SEPARIMI ELEKTROFORETIK I PROTEINAVE TE SERUMIT NE SHIRITAT CELLOGELL

Hyrje

Gjatë sëmundjeve të ndryshme shpesh herë ndodhin ndryshime të koncentrimeve të fraksioneve të veçanta të proteinave serumike, gjegjësisht ndryshim i koncentrimeve absolute të tyre ose ndryshim i raporteve të tyre të ndërsjella. Kjo nënkupton se koncentrimi i të gjitha proteinave në serum mund të jetë në kufijtë e vlerave referente, por koncentrimi i fraksioneve të veçanta proteinike të jetë i ndryshueshëm që sjellë deri te prishja e raportit ndërmjet fraksioneve proteinike. Më shpesh paraqitet zvoglimi i koncentrimit të albuminave, kurse ndryshimet në globulina reflektohen në rritjen e disa fraksioneve globulinike.

Ndryshimet në raportin e fraksioneve proteinike në plazmë ose serum mund të përdëftohen dhe përcaktohen nëpërmjet teknikave elektroforetike, ku rezultatet e fituara kanë një rëndësi të madhe klinike, gjegjësisht ata kontribuojnë për formimin e diagnozës, si dhe për ndjekjen e rrjedhës së procesit patologjik.

Elektroforeza paraqet lëvizjen e grimcave koloidale me polaritet të njejtë në fushën elektrike të njëkahëshme dhe ku nuk ndryshohen vetitë e tyre fiziko-kimike. Në përgjithësi elektroforeza është teknikë separative, me anë të së cilës proteinat mund të ndahen në mënyrë kuantitative dhe kulitative, tëpërcaktohen një numër i madh i proteinave, lipoproteinave, glikoproteinave, izoenzimeve, aminoacideve dhe substancave tjera qe ndodhen në plazmë dhe në lëngjet tjera biologjike.

Baza teorike e elektroforezës

Proteinat, si rezultat i karakterit të tyre amfotern, në mvarësi prej pH së mjedisit silllen si molekula me ngarkesa neto pozitive ose neto negative. Këto molekula nën ndikimin e rrymës elektrike të njëkahshme, dhe mvarësisht nga tipi i ngarkesës elektrike (pozitive apo negative), lëvizin drejt katodës ose drejt anodës, gjegjësisht nuk lëvizin dhe fundrrohen kur ndodhen në pikë e tyre izoelektrike. Shpejtësia me të cilën lëvizin molekulat proteinike nëper fushën elektrike varet nga sasia e ngarkesës, madhësia dhe forma e molekulave, intensiteti i fushës elektrike si dhe nga natyra e mbajtësit në të cilin zhvillohet elektroforeza.

Te shumica e teknikave elektroforetike, shpejtësia me të cilën lëvizin grimcat varet kryesisht nga sasia e ngarkesës elektrike, gjegjësisht nga ndryshimi ndërmejt pikës izoelektrike të kolodit përkatës dhe pH së mjedisit në të cilin kryhet elektroforeza. Sa më i madj të jetë ndryshimi, aq më e madhe është sasia e ngarkesës elektrike të molekulave proteinike, gjegjësisht shpejtësia e tyre e lëvizjes. Kjo nënkupton se komponentet e veçanta të përmbajtjes për shkak të pikave të ndryshme izoelektrike, për kohë të njejtë kalojnë rrugë të gjata të ndryshme, gjegjësisht fraksionet e përmbajtjes ndahen nga njëra tjetra ( fig.1 )

1

Fig.1 Varshmëria e shpejtësisë së lëvizjes të molekulave proteinike nga madhësia e ngarkesës elektrike.

Proteinat e plazmës i kanë këto pika izoelektrike:

Albuminat 4.6

Alfa1-globulinat 4.8

Alfa2-globulinat 5.0

Beta-globulinat 5.2

Fibrinogjeni 6.0

Gama-globulinat 6.3

Gjatë separimit elektroforetiktë proteinave të serumeve në mjedis bazik ( më shpesh me pH 8.6-9.2), të gjitha disocojnë si molekula neto negative ( anjone ).

