Özet

Amaç: Benzalkonium klorid ile deneysel aganglionozisoluflturulmas› modelinin (DAM) sorgulanmas› ve literatürde¤erlendirilmesi.

Gereç ve Yöntem: Çal›flma her grupta 10'ar adet Spragu-e-Dawley s›çan ile geç dönem (GD-1), geç dönem kontrolgrup (GD-2) ve aganglionoziste erken dönem (ED) de¤i-fliklikler olarak 3 grup denekte yap›ld› ve ayr›ca ek olarak4 adet denekte de uzun segment aganglionozisin klinik et-kileri gözlendi. Tüm deneklere ifllem öncesi ve sonras›ndaanatomik de¤ifliklikleri gözlemek amac› ile lavman opakgrafiler çekildi. Ganglion de¤ifliklikleri histopatolojik ola-rak de¤erlendirildi. Deneklerin klinik de¤ifliklikleri izlendi.

Bulgular: GD-1 deneklerde çal›flman›n bafl›nda t›kan›kl›kbulgular› görülse de geç dönemde bu bulgular tamamendüzeldi. Bir denek d›fl›nda çal›flma sonunda GD-1 denekle-rin lavman opak grafileri normal bulundu. GD-1 de kilokayb› mevcuttu (p

HH'nin patogenezini anlamak için çeflitli t›kan›kl›kmodelleri öne sürülmüfltür. Önceleri distal kolonba¤lanarak basit t›kan›kl›k modeli yap›lm›fl ve HHbenzeri klinik oluflturulmufltur. Fakat hastal›¤›n sade-ce anatomik bir t›kan›kl›k olmad›¤› anlafl›lm›flt›r.HH'da efllik eden ba¤›fl›kl›k sistemi bozukluklar›,barsak flora de¤ifliklikleri, barsak musin oranlar›nda-ki de¤ifliklikler hastal›¤›n sadece aganglionoziseba¤l› fonksiyonel bir t›kan›kl›k ile seyretmedi¤inigöstermektedir (1,8).

1978'de A. Sato s›çanlarda kolon serozas›na benzal-konium klorid (BK) uygulayarak HH'da oldu¤u gibiseçici olarak ganglion hücrelerinde dejenerasyon vesonuçta aganglionozis geliflti¤ini gözlemledi (10). Sa-to çal›flmas›nda nöronlarda dejenerasyonun erkendönemde bafllad›¤›n› ve BK uygulanan barsak parça-s›nda tamamen aganglionozis geliflimini ise otuzun-cu günde olufltu¤unu saptad›. Sonralar› bu model pekçok çal›flmada kullan›lm›fl ve hayvan modeli olarakda bildirilmifltir (1,4,5,7,10,12). Bununla beraber de¤i-flik zamanlarda yap›lan birkaç çal›flma modelin güve-nirlili¤ini sorgulamam›za yol açm›flt›r (2,9).

Çal›flmam›zda Sato'nun deneysel aganglionozis mo-deli (DAM) sonras› aganglionozisin mikroskopikolarak görüldü¤ü otuzuncu günü de içeren s›çangruplar›nda ifllemin klinik ve histopatolojik de¤iflik-likleri gözlemledik. Ayr›ca literatürde baflvurdu¤u-muz di¤er yay›nlar› da göz önüne alarak ilk k›rk se-kiz saat içindeki de¤ifliklikler erken dönem de¤iflik-likler ve uzun segment aganglionozis ifllemi yap›lan4 denek olarak ayr› bir grupta de¤erlendirdik (2,9,12).

Gereç ve Yöntem

A¤›rl›klar› 250-300 g aras› 34 adet yetiflkin erkekSprague-Dawley s›çan çal›flmada kullan›ld›. Denek-lere 50 mg/kg intramuskuler ketamin HCL (Ketalar,Pfizer, ‹stanbul, Türkiye) ile genel anestezi sa¤land›.Sato'nun 1978'de tan›mlad›¤› gibi; % 0.1’lik BK so-lusyonu (Zefiran®, ‹lsan-‹ltas) 10 mm rektal, 5 mmdistal sigmoid kolon serozas›na bir bez ile uygulan-d›. Otuz dakika uygulama sonras› BK'l› bezler al›na-rak ›l›k serum fizyolojik ile barsaklar y›kand›. Çal›fl-ma için etik komite izni al›nd›. (Cerrahpafla T›p Fa-kültesi etik komitesi).

