benaim g. acta cientif venezol rev 2004
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7/23/2019 Benaim G. Acta Cientif Venezol REV 2004
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La CA2+-ATPasa de la membrana plasmáticacomo enzima clave en la homeostasisintracelular del calcio. Estimulación por etanol y otros efectores
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Gustavo Benaim
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REVISION (BIOLOGIA CELULAR)
Acta Científica Venezolana, 55: 304-314, 2004
LA Ca2+-ATPasa DE LA MEMBRANA PLASMATICA COMOENZIMA CLAVE EN LA HOMEOSTASIS INTRACELULAR DEL
CALCIO. ESTIMULACION POR ETANOL Y OTROS EFECTORES
Gustavo BenaimLaboratorio de Señalización Celular y Bioquimica de Parasitos
Centro de Biociencias. Instituto de Estudios Avanzados (IDEA) y Laboratorio de Biofísica.Instituto de Biología Experimental, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.
Apartado 47114. Caracas, Venezuela.e-mail [email protected]
Recibido: 27/05/04; Revisado: 06/07/04; Aceptado: 23/11/04
RESUMEN: La Ca2+
-ATPasa de la membrana plasmática (PMCA) es una enzima clave en la regulación de la concentración basal de Ca2+
.Hemos demostrado que el etanol estimula la actividad de la Ca
2+-ATPasa y el transporte de Ca
2+ asociado. Cuando el etanol y la
calmodulina (CaM) esta presentes simultáneamente, el efecto estimulatorio es aditivo, lo cual apoya que estos efectores actúan a través dedistintos mecanismos. Mediante el uso de isoformas diferentes de la Ca
2+-ATPasa se demostró que la variante PMCA2CI resultó ser mas
sensible al efecto del etanol. Es Interesante resaltar que esta es la isoforma mas predominante en cerebro, cerebelo y tejido nervioso. Porotra parte, el fosfatidiletanol se forma mediante la transfosfatidilación de ciertos fosfolípidos cuando el etanol está presente, por unareacción que es catalizada por la fosfolipasa D. Este fosfolípido se acumula en la membrana de las células de mamífero luego del consumode alcohol. Hemos demostrado que el fosfatidiletanol también estimula a la bomba de calcio de la membrana plasmática. Este fosfolípidoincrementa la afinidad de la enzima por Ca
2+ en mayor medida que la que se obtiene en presencia de CaM u otro fosfolípido acídico natural.
Los esfingolípidos han sido reconocidos recientemente como importantes segundos mensajeros, actuando en varios sistemas encombinación con el Ca
2+. En vista del hecho que la PMCA es estimulada por etanol, y tomando en cuenta que los esfingolípidos poseen
grupos hidroxilo libres, decidimos estudiar el posible efecto de la ceramida y la esfingosina sobre esta bomba de calcio. Demostramos quela ceramida estimula a la Ca
2+-ATPasa de una manera dosis-dependiente y de forma aditiva a la CaM y al etanol, cuando se compara con
estos dos efectores añadidos separadamente. La ceramida afecta tanto la afinidad de la enzima por el Ca2+
, como su Vmax. Mas aún, esteesfingolípido también estimula el transporte de Ca
2+ en vesículas invertidas de eritrocitos. Por lo contrario, la esfingosina, la cual se ha
reportado en varios sistemas que actúa de manera antagónica a la ceramida, mostró un efecto inhibitorio sobre la Ca2+
-ATPasa. Estainhibición también se observó en presencia de CaM. Estos resultados tomados en conjunto sugieren que la ceramida y la esfingosinaactúan antagónicamente sobre la PMCA, lo cual coincide con el efecto opuesto que estos esfingolípidos poseen frecuentemente endiferentes sistemas. Palabras clave: Ca
2+-ATPasa; calmodulina; etanol; esfingolípidos; ceramida.
THE PLASMA MEMBRANE Ca2+
-ATPase AS A KEY ENZYME IN THE INTRACELLULAR CALCIUMHOMEOSTASIS. STIMULATION BY ETHANOL AND OTHER EFFECTORS
ABSTRACT: The plasma membrane Ca2+
-ATPase (PMCA) is a key enzyme in the regulation of the intracellular Ca2+
concentration. Studiesfrom this laboratory have shown that ethanol stimulates the Ca
2+-ATPase activity and its associated Ca
2+-transport. When ethanol and
calmodulin (CaM) were present simultaneously, the stimulatory effect was additive, supporting that these two effectors act through differentmechanisms. The use of different isoforms of the Ca
2+-ATPase showed that the variant PMCA2CI was more sensitive to the effect of
ethanol. Interestingly, this is the predominant isoform in brain, cerebellum and nervous tissues. On the other hand, phosphatidylethanol isformed by transphosphatidylation of phospholipids when ethanol is present, a process catalyzed by phospholipase D. This phospholipidaccumulates in the plasma membrane of mammalian cells after ethanol consumption. It was demonstrated that phosphatidylethanol alsostimulates the plasma membrane calcium pump. The phospholipid increases the affinity of the enzyme for calcium to a larger extent than inthe presence of calmodulin or other natural acidic phospholipids. Sphingolipids have been recently recognized as important secondmessengers acting, in many systems, in combination with Ca
2+. In view of the fact that the PMCA is stimulated by ethanol, and since
sphingolipids possess free hydroxyl groups, the study of the possible effect of ceramide and sphingosine on this calcium pump was
undertaken. It was shown that ceramide stimulates the Ca2+
-ATPase in a dose-dependent manner, and additively to the activation observedin the presence of CaM or ethanol, when compared to any of these effectors alone. Ceramide affects both the affinity for Ca
2+ and Vmax of
the enzyme. Furthermore, this second messenger also stimulates Ca2+
transport in inside-out plasma membrane vesicles from erythrocytes.Conversely, sphingosine, a reportedly antagonist to ceramide in many systems, showed an inhibitory effect on the Ca
2+-ATPase activity. This
inhibition was also observed on the CaM-stimulated enzyme. Taken together these results suggest that ceramide and sphingosine actantagonistically on the PMCA. This is in accordance with the frequently reported opposite effect of these sphingolipids in different systems.Key Words: Ca
2+-ATPase, calmodulin; ethanol, sphingolipids, ceramide.
