desafio

4400

sensibilização

Figura 13. Intumescimento das MQR na pata. Camundongos receberam 50 µg de mqr na pata. A formação de edema foi acompanhada por 72 horas conforme indicado. Controle: PBS s.c. (pata). Média ± sd, (n=3 animais por grupo).

Figura 14. Contagem de eosinófilos. Camundongos BALB/c foram sensibilizados com MQR pelas vias i.n. ou s.c. Uma semana após a última dose foram desafiados com 50 µg de MQR na pata. Esfregaço sanguíneo foi realizado 24 horas após o desafio. Controle negativo: sensibilização com pbs. Controle positivo: sensibilização e desafio com ova s.c.. Média ± sd, (n=3 animais por grupo). *** p< 0,001 em relação ao PBS.

0 120 240 0

1

2

3

4

PBS

MQR

24 72

(min)

Ed

em

a (

mm

x 1

0)

48 (hs)

PBS OVA sc MQR sc MQR in0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

(% e

osin

ófi

los n

o s

an

gu

e)

***

4.2.2 - adsorção e cinética de liberação do lack dna em mqr

4.2.2.1 adsorção do lack dna em mqr

Dados os resultados positivos nos estudos de biocompatibilidade, a próxima

etapa foi avaliar a capacidade de adsorção do lack dna nas mqr. Para isso, 50mg de

mqr liofilizadas e 1 mg de lack dna foram adicionados a 50 ml de uma solução de

etanol:tampão fosfato (1:2) - ph 5.5, e incubados por 2 horas a 37°c sob agitação.

Após este tempo as partículas foram centrifugadas e a concentração de dna foi

dosada no sobrenadante por espectrometria. O dna adsorvido foi calculado

subtraindo-se a concentração do dna do sobrenadante do dna total adicionado no

início do processo. A taxa de adsorção de três lotes diferentes mostra a consistência

do processo, com variação entre 84% e 90% (87 ± 3) (fig. 15).

Após a formação do complexo mqr/lack dna, como forma de se comprovar a

ligação do dna na superfície das mqr, estas partículas foram ressupendidas em pbs

e foi adicionado brometo de etídeo (bret) à suspensão. As microesferas foram

então observadas em microscopia de fluorescência e fotografadas, mostrando a alta

fluorescência das mqr somente quando complexadas ao lack dna, compatível com a

presença do lack dna na sua superfície, sem, contudo descartar a possibilidade de

complexação também na malha interna do polímero. Este resultado mostra que

reticulação com 1,5% de gliceraldeído não alterou sensivelmente a carga superficial

positiva da partícula, estando de acordo com o potencial zeta de + 55 mv (oliveira

et al., 2005) (fig. 16)

Figura 15. Taxa de incorporação do lack dna em mqr. LACK DNA e MQR foram incubados a 37°c/2h sob agitação. Após este tempo, as micropartículas foram centrifugadas e o LACK DNA livre no sobrenadante foi dosado na densidade ótica de 260 nm. A taxa de incorporação foi obtida subtraindo-se o LACK DNA do sobrenadante do LACK DNA total adicionado no início do processo. Resultados expressam as taxas de incorporação de 3 lotes diferentes de LACK DNA.

*

0

20

40

60

80

100

% D

NA

in

co

rpo

rad

o 86% 84% 90%

Lote 1 Lote 2 Lote 3

Figura 16. Adsorção do LACK DNA na superfície das MQR. Microscopia de fluorescência do complexo MQR/LACK DNA marcado com BrEt (aumento de 32x). A. MQR “vazias” em luz visível. B. MQR “vazias” marcadas com BrEt, fluorescência c. Complexo MQR/LACK DNA marcado com BrEt, fluorescência.

A

B

C

20 µm

4.2.2.2 CINÉTICA DE LIBERAÇÃO DO LACK DNA DAS MQR

O complexo MQR/LACK dna foi adicionado a tampão fosfato ph 5,5 e a

suspensão colocada em agitação a 37°c. Alíquotas foram retiradas nos tempos

indicados, centrifugadas e o dna foi dosado no sobrenadante.

