Biacore T200分子互作分析系统

操作应用培训资料

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一 系统基本操作....................................................................................................................................................................................................

1.1 开机操作................................................................................................................................................................................................................

1.2 缓冲液的放置....................................................................................................................................................................................................

1.3 芯片的放置..........................................................................................................................................................................................................

1.4 放置试管架..........................................................................................................................................................................................................

1.5 响应信号的归一化处理............................................................................................................................................................................

1.6 温度设置................................................................................................................................................................................................................

二 配体的偶联...........................................................................................................................................................................................................

2.1 运行手动模式....................................................................................................................................................................................................

2.2 配体的预富集....................................................................................................................................................................................................

2.3 手动模式数据图的分析............................................................................................................................................................................

2.4 偶联配体................................................................................................................................................................................................................

2.5 偶联结果分析....................................................................................................................................................................................................

三 芯片表面测试和再生条件选择...................................................................................................................................................

3.1 芯片表面测试....................................................................................................................................................................................................

3.2 再生条件选择....................................................................................................................................................................................................

四 测定亲和力和动力学（多循环）............................................................................................................................................

4.1 设置多循环动力学........................................................................................................................................................................................

五 捕获法和单循环动力学........................................................................................................................................................................

5.1 捕获法......................................................................................................................................................................................................................

5.2 单循环动力学....................................................................................................................................................................................................

六 数据分析..................................................................................................................................................................................................................

6.1 数据的导入和检查........................................................................................................................................................................................

6.2 亲和力和动力学数据分析......................................................................................................................................................................

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目 录

七 设备维护........................................................................................................................................................................................................................

7.1 芯片的保存..........................................................................................................................................................................................................

7.2 Desorb和Sanitize............................................................................................................................................................................................

7.3 系统检测 System Check.......................................................................................................................................................................

7.4 关机程序 Shut down................................................................................................................................................................................

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一 系统基本操作

在本练习中，我们将学习如何开启设备、正确放置实验所需的试剂和缓冲液、放取芯片和试管架、冲洗流路系统

以及响应信号归一化处理。当系统更换缓冲液或者芯片后，必须运行Prime程序。Prime时缓冲液会冲洗整个流路系统，

为下一步的实验做好准备。

1.1开机操作1) 打开Biacore T200系统和电脑的电源开关。Biacore T200的电源开关位于系统背面的左下角。开机后，需等待检测单

元的温度达到预设温度（用户自设，通常为25℃）。待温度稳定后，面板上的温度指示灯（黄色）会停止闪烁，该

过程可能需要30-60分钟。

2) 打开Biacore T200 控制软件（Strart→Program→Biacore→Biacore T200 Control Software），运行后软件程序会自动

和主机系统建立连接。

3) 准备运行缓冲液。本练习采用10X HBE-EP+缓冲液（已经0.22μm膜过滤）：量取50ml 10XHBS-EP+缓冲液、450ml去离子水，混匀后放入500ml缓冲液瓶。

1.2缓冲液的放置1) 将已经配制好的缓冲液放在T200系统左侧的缓冲液托架上，换上黑色的单孔盖。

2) 将缓冲液进液管A（注意软管上的蓝色标签）插入至缓冲液瓶底部。其余三根进液管（B、C和D）放在左侧的

舱门后。在实验中，Biacore T200最多支持4种缓冲液；只使用一种缓冲液时，进液管默认为A管。

3) 将2L的废液瓶放置在T200系统右侧的缓冲液托架上，连接上专用的盖子。

4) 取500ml去离子水装入500ml缓冲液瓶，放置在右侧缓冲液托架上，并将进液管A插至瓶底。瓶中的水将用于

清洗进样针。

1.3 芯片的放置1) 点击工具条中的 按钮或选择Tools菜单中的Insert Chip选项，打开芯片舱门。

2) 如果已经有芯片在芯片舱内，点击工具条中的 按钮或选择Tools菜单中的Eject Chip选项。

点击Eject Chip，流动池中的液体将被排空，随后芯片舱门将自动打开。

3) 如果使用的是新芯片，选择New Chip。在Chip Type的下拉菜单中选择对应的芯片种类，在Chip Id中填入和芯片

相关的实验信息，Chip lot No.中可填入芯片批号（选填）。如果是已经使用过的芯片，请选择Reuse Chip，并在Chip

Id下拉菜单中找到与之相对应的芯片信息。

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4) 手持芯片，有字的一面朝上。按照芯片上的箭头方向，将芯片轻轻推入卡槽，最后合上芯片舱的舱门。

5) 点击Dock Chip按钮，芯片置入后系统将自动转入待机（Standby）状态。

6) 选择Tools→Prime命令，点击Start。缓冲液会以较高的流速冲洗整个内部的流路系统，整个过程耗时6-7分钟。结

束后，点击Close，系统自动转入待机（Standby）状态。

芯片的放置方法

1.4放置试管架1) Biacore T200有三种不同的试管架供用户使用：Reagent Rack 1、Reageng Rack 2（图A）和Sample and Reagent Rack1（图B），见下图。