INTRODUCCION
El calcio es probablemente el mas importante entretodos los mensajeros intracelulares, en los mecanismosde traducción de señales en las células eucarióticas. Su
función como mensajero está garantizada por lacapacidad de la célula de mantener, en virtud de susdiferentes mecanismos homeostáticos, unaconcentración citoplasmática de este catión 4 órdenes demagnitud por debajo de su concentración extracelular
18.
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Ca2+
-ATPasa de la membrana plasmática 305
Como catión bivalente es además atraído fuertementehacia el interior de la célula en virtud de la diferencia depotencial eléctrica transmembrana negativa en el interior.
Así, este ión esta separado de su potencial de equilibrioelectroquímico que predice la ecuación de Nernst, unas10.000.000 de veces, si este catión se distribuyerapasivamente a través de la membrana. Este valor seencuentra muy por encima que el de cualquier otro ión
presente en la célula. Este hecho implica que la aperturade un canal de calcio en la membrana plasmática,producto de una interacción con una señal específica,conllevaría a una entrada rápida de este catión, lo cualde hecho constituye la base de su acción como segundomensajero.
En este sentido cabe preguntarse porque es el calcio,entre todos los iones disponibles en la naturaleza, el queha sido seleccionado evolutivamente como el masimportante mensajero intracelular. Volviendo a laelevadísima diferencia con respecto a su potencial deequilibrio electroquímico, probablemente el primerproblema que tuvo que afrontar la célula durante su
evolución, con respecto a este catión es su muy bajasolubilidad, en comparación a otros iones, aunada a sugran abundancia en el agua de mar, donde se originó lavida. De esta manera, si no fuera excluido, el calcioprecipitaría en el interior celular, fundamentalmente conlos abundantes fosfatos y los ácidos orgánicos, lo cualimposibilitaría los procesos que se llevan a cabo en elcitoplasma. La solución fue mantener una membranamuy impermeable al calcio y simultáneamente diseñarmecanismos de transporte altamente específicos, tantopara su exclusión activa hacia el medio extracelularcomo para su almacenamiento en organelos específicos.Posteriormente en la evolución, dado que la célula tuvo
que invertir una cantidad importante de energía enmantener este elevado gradiente electroquímico decalcio, toma ventaja de dicho gradiente, y de otraspropiedades químicas de este elemento y lo transformaen el catión señal por excelencia.
Aunque esto es solo un teoría, parece concebible enfunción de las características de este particular catión ytomando en cuenta los otros hechos mencionados eneste contexto.
Regulación intracelular de calcio
Tomando en cuenta lo anterior no es de extrañar que
la célula posea hasta 7 mecanismos diferentes paramantener la concentración citoplasmática de calcioiónico [Ca
2+]i a nivel submicromolar
7,18. A nivel de los
organelos, están presentes en el retículo endo (sarco)plasmático y la mitocondria. El primero presenta unaCa
2+-ATPasa (SERCA), o bomba de Ca
2+, con alta
afinidad por Ca2+
, pero con baja capacidad para eltransporte del mismo, mientras que la mitocondria por locontrario, posee un uniporte electroforético energizadopor el gradiente electroquímico de protones en lamembrana interior mitocondria, el cual presenta una altacapacidad de transporte pero una muy baja afinidad por
este catión7,18
. Ambos presentan también mecanismosde salida de Ca
2+. La mitocondria excluye al catión
gracias a un intercambiador Na+/Ca
2+, (o en algunos
casos H+/Ca
2+), el cual es electroneutro, mientras que la
salida de calcio del retículo endo(sarco)plasmático selogra a través de canales altamente regulados: Un canalde rianodina, mucho mas abundante en elsarcoplasmático, y un canal de sensible a IP3 mas
importante en el retículo endoplasmático15, en el cual seinduce la liberación cuando se produce este mensajeropor la acción de la diferentes fosfolipasas C sobre elfosfatidilinositol (4,5) bisfosfato, lo cual conlleva atambién a la liberación del diacilglicerol, otro fundamentalsegundo mensajero, que a su vez estimula la proteínaquinasa C, con importantes implicaciones en losmecanismos de señalización celular
15. También se ha
identificado otra Ca2+
-ATPasa diferente a las anteriores(PMR1), la cual está presente en el sistema de golgi y en
vesículas secretoras de insulina en las células β delpáncreas
29. Sin embargo, en estas últimas células su
función parece estar mas asociada a la secreción de la
hormona29
que a la regulación intracelular del Ca2+
.Los mecanismos presentes en diferentes organelos