Kur elektroforeza zhvillohet në mjedis acidik (për shembull pH 3.8 ), të gjitha proteinat disocojnë si molekula me ngarkesë neto pozitive ( katjone ).

2

Në mjedis bazik, albuminat lëvizin me shpejtësi më të madhe pë shkak të dallimit të madh ndërmjet pikës izoelektrike të tyre dhe pH së mjedisit ( përmbajnë më së shumti ngarkesë elektrike negative, përderisa gama-globulinet udhëtojnë më ngadalë ( fig. 2). Në mjedis acidik gama-globulinet lëvizin me shpejtësi më të madhe, sepse me këtë pH ata posedojnë më së shumë ngarkesa elektrike pozitive (fig.3).

Fig.2 Elektroforeza e proteinave të serumeve me pH 8.6

Fig.3 Elektroforeza e proteinave të serumeve me pH3.8

3

Vendi i aplikimit të serumit

Vendi i aplikimit të serumit

Elektroforeza e proteinave nuk duhet të kryhet as në mjedis të fortë acidik as në mjedis të fortë bazik, sepse në një mjedis të tillë proteinat denatyrohen.Duhet poashtu të shmanget puna edhe me pH që është afër ndonjërës nga pikat izoelektrike. Rryma që përdoret për lëvizjen elektroforetike duhet të jetë e njëkahëshme me tension dhe intansitet konstant. Përveç kësaj duhet të mbahet konstant edhe ngarkesa, e kjo bëhet me shfrytëzimin e puferit me pH të duhur, forcë jonike dhe përçueshmëri. Puferët që përdoren më shpesh janë ato fosfatik dhe Tris-HCl.

Ekzisojnë dy tipe të elektroforezës: elektroforeza e lirë dhe zonike. Te elektroforeza e lirë vetë puferi paraqet mjedisin në të cilin zhvillohet separimi i proteinave, kurse te elektroforeza zonike për separim përdoret një mbajtës i fortë. Në ditët e sotme elekroforeza e lirë nuk përdoret për qëllime rutinore, nga shkaku i disa mangësive ( zgjat shumë, aparatura është e shtrenjtë, përdoret sasi relativisht e madhe nga materiali hulumtues).

Elektroforeza në mbajtës të fortë sot është një teknikë rutinore në laboratoritë klinike.Te ky tip i elektroforezës ndërmjet elektrodave ndodhet një mbajtës i lyer me pufer në të cilin zhvillohet elektroforeza. Tek mbajtësi, materiali hulumtues, për shembull përzierje e proteinave të serumeve, ndahet në zona dhe për këtë arsye ky tip i elektroforezës quhet elektroforezë zonike. Këto zona mund të vizualizohen dhe të jenë në përdorim për analiza të mëtutjeshme.

Mbajtësit që më shpesh përdoren, sipas të cilëve shënohet tipi i teknikës elektroforetike, janë këto:

Letra filtruese – gjatë elektroforezës të proteinave të serumeve në letër do të fitohen 5 fraksione proteinike;

Acetati i celulozës – paraqet një gel të hollë të acatait të celulozës ( cello gell ) i vendosur në një foli plastike, i cili me karakteristikat e tij mundëson që gjatë elektroforezës së proteinave të serumeve të ndahen 18 – 23 fraksione;

Geli i amidonit – gjatë separimit të fraksioneve proteinike në gelin e amidonit, përveç ngarkesës elektrike, pjesërisht ndikon edhe masa molekulare. Ndarja ndodh si pasojë e sasisësë ngarkesës, por separimi i fraksioneve proteinike me ngarkesë të ndryshme apo të njejtë mundësohet nga ndryshimet në masën e tyre relative molekulare, që rezulton me më shumë se 20 fraksione të proteinave serumike;

Geli poliakrilamid – ky mbajtës përdoret më së shumti, sespe mundëson formim të geleve me madhësi të ndryshme ty poreve, gjegjësisht tek ai përdoret edhe efekti i filtrit molekular. Më shpesh përdoret për ndarjen e proteinave të cilat në lengjet trupore janë me koncentrim të ulët;

Geli agaroz – ky mbajtës përveç se në biokimi gjen zbatim të veçantë në biologjinë molekulare, për separimin e fragmenteve të ADN.