图A：Reagent Rack 1&2（左1右2） 图B: Sample and Reagent Rack1

Reagent Rack 1&2通常和96/384微孔板配合使用，加装在指定的试管架底座上。具体的组装方式参见下图。

Reagent Rack 1&2和96/384微孔板安装方式

本次培训中，我们将主要使用Sample and Reagent Rack1。

2) 点击工具栏 按钮，或选择Tool→Eject Rack，样品舱舱门会自动打开。

注意：试管架的弹出功能按钮在“程序向导设置”和“手动运行模式”中会有特定的位置，请注意区别。具体操作会在

后文中说明。

3) 用手指将试管架下方的金属按键向里侧按（见下图中白色箭头），试管架将会解除锁定并弹出，然后可以轻轻抽出

试管架

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试管架的取出方式

4) 按住试管架右侧的黑色按钮，向左侧打开金属盖。放入相应的试管后，轻轻合上金属盖。听到“咔”声，表明金属

盖已经处于锁定状态。

5) 将试管架沿着卡槽轻轻推入样品舱，听到“咔”声，表明试管架已经处于正确位置并锁定。

试管架的放入方式

6) 点击Eject Rack Tray对话框中的OK，试管架会被自动送入样品舱，舱门也会自动合上。注意：样品舱舱门打开后会

有时间限制，打开60秒后舱门将自动合上。最后15秒时，对话框中的倒数计时会显示为红色字体并闪烁。此时请不

要强行将试管架放入，以免夹到手。可以等待舱门合上后，重新打开即可。

1.5响应信号的归一化处理1) 当使用新芯片时，为了保证最好的灵敏度，建议用户通过归一化处理程序，对Biacore的检测器进行信号校正。选择

Tool→More Tools，在Maintenance Tools目录中选择Normalize，点击Start。

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2) 在弹出的对话框中点击Next。3) 在一个7mm试管中加入120μl BIAnormalizing solution 70%。点击左下方的Eject Rack，取出试管架。将试管放入程序

中显示的指定位置（R2F6）。确认试管架盖子正确合上后，将试管架放入样品舱，关上舱门。

4) 点击Start运行程序。运行结束后（约8分钟），点击Close结束程序。

1.6温度设置1)选择Tools→Set Temperature。在Analysis temperature中，可以对流动池中的样品检测温度进行调整，温度范围4-

45℃。在Sample Compartment Temperature中，可以对样品舱温度进行调整，温度范围4-40℃。Analysis temperature

调整后，需等待温度稳定后，才能继续实验。

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3) 在Save Result As对话框中，创建新的目录，命名为“Training”。把文件保存为Manual pH Scouting.blr，点击Save。4) 现在系统进入手动运行模式。

2.2配体的预富集将配体（蛋白或多肽）偶联到芯片上（CM系列，羧基表面）时，需要把蛋白溶在pH低于其等电点的溶液中。此时，

蛋白表面的净电荷净为正，在流经芯片表面时，可以通过静电吸附作用结合到芯片表面的羧基（电荷为负）上。但是

过低的pH会影响蛋白的活性，因此我们应用预富集实验，寻找最适合的pH条件。

1) 样品准备。准备3个1.5ml EP管，分别取3μl配体，加入97μl不同pH的醋酸钠缓冲液中（10mM sodium acetate，pH4.5、5.0、5.5）充分混匀，配体的最终浓度约为20μg/ml。如有气泡，可离心去除。另取1个1.5ml EP管，加入200ul氢氧化钠

（50mM sodium hydroxide）。如果使用的是带盖的EP管，所有盖子必须剪去。

2) 点击 图标（Eject rack tray），退出试管架。将缓冲液pH为5.5的EP管放在R1D1位置，pH为5.0的放在R1D2，pH为4.5的放在R1D3。将NaOH放在R1E1位置。将试管架放回样品舱，关上舱门。

3) 进样。点击注射命令图标 （Sample injection，红色）。选择Vial/well position旁的下拉菜单，在样品位置图中点击R1D1位置。设定Contact time（进样时间）为120秒。注意对话框底部显示的是需要的最小样品体积，确认试管中的样

品体积满足要求后。点击OK。

二 配体的偶联

在该部分中，我们将尝试把配体（蛋白）偶联到CM5芯片上。正式偶联之前，需要进行配体的预富集，以确定最

佳的偶联浓度和pH条件。同时，通过预富集实验，可以学习如何在T200的手动运行模式下开展实验。本次练习中，

使用的配体为Monoclonal mouse-anti-human β2-microglobulin antibody。

2.1运行手动模式1) 点击工具条中的 图标，或者选择Run→Manual Run。2) 软件显示Manual Run对话框。在Flow rate（流速）中输入10 μl/min。除动力学测定实验外，流速一般设为10 μl/min。在Flow path中选择Flow path 2，使用2号通道进行预富集实验。在右上方的下拉菜单中选择需要使用的试管架，本次