están limitados por la capacidad de éstos comocompartimientos, por lo que a largo plazo, son losmecanismos ubicados en la membrana plasmática losresponsables de la alta asimetría en la distribución delcalcio entre el interior y el exterior celular
7. Existe varios
tipos de canales muy bien regulados a través diversosmoduladores que permiten la entrada de Ca
2+ siguiendo
su gradiente de potencial electroquímico, tantodependientes de ligandos como dependientes de voltaje,cuya descripción no está en los alcances de estarevisión. Entre los mecanismos de exclusión, existe un
intercambiador Na
+
/Ca
2+
, el cual extruye Ca
2+
del interiorcelular utilizando como energía la disipación delgradiente electroquímico de Na
+existente entre el
citoplasma y el exterior celular 25
. Este intercambiadorpresenta una estequiometría de 3Na
+/Ca
2+, siendo muy
importante en células excitables donde los cambios en laconcentración basal del Ca
2+ pueden ser bastante
elevados25
. De acuerdo a esto, su afinidad por el Ca2+
esrelativamente baja, en comparación con su capacidadrelativa de transporte, la cual es alta. Por otra parte, laCa
2+-ATPasa (o bomba de calcio) de la membrana
plasmática presenta una relativamente baja capacidadde transporte pero una alta afinidad por el Ca
2+,
compatible con la concentración citoplasmática de estecatión cuando la célula esta en reposo7,20. A diferenciade el intercambiador Na
+/Ca
2+, esta enzima es
extremadamente ubicua, habiéndose identificado entodas las células eucariotas estudiadas hasta elpresente, desde mamíferos hasta plantas, y desdehongos hasta parásitos
12.
La visión en conjunto de todos estos diferentesmecanismos permiten concluir que su presenciasimultanea en una célula no es redundante, ya que cadamecanismo presenta ubicación espacial, afinidad ycapacidad diferente, lo que garantiza que en conjuntoson capaces de mantener la homeostasis intracelular de
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306 Benaim
Ca2+
tanto en reposo, como luego de una señal queeleve subitamente su concentración.
La Ca2+
-ATPasa de la membrana plasmática
Desde el punto de vista estructural y funcional, la Ca2+
- ATPasa de la membrana plasmática (definidageneticamente como PMCA) es diferente a la Ca
2+-
ATPasa presente en el retículo endo(sarco)plasmático(SERCA), ya que su peso molecular es de 138.000 Da
16,
mientras que la del retículo está entre 109.000 y 115.000Da
18. Ambas proteínas han sido secuenciadas,
encontrándose muy poca homología secuencial. Dehecho, las únicas secuencias comunes entre ambasproteínas son las correspondientes al sitio defosforilación por el ATP y el sitio de unión de nucleótidos.Estos dos sitios son característicos de todas las bombasiónicas del tipo ¨P¨, así definidas por la formación de unintermediario fosforilado (un aspartil-fosfato) durante su
ciclo catalítico18. La estequiometría de estas dos bombasiónicas también es distinta. La Ca
2+-ATPasa de la
membrana plasmática transporta un átomo de Ca2+
porcada molécula de ATP que hidroliza, mientras que laenzima del retículo transporta 2 átomos por molécula de
ATP18
. Otra diferencia fundamental lo constituye elhecho de que la enzima de la membrana plasmáticapuede perder hasta el 40 % de su masa y todavía sercapaz de transportar calcio de una manera ATP-dependiente
2,17. De hecho, en experimentos mediante
proteólisis parcial de la proteína y reconstitución enliposomas, hemos demostrado que un fragmento de81.000 Da. es capaz de mantener la función de hidrólisis
de ATP y el transporte de Ca2+
asociado2
. Este hechosugiere que alrededor del 40 % de la masa de la enzimaesta comprometida en su regulación
17, a diferencia de la
bomba del retículo la cual es muy pobremente regulada.Es interesante mencionar que aunque la Ca
2+-ATPasa
de la membrana plasmática es altamente ubicua entrelos organismos eucariotes como se mencionóanteriormente, existen diferencias interesantes entreestas bombas de calcio en distintos organismos. Porejemplo, la Ca
2+-ATPasa del parásito patógeno
Trypanosoma brucei , causante de la enfermedad delsueño, aunque tiene un peso molecular aparente similara la enzima homóloga de humanos y comparte otrascaracterísticas con ésta
8, es inhibida por la pentamidina,
droga de uso generalizado en la cura de la dolenciaantes mencionada, mientras que esta droga no tieneningún efecto sobre la Ca
2+-ATPasa de humanos
8. Lo
mismo puede decirse del efecto de cristal violeta (ovioleta de genciana) sobre esta enzima en Trypanosomacruzi
26. Estos estudios apuntan hacia la búsqueda de
diferencias entre esta enzima en distintostripanosomatidios, con respecto a la estructura homólogade mamíferos, con el objeto de establecer diferenciasrelevantes desde el punto de vista terapéutico, en eldesarrollo de drogas contra las enfermedades causadaspor estos parásitos
12.