Në princip të gjith këto teknika elektroforetike janë të njëjta, por dallohen në procedurën e vizualizimit ( më shpesh ngjyrosjen ) të komponenteve të separuara. Lloji i ngjyrës varet nga substancat që separohen.

4

Puna praktike

Elektroforeza e proteinave të serumeve në shiritat cellogell

Principi i punës

Nën ndikimin e fushës së njëkashme elektrike në mjedis bazik( pH 8.6 ) vjen deri te separimi i priteinave të serumeve, si rezultat i ndryshimeve në ngarkesën elektrike. Si mbajtës i elektroforezes përdoren shirita nga geli i acatatit të celulozës. Pas ngjyrosjes shiritat denzitometrohen, ose ngjyra e fraksioneve eluohet dhe fotometrohet në raport me provën e verbër, me filter të gjelbër.

Materiali: Serumi

Reagjentët dhe mjetet e punës

1. Puferi veronal, pH 8.6 ( 10.3g dietilbarbiturat natriumi dhe 1.34g acid dietil barbiturik tretet dhe mbushet deri në 1 litër me ujë të destiluar );

2. Ngjyra Ponceau S, 6.57 mmol/L (0.5 g ngjyrë Ponceau S treten dhe mbushen deri në 100 mL me 0.3 mol/L acid trikloracetik, i cili përgatitet ashtu që 5 g CCl3COOH treten dhe mbushen deri në 100 mL me ujë të destiluar);

3. Tretja për larjen e shiritave me tepricë të ngjyrës, 0.83 mol/L acid acetik (50mL nga koncetrimi i CH3COOH mbushen deri në 1 litër me ujë të destiluar);

4. Metanoli, CH3OH, komercial;5. Tretja për arritjen e transparencës të shiritave ( përzihen 86 mL metanol, 14 mL acid

acetik i koncetruar dhe 0.1 mL glicerol );6. Acid acetik 13.3 mol/L ( përzihen 80 mL CH3COOH i koncentruar dhe 20 mL ujë i

destiluar);7. Vaska e eleltroforezës me urë prej 8.5 cm, aplikator, shiriti cellogell me dimensione

5.7x14 cm, letër filtruese, përmisues/drejtues rryme.

Procedura

Shiritat cellogell futen në pufer 10 min dhe pastaj teprica e puferit ndërmjat dy faqeve të letrës filtruese largohen. Shiritat vendosen në murin e vaskës të elektroforezës me anën e ndyrë ( nga e cila kalojnë proteinat ) të kthyer për sipër, dhe kjo njifet nga ajo se kendi mesatar i shiritit ndodhet poshtë djathtas. Shiritat duhet të shtrëngohen te ura, ashtu që fundet e shiritave të jenë të zhytura në pufer i cili paraprakishtështë i vendosur në të dyja anët e vaskës. Në një largësi e caktuar nga fundi i katodës me anë të aplikatorit shtojmë 1.5 µL serum në formë të vijës së hollë.Pasi të ndodhë kjo, vaska mbulohet dhe kyqet në rrymë prej 220 V. Elektroforeza zgjat 35 min. Pasi të ndërpritet rryma, shiritat transferohen në vaskë me ngjyrë ( ngjzrë Ponceau S) dhe këtu qëndrojnë 5 min. Pastaj shiritat shpërlahen 3-4 herë në tretësirën për larje. Shiritat e lagur mundet menjëherë të lexohen në denzitometër, ose me mnonjë procedurë të përkthehen në preparat transparent dhe të përhershëm. Për këtë qëllim, ata pas larjes futen për 30 sec në

5

metanol që të dehidrojnë, dhe pastaj 1 min në metanol, acid acetik dhe glicerol. Pastaj shiritat vendosen në pllakë qelqi, menjanohen fluskat prej ajri dhe teprica e lëngut me ndihmën e letrës filtruese. Ngrohen në temperaturë 50-60 oC, 5-6 min deri sa nuk bëhen plotësisht të dukshme. Pasi të ftohen (pllaka e qelqtë me shiritat qëndron e kthyer në letrën filtruese), shiritat nxirren nga pllaka dhe densitometrohen.