实验中选用Sample and Reagent Rack1。如果样品舱中的试管架为其他型号，点击Eject Rack进行更换。之后点击Start。

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5) 重复命令3-4，分别进样R1D2和R1D3，时间120秒，每次进样后再生30秒。

6) 在左侧的命令队列窗口（Command Queue）中，所有的命令都按照输入的顺序进行排列。如果需要对排列的命令进

行修改，可在此命令上点击右键，选择相应的指令（编辑、删除、剪切、插入等）即可。命令处于正在执行状态时，

会在前面显示齿轮 图标，已经完成的命令则标记为打勾。

7) 所有命令都完成后，点击结束命令图标 （Stop run），退出手动运行模式。

8) 其他手动模式命令介绍

流速（Flow rate）：重新设定流速

流路（Flow path）：重新设定流路，但只能在目前运行Cycle设定的流路中进行选择。

等待（wait）：在两条命令中插入指定的时间间隔，期间流过芯片的是缓冲液。

新循环（New cycle）：在同个文件下开启新一页的传感图，可以重新设定流路。

暂停（Pause）：暂时停止运行，缓冲液依旧流过芯片，数据采集也不会停止。

继续运行（Resume run）：解除暂停状态。

2.3手动模式数据图的分析手动模式是经常采用的一种实验方式，其最大的优点是样品测试灵活。因此经常被用来摸索各种实验条件。以下将介

绍一些常用的功能，用以分析手动模式下的数据结果。

1) 放大和缩小：长按鼠标左键并拖曳选择要放大的图形区域，可以对图形的局部实现放大，该操作可重复进行。

双击图形的空白处或选择View→Unzoom，可以退出最近一次的放大效果。

2) 图形坐标的读取：点击工具栏 图标（快捷方式F8）或选择View→Reference line，传感图中出现黑色十字坐标以及

Reference line窗口。用鼠标左键选中十字的Y轴，可以对十字坐标进行左右拖曳，而十字的交叉点会在信号曲线上进

行运动。十字中心点的坐标将会显示在Reference line窗口中，以s为单位的是X轴读数，以RU为单位的是Y轴读数。

练习：读取pH5.5样品的信号变化A. 图中第一个信号峰是配体在pH5.5醋酸钠溶液中的预富集数据。放大图形，使用Reference line，将中心点对准进样

开始后最低的信号点。

4) 再生。点击再生命令图标 （Regeneration injection，蓝色）。Vial/well position选择R1E1位置，进样时间为30秒。点

击OK。

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B. 选择View→Baseline（快捷方式F9），该命令将目前选中的信号点作为基线，Y轴数值归零。

C. 移动Reference line至进样结束前最高的信号点，读取Reference line窗口中的Y轴读数。该数值就是最低点到最高

点的相对信号变化值。

D. 应用同样方法，计算另外两个样品（pH5.0和pH4.5）的信号变化。

3) 报告点：对于一个Injection命令，系统会自动生成3个报告点（baseline、binding和stability）。Baseline点位于样品

进样开始前10秒钟，代表基线的读值。Binding点位于进样结束前5秒钟，代表最高的结合信号。Stability点位于进样

结束后10秒钟，代表解离信号的变化情况。

在报告点的数据列表中（如下步骤D中所示），以Binding_1为例，Fc指流路通道位置，Time指该点的X轴位置，AbsResp代表Y轴的绝对信号值，RelResp代表该点和它之前最近的一个Baseline点相比后的相对信号值（此处即Binding_1减去

Baseline_1）。Baseline显示该点是否是基线报告点。

练习：增加一个报告点

A. 调用Reference line，十字中心点放在第一个峰中间（进样开始后约60秒处）。

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B. 在工具栏中点击 图标或选择Edit→Report Point→Add，弹出Add report point对话框。

C. 在Id中输入报告点名称：RP1（不能和现有报告点重名），勾去Baseline选项（如果是作为Baseline点，则保留），

点击OK。

D. 检查下方数据列表中新增加的报告点RP1，读取其相对信号值。

E. 右键点击数据列表中的RP1，可以进行删除或编辑。

4) 根据2.3 (2)中得到的结果，讨论哪一个pH条件是最合适的偶联条件。

5) 关闭传感图窗口。

2.4偶联配体偶联是指将配体固定到芯片上的过程。针对不同的芯片和配体，偶联方法各不相同。本实验将采用最典型最常用的

偶联方法—氨基偶联法。通过之前的预富集实验，偶联实验中合适的配体浓度和pH条件已经确定。应用Biacore T200

控制软件中的向导功能，即可完成配体偶联。

1) 计算偶联量

在理论课中，我们介绍了如何计算所需的配体偶联量RL。本次实验中，配体（Ligand）的分子量是150KD，分析物

（Analyte）分子量是11.8KD。考虑到之后的动力学测定实验，Rmax设为100RU。由于配体是抗体，每个抗体分子理

论上可以结合2个抗原分子，因此化学计量比Sm等于2。请通过下面的公式进行配体偶联量RL的计算。

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3) 选择Surface Preparation下的 Immobilization，点击New，进入下一步。