Geç dönem (GD-1) 10 dene¤e DAM uyguland›ktan

sonra normal hayvan yemi ve su ile beslendi. Denek-lerin ikisi 15. günde, ikisi 20. günde, alt›s› ise 30.günde dekapitasyon ile öldürüldü. Geç dönem kon-trol (GD-2) 10 adet s›çana ifllem yap›lmaks›z›n hay-van yemi ve su verildi. Deneklerin ikisi 15. günde,ikisi 20. günde, alt›s› ise 30. günde öldürüldü. De-neklerin 15, 20 ve 30. günlerde öldürülmelerinin se-bebi bu yaz›da belirtilmeyen, çal›flman›n kurulumaflamas›nda baz› s›çanlarda otuzuncu günü tamam-layamadan ölümler geliflmesi idi. Ara ölümlerin his-topatolojik ve klinik aç›dan de¤erlendirilmesine ka-rar verildi ve çal›flmada 15. ve 20. günlerde ölümlergerçeklefltirilerek histopatolojik ve klinik incelemeyap›ld›. Çal›flmam›zda erken grup oluflturulmas› iseçal›flman›n kurulum aflamas›nda Sato'nun bulgular›-n›n aksine erken dönemde deneklerde aganglionozisklini¤inin daha belirgin olmas›na ra¤men histopato-lojik de¤iflikliklerin net olarak tan›mlanmam›fl olma-s› idi. Erken dönem çal›flma olarak 10 adet erkek s›-çanda BK'n›n erken dönem histopatolojik de¤ifliklik-ler araflt›r›ld›. Denekler ikiflerli gruplar ile 1, 2, 12,24 ve 48. saatlerde öldürüldü.

Ayr›ca 4 adet s›çanda da 15 mm üzeri (25 mm) BKuyguland›. Bu uygulaman›n sebebi de Sato orijinalçal›flmas›nda uzun segment BK uygulad›¤› s›çanlar-da erken dönemde ölüm ile sonuçlanan ileus geliflti-¤ini saptamas› idi. Biz de 15 mm den uzun segmentaganglionozisin erken dönemde mortaliteye etkisinide¤erlendirdik ve tart›flmaya açt›k.

GD-1 ve GD-2 çal›flma gruplar›ndaki deneklerin ifl-lem öncesi ve sonras›nda kilolar› ölçüldü. Tüm grup-lardaki deneklere kolon anatomik de¤ifliklikleri ifllemöncesi ve sonras›nda sodyum diatrizoat (Urovisi-on®-Schering) kullan›larak yap›lan lavman opakgrafilerle gözlemlendi. Patoloji örnekleri serum fiz-yolojik ile y›kand› ve % 10 formaldehit solusyonundasakland›. Rutin doku prosedüründen sonra her birpatoloji örnekleri parafin bloklara al›nd›. Ano-rek-tumdan ve sigmoid kolondan 0.5 mikron kal›nl›ktaaltm›fl adet kesit al›nd› ve kesitler hematoksilen-eozinile boyand›. Ifl›k mikroskopu ile de¤erlendirme yap›l-d›. Örneklerde dejenerasyon ve ganglion hücresivarl›¤› araflt›r›ld›. Her iki gruptaki a¤›rl›k de¤ifliklik-leri Mann-Whitney-U testi ile de¤erlendirildi. P

Bulgular

GD-1 deneklerde ifllem sonras› ilk günlerde defekas-yon miktar› azald›, d›flk› kalibrasyonu inceldi ve ge-nel aktivitelerinde azalma izlendi. ‹zlemde genel du-rumu bozulan ve 15. günde öldürülen bir denek d›-fl›nda tüm deneklerde birinci haftan›n sonunda geneldurumun kademeli olarak tamamen düzeldi¤i görül-dü. Bu denek d›fl›nda tüm hayvanlar›n postmortemlaparatomisinde az derece yap›fl›kl›k d›fl›nda bulguyoktu. Bu denekte ise distal dar barsak ve dilateproksimal kolonik barsak ile beraber geçifl bölgesin-de küçük perfore bir alan saptand›. Ortalama kilokayb› 16.7 g (+6, -116g) bulundu. Yine bu denek d›-fl›nda tüm lavman opak grafiler do¤al idi (Resim 1).15, 20 ve 30. günlerde öldürülen deneklerin histopa-tolojik incelemelerinde minimal dejenerasyon ilenormal ganglion hücreleri varl›¤› saptand› (Resim 2). GD-2 denekler de 15, 20 ve 30. günlerde öldürüldü-ler. Deneklerde klinik bir de¤iflim gözlenmedi. Orta-lama kilo art›fl› +6.8 gr (+4, +10g) bulundu. Lapara-tomi bulgular› ve lavman opak grafileri do¤al bulun-

Resim 1. ‹fllemin 30. gününde normal anatomik yap› gösterenlavman opak grafisi. Genel durumu bozuk olan 15. günde öl-dürülen d›fl›ndaki GD-1 ve 2 tüm deneklerin kolon grafisindepatoloji görülmedi.

