Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 156, 100--106 (1974) �9 by g. F. Bergmann, Miinchen 1974

Obersichtsbericht/Review Article Bestimmung yon Sulfhydryl- und Disulfid-Gruppen in Proteinen

mit Hilfe der amperometrisehen Titration I. (Jber die Reaktionsf~ihigkeit yon Protein-SH-Gruppen und die Stt-Spezifi tat

yon Silber-Ionen

Klaus Hofmann und Reiner Hamm

Institut fiir Chemie und Physik der Bundesanstalt fiir Fleischforschung, Kulmbach (BED) Eingegangen am 3. Mai 1974

Determination of Sulphydryl and Disulphide Groups in Proteins by Amperometrie Titration

I. On the Reactivity of StLGroups of Proteins and the SH-Speeifity of Silver Ions ~qummary. In general it is difficult to measure SH groups in proteins. The problems are due to

the protein structure (hidden or slowly reacting SH groups) or to the low specifity of the reagents or the environmental influences like oxidation. The reason of the different reactivity of SH groups in proteins is discussed: Sterie hindrance, combined functional groups, hydrophobic environment, thiazolin hypothesis, isothiuronium residues, splitting of disulphide groups and acid-labile sul- phides. The extent of the masking of SH groups in proteins varies with different reagents used. The denaturation which makes usually all SH groups accessible to reagents is not always neces- sary and recommendable. Doubts have been thrown on the specifity of AgNOs for SH groups be- cause of some experiences with SH compounds of low molecular weight (formation of complexes). But it is not justified to transfer the conditions of small SH compounds to proteins. Studies on proteins with defined SH and SS content showed in the contrary that silver ions under the con- ditions of the amperometrie titration (tris buffer pH 7.4) may be used as a specific SH reagent.

Zusammen/assung. Die Bestimmung der SH-Gruppen in Proteinen bereitet h~ufig Schwierig- keiten, die in tier Proteinstruktur (,,maskierte" und langsam reagierende Stt-Gruppen), in tier mangelnden Spezifiti~t tier Reagentien oder in ~uBeren Einflfissen begriindet liegen. Die mSglichen Griinde ffir die unterschiedliche Reaktionsf~higkeit der Protein-SH-Gruppen und deren jAmde- rung dutch Denaturierung werden diskutiert (Sterische Hinderung, I~achbargruppeneffekte, hydrophobe Bindungen, Thiazolinhypothese, Isothioharnstoffreste, Disulfidspaltung, s~urelabile Sulfide). Der Grad der ,,Maskierung" yon Protein-Stt-Gruppen ~uBert sich gegeniiber verschiede- nen Reagentien unterschiedlich. Obwohl nach Denaturierung haufig nile Stt-Gruppen zug~nglich werden, ist die Denaturierung nicht generell notwendig oder empfehlenswert. Die Spezifit~t yon AgNOa fiir SH-Gruppen ist auf Grund der Erfahrungen mit niedermolekularen SH-Verbindungen angezweifelt worden (Komplexbildung). Die t]bertragung auf Proteine ist jedoch nicht gerecht- fertigt. Untersuchungen an Proteinen mit definiertem SH- und SS-Gehalt zeigten im Gegenteil, dal~ unter den Bedingungcn der amperometrischen Titration (Trispuffer pH 7,4) Ag+-Ionen als spezifisches SH-Reagens angesehen werden kSnnen.

Ein~iihrung Die SH-Gruppe x ist die am st/irksten nucleophile und somit reaktionsf/ihigste

funktionelle Gruppe der Proteine [1]. In vielen F/fllen steht sie im Zusammenhang mit den Eigensehaften und Funktionen yon Enzymen und anderen Proteinen; sie ist daher h/~ufig Gegenstand bioehemiseher Untersuchungen gewesen [2--9]. Aueh bei Lebensmitteln (z. B. Milch, K/ise, Fleisch, Weizenmehl, Teig, Bier) haben sieh Beziehungen zwisehen den SH-Gruppen der Proteine und den Eigensehaften sowie den Ver/~nderungen w/~hrend der Lagerung, Behandlung und Verarbeitung der Lebensmittel ergeben [10--21]. Somit beansprueht die Bestimmung der SH-Gruppen in Proteinen grebes analytisehes Interesse. Mit ihr ist h/~ufig aucb die Bestimmung der Disulfidgruppen verkniipft, die nach Einwirkung yon Reduktionsmitteln (R-SS-R -+ R-SH) ebenfalls als SH-Gruppen erfaBt werden kSnnen.