4) 在Immobilization Setup向导窗口中，在Chip type下拉菜单中，选择CM5。本次实验会将配体固定在第2通道上，因

此在Flow cell 2前的方框中打勾。Method选取Amine（氨基偶联），Ligand中填入配体的名称：anti-beta2micro。选择Aim

for immobilization level，在Target level中输入之前计算所得的偶联量 1000 RU。Wash solution保持50mM NaOH不

变。点击Next，进入下一步。

mLmax SR

MWligandMWanalyteR ××=

配体偶联水平RL =_______RU

注意，实际偶联量= 1.5RL =_______RU

2) 点击工具栏中的向导 图标，或选择File→Open/New Wizard Template，打开向导对话框。

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5) 在System Preparations对话框中，由于之前已经运行过Prime程序，因此去掉Prime before run前的打勾。保持25℃

温度设置不变。点击Next，进入下一步。

6) Rack Positions对话框中，左侧为样品试管在试管架上的位置信息。右侧是具体的样品列表和所需体积信息。在左

上角的下拉菜单中选择Sample and reagent rack 1。切换样品架可能会引起原有样品位置的丢失，点击下方Menu，选择

Default Positions，即可重新恢复样品位置。默认的样品试管通常为7mm小试管，如果要使用1.5ml EP管，可以通过鼠

标拖曳的方式重新安排（例如选择A1位置的试管，按住鼠标左键，拖入D1位置）。注意右侧的样品表格，改变试管

型号会引起样品所需体积的变化。

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7) 根据样品架位置表，准备足够体积的样品。

A. 取194μl 的10mM pH5.0醋酸钠缓冲液，放入1.5ml试管。从Ligand配体储液中吸取6μl加入醋酸钠缓冲液，混匀。醋

酸钠的pH条件是根据预富集实验的结果确定的。

B. 吸取100μl的EDC和NHS（来自氨基偶联试剂盒），分别加入两个试管。

C. 吸取140μl的乙醇胺（ethanolamine，来自氨基偶联试剂盒），加入试管。

D. 吸取70μl的50mM NaOH加入试管。

E. 另取一个空试管，剪去管盖。其余的试管剪去原有的盖子，盖上橙色橡皮盖，空试管不加。如果试管中有气泡，可

离心去除。

F. 点击Rack positions对话框左下方的Eject Rack，取出试管架。

G. 根据样品位置表中的信息，将准备好的试管放入试管架。配体→R1D1，NaOH→R1D2，EDC→R1D3，NHS→ R1D4，空试管→R1D5，乙醇胺→R1D6。H. 检查样品是否放置正确，盖上试管架盖子。将样品架送回样品舱。

8) 点击Next，弹出Prepare Run Protocol对话框。仔细检查所列事项，确认左侧架子上的运行缓冲液体积大于表

中所显示的最低要求。点击Start。

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9) 将Wizard Template（向导模板）另存在Training目录下，文件名Ligand immobilization。点击Save。10) 将Result（结果文件）另存在Training目录下，文件名“Ligand immobilization.blr”。点击Save。11) 系统正式自动运行偶联程序，整个过程耗时约40-50分钟。具体运行时间显示在运行窗口下方的状态栏中，如estimated total run time所示。

2.5偶联结果分析1) 偶联结束后，会自动弹出偶联结果报告（Immobilization Results）。为了方便查看传感图，先点击Close，关闭报告。

2) 偶联过程的传感图如图所示。请观察图中的所有信号曲线，清楚了解每个信号峰所代表的步骤和目的。

A. 预富集。当选择Aim for immobilization level进行偶联时，偶联过程中首先会运行预富集测试（如果选择Specify contact time and flow rate，则不会运行预富集）。预富集的目的是（1）预判以现有的样品条件是否可以达成设定的偶联量；

（2）通过五个预测点的斜率（Preconc1至Preconc5）推算脉冲式进样（F）中第一针所需要的进样体积。系统如果预

测当前的样品条件无法达成预设的偶联目标（过低too slow或过高too fast），运行完清洗（B）过程后，会自动停止

当前的偶联程序。需改变偶联配体的条件（浓度和pH）后重新尝试，芯片不会受影响。

B. 用NaOH把吸附在芯片表面的配体清洗掉。

C. 基线。

D. 混合后的EDC/NHS活化芯片表面的羧基。

E. 活化后的基线。

F. 配体以脉冲进样的方式，吸附和共价结合到芯片表面。

G. 缓冲液将结合不牢固的配体冲洗掉。

H. 用乙醇胺封闭芯片表面剩余的羧基，进一步将结合不牢固的配体冲洗掉。

I. 偶联结束。

3) 将传感图中的报告点（打x处）和下方报告点窗口的数据进行对应。

4) 重新打开偶联结果报告，选择View→Wizard Results。报告中列出了两个数据Response bound和Response final，该数据的计算方法如下所示：