Resim 2. ‹fllemin 30. gününde ganglion hücreleri ile normalpleksus görülüyor (x200 HE).

Resim 3. Erken dönem grupta DAM uygulanm›fl 2. günde olans›çan. Dilate ve dar kolonik segment gözükmektedir.

Çocuk Cerrahisi Dergisi 20(3):132-137, 2006

134

Resim 4. Resim 5 deki dene¤in kolon yap›s›. Resmin sa¤›ndadilate rektum ve dar ano-rektum görülüyor.

Resim 5. Tüm kesitlerde muskuler pleksusta ganglion hücre-leri görüldü. Özellikle 24 ve 48. saatlerde dejenerasyon veganglion say›s› azl›¤› belirginleflti (x200 HE).

Tablo 1. Olgulara ait demografik veriler.

Gruplarn=34(250-300 g)

GD-1n=10

GD-2n=10

EDn=10

Uzun Segmentn=4

‹fllem

DAM (15 mm)Lavman opak grafiA¤›rl›k de¤iflimi

Lavman opak grafiA¤›rl›k de¤iflimi

DAM (15 mm)Lavman opak grafi

DAM (25 mm)

Beslenme

YemSu

YemSu

YemSu

YemSu

Klinik Takip

Erken dönemde barsakt›kan›kl›¤›D›flk› kalibrasyonunda azal-ma1. hafta sonunda düzelme1 dene¤in klini¤inde bozul-maOrt.: -16.7 g

Klinik de¤iflme yokOrt.: +6,8 g

Erken ameliyat sonras› bul-gular, 24 ve 48 saat denek-lerin lavman opak velaparatomilerinde dilateproksimal dar distal segment

Erken ameliyat sonras› bul-gular, A¤›r barsak t›kan›k-l›¤› bulgular›,

Öldürülme zamanlar›

15. gün (n=2)20. gün (n=2)30. gün (n=6)

15. gün (n=2)20. gün (n=2)30. gün (n=6)

1. saat (n=2)2. saat (n=2)12. saat (n=2)24. saat (n=2)48. saat (n=2)

Denekler ilk 3 günde ileusve perforasyon ile öldü.

Histopatoloji

Minimal dejenerasyonNormal ganglion hücresi

Normal ganglion hücresi

Ganglion say›lar›nda belir-gin azalma ve dejenerasyon

Ganglion say›lar›nda belir-gin azalma ve dejenerasyon,perforasyon

G. Gündo¤du ve ark., Benzalkonium klorid ile oluflturulan intestinal aganglionozis modelinin irdelenmesi

135

du. Ganglion hücreleri tüm deneklerde normal olarakbulundu. GD-1 ve GD-2 gruplar› aras›nda a¤›rl›k de-¤ifliklikleri ileri derece anlaml› bulundu (p

Nöronal plastisite fenomeni di¤er sistemlerde oldu¤ugibi intestinal sistemde de kök hücrelerin nörotropikfaktörler eflli¤inde yeni ganglion hücrelerine dönüfl-mesi ile geliflmektedir (3,11). Garcia ve Ramalho'nunçal›flmalar› intestinal sistemde nöronal plastisite fe-nomeninin varl›¤›na ait çal›flmalar olup hiçbirisindeSato'nun modelinin geçerlili¤i sorgulanmam›flt›r.

BK ile en son çal›flma Hanani taraf›nca yap›lm›flt›r.Hanani çal›flmas›nda intestinal sistemde nöronalplastisiteyi araflt›rm›fl ve BK uygulad›¤› deneklerdegeçici aganglionozis klini¤i gözlemlemifltir. Hananiifllem sonras› deneklere ikinci gün yapt›¤› laparato-mide d›flk› ile dolu dilate proksimal kolon ve distalin-de dar kolon gözlemlemifl. Bu deneklerin sitolojisin-de nöron ve nöronal liflerde dejenerasyon saptam›flfakat aganglionozis görmemifltir. 30 ve 60. günde öl-dürülen deneklerde ise nöron say›s› kontrol gruba gö-re az olmakla beraber tüm kolonda varl›¤›n› sapta-m›flt›r. Hanani ilk defa Sato'nun modelinin geçerliolamayaca¤›n› bildirmifltir (6).