A curva de liberação in vitro (fig. 17) apresenta uma cinética de dois tempos.

Cerca de 30% do lack dna foi liberado na primeira hora, reduzindo-se

sensivelmente a liberação nas duas horas seguintes, quando então passou de 44%

para 93% (4 horas de incubação/agitação). Em 21 h, 100% do dna havia sido

liberado. A liberação quase que total no período de 4 horas indica uma taxa

adequada para o tempo esperado de permanência das partículas na mucosa nasal.

Figura 17. Cinética de liberação do LACK DNA adsorvido em MQR a pH 5,5 e 37°c. Alíquotas do complexo MQR/LACK DNA foram colhidas nos tempos indicados e a porcentagem de DNA liberado em relação ao total adsorvido foi feita a partir da leitura do sobrenadante em espectrofotômetro a 260 nm. (resultados representativos de três experimentos).

0 1

3 40

25

50

75

100

(horas)

(%)

2 21

4.2.3 - Efeito da incorporação de LACK DNA em MQR na eficácia da vacina

intranasal

4.2.3.1 Potencialização da eficácia da vacina LACK DNA

Uma vez que as MQR mostram-se biocompatíveis, capazes de adsorver com

eficiência o LACK DNA e que o complexo formado mostrou-se capaz de liberar o DNA

satisfatoriamente in vitro, o passo seguinte foi avaliar o sistema MQR/LACK DNA na

imunização de camundongos visando a potencialização da eficácia da vacina de LACK

DNA intranasal na leishmaniose cutânea

Assim, 30 µg de LACK DNA livre ou complexado com MQR foram

administrados por via intranasal em camundongos BALB/c em duas doses, com

intervalo de 7 dias, conforme protocolo anterior (Pinto et al., 2004; Gomes et al.,

2007). Uma semana após a última dose, os camundongos foram desafiados com L.

Amazonensis na pata e o curso da lesão foi acompanhado por 110 dias. Conforme a

Fig. 18, o LACK DNA administrado adsorvido nas microesferas foi capaz de retardar o

crescimento da lesão e também de controlar a replicação do parasita. (Fig. 19).

Assim como no experimento anterior para a formulação lipossomal (Fig. 7),

aqui também a alta virulência da infecção não permitiu a visualização da eficácia do

LACK DNA livre quanto à redução do tamanho da lesão em relação ao grupo que

recebeu somente PBS (Fig. 18). No entanto, quando o tamanho da carga parasitária

é usado, nota-se que o LACK DNA livre foi capaz de induzir imunidade protetora (Fig.

19). Em ambos os parâmetros avaliados, a formulação em MQR mostrou

potencialização da eficácia vacinal do LACK DNA.

Figura 18. Efeito da incorporação de LACK DNA em MQR no controle do crescimento da lesão. Camundongos BALB/c foram imunizados pela via intranasal com 30 µg de LACK DNA livre ( ) ou 30 µg de MQR LACK DNA ( ) em duas doses com intervalo de 7 dias. Controles receberam PBS ( ). Uma semana após a segunda dose os animais foram infectados com L. Amazonensis na pata e o crescimento da lesão foi acompanhado por medidas periódicas com paquímetro nos tempos indicados. Média ± SD, n=6 animais por grupo. **p< 0,01, * p< 0,05, em relação ao PBS e ao LACK DNA livre..

Figura 19. Efeito da incorporação de LACK DNA em MQR no controle da carga parasitária. Camundongos BALB/c foram imunizados e infectados como para a Fig. 18. 110 dias após a infecção, os camundongos foram eutanasiados e as patas foram retiradas para quantificação da carga parasitária. Média ± SD, n=6 animais por grupo. ***p< 0,001, **p< 0,01 , *p< 0,05.