Regulación de la Ca2+
-ATPasa por la calmodulina
La Ca2+
-ATPasa de la membrana plasmática esestimulada por la calmodulina (CaM), una proteína de16.700 bien conservada evolutivamente y cuya ubicuidaden las células eucarióticas es paralela a la de bomba decalcio. De hecho, se podría postular que ambasproteínas han coevolucionado en los eucariotes con el fin
de garantizar el funcionamiento del Ca2+ como señal. Así, cuando el calcio se eleva intracelularmente,producto de la apertura de un canal voltaje-dependienteo ligando-dependiente, este catión se une a la CaM lacual cambia su conformación y modifica la actividad delas enzimas “blanco”, lo cual a su vez desencadena lareacción de la célula ante la señal. Posteriormente, elcomplejo Ca
2+-CaM, estimula a la bomba de calcio de la
membrana plasmática, conllevando a la disminución dela concentración del Ca
2+ citoplasmático a su nivel de
reposo, preparando así a la célula para responder a unanueva señal
7,18. La CaM presenta 4 sitios de unión para
el calcio los cuales son altamente cooperativos. La unión
del calcio a la proteína incrementa su contenido de α-hélice, concomitantemente con su hidrofobicidad
14. La
conformación de la proteína depende estrictamente decuantos átomos de calcio estén enlazados, lo cual latransforma en un “sensor” de la concentracióncitoplasmática de Ca
2+. De esta manera puede reconocer
diferentes enzimas de acuerdo a la concentración deCa
2+ intracelular presente en un momento dado.
También se ha postulado que la apocalmodulina(proteína en ausencia de Ca
2+), es capaz de reconocer
ciertas enzimas blanco14
. La estructura de la CaM hasido conservada evolutivamente entre los diferenteseucariotas
6,14. Sin embargo, la CaM de los
tripanosomatidios presenta como excepción 17sustituciones aminoacídicas con respecto a la proteínade humanos
14. Mas recientemente, se ha demostrado
que la CaM fosforilada por diferentes proteínas-quinasascambia su función con respecto a ciertas proteínasblanco
13,14, lo cual incrementa mas aún su plasticidad
como molécula reguladora. Todas estas característicasle permiten a la CaM un espectro de acción muy amplio,en los mecanismos de traducción de señales.
Con respecto a la Ca2+
-ATPasa, la CaM incrementatanto su Vmax como su afinidad por el calcio y por el
ATP4,7,20
. La proteólisis parcial de la enzima mediantetripsina
1,2o calpaína
35simula el efecto de la CaM, lo cual
ha permitido elaborar un modelo mediante el cual la CaMremovería una compuerta auto-inhibitoria de la enzimapermitiendo así un mayor acceso de los sustratos (Ca
2+ y
ATP) al sitio activo1,2,7,17
.La actividad de la enzima también puede ser
incrementada mediante su auto-agregación, lo cualpermite sugerir que la enzima podría presentar unatransición de monómero a dímero
23. Los solventes
orgánicos como el dimetilsulfóxido y los poli-alcoholes(etilenglicol, glicerol) también simulan el efectoestimulatorio de la CaM
3,4, lo cual sugiere que también
actúan removiendo la mencionada compuerta auto-inhibitoria
7 (Figura 1).
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Ca2+
-ATPasa de la membrana plasmática 307
Figura 1. Modelo de interacción de la Ca2+
-ATPasa de la membrana plasmática con la calmodulina y con solventes orgánicos como elDMSO. Ver explicación en el texto (Redibujado de Benaim, G. 1993, con autorización).
Regulación de la Ca2+
-ATPasa por otros efectores
La Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática tambiénpuede ser estimulada por fosfolípidos acídicos y ácidosgrasos poli-insaturados de cadena larga
18. De hecho, se
ha postulado que la proporción de fosfatidilserinapresente en la cara interna de la membrana plasmáticaes suficiente para estimular al 50% de la actividad de laenzima.
El efecto de los fosfolípidos acídicos es más notablesobre la afinidad de la enzima por el Ca
2+, la cual se
incrementa por encima del valor alcanzado cuando esestimulada por la CaM
18. También puede ser estimulada
mediante fosforilación por diferentes proteínas quinasas,como por la proteína-quinasa A
19 y por la proteína-
quinasa C36.Respecto a la estimulación por la proteína quinasa C,
esta ocurre el mismo sitio de unión de la CaM, por lo queambos efectores actúan sobre la bomba de calcio de unamanera excluyente, por lo que sus efectos sobre laenzima no son aditivos. De esta manera, cuando laenzima ha sido fosforilada por la proteína quinasa C, nopuede unir CaM. De acuerdo con esto, cuando la enzimatiene enlazada a la CaM, el sitio de fosforilación por laquinasa esta protegido por la interacción
36. Los iones
monovalentes, como el Na+ y el K
+, también regulan la
actividad de la Ca2+
-ATPasa31,32
.