1 Die Nomenklatur der SH-Gruppen und SIt-Verbindpngen ist nicht einheitlich. Sch6berl [23] sowie Wagner [24] halten das Prafix ,,Merkapto ' (yon Merkaptan) fiir die einzig korrekte Bezeichnung. Ubliche Namen sind aber auch Sulfhydryl- und Thiol-Gruppe. Ersterer ist in der englischsprachigen biochemischen Literatur weir verbreitet, so dab eine Beschr~nkung auf die Be- zeichnung Merkapto bzw. Mercapto nicht mehr gerechtfertigt erscheint.

101

1. Das Problem des vollst~indigen Eriassens yon Protein-SH-Gruppen Die Bestimmung aller in einem Protein vorhandenen Stt-Gruppen ist ein auBer-

ordentlieh vielschiehtiges Problem. Selbst bei der Reaktion niedermolekularer SH- Verbindungen mit SH-Reagentien ist die erwartete St6ehiometrie nicht immer ge- sichert. Beneseh, ein Experte auf diesem Gebiet, k o m m t sogar zu der SchluBfolgerung, ,,dab kein einfaches analytisches Verfahren, welches auf der einen odor anderen Reaktion der SH-Gruppen mi t SH-Reagentien beruht, als endgfiltig betrachtet werden kann" [22]. Man muB deshalb unterseheiden zwischen dem ermittelten SH-Gehalt und dem tats~chliehen SH-Gehalt eines Proteins. I m Idealfall st immen beide SH- Gehalte iiberein. Sie entsprechen dann dem Cysteingehalt des Proteins. I m allge- meinen wird jedoeh der ermittelte SH-Gehalt yon dem tatsi~chlichen abweichen. Die hierfiir in Betracht kommenden Griinde sind im folgenden zusammengestellt:

Ursachen fiir die Nichtiibereinstimmung zwischen tats~ehliehom und gefundenem SH-Gehalt in Proteinen

I. SH-Gehalt zu niedrig II. SH-Gehalt zu hoch

Ia)

Ib)

Ic)

Niehtreaktivo (,,maskierte") SH-Gruppen

unvollst~ndige Reaktion (z. B. zu rasehe Titration)

Oxydation eines Toils der SH-Gruppen (SH --> SS) durch Luftsauersteff

IIa) Reagonsverbrauch dutch Reaktion bzw. Komploxbildung mit anderen funktionel- len Gruppen der Proteino

IIb) l~eaktion mit anderen Inha]tsstoffen (Jodid, Bromid, Sulfid, im Falle yon Ag + als Reagens)

Zu Ia: Fiir dio mangelndo Reaktionsf~higkeit mancher Protein-SH-Gruppen kSnnen verschio- done Ursachen in Betracht gezogen werden (s. Absctmitt 2a). Zu Ib: Einem unvollstgndigon Vorlauf der Reaktion kann man durch Verl~ngerung dot Reaktions- zeit begegnon. Bei Einsatz der amperometrischen Titration ist es daher h~ufig n6tig, eine ,,Rea- gonsiibersehuB"- odor bessor eine ,,indirekte" Titration anzuwonden [25, 26]. Zu Ir Eine Oxydation der SH-Gruppen l~Bt sieh durch Ausschlu0 yon Luftsauerstoff {Durehlei- ten yon Inertgas) einschr~nkon. Da eine vSlligo Sauerstofffreiheit der verwendeten LSsung prak- tiseh kaum zu erreichen ist, biotet dieso Vorkehrung keine Sicherheit. Naeh unseren Erfahrungen [27] kann jedoeh die durch Spuron yon Schwermetallionen (Cu ++, Mn ++ ) katalytisch besehleunigte Autoxydation yon SH-Gruppen dureh Zusatz yon EDTA vollst~ndig gehommt werden. Eine 0,5 % EDTA enthaltende Glutathionl6sung erf~hrt aueh in Gegonwart von Luft innerhalb yon minde- stens 12 Std koine nachweisbare Xnderung des SH-Gehaltes; das gleiche trifft fiir Proteinl5sungen zu. Die Gefahr der Komplexbildung (IIa) wird in Absehnitt 3 eingehend diskutiel't.