LACK DNA

PBS

MQR LACK DNA

0 25 50 75 100 125 0

1

2

3

4

5

tempo (dias)

les

ão

(m

m)

***

0123456789

10 11

PBS LACK DNA MQR LACK DNA

**

nº

de p

ara

sit

as (

x 1

07)

***

*

5. Discussão

5. Discussão

O estudo apresentado nesta dissertação refere-se ao desenvolvimento

tecnológico da vacina gênica de lack dna incorporada em lipossomas catiônicos e em

micropartículas de quitosana reticuladas com gliceraldeído como sistemas de entrega

de vacina de mucosa contra leishmaniose cutânea.

A mucosa nasal foi utilizada como via de administração em virtude de

resultados anteriormente obtidos por nosso grupo, onde a administração tanto de

antígeno bruto de l. Amazonensis (laag), como de lack dna induziu por esta via uma

forte resposta protetora contra o desafio com l. Amazonensis (pinto et al, 2004).

O primeiro sistema que estudamos foram os lipossomas catiônicos. Algumas

tentativas de imunização de camundongos com antígenos de leishmania

incorporados em lipossomas têm sido realizadas, como o uso de antígenos solúveis

totais de leishmania (shimizu et al, 2007), proteína 1 induzida por stress (rlmsti1)

(badiee, et al 2007) ou gp63r (jaafari et al, 2006). A administração de lack dna

incorporado em lipossomas catiônicos não foi capaz de aumentar a transfecção in

vitro de macrófagos peritoneais quando comparado ao lack dna livre, como podemos

observar pela intensidade até mesmo menor dos amplicons de cdna do rt-pcr

apresentados no gel de agarose (fig. 5 e 6).

Isto não descartou a possibilidade de que in vivo este complexo pudesse

melhorar a eficácia da vacina, pois o lipossoma estaria protegendo o lack dna da

ação de DNAses presentes em secreções da mucosa.

Pelos resultados obtidos após o acompanhamento da lesão (fig. 7), podemos

observar que o parasito estava muito virulento, produzindo lesões muito grandes,

fora do padrão de lesões que geralmente esta infecção apresenta. Devido a esta alta

virulência, a dose de LACK DNA livre administrada foi subótima, não levando à

proteção dos camundongos, quando o parâmetro tamanho da lesão é avaliado. O

LACK DNA lipossomal não foi capaz de promover uma melhoria na eficácia do lack

dna nestas condições. É possível, no entanto, que variações na espessura da pata

(tamanho da lesão) não sejam sensíveis o suficiente para detectar um efeito

protetor, como visto em experimentos utilizando MQR (fig. 18 e 19).

As propriedades do complexo formado pelos lipossomas catiônicos e DNA

podem ser manipuladas com a intenção de se aumentar a transfecção (hirashima et

al., 2007). De qualquer forma, novas formulações lack dna lipossomais com

diferentes proporções de lipídeos catiônicos e de lack dna serão preparadas com o

intuito de melhorar a eficácia da vacina.

Outro sistema que estudamos foram micropartículas de quitosana reticuladas

com gliceraldeído 1,5%. Este sistema foi recentemente desenvolvido (oliveira et al,

2005) e trouxe a inovação de utilizar como agente reticulador gliceraldeído, que é

um aldeído encontrado no organismo humano como um produto metabólico da

frutose. O gliceraldeído não é tóxico, ao contrario dos outros aldeídos utilizados até

então como agente reticulante, o glutaraldeído e o formaldeído (vandelli et al.,

2001).

Com o desenvolvimento desta nova formulação, onde as partículas têm

tamanho médio de 6,7 µm, potencial zeta de +55,3 ± 0,6 mv (oliveira et al., 2005),

a primeira avaliação que fizemos para mostrar que seu uso é seguro para aplicações

farmacêuticas foi realizar testes de toxidez e alergenicidade. Sabe-se que o polímero

de quitosana é biocompatível e biodegradável (tharanathan et al, 2003), que

hidrogéis de quitosana são biocompatíveis quando implantados subcutânea ou

intraperitonealmente em ratos (azab et al, 2007) e que in vitro nanopartículas de

quitosana são compatíveis com células do epitélio respiratório (grenha et al, 2007).