Estimulación por etanol y por fosfatidiletanol
A pesar de que el alcohol se ha consumido por todaslas civilizaciones desde que se conoce la historia delhombre, aún se desconoce el mecanismo mediante elcual ejerce su efecto farmacológico. Menos se sabe delas razones que convierten a un individuo en alcohólico ya otros no. Tampoco se sabe mucho acerca de losmecanismos de transmisión de señales que en últimainstancia definen el estado de ánimo de los sereshumanos. Sin embargo, existen evidencias recientes queseñalan al calcio como responsable de alguno de estosfenómenos. Así, se ha reportado en estudios realizadospor un grupo de psiquiatras en pacientes maníaco-depresivos, que durante la fase maníaca, laconcentración de calcio intracelular es menor quedurante la fase depresiva. Inclusive, el tratamiento conlitio en individuos bipolares, revierte a los pacientes auna distribución normal de las concentraciones de calciointracelular. No es difícil concebir que, como el calcioregula la liberación de neurotransmisores, unaperturbación en los mecanismos homeostáticosresponsables del mantenimiento de las concentracionesbásales intracelulares de este catión, podría serresponsable de algunas de estas manifestacionesclínicas.
En este particular, hemos obtenido evidencias de queel etanol y otros alcoholes alifáticos de cadena corta
Proteólisis controlada
Dominio autoinhibitorio CaM
Solvente orgánico
C a
2 + - A T P a
s a
Estimulación por CaM
Estimulación por solventes orgánicos
Proteólisis controlada
Dominio autoinhibitorio CaM
Solvente orgánico
C a
2 + - A T P a
s a
Estimulación por CaM
Estimulación por solventes orgánicos
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308 Benaim
estimulan la Ca2+
-ATPasa de eritrocitos humanos, tantoen su forma purificada como sobre la enzima in situ
10. El
transporte de calcio en vesículas invertidas de eritrocitoshumanos también es estimulado por el etanol de unamanera dosis-dependiente, lo cual permite inferir queetanol podía estimular esta actividad in vivo
10. El
mecanismo de acción de este alcohol es distinto al dela CaM, ya que su efecto es aditivo con el modulador
proteico natural, tanto con respecto a la velocidadmáxima de la enzima, como sobre su afinidad por el Ca
2+
y ATP10
. El efecto del etanol sobre la Ca2+
-ATPasa estotalmente revertido al lavar las membranas mediantecentrifugación en un medio sin alcohol, lo cual sugiereque el efecto inducido por el etanol sobre la Ca
2+-
ATPasa en condiciones farmacológicas, puede serrevertido una vez que el alcohol haya sido eliminado
22.
Por otra parte, siguiendo con este mismo estudio, sedemostró que el efecto del etanol no se confina a laCa
2+-ATPasa de eritrocitos, sino que es capaz de
estimular también a la enzima homóloga de Leishmaniamexicana
9, lo cual sugiere que este efecto podría ser
mas general, ya que la Ca2+
-ATPasa de la membranaplasmática es una enzima, que además de ser ubicua encélulas eucarióticas
5,6, está bastante conservada
evolutivamente11,17
.Otros resultados de nuestro laboratorio han
demostrado que el fosfatidiletanol es capaz de estimular
la actividad de la Ca2+-ATPasa a niveles mayores queotros fosfolípidos naturales
34, tanto en la enzima
purificada de eritrocitos humanos como sobre la enzimain situ
22(Figura 2). También hemos demostrado que este
efecto es extrapolable al transporte de Ca2+
, en vesículasinvertidas de eritrocitos humanos
34. Este efecto es
interesante, ya que este fosfolípido se acumula en lamembrana cuando el etanol esta presente, mediante unproceso de transfosfatidilación mediado por la fosfolipasaD
28, en el cual el alcohol sustituye al agua, formándose
un fosfatidilalcohol en lugar de ácido fosfatídico.
Figura 2. Efecto de concentraciones crecientes de fosfatidiletanol sobre la actividad de la Ca2+
-ATPasa de fragmentos de membrana.
La concentración de Ca2+
libre utilizado fue 10 µM. Control (); 5% (v/v) etanol (). Tomado de Cervino y Benaim, 2002, conautorización).
0 100 200 300 400 5000
10
20
30
40
Concentración de fosfatidiletanol, g/ml)
A c t i v i d a
d E s p e c í f i c a
( n m o l e
s P i / m g . m
i n )
0 100 200 300 400 5000
10
20
30
40
Concentración de fosfatidiletanol, g/ml)
A c t i v i d a
d E s p e c í f i c a
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Ca2+
-ATPasa de la membrana plasmática 309
La acumulación de fosfatidiletanol se ha reportado queocurre luego de una ingesta alcohólica, presentando unatasa de degradación muy lenta
28. De hecho, se ha
postulado que parte del efecto del etanol en humanospuede ser atribuido a la acumulación en la membrana defosfatidiletanol
28.