2. Reaktionsf~ihigkeit yon Protein-SH-Gruppen a) ,,Klassische" Vorstellungen. Eialbumin ist das Beispiel eines Proteins, dessen

SH-Gruppen im nat iven Zustand mit dem am l~ngsten bekannten SH-Reagens Nitroprussid-Natrinm nicht naehweisbar ist, und zwar weder, wie allgemein fiblich, in ammoniakalischer L6sung noeh in schwach saurer ZinkchloridlSsung, in welcher die gebildete Farbe relativ stabil ist [28--30]. Aueh Ferrieyanid und Porphyridin, zwei in frfiheren Jahren zur quanti tat iven SH-Bestimmung h/~ufig verwendete Rea- gentien [31, 32] geben mi t nat ivem Eialbumin keine positive Reaktion. Das gleiche gilt ffir die SH-Reagentien 5,5-Dithio-bis(2-nitrobenzosi~ure) (Ellmans Reagens [33]) und N-•thylmaleinimid [34 bzw. 35]. Solehe ,,unzug/~ngliehen" SH-Gruppen werden im Englischen als "masked", "hidden", "inaccessible" oder "inavailable" bezeichnet [36]. Andererseits vermSgen jedoeh einige andere SH-Reagentien zumindest teflweise mi t den ,,unzug/~ngliehen" SH.Gruppen des Eialbumins zu reagieren, n/~mlich p-Chlormereuribenzoat [34, 37--39], Jod [34, 40], Jodaeetamid [41], o-Jodosoben- zoat [42] und Silbernitrat [43, und eigener Befund]. Die ,,Unzugiingliehkeit" der SH-Gruppen des nativen Eialbumins kann demnach nieht als absolut und unabhi~ngig vom jeweils angewendeten Reagens betrachtet werden.

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Bei Denaturierung durch ttarnstoff [28, 32, 41, 44], Guanidin [32, 41, 44, 45] oder Hitzebehandlung [28, 32, 44, 46] werden jedoch die SH-Gruppen des Eialbumins auch gegenfiber den anderen StLReagentien leicht zug~nglich. Die zahlreichen, an Eialbumin gcsammelten Erfahrungen kSnnen allerdings nicht ohne weiteres auf andere 1)roteine fibertragen werden. Bei jedem einzelnen Protein liegen, wie viele Beispiele in der Literatur zeigen, besondere, for das jeweilige Protein charakteristische Verh~ltnisse vor. Dementsprechend fiihrt Wallenfels [1] aus: ,,Es scheint auch un- mSglich, die chemische Reaktivit~t einzelner Gruppenarten im nativen Protein ein- heitlich zu beurteilen." So ist die generelle l~eststellung yon Cecil u. McPhee [4], dab Proteine for die Bestimmung sKmtlicher SH-Gruppen denaturiert sein mfissen, durchaus nicht fiir alle Proteine zutreffend. Bei l~indcrserumalbumin [45, 47--49] und Muskelprotein [25] z. B. wurden bei Anwendung bestimmter l~eagentien im nativen Zustand ebensoviel SH.Gruppen gefunden wie im denaturierten Zustand. Es besteht somit keine ausreichende Begrfindung for die Auffassung, ,,dab die Proteine bei vorsichtiger Behandlung keine titrierbaren Gruppen enthalten" [50].

Die Freisetzung der SH-Gruppen infolge Denaturierung wird mit der dabei ein- tretenden/~nderung der r~u~nlichen Struktur des nativen Proteinmolekfils erklhrt [51--55], so dab die zuvor aus sterischen Grfinden ,,abgeschirmten" SH-Gruppen nach "Entfaltung" des Molekfils frei zug~nglich werden. Zur Erkli~rung der Tatsache, dab in Proteinen SH-Gruppen mit sehr unterschiedlicher Reaktionsfi~higkeit vorkom- men, reicht diese Deutung jedoch sicher nicht aus. Neuere Untersuchungen an SH-Verbindungen haben weitere, wichtige Gesichtspunkte zum VerstKndnis des Verhaltens der SH-Gruppen in Proteinen beigetragen, die im folgenden kurz dar- gestellt werden sollen.

b) Neuere Erkenntnisse. Nach Wallenfels [1, 56, 57] sind vor allem ,,Nachbar- gruppeneffekte" (,,Kombinationsfunktionen", "combined/unetional groups") fOr die groBen Unterschiede der Reaktionsf~higkeit yon SIt-Gruppen in Proteinen verant- wortlich, wobei Wasserstoffbrfickenbindungen, Coulombsche Kr~fte und sterische ttinderung oder sterische Bevorzugung yon Bedeutung sind [57].