Response bound： 响应信号值（G）― 响应信号值（E）Response final： 响应信号值（I） ― 响应信号值（C）Response bound代表配体进样后，结合到芯片表面的数量。该数值用以判断是否达到Aim for immobilization level中设

定的偶联量。

Response final代表整个偶联过程中，通过共价结合方式，偶联到芯片表面的物质的总数量，其中包括配体，EDC/NHS以及乙醇胺。

5) 我们预设的配体偶联量是1000RU，实验结果是否达到了这一预期？

6) 关闭偶联结果报告和传感图。

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三 芯片表面测试和再生条件选择

在这个章节中，将练习在开展测定实验之前，使用分析物进行简单的芯片表面测试，从而判别是否存在非特异性

结合，并选择正确的分析物浓度进行后续实验。同时，选择正确的再生条件对实验结果的准确性至关重要。

3.1芯片表面测试

通过芯片表面测试，我们需要确定：（1）分析物是否和配体存在特异性结合；（2）分析物和芯片表面是否存在非特

异性结合；（3）如何选择适当的分析物浓度进行后续的实验分析；（4）如何选取正确的进样时间和解离时间。

我们推荐在手动模式下进行芯片表面测试，以实现最大程度的灵活性。

本次实验的分析物为human β2-microglobulin（β2-微球蛋白），储液的浓度为100μg/ml，分子量11.8KD，摩尔浓度C = 8475nM。

1) 启动手动模式，方法参见2.1部分内容。Flow rate设为10μl/min，流路选择Flow path1-2，并在Reference subtraction选择2-1。试管架选择Sample and Reagent Rack1。点击Start，结果文件保存为“surface test.blr”。

2) 手动模式开始后，选择工具栏View→Show Only Current Curve。在Curve窗口中，选择Subtracted Fc=2-1。

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3) 样品准备：

A. 取10 ml HBS-EP+缓冲液（左侧托架上的运行缓冲液）放于试管中。

B. 取10 μl分析物（analyte）原液和990 μl HBS-EP+缓冲液，在试管中混匀，标记为A1，浓度为85nM。

C. 从A1试管中取20 μl溶液，另取180 μl HBS-EP+缓冲液，在试管中混匀，标记为A2，浓度为8.5nM。

D. 从A2试管中取20 μl溶液，另取180 μl HBS-EP+缓冲液，在试管中混匀，标记为A3，浓度为0.85nM。

E. 取200 μl Glycine-HCl pH2.5 放入试管，标记为R。4) 退出试管架，将A1放于R1D1，A2放于R1D2，A3放于R1D3，R放于R1E1。将试管架放回样品舱内。

5) 点击sample injection图标，选择位于R1D1的A1样品，进样时间设为180秒，点击OK。

6) 点击wait图标，等待时间选择60秒，点击OK。

7) 点击Regeneration injection图标，位置选择R1E1，进样时间设为30秒，点击OK。

8) 重复步骤（5）到（7），将A2和A3样品以同样方法进样。

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9) 点击End Manual Run图标，结束。

10) 结果分析

A. 比较Fc1、Fc2、Fc2-1的结合曲线，结合在理论课中学到的内容，观察开始进样阶段的容积效应以及是否存在非特

异性结合。

B. 比较A1、A2和A3三个不同浓度样品的binding报告点，理解分析物浓度和RU信号大小的关系。

C. 理解如何选择正确的进样和解离时间。

3.2再生条件选择再生条件的选择是整个实验中非常关键的步骤，直接关系到实验结果的重复性。一般可以通过手动方式或向导程序进

行条件选择。这部分的练习将会采用向导程序，说明如何选取最优的再生条件。

本次实验的分析物为human β2-microglobulin（β2-微球蛋白），筛选的再生条件为Glycine 3.0、2.5和2.0。

1) 点击工具栏中的向导 图标，或选择File→Open/New Wizard Template，打开向导对话框。

2) 选择Assay Development下的Regeneration Scouting，点击New。

3) 在Injection Sequence对话框中，Flow path选择2-1，Chip type选择CM5，点击Next，进入下一步。

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4) 在Setup对话框中不做任何选择，点击Next，进入下一步。

5) 在Injection Parameter对话框中，Solution填写Beta2micro，Contact time设为60秒，Flow rate为30μl/min。点击

Next，进入下一步。

6) 在Experimental Parameters对话框中，Flow rate设为30μl/min。本次实验一共测试3种再生试剂，因此Number of conditions设为3。每种条件一般都会测试3-5次，Number of cycles for each condition设为4次。在setting表格中，