Los hallazgos anteriores nos han permitido postularque la combinación del etanol con el fosfatidiletanol
formado a partir de éste, podría tener un efectosinergístico sobre la activación de la Ca
2+-ATPasa y el
consecuente transporte de calcio. Este efecto se observamas sobre la afinidad de la enzima por el Ca
2+, lo cual
permite especular que cuando la enzima se encuentraestimulada por ambos efectores, podría disminuir laconcentración basal del catión por debajo a la que sealcanza en presencia de por ejemplo, CaM. De estamanera, esto podría conllevar a que a la célula le seríamas difícil alcanzar un nivel umbral en la [Ca
2+]i luego de
una señal adecuada, respondiendo mas tardíamente,con los consecuentes posibles efectos que esto podríaocasionar en los mecanismos de transmisión de señales.
Más recientemente hemos encontrado que el efectodel etanol es diferente entre las distintas isoformas de laenzima presentes en humanos
21. Así, hemos observado
que el etanol tiene un efecto diferencial sobre cuatroisoformas diferentes de la Ca
2+-ATPasa de membrana
plasmática (PMCA1CI, PMCA2CI, PMCA4CI yPMCA4CII)
21. Estas isoformas son producto de 3 genes
diferentes y difieren en cuanto a estructura y en algunasde sus propiedades
20. Asimismo, estas isoformas se
encuentran expresada de manera diferencial en losdistintos tejidos
33. Las isoformas PMCA1CI y PMCA4CII
se encuentran expresadas en las membranas de todaslas células eucariotas estudiadas hasta el momento, la
isoforma PMCA4CI se encuentra principalmente entejidos musculares tales como corazón y estomago,mientras que la isoforma PMCA2CI se encuentraexpresada principalmente en células nerviosas, cerebroy cerebelo
20,33.
Para realizar este estudio, las 4 isoformas fueronexpresadas mediante un sistema de sobre-expresión através de baculovirus. Para ello, baculovirusrecombinantes conteniendo el cDNA para cada una delas isoformas fueron utilizados para infectar una líneacelular de insectos (Sf9). Posterior a la expresión, lasproteínas de interés fueron caracterizadas tanto desde elpunto de vista bioquímico como funcional
21. Las 4
isoformas resultaron ser estimuladas por el etanol en unaforma dosis-dependiente, observándose igualmente entodas ellas un efecto aditivo del alcohol sobre laestimulación obtenida por la CaM. Sin embargo,existieron diferencias significativas entre las mismas encuanto a la concentración del alcohol a la cual sealcanzó el máximo efecto estimulatorio (Figura 3).
En este sentido, ha sido muy interesante observar quela isoforma mas sensible al etanol es la PMCA2CI
21, la
cual como se mencionó está ubicada fundamentalmenteen cerebro, cerebelo y tejido nervioso
33. La dosis de
etanol con la cual se alcanza el máximo de estimulaciónen esta isoforma está precisamente en el rango
farmacológico27
, fácilmente adquirible en la sangre luegodel consumo excesivo de alcohol.
Estos resultados nos permiten sugerir que el efecto deletanol en humanos podría deberse a la estimulación deltransporte de calcio a nivel de estos tejidos, con laconsecuente disminución en la concentracióncitoplasmática de este catión. Esto tendríaconsecuencias en la liberación de ciertos
neurotransmisores, ya que es bien conocido que estefenómeno esta regulado por los niveles de calcio en lascélulas de estos tejidos.
Como se mencionó anteriormente, se ha encontradoen estudios con pacientes maníaco-depresivos, unacorrelación entre la concentración de calciocitoplasmático y el estado anímico. Específicamente,durante la crisis maníaca, los pacientes presentaron unamenor concentración de Ca
2+ citoplasmático en los
eritrocitos, que durante la crisis depresiva. El estado deanimo durante la crisis maníaca se asemeja al inducidopor la intoxicación etílica, en cuanto a la manifestaciónde un cuadro eufórico. Aún cuando esta relación es
hasta el presente especulativa, es perfectamentefactible, y merece ser investigada con detalle en elfuturo.
En otro orden de ideas, recientemente también hemosadelantado con respecto a la identificación del sitio deinteracción de la bomba de calcio con el etanol.
Durante el estudio del efecto del etanol sobre lasdiferentes isoformas de la Ca
2+-ATPasa, pudimos
observar que dos de las isoformas, las cuales sonproductos de un mismo gen, las isoformas PMCA4CI yPMCA4CII, se comportaron de manera diferencial con eletanol
21. Estas isoformas únicamente difieren en cuanto
a la secuencia en la porción C-terminal de la proteína.
Estos hallazgos sugieren que esta región de la enzimapudiera ser importante para el mecanismo de acción deletanol. Con el objeto de verificar esta posibilidad,estudiamos el efecto del etanol sobre dos formastruncadas de la enzima originadas a partir de la isoformaPMCA4CII. Una de las formas truncadas carece de los
44 aminoácidos hacia la región C-terminal (PMCA∆44),mientras que la otra forma presenta una truncación de
139 aminoácidos (PMCA4∆139) hacia esta mismaregión. Estas formas truncadas fueron expresadasmediante el mismo sistema descrito anteriormente
21.
Cuando se ensayó el efecto del etanol sobre la actividad
enzimática de la isoforma PMCA4∆44 se observó que el
etanol estimuló a esta proteína de manera similar alefecto observado sobre la isoforma nativa PMCA4CII.Por el contrario, cuando se determinó el efecto del
etanol sobre la forma truncada PMCA4∆139 el etanol notuvo ningún efecto sobre la actividad de la enzima
21.