Çal›flmam›zda DAM uygulanan s›çanlarda erken dö-nemde geliflen klinik ve histopatolojik bulgular budeneklerde bir sürecin bafllad›¤›n› gösterse de bu sü-recin geç dönemde düzeldi¤i görüldü. Bu düzelme-nin nöronal plastisiteye ba¤l› olarak, barsaktaki pri-mitif hücrelerin yeni ganglion hücrelerine dönüflme-si ile oldu¤unu varsaymaktay›z. Bulgular›m›za göredeneklerde erken dönemde barsak hareketleri 15 mmgibi s›n›rl› t›kan›kl›k alan›n› tolere edebilirken,aganglonozis uzun segment oldu¤unda rejenerasyongerçekleflse de ileri derece kat›laflm›fl olan d›flk›n›nbarsak hareketleriyle ilerleyemedi¤i ve klini¤in kötü-leflti¤ini öngörmekteyiz.

Bütün bu modelin geçerlili¤ini sorgulayan bulgular›-m›zla beraber flimdiye de¤in pek çok t›kan›kl›k mo-deli ile HH benzeri durum elde edilmeye çal›fl›lsa daefllik eden ba¤›fl›kl›k sistem patolojileri, sendromlar,barsak flora de¤ifliklikleri HH'nin sadece bir t›kan›k-l›k modeli olmad›¤›n› göstermektedir.

Sonuç olarak; günümüze dek Sato'nun DAM modeliaganglionozis fizyopatolojisini anlamak ve olufltur-mak için iyi bir model olarak savunulmufl olsa da ça-l›flmam›zda bu modelin güvenilirli¤inin olmad›¤›n›öngörmekteyiz.

Bu çal›flma ‹stanbul Üniversitesi Araflt›rma Fonu taraf›ncadesteklenmifltir.Proje no: UDP- 376/26082004

Kaynaklar

1. Chang KS, Chang JHT: Animal models of pediatric sur-gical disease. Ped Surg Int 9:307, 1994 2. Garcia SB, Demarzo MM, Vinhadeli WS, Llorach-Vel-ludo MA, Zoteli J, Herrero CF, Zucoloto S: No reductionwith ageing of the number of myenteric neurons in benzal-konium chloride treated rats. Neurosci Lett 4:331-66, 2002 3. Georg B.T. von Boyen , Max Reinshagen , Martin Ste-inkamp , Guido Adler, Joachim Kirsch: Enteric nervousplasticity and development: dependence on neurotrophicfactors. J Gastroenterol 37:583, 2002 4. Goto S, Gunter M, Grosfeld JL: Surgical treatment of to-tal colonic aganglionosis: Efficacy of aganglionic patchenteroplasty in the rat. J Pediatr Surg 21:7-601, 1986 5. Goto S, Grosfeld JL: Is preserving the entire aganglioniccolon reasonable in the surgical treatment of total colonicaganglionosis? J Pediatr Surg 22:623-627, 1987 6. Hanani M, Ledder O, Yutkin V, Abu-Dalu R, Huang T,Hartig W, Vannucchi M, Pellegrini M: Regeneration ofmyenteric plexus in the mouse colon after experimental de-nervation with benzalkonium chloride. J Comp Neurology462:315, 2003 7. Mortell A, Montedonico S, Puri P. Animal models in pe-diatric surgery. Pediatr Surg Int 22:111-28, 2006 8. Puri P: Hirschsprung's disease: Clinical and experimen-tal observations. World J Surg 17:374, 1993 9. Ramalho F.S, Santos L.N.Z: Myenteric neuron numberafter acute and chronic denervation of the proximal jeje-num induced by benzalkonium chloride. Neurosci Lett26:163, 74, 1993 10. Sato A, Yamamoto M, Imamura K, Kashiki Y, Kunie-da T, Sakata K: Pathophysiology of aganglionic colon andanorectum: An experimental study on a aganglionosis pro-duced by a new method in the rat. J Pediatr Surg 13:399,1978 11. Timothy S. Sadiq, M.D., David A. Gerber: Stem Cellsin Modern Medicine:Reality or Myth? Journal of SurgicalResearch 122:280, 2004 12. Yoneda A, Shima H, Nemeth L, Oue T, Puri P: Selec-tive chemical ablation of the enteric plexus in mice. Pedi-atr Surg Int 18:234, 2002

G. Gündo¤du ve ark., Benzalkonium klorid ile oluflturulan intestinal aganglionozis modelinin irdelenmesi

137