In Modelluntersuchungen an micellenbildenden Cysteinderivaten, deren LSsungen weitere Micellenbildner enthielten, konnte Heitmann [58, 59] zeigen, dab die Cystein- seitenkette -CIt2-SH in das hydrophobe Bindungssystem der Micellen einbezogen ist. Die Einverleibung der SH-Gruppe in anionische Micellen ist mit einer Maskierung der SH-Gruppe verbunden. Ist diese jedoch in kationische Miccllen eingeschlossen, so tritt der gegenteilige Effekt, d.h. eine Steigerung der Reaktionsfi~higkeit der SI-I- bzw. S--Gruppe, ein [59]. Nicht-ionische Micellen haben nur einen geringen EinfluB auf die Reaktionsrate. Die unterschiedliche Reaktionsf/ihigkeit der SH- Gruppen ist daher vor allem auf elektrostatische Effekte in den hydrophoben Be- reichen zuriickzufiihren [59]. Diese Erkenntnisse lassen sich mSglicherweise auch auf Protcine fibertragen ("masked" und "super reactive SH groups").

Auch yon anderen Autoren wird die Einbeziehung der SIt-Gruppe in hydrophobe Bereiche des Proteinmolekiils diskutiert [60, 61]. Dementsprechend h~ngt ihre Reaktionsgeschwindigkeit yon der Polarit~t des SH-I~eagenses ab, und zwar verl~uft die Reaktion mit schwach polaren aliphatischen l~eagentien schneller als mit starker polaren [60]. Domanski u. Ostrowski [62] haben Cystein und SI-I-Glutathion in Gegenwart yon Aminen mit Silbernitrat amperometrisch titriert und dabei zu niedrige SIt-Werte gefunden. Daraus ~_rd gefolgert, dab die verminderte Reaktionsf~higkeit yon Protein-SH-Gruppen auf einer Wechselwirkung dieser Gruppen mit den ~-Amino- gruppen der Lysinreste und den Guanidylgruppen der Argininreste in den hydro- phoben Regionen der Proteine beruhe.

Bemerkenswert ist, dab die Blockierung yon SIt-Gruppen zu einer Konformations- ~nderung bzw. Denaturierung eines Proteins fiihren kann [63--66], so dab hierdurch weitere, zuvor unzug~ngliche SH-Gruppen, reagieren kSnnen.

103

c) Spezielle Deutungen. Bei l~ngerer Einwirkung yon 4 m-Guanidin auf Rinder- serumalbumin stellten Kolthoff u. Mitarb. [67] eine Abnahme der mit Ag+-Ionen bestimmbaren SH-Gruppen fest. Dies wurde so gedeutet, dal3 eine Stt-SS-Austausch- reaktion nach dem Schema:

/s Protein-SH ~- Protein\ l --> Protein-S-S-Protein-Sit

\ S

stattfinde und die neugebildete SIt-Gruppe weniger reaktionsf~hig sei [67]. Bei sp~teren mit AgNO~ durehgeffihrten SH-Bestimmungen an mit 8 m-Harn-

stoff denaturiertem Rinderserumalbumin fanden Kolthoff u. Mitarb. [68] dagegen zu hohe Wcrte. Hierbei win'de eine Disulfidspaltung als Ursache in Betracht gezogen [68]. Die oben gegebene Erkl~rung erscheint somit recht willkiirlich, denn es ist kaum denkbar, dab Guanidin und Harnstoff als Denaturierungsmittel f/ir die entgegen- gesetzten Befunde verantwortlich gemacht werden kSnnen. DaB SH-Reagentien, wie Silbernitrat und p-Chlormereuribenzoat, unter bestimmten Bedingungen Disul- fidgruppen angreffen und spalten kSnnen [22, 69, 70], mul3 als gesichert betraehtet werden. Diese Gefahr besteht insbesondere bei Einwirkung eines relativ grol]en Reagensfiberschusses und bei sehr langer Einwirkungsdauer.

Verschiedentlich wird auch angenommen, dal3 die ,,maskierten" SH-Gruppen gar nieht als SH-Gruppen, sondern in Form yon besonderen Verbindungen vorliegen, aus denen sie erst frcigesetzt werden. Am ~Itesten ist die Thiazolinhypothese yon LinderstrSm-Lang [71]. Dutch hydrolytisehe 0ffnung des heterocyclischen Ffinfrings von 2-Methylthiazolin wird eine SIt-Gruppe gebildeb:

H2C N H~C ...... NH

H~c\ s/c--c . H~C\s H co--oH.