Estos resultados demuestran que la región relevante enla Ca
2+-ATPasa para el efecto del etanol está ubicada
entre estos 95 aminoácidos diferentes entre las dosformas truncadas.
Estos estudios merecen ser continuados con el objetode caracterizar la secuencia de aminoácidos responsabledel efecto del etanol en esta enzima.
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310 Benaim
Figura 3. Efecto del etanol sobre la actividad hidrolítica de las distintas isoformas expresadas de la Ca2+
-ATPasa. La concentración de
Ca2+
libre fue 10 µM. (A) isoforma PMCA1CI, (B) isoforma PMCA2CI, (C) isoforma PMCA4CI y (D) isoforma PMCA4CII. (○) representa la
curva de control y (●) en presencia de 5 µg/ml CaM. El 100 % de actividad para la isoforma PMCA1CI corresponde a una actividad
específica de 1.40 nmolPi/mg.min, para la isoforma PMCA2CI es de 4.36 nmolPi/mg.min, para la PMCA4CI es de 6.19 nmolPi/mg.min ypara la PMCA4CII es de 7.95 nmolPi/mg.min. (Tomado de Cervino y col. 1998, con autorización).
Regulación de la Ca2+
-ATPasa por otros lípidos naturales
El efecto del etanol sobre la actividad hidrolítica de ATP y sobre el transporte de calcio asociado es mayorque el reportado hasta el presente mediante el uso deotros efectores naturales o artificiales
10,34, lo cual índica
que la bomba de calcio de la membrana plasmática debeser estimulada fisiológicamente mediante otrosmecanismos desconocidos hasta el presente. En estesentido nos propusimos identificar la posible existenciade estos efectores naturales. Entre los candidatos quedecidimos estudiar, tomando en cuenta suscaracterísticas físico-químicas y su estructura molecular(compuestos anfifílicos con grupos "hidroxilo" libres) seencuentran los esfingolípidos. Estos compuestos cuyafunción era bastante oscura en el pasado (de ahí sunombre), han sido reconocidos recientemente como unimportante grupo de segundos mensajeros, involucradosen procesos celulares tan relevantes como laproliferación celular, la diferenciación y la muerte celular
programada, mejor conocida como apoptosis30
. Laceramida se forma a partir de la esfingomielina poracción de una esfingomielinasa, y a su vez estransformada en esfingosina por una ceramidasa. Ambosesfingolípidos presentan dos grupos “hidroxilo” libres(Figura 4) y a su vez, ambos son susceptibles de serfosforilados a través de quinasas específicas, las cualeslos transforman en ceramida-1-P y esfingosina-1-P, los
cuales constituyen a su vez otro grupo de señales confunciones diferentes a sus precursores
30. A pesar de la
importancia que han revestido recientemente este nuevogrupo de señales, poco se sabe respecto a sumecanismo de acción, y menos aún respecto a surelación con otros mensajeros, en particular con el Ca
2+.
Utilizando como sistema de estudio a la Ca2+
-ATPasapurificada de eritrocitos humanos, demostramos que laceramida tiene un notable efecto estimulatorio sobre laactividad de esta enzima
24. Este efecto es aditivo al
obtenido en presencia de CaM, y curiosamente tambiénal obtenido en presencia de etanol, lo cual indica que
0 1 2 3 4 5 60
100
200
300
400
0 1 2 3 4 5 6
0
100
200
300
400
0 2 4 6 8 10 120
100
200
300
400
0 2 4 6 8 10 12
0
100
200
300
400
Et-OH, % (v/v) Et-OH, % (v/v)
Et-OH, % (v/v) Et-OH, % (v/v)
A c t i v i d a d C a 2 + - A T P a s a ,
( % )
A c t i v i d a d C a 2 +
- A T P a s a ,
( % )
A c t i v i d a d C a 2 + - A T P a s a ,
( % )
A c t i v i d a d C a 2 + -
A T P a s a ,
( % )
PMCA1CI PMCA4CII
PMCA4CIPMCA2CI
0 1 2 3 4 5 60
100
200
300
400
0 1 2 3 4 5 6
0
100
200
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400
0 2 4 6 8 10 120
100
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0
100
200
300
400
Et-OH, % (v/v) Et-OH, % (v/v)
Et-OH, % (v/v) Et-OH, % (v/v)
A c t i v i d a d C a 2 + - A T P a s a ,
( % )
A c t i v i d a d C a 2 +
- A T P a s a ,
( % )
A c t i v i d a d C a 2 + - A T P a s a ,
( % )
A c t i v i d a d C a 2 + -
A T P a s a ,
( % )
PMCA1CI PMCA4CII
PMCA4CIPMCA2CI
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Ca2+
-ATPasa de la membrana plasmática 311
actúan a través de mecanismos distintos (Figura 5). Elefecto observado se manifiesta también en unincremento significativo en la afinidad de la enzima por elCa
2+. En este estudio también ensayamos el efecto de
este esfingolípido sobre la expresión funcional de laCa
2+-ATPasa, el transporte de Ca
2+, encontrando que es
capaz de estimular la acumulación del catión envesículas invertidas de eritrocitos humanos
24, también de
una manera aditiva a la CaM (Figura 6). La esfingosina,
a diferencia de la ceramida, tiene un marcado efectoinhibitorio sobre la actividad de la Ca
2+-ATPasa, tanto en
presencia como en ausencia de CaM, compatible con elfrecuente efecto antagónico que estos dos esfingolípidospresentan entre si en diferentes sistemas
30. Por otra
parte, ni la ceramida-1-P, ni la esfingosina-1-P mostrarontener efecto sobre la actividad de esta enzima
24. Estos
estudios permiten enlazar a la Ca2+
-ATPasa con los
esfingolípidos en la red de transmisión de señales.