Regeneration solution分别填入Glycine-HCl 3.0, 2.5, 2.0（从高到低填写），contact time均为30s。点击Next，进入下一步。

7) 在System Preparation中，去掉Prime before run前的打勾，点击Next。

8) 试管架选择Sample and Reagent Rack1。可以观察到右侧的样品列表中，每一次进样的分析物都置于独立的试管

中，且默认为小号试管。点击下方Menu按钮，选择Automatic Positioning，弹出对话框，在此可以将不同管中的同一

样品合并到同一试管中，并且可以批量改变样品的试管种类。

9) Region栏中列出了按目的分类的所有样品。现在我们需要将分析物中相同的样品合并到同一试管中，因此选择该

样品对应的Pooling一栏，在下拉菜单中选取Yes，表明只要是相同名称的样品，就合并于同一试管内。然后将Vial Size

全部改成Medium，所有样品都将采用1.5ml试管（small指代7mm小试管，Medium指代1.5ml试管，Large指代4ml玻璃

瓶）。完成后点击OK。

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10) Automatic Positioning完成后可以看到样品已经重新分配，试管型号也统一为1.5ml试管。

11) 样品准备：

A. 从实验3.1中的A1试管中取350μl样品，HBS-EP取350μl，置于1.5ml试管中混匀。

B. 按样品列表中的体积要求，准备3种Glycine-HCl再生溶液。

C. 按要求另准备两管HBS-EP缓冲液。

12) 将准备好的样品放置于样品架中的指定位置。点击Next。

13) 检查一下缓冲液，点击Start。

14) 保存方法和结果文件，结果文件保存为“pH Scouting.blr”。实验开始进行。

15) 实验结果（课堂讨论分析）

思考：3个条件中哪一个可选为最适合的再生条件，为什么？

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3) 在setup对话框中，设置Startup。在运行正式样品前，通常都会运行若干Startup循环，目的是让系统在开始阶段模

拟运行样品，以达到稳定的基线和系统状态。因此此时的样品一般都用缓冲液替代分析物样品。在solution中输入Buffer，Number of Cycles设为3（通常为3-5次）。点击Next，进入下一步。

四 测定亲和力和动力学（多循环）

在这章节中，我们将应用向导程序设置多循环实验，完成亲和力和动力学数据的检测。同时，我们也将介绍如何分析

所得到的实验数据。

在第2章中，我们已经在芯片上偶联了配体（β2-microglobulin抗体）。在第3章中，我们确定了分析物（β2-microglobulin）的浓度范围和再生试剂条件。在这章节中，我们将会检测配体和分析物的亲和力和动力学。

4.1设置多循环动力学1) 打开New Wizard Template，在Assay中选择Kinetics/Affinity，点击New。

2) 在Injection Sequence对话框中，Flow path选择2-1，Chip type选择CM5，点击Next，进入下一步。

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4) 在Injection Parameters对话框中，设置进样、解离和再生的相关参数。

在Sample中，Contact time是指分析物的进样时间，通常为1-5分钟，本次实验设为180s。亲和力实验的Flow rate必须

大于30μl/min，此处设为30μl/min。Dissociation time是指解离时间，需根据样品的情况设置，此处设为300s。在Regeneration中，Solution输入regeneration scouting结果中确认的再生试剂条件，Glycine-HCl 2.5。Contact time设为30s，Flow rate设为30μl/min。如果再生试剂选择的是NaOH，建议在Stabilization period中设置60s的稳定时间。点

击Next，进入下一步。

5) 在Samples对话框中填写样品的名称和浓度信息。请注意，如果是同一样品，即使浓度不同，其名称也必须保持一

致。本次实验的分析物是beta2micro，分子量11800Da，浓度分别为0、2、4、8、16、32nM。注意在Concentration中选择正确的浓度单位。此外，必须运行一个重复的浓度以检测实验的重复性，因此最后加上一个8nM的样品。如果

需要加入对照样品，可在下方的Control samples中填入。点击Next，进入下一步。

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6) 去掉Prime before run前的打勾。点击Cycle run list，确认实验运行中所有的循环是否正确。点击Next，进入下一步。