Densitometri është një lloj fotometri i kompjuterizuar i cili, duke matur sipërfaqen dhe intansitetin e ngjyrosjes të fraksioneve, vizaton lakore ( Fig.4 ) dhe i njehson përqindjet relative të fraksioneve të veçuara të proteineve të serumeve .

Fig.4 Lakorja densitometrike

Nëse nuk posedojmë densitometër rezultatet i fitojmë manualisht, fotometrikisht.Fraksionet e veçuara priten dhe secila nga ato vendosen veçmas në epruvetë në të cilën më pas shtojmë nga 3 mL 13.3 mol/L acid acetik për eluimin e ngjyrës.Një pjesë e shiritit para albumineve përdoret për provën e verbër dhe përpunohet në mënyrë të njejtë si dhe fraksionet.Pasi që ngjyra e shiritit plotësisht do të eluohet, matet absorbanca e tretjeve të ngjyrosura në raport me provën e verbër me filter të gjelbër 512 nm.

Njehsimi

Koncetrimi i fraksioneve të veçanta proteinike shprehet në:

Përqindje relative nga proteinat e përgjithshme:

fraksioni % =

SI njësi, si pjesë e 1, fraksioni i masës:

6

Koncentrimet absolute (g/L) :

g/L =

Kur lexohen shiritat në densitometër, ai i jep rezultatet të njehsuara në përqindje relative.

Vlerat referente

Fraksioni % SIalbuminat 52-61 0.52-0.61α 1 – globulinet 3-5.5 0.03-0.05α 2 – gllobulinet 6-10 0.06-0.10β - globulinet 9-14 0.09-0.14γ - globulinet 15-22 0.15-0.22

Rëndësia klinike

Shiriti elektroforetik ( elferogrami) dhe rezultatet që dalin nga ai, kontribuojnë shumë për formimin e diagnozës, sepse disa sëmundje dhe gjendje japin elferograme karakteristike. Përveç kësaj, nëpërmjet tyre mundet të ndiqet edhe zhvillimi i procesit patalogjik.

Fraksioni i α-globulineve (α1 dhe α2) rritet në figurën elektrogoretike gjatë gjendjeve patologjike, kryesisht ato që ndërlidhen me dëmtimet akute të indeve, për shembull gjatë sëmundjeve përndezëse dhe autoimune, tumorëve malign, dëmtimet operative apo traumatike të indeve.

Β-globulinet paraqiten në koncentrime të rritura gjatë opstrukcionit të kanaleve tëmthore dhe sindromit nefrotik, dhe disaherë edhe gjatë shtatzanisë.

Rritja e koncentrimit e γ-globulineve (hipergramaglobulinemia) ndodh gjatë sëmundjeve infektuese kronike, dhe çdoherë kur si përgjigje e infeksionit fillon krijimi më intenziv i antitrupthave.

Në Figurën 5 janë paraqitur lakoret densitometrike të proteineve të serumeve të fituara nga pacientë me verdhëzën serumike (a) dhe cirozë alkoolike të mëlçisë (b).

7

Figura 5. Lakoret densitometrike të proteinave të serumeve

Rezultatet:

Pas separimit elektroforetik të proteineve të serumeve në shiritin selogel të njehsohen përqindjet relative të fraksioneve të veçuara proteinike në mostrën e serumit hulumtues. Rezultatet të futen në tabelën e mëposhtme.

Fraksioni % SIalbuminatα 1 – globulinetα 2 – gllobulinetβ - globulinetγ - globulinet

Data Asistenti

_______________ _______________

8