Das Vorkommen eines solchen Ringes in Proteinen ist jedoch noch nicht naeh- gewiesen worden. Versuche an Eialbumin [28] und RinderserumaIbumin [72] haben vielmehr gezeigt, dal3 Thiazolinringe zumindest in diesen beiden Proteinen nicht vor- ]iegen kSnnen und die Zunahme der SH-Gruppen durch Denaturierung andere Ur- sachen haben mul3.

Eine andere Hypothese basiert auf der Annahme, dal3 in Proteinen Isothioharn- stoff-Gruppierungen enthalten seien, die bei Einwirkung yon Aminen nach dem Schema

Rz--S--C( x~ ~- R2--NH~-> Rz--SH + R2--NH--C( NH~ \NH~

SH-Gruppen freisetzen [72]. Obwohl die an Rinderserumalbumin [72] und dem Enzym Transamidinase [73] gemaehten Beobaehtungen mit dieser Hypothese gut /ibereinstimmen, stehen Beweise hierf/ir noch aus. Sehlie~lich wurde berichtet, dal3 in Enzymen sog. s~urelabfle Sulfide, die mit Ag+-Ionen reagieren kSnnen, enthalten seien [66], deren Natur jedoch nieht n~her bekannt ist.

d) Allgemeine Gesichtspunkte. Die fiir die Maskierung oder Freisetzung der SIt- Gruppen verantwortliehen Bindungskr~fte werden im allgemeinen auch vom pH- Wert der Proteinl5sung beeinflul3t. Auf Grund dieses Einflusses sowie wegen der pH.Abh~ngigkeit der Dissoziation der SH-Gruppe gem~13 R - SH ~ R - S- + H+ h~ngt die Reaktionsf~higkeit der Protein-SII-Gruppen ganz allgemein auch vom pH-Wert ab.

Eine wesentliche Aufgabe bei der analytischen Bestimmung yon SH-Gruppen in Proteinen besteht darin, in jedem einzelnen Falle diejenigen Versuehsbedingungen herauszufinden, unter denen eine vollst~ndige Erfassung aller vorhandenen SIt-

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Gruppen gew~hrleistet ist, sei es mit oder ohne Anwendung eines Denaturierungs- mittels. Man kSnnte annehmen, die Anwendung eines Denaturierungsmittels sei in jedem Falle angebraeht. Hier ist ]edoeh zu beriieksiehtigen, dal3 damit aueh Naeh- teile verbunden sind, wie z.B. leiehtere Oxydierbarkeit der SH-Gruppen [67, 74] uncl viscose LSsungen (ergeben nur flaeh ansteigende Titrationskurven mit einem unscharfen Endpunkt). Zu beachten ist weiterhin, dab versehiedene Denaturierungs- mittel hinsiehtlich der Zahl freigesetzter Protein-SH-Gruppen untersehiedlieh wirken kSnnen [75] und dal~ Harnstoff offensichtlich auch labile SS-Bindungen zu spalten vermag [22], wodureh ein Mehrverbrauch an SH-Reagens verursaeht werden kann.