Figura 4. Diagrama de la ruta de síntesis y degradación de los esfingolípidos. Las enzimas principales involucradas están señaladas.
O
OHCH2OH
NH
OHCH2OPO3
-H2
NH
O
OHCH2OPO3
-H2
+NH3
Ceramida-1-fosfato
Esfingomielina
O
NH
OHCH2OPO3
-CH2CH2 N(CH3)3+
Ceramida
esfingomielinasa
OHCH2OH
+NH3
Esfingosina
Esfingosina-1-fosfato
ceramidasa
esfingosina quinasa
ceramida quinasaO
OHCH2OH
NH
OHCH2OH
NH
OHCH2OPO3
-H2
NH
O
OHCH2OPO3
-H2
+NH3
Ceramida-1-fosfato
Esfingomielina
O
NH
OHCH2OPO3
-CH2CH2 N(CH3)3+
Ceramida
esfingomielinasa
OHCH2OH
+NH3
Esfingosina
Esfingosina-1-fosfato
ceramidasa
esfingosina quinasa
ceramida quinasa
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312 Benaim
Figura 5. Efecto de concentraciones crecientes de ceramida sobre la actividad de la Ca2+
-ATPasa purificada de eritrocitos humanos. La
concentración de Ca2+
libre utilizado fue 10 µM. Control (○); Calmodulina (●).5% (v/v) etanol (); 5% (v/v) etanol mas calmodulina ().Modificada con permiso de C. Colina, V. Cervino y G. Benaim, (2002) Biochem. J. 362: 247-251. The Biochemical Society
Figura 6. Transporte de Ca2+
inducido por ceramida en vesículas de eritrocitos humanos. El transporte de Ca2+
se determinó mediante Arsenazo III en un espectrofotómetro de doble longitud de onda (675-685 nm) en vesículas invertidas de eritrocitos humanos. Eltransporte de Ca
2+ se evidencia como una disminución en la señal debida a la disminución del Ca
2+ extravesicular, luego de su captura a
través de la bomba. La adición del ionóforo de Ca2+
A-23187 conlleva a la liberación del catión, lo cual demuestra que había sidoacumulado en las vesículas. (). Modificada con permiso de C. Colina, V. Cervino y G. Benaim, (2002) Biochem. J. 362: 247-251. TheBiochemical Society.
0
2
4
6
0 10 20 30 40 50
Concentración de ceramida, (µM)
( µ m o l e s P i / m
g . m
i n )
0
2
4
6
0 10 20 30 40 50
( µ m o l e s P i / m
g . m
i n )
A c t i v i d a d C a 2 + - A T P a s a
0
2
4
6
0 10 20 30 40 50
Concentración de ceramida, (µM)
( µ m o l e s P i / m
g . m
i n )
0
2
4
6
0 10 20 30 40 50
( µ m o l e s P i / m
g . m
i n )
A c t i v i d a d C a 2 + - A T P a s a
CaCl 2
2.5 µM
Ceramide
CaM
100 sec
ATP
A23187
CaCl 2
2.5 M
Ceramida
CaM
100 seg
ATP
A-23187
CaCl 2
2.5 µM
Ceramide
CaM
100 sec
ATP
A23187
CaCl 2
2.5 M
Ceramida
CaM
100 seg
ATP
A-23187
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Ca2+
-ATPasa de la membrana plasmática 313
Como continuación de este estudio, masrecientemente hemos obtenido resultados que apoyanque el diacilglicerol, otro lípido con un grupo “hidroxilo”libre, también es capaz de estimular la Ca
2+-ATPasa,
incluso a niveles superiores a los alcanzados por otrosefectores naturales, reproduciendo parcialmente elefecto del etanol sobre esta enzima
37. Como se
mencionó anteriormente, el diacilglicerol es un
importante segundo mensajero que se forma mediante laactivación de receptores por ciertas hormonas yneurotransmisores, lo cual conlleva a la hidrólisis delprecursor fosfatidilinositol 4,5, -bisfosfato
15 y a la
producción simultanea del promotor de la liberación de
Ca2+
del retículo endoplasmático, el inositol-(1,4,5) tris-fosfato. Los resultados obtenidos hasta el presenteindican que el efecto del diacilglicerol sobre la actividadde la enzima es aditivo respecto a la estimulación por laCaM y por la proteína quinasa C, lo cual constituiría unavía alterna de regulación de la Ca
2+-ATPasa.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por el FONACIT(Proyecto S1-1999000058 y Proyecto de Grupo G-2001000637) y por el C.D.C.H-U.C.V. PI-03-33-4798/00.
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