Os primeiros testes de toxidez aguda foram realizados administrando-se as

partículas reticuladas pelas vias intranasal e subcutânea. A primeira é a via por onde

a vacina é administrada e a segunda foi usada considerando-se a possibilidade de se

validar uma outra via de administração para estas partículas. Nano e micropartículas

de quitosana já vêm sendo usadas experimentalmente para o direcionamento de

vacinas de mucosa com sucesso (van der lubben et al, 2001).

Dada a dificuldade de colheita do muco nasal dos camundongos, a resposta

inflamatória no bal foi avaliada, considerando-se que parte do material inalado

chegue aos pulmões (lee et al., 2006). O lavado broncoalveolar realizado 2 horas

após a administração das partículas por via intranasal (fig. 8) mostrou que as

partículas não provocaram influxo celular, indicando que não levaram a um processo

inflamatório no sistema respiratório inferior local. Este resultado mostra que a

reticulação não tornou as microesferas indutoras de inflamação nos pulmões, mas a

possibilidade de reação local na mucosa nasal precisa ser avaliada, principalmente

por ser a quitosana um polímero mucoadesivo (van der lubben et al, 2001).

As dosagens de transaminases tgo e tgp no soro dos camundongos 24 h após

a segunda administração das partículas por ambas as vias nasal e subcutânea

mostraram valores semelhantes ao grupo controle pbs, indicando que nessas doses

terapêuticas as mqr não causaram dano ao tecido cardíaco ou hepático (fig 9a e 9b).

A dosagem de creatinina no soro (fig. 9c) dos camundongos 24 horas após

receberem a segunda dose de mqr pelas duas vias também não se mostrou alterada

em relação ao grupo controle pbs, mostrando que as partículas também não

provocaram danos ao tecido renal.

Depois de avaliar que as mqrs não eram potencialmente tóxicas pelas vias i.n.

E s.c., avaliamos se elas eram capazes de induzir toxidez quando administradas pela

via intraperitoneal, uma via muito mais invasiva e que nos permitiu administrar uma

quantidade muito maior de partículas - 8 mg - que é cerca de 5 vezes a quantidade

utilizada na vacinação (1,5 mg).

Ao analisarmos o infiltrado celular do peritoneal 3 dias após a administração

das partículas (fig. 10), pudemos observar que em camundongos que receberam mqr

não ocorreu influxo celular local, compatível com ausência de efeito pró-inflamatório

das mqr. As concentrações de tgo e tgp (fig. 11a e 11b) encontradas nos soros dos

camundongos 3 dias após a administração foram semelhantes as do grupo pbs,

mostrando que também por esta via, com uma carga maior de partículas, a

administração foi segura. Os níveis de creatinina observados (fig. 11c) também

encontram se dentro da normalidade, indicando também ausência de toxidez renal

detectável.

Diante dos parâmetros de toxidez aguda analisados, podemos concluir que

mqr são biocompatíveis, apropriadas para uso em vacinas. Após realizar testes de

toxidez aguda, realizamos ensaios de alergenicidade, para verificar se as

microesferas eram potenciais indutoras de alergia. O edema de pata induzido pelas

mqr i.n. E s.c. Até 120 min foi semelhante ao controle pbs (fig. 12), indicando

ausência de hipersensibilidade cutânea imediata. No grupo que recebeu ova s.c. Foi

observado edema nos primeiros minutos após o desafio, indicando hipersensibilidade

cutânea imediata (controle positivo).