7) 按照3.2(8)--(10)中的方法，更换试管架型号，合并样品管以及更换试管种类。

8) 样品准备：

A. 从实验3.1中的A1试管中取226μl样品，HBS-EP缓冲液取374μl，置于试管中混匀，样品最终浓度为32nM，试管标

记为S6。

B. 从S6试管中取出300μl样品，HBS-EP缓冲液取300μl，置于试管中混匀，样品最终浓度为16nM，试管标记为S5。

C. 依照B的操作方法，依次制备S4（8nM），S3（4nM），S2（2nM）。

D. 取160μl HBS-EP缓冲液置于试管，标记为S1（0nM）。

E. 取一个空试管，加入500μl HBS-EP缓冲液，标记为buffer。

F. 取一个空试管，加入500μl Glycine-HCl 2.5再生试剂，标记为Reg。

9) 剪去所有试管的盖子，盖上对应的橡皮盖。将准备好的样品放置于样品架中的指定位置。点击Next。

10) 检查一下缓冲液，点击Start。

11) 保存方法和结果文件，结果文件保存为“Kinetic data.blr”。实验开始进行。

12) 数据分析请参考第7章节。

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五 捕获法和单循环动力学

捕获法（Capture）是一种常用的实验方法，对于抗体或是带有标签的配体有良好的实验效果，而且再生条件也

易于掌握和控制。

单循环动力学是一种快捷的亲和力和动力学的检测方法，相较于多循环检测法，其具有快速、简单和易于再生的优点。

本章节的练习将结合上述两种方法，检测配体和分析物之间的亲和力和动力学。

5.1捕获法在应用捕获法进行实验时，通常会将可以和配体特异性结合的捕获分子（通常是抗体，且不会和分析物结合）固定在

芯片上。检测过程中，配体会特异性的结合到捕获分子上，然后再检测分析物和配体之间的相互作用。本次实验中，

配体是单克隆mouse-anti-human β2-microglobulin 抗体，所以选择单克隆Anti-Mouse IgG抗体作为捕获分子。

偶联捕获分子

1) 偶联捕获分子：通常会在参比通道和样品通道上同时偶联捕获分子。通过参比通道，可以检测捕获分子是否和分

析物存在结合，避免干扰实验结果。实验需要偶联量尽量高一些，因此会采用Specify contact time and flow rate作

为偶联目标的设置。

2) 打开向导程序中的Immobilization项，选择需要偶联的通道，本次实验选择Fc1和Fc2。在Ligand中输入捕获分子的

名称Anti-Mouse IgG，选择Specify contact time and flow rate模式，Contact time设为420s，Flow rate为10μl/min。

3) 根据程序提示准备相应的样品。Anti-Mouse IgG抗体的最终浓度为30μg/ml，偶联缓冲液为醋酸钠pH5.0（5μl+162μl）。

具体设置方法请参考2.4章节的内容。

实验方法设定

接下来，我们将演示如何在向导程序中设定捕获法，用多循环模式测定单个配体和分析物之间的相互作用。如果有多

种配体或采用单循环动力学检测，则需要用户编写方法实现，我们将会在后续的内容中介绍相关方法。

4) 打开New Wizard Template，在Assay中选择Kinetics/Affinity，点击New。

5) 在Injection Sequence对话框中，Flow path选择2-1，Chip type选择CM5。勾选Ligand Capture选项，可以在流程

图中看到，Sample前加入了Ligand Capture步骤。点击Next，进入下一步。完成Setup对话框，进入下一步。

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6) 在Injection Parameters对话框中，Ligand填写anti-beta2micro，Contact time设60s，Flow rate为10μl/min。

其他参数参见4.1章节的内容。

后续步骤基本和4.1中的多循环模式一致，在这里我们暂不展开。

5.2单循环动力学单循环动力学（Single Cycle Kinetics，SCK）是新一代Biacore系统中增加的功能。其改变了传统的多循环模式中，

重复进样→再生的实验模式，而采用将分析物从低浓度到高浓度连续进样，最后一次再生的模式。

在本练习中，我们将在捕获法的基础上，应用单循环动力学实现配体和分析物之间的相互作用分析。对于T200系统，

需要用户编辑Method完成SCK的设置。

1) 在工具栏中选择File→Open/New Method，打开向导对话框。

2) 选择Biacore Methods文件夹，点击Open。Biacore Mothed目录下有众多常用的已编辑的方法。如果需要完全新建

方法，则选择New。

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3) 选择Single-cycle kinetics，点击Open。

4) 在左侧的项目按钮中选择Cycle Types。进入Cycle Type设置界面。

5) 界面上方的Cycle Types框中列举了具体的Cycle名称。在本实验方法中，有Sample和Startup两个。运行实验过程

中，Startup程序中运行的是Startup Cycle的内容，而分析样品过程则运行Sample Cycle的内容。由于本实验要使用捕

获法固定配体，因此需要在进样之前加入捕获命令。

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先选中Cycle types中的sample，可以看到在下方的Command框中依次排列了Sample 1和Regeneration 1命令。在下拉

菜单中选择Capture，点击Insert。Capture 1命令被排在了Sample 1之后，选中后点击向上箭头，使之排到队首。

接下来设置Capture过程的相关参数。Capture Solution中写入Ligand名称Anti-beta2micro，Contact time设为60s。Flow

rate为10μl/min，Flow path改为second。

选择sample 1进行进样参数的设置。Contact time设为120s，Dissociation time设为300s。其余设置保持不变。

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选择Regeneration 1进行再生参数的设置。Regeneration名称设为Glycine-HCl 1.7，Contact time设为180s。其余设置保