3. Die Spezifitiit yon Ag+-Ionen fiir Protein-SH-Gruppen

Wiihrend im vorhergehenden Absehnitt die Reaktionsf~higkeit der Protehl-SH- Gruppen im allgemeinen, d. h. gegenfiber versehiedenen SH-Reagentien, diskutiert wurde, soll nun die Frage naeh der Spezifiti~t der SH-Bestimmung auf die Anwendung yon Silbernitrat besehri~nkt werden. Allgemein hat sich gezeigt, da]] die Spezifit~t des Silbernitrats yon den Reaktionsbedingungen, d. h: yore pH-Wert, der Tempera- tur und der Zusammensetzung der L5sung, abhangig ist. So warden z. B. bei An- wendung yon Ammoniak- [3, 67, 71, 76--82], Tris- [43, 78--80, 83--85] undImidazol- puffer [86] bei verschiedenen pH-Werten (zwisehen 6 und 10) mehr oder weniger starke Abweichungen yon dem bei vollsti~ndiger und spezifiseher Umsetzung zwischen Ag + und RSH zu erwartenden molaren Reaktionsverhiiltnis yon 1:1 gefunden. Eine Ausnahme bildet SH-Glutathion (GSH), bei dessen amperometriseher Titration mit Silbernitrat in allen Fallen ein iiquimolarer AgNO 3 Verbraueh festgestellt wurde [25, 27, 43, 45, 78--80, 87, 88]. Lediglich Burton [79] fand in Trispuffer pit 7,4 einen um 30% zu hohen Titrationsendpunkt. Bei mehreren hundert Glutathion- Titrationen, die wir bisher durehffihrten, beobachteten wir niemals einen iiberhShten AgNOa-Verbrauch. Sehr untersehiedlieh sind dagegen die Ergebnisse der ampero- metriseh-argentometrischen Titration yon Cystein: In manehen Fi~llen entsprach der Reagensverbraueh dem SH-Gehalt [3, 45, 80, 81, 89], in anderen F~illen dagegen erhielt man einen teilweise betr~chtlichen Mehrverbrauch an AgN03 (bis 55%) [25, 27, 78, 79, 82]. Aueh bei der Titration anderer niedermolekularer SH-Verbindungen wurden versehiedentlich zu hohe SH-Werte gefunden [27, 78, 79]. Es muB daher angenommen werden, dal] Ag+-Ionen mit dem primer entstehenden Silbermercaptid Komplexe zu bilden vermSgen [27, 78--80, 82], die je naeh den vorliegenden Reak- tionsbedingungen unterschiedlicher Zusammensetzung sein kSnnen [allgemein: (CySAg)xAg+]. Versehiedene Autoren nehmen daher an, da] Silberionen aueh bei der Bestimmung yon Protein-SH-Gruppen unspezifiseh reagieren [4, 5, 35, 78, 79] und somit zu Fehlergebnissen fiihren. Da bei der amperometrischen Titration Gluta- thion, in welchem das Cystein am Amino- und am Carboxylende substituiert ist, mit Silberionen im ~quimolaren Verh~ltnis reagiert, andererseits freies Cystein [25, 27, 78, 79, 82] sowie nur einseitig substituiertes Cystein (Cysteiniithylester) bzw. desamin- iertes Cystein (Mercaptopropionsi~ure) einen zu hohen Verbraueh an Silbernitrat verursaehen [27], kann angenommen warden, da~ eine Komplexbildung nur bei entsprechender Konstitution eintritt, n~mlich wenn freies Cystein oder Cysteinderi- rate vom Typ I oder II vorliegen, und daI~ Komplexbildung nicht erfolgt, wenn das Derivat dem Typ III entspricht:

+HaN--CH--CO--R R--NH--CH--CO0- R--HN--CH--CO--~

CIt2 CH~ CH2 I I I

SII SH SH

Typ I Typ II Typ III

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D a Cystein in den meis ten Pro te inen an der Amino- und Carboxy lg ruppe subst i - t u i e r t und d a m i t in F o r m yon T y p I I I vorl iegen di irf te , k a n n m a n die an Cyste in und seinen D e r i v a t e n v o m T y p I und I I gewonnenen Er fah rungen n ich t ohne weiteres a u f SH-Pro t e ine f iber t ragen. A u f Grund dieser Be t r ach tungen muB vie lmehr - - im Gegensatz zu B u r t o n [79] - - angenommen werden, dab die Gefahr der K o m p l e x - b i ldung bei P ro te inen wesent l ich geringer i s t als bei n iedermolekula re r SH-Verbin- dungen. Dennoch ve r suoh ten wit , die F r a g e nach der Spezifi t / i t y o n S i lbe rn i t r a t fiir P r o t e i n - S H - G r u p p e n un te r den yon uns angewende ten speziellen Bedingungen der ind i rek ten amperomet r i s chen T i t r a t i on [25] zu pri ifen. Dabe i wurden SH-Bes t im- mungen an reinen, kr i s ta l l i s ie r ten Tes t -Pro te inen durchgeff ihr t , die eine b e k a n n t e Zahl an (1) SH-Gruppen , (2) Disulf idgruppen, (3) SH- und Disul f idgruppen und (4) weder S t L noch Disu l f idgruppen enthiel ten. Die Ergebnisse , die demn~chs t ausffihr- l ich mi tge te i l t werden, zeigten, dal~ in ke inem der un t e r such ten Fi~lle der AgNO 3- Verbrauch h6her lag als a u f G r u n d des vor l iegenden SH-Geha l tes zu e rwar ten war [90]. AgNO3 k a n n daher in v ie len F~l len durchaus als spezifisches SH-Reagens ffir P ro te ine angesehen werden.

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