A medida das patas 24 horas após o desafio (fig. 12), apresentou edema em

todos os camundongos que haviam sido desafiados com mqr. Como o grupo pbs,

que não havia sido sensibilizado com mqr também apresentava edema, levantamos a

hipótese de que ao invés do aumento de volume ser devido a uma resposta imune,

poderia ter sido provocado por intumescimento das microesferas na pata.

Para confirmar que a formação deste aumento de volume não estava

relacionada com resposta alérgica e que poderia assim estar relacionado com o

intumescimento, 50 µg de mqr foi administrada na pata e o aumento de volume foi

acompanhado por 72 horas (fig. 13). Observou-se que mqr realmente provocam um

aumento no volume na pata, que desaparece dentro de 72 horas. Este aumento de

volume pode realmente se dar por intumescimento das micropartículas, o que pode

ser benéfico, pois auxiliaria no processo de liberação do lack dna do sistema. Como

a via que iremos utilizar em nosso estudo é a via nasal e não a subcutânea, a real

causa será avaliada posteriormente por experimentos de análise histológica.

A contagem de eosinófilos foi outro parâmetro de alergenicidade avaliado,

uma vez que estas células estão aumentadas durante os processos alérgicos (fig.

14). As mqr não foram capazes de induzir eosinofilia, confirmando por mais este

parâmetro que não são potenciais indutoras de alergia.

Os resultados de toxidez aguda e alergenicidade mostraram que mqr são

biocompatíveis, como a maior parte dos produtos desenvolvidos a partir de quitosana

(sinha et al., 2004).

Após a avaliação da biocompatibilidade das microesferas, o passo seguinte foi

verificar a capacidade das partículas adsorverem o lack dna e após esta adsorção,

serem capazes de liberarem-no novamente, dois pontos essenciais para que este

complexo possa ser utilizado para vacinação.

O processo de adsorção foi realizado com sucesso (fig. 15), com um

rendimento em torno de 84% a 90% do lack dna adicionado. Dados da literatura

mostram processos de adsorção de dna em quitosana com aproveitamento entre

78% (oliveira et al, 2006) e 95% (leong et al, 1998). Nossos dados mostraram-se

satisfatórios quando comparados com outros sistemas de complexação.

Após comprovar por espectrofotometria a ligação do dna às microesferas, o

complexo foi marcado com bret para obtermos um resultado qualitativo, visualizando

o complexo formado em microscopia de fluorescência (fig. 16). Observou-se que

microesferas “vazias” não emitem fluorescência e que o complexo mqr/lack dna

aparece fortemente fluorescente devido a ligação do bret ao lack dna adsorvido na

partícula, o que comprova a adsorção. Resultados semelhantes foram obtidos por

oliveira e colaboradores (2006), que também visualizaram por fluorescência a ligação

do plasmídeo pvax-hsp65, que codifica uma proteína imunogênica de m. Leprae

marcado com bret em microesferas de quitosana reticuladas, mas não avaliaram a

capacidade de liberação do dna das partículas após adsorvido.

Depois da adsorção, a capacidade de liberação do lack dna das mqr foi

avaliada in vitro, nas condições fisiológicas ph 5,5/37°c (fig. 17). A curva de

liberação mostra um resultado bastante promissor, pois apresenta uma liberação

controlada, com 30% do lack dna sendo liberado em 1h. Com 3 horas esta liberação

continua acontecendo, com cerca de 44 % de liberação. Este dna liberado nas

primeiras horas pode ser o que estava adsorvido mais superficialmente na

microesfera. Após as 3 primeiras horas, pode ter começado a ocorrer uma pequena

degradação da partícula, o que levou a uma maior liberação do dna que poderia

estar adsorvido nas camadas mais internas da microesfera. 4 horas após o início do

processo 93% do lack dna está livre no sobrenadante. Com 21 h, 100% do dna

adicionado estava livre novamente. Este esquema de liberação é muito importante,

pois mostra uma liberação que ocorre de maneira controlada, com cerca de 40% do

dna sendo liberado nas primeiras 3 horas de maneira continuada, e entre a 3º e a 4º

hora, ocorre a liberação de uma grande quantidade, funcionando como um reforço.

In vivo este esquema de liberação traz a vantagem de proteger o dna de ser

degradado de uma única vez por dnases da mucosa. Sabe-se que o dna livre na

mucosa é degradado em poucos minutos pela ação destas enzimas. Sua liberação de

maneira controlada e vetorizada, pelo direcionamento para a mucosa através da

propriedade mucoadesiva da quitosana, aumentaria sua disponibilidade e a

possibilidade de transfectar células ou ser fagocitado por células apresentadoras de

antígenos, levando a codificação da proteína que estimulará o sistema imune,

melhorando desta maneira a eficácia da vacina (greenland and letvin, 2007).

Tentativas de imunização pela via intranasal com antígenos e dna adsorvidos

em quitosana estão descritas na literatura, como vacinas contra o vírus influenza em

modelos experimentais (amidi et al, 2007) e humanos (robert et al., 2005) e contra

difteria em modelos murinos (van der lubben et al., 2003). Não há relatos na

literatura de uso da quitosana como sistema de liberação contra leishmaniose com

vacinas protéicas ou de dna.

No processo de preparação da vacina foram realizados com sucesso os

ensaios de biocompatibilidade e de avaliação da capacidade das mqrs em adsorver e

liberar o lack dna.

Diante disso, o passo seguinte foi vacinar camundongos e observar se a

complexação foi capaz de melhorar a eficácia do lack dna na proteção contra a

infecção com l. Amazonensis. Pelos resultados obtidos com o acompanhamento da

lesão (fig. 18), pudemos observar que a infecção foi muito virulenta, produzindo

lesões muito grandes, fora do padrão de lesões que geralmente esta infecção

apresenta. No dia 90 a lesão geralmente apresenta-se em torno de 0,5 mm para o

grupo pbs (pinto et al., 2004). Neste experimento, no dia 90 a lesão já estava com

2,5 mm (experimento realizado em paralelo a este com lipossomas catiônicos

apresentou o mesmo perfil). Devido a esta alta virulência, a dose de lack dna livre

administrada foi uma dose subótima, não levando a proteção dos camundongos. Por

outro lado, o grupo que foi imunizado com lack dna incorporado em mqr exibiu um

desenvolvimento de lesão mais controlado, mesmo neste sistema muito virulento,

indicando que a incorporação foi capaz de potencializar a eficácia da vacina.

Ao observarmos a carga parasitária das patas infectadas (fig. 19), podemos

confirmar que a vacinação com o complexo mqr lack dna melhorou a eficácia da

vacina, pois além de controlar o crescimento da lesão, inibiu a replicação do parasito

quando comparada com o controle pbs (p< 0,001). A avaliação da carga parasitária

também mostrou que lack dna livre também foi capaz de controlar a replicação

parasitária, mesmo não tendo controlado o desenvolvimento da lesão, quando

comparado ao grupo controle pbs (p< 0,01). Podemos observar ainda, que o grupo

vacinado com mqr lack dna inibiu a replicação do parasito de maneira significativa

quando comparado ao grupo vacinado com lack dna livre, confirmando a

potencialização da eficácia da vacina. Estes dados corroboram resultados publicados

por nosso grupo que mostram que administração de lack dna livre é capaz de

controlar a carga parasitária na pata (pinto et al, 2004).

No geral, os resultados mostrados neste trabalho mostram que nas condições

de formulação utilizadas, as microesferas de quitosana reticuladas com 1,5% de

gliceraldeído (MQR) foram superiores aos lipossomas catiônicos na vacinação

intranasal com LACK DNA, mesmo em caso de desafio mais severo com o agente

infectante. O trabalho aponta, portanto, para a exeqüibilidade do desenvolvimento

tecnológico da formulação MQR/ LACK DNA.

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