持不变。

然后对Cycle types中的Startup做同样的设置。

6) 点击左侧的Verification按钮，确认所编辑的方法正确可行。

7) 点击下方的Save as，将方法保存在Training目录下，名称“Capture_SCK”。

8) 点击左侧的Setup Run，正式运行所编辑的方法。

9) 首先选择实验所用的流路。点击Next，进入下一步。

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10) 在Variables对话框中设置样品的相关信息。首先选择Assay steps中的Startup，在Solution中填入Buffer。

然后选择Assay steps中的Sample。Sample solution中填写分析物名称beta2micro，MW为11800Da。前两次循环，分析

物浓度都是0（做两次零浓度，作为零浓度扣减）。在第3栏中Conc1到Conc5分别填入分析物浓度2、4、8、16、32nM

（务必从低到高）。点击Next，进入下一步。

11) 检查Run Cycle List，确认无误后，点击Next，进入下一步。

12) 去掉Prime before run前的打勾。点击Next，进入下一步。

13) 对样品试管进行合并，且都采用1.5ml试管。具体方法参见3.2 (9)的内容。点击Next，进入下一步。

14) 检查缓冲液是否足够，点击Start。保存结果文件，结果文件保存为“Capture_SCK.blr”。实验开始进行。

15) 数据分析请参考第7章节。

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六 数据分析

在本章节中，我们将演示如何分析Biacore的实验结果。在第四章和第五章的练习中，我们分别完成了基于直接

偶联的多循环动力学实验和基于捕获法的单循环动力学实验。现在，我们将应用Biacore Evaluation Software对实验

结果进行分析。

6.1数据的导入和检查1) 打开Biacore Evaluation Software程序，（Strart→Program→Biacore→Biacore T200 Evaluation Software）。

2) 选择File→Open，打开实验的数据结果文件。

3) 结果打开后，实验结果的传感图会出现在窗口中。

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4) 观察传感图，检查数据是否存在异常，主要包括进样、解离和再生部分。在传感图的上方有3个小窗口（见上图），

A窗口可以对显示的Flow Cell进行选择。B窗口可以按照实验步骤的目的选择相应的数据。C窗口可以对所有的实验曲

线进行单独或选择性的显示。

5) 由于每个循环的基线位置有所差异，为方便观察数据，通常会将所有曲线的基线归零。点击右上方的Tools按钮，

在下拉菜单中选择Sensorgram Adjustment。

6) 基线归零需要对传感图的Y轴进行调整。在Y-adjustment中选择Report Point，下拉菜单中选取Baseline。表示

所有传感图的Baseline会重合在一起，且基线信号值归零。

7) 可以看到，经过调整后的所有传感图的Baseline已经对齐且归零。

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8) 点击左侧Evaluation Explore窗口中Plot目录下的Baseline Sample，可以检查各流路上的基线是否存在波动或漂移。

9) 分别点击Plot目录中的其他选项：Binding Level可以检查所有曲线Binding点的分布，Binding Stability可以检查所

有曲线Stability点的分布，而Binding to reference 可以检查分析物是否和参比通道存在非特异性结合（重要）。

10) 点击Report Point Table，可以显示报告点表。该表格汇总了所有通道上每个循环的所有报告点的具体数值，可

以通过Filter功能选择性的查看所需要的数据。

6.2亲和力和动力学数据分析1) 选择Kinetics/ Affinity下的Surface bound选项，进入分析界面。

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2) 在Select Curves界面中选取要分析的数据。如果要分析单组数据，在分析模式中选择Single mode。如果要批量分

析多组数据，选择Batch mode。在Curves窗口中，如果不想分析部分数据的传感图，可以将传感图之前的打勾去掉。

点击Next。

3) 在Select Data界面中，所有的曲线都已经扣减了零浓度曲线。如果不需要分析传感图上的部分数据段，可以用鼠标

右键标出。点击Remove Selection即可。

界面的右下方有两个按键：Affinity和Kinetics。如果传感图是快上快下型（fast-on, fast-off ，常见于小分子分析物），

请选择Affinity，应用稳态模型steady state进行分析。如果传感图是呈现动力学形态，请选择Kinetics进行分析。在本

练习中，请选择Kinetics。

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4) 在Fit Kinetics界面中，需要选择正确的拟合模型。针对不同的结合模式，Biacore共有5种预设的模型可供选择。本

练习中样品结合模式为1：1结合模式，因此选取1:1 Binding。点击Parameters可以对拟合模型进行具体的参数设置和

调整，该内容将在Biacore Kinetics Level 1的课程中展开介绍。点击Fit按钮，开始对数据进行拟合分析。

5) 拟合过程需要短暂的时间，可以根据具体情况选择放弃Abort或接受Accept。不做选择的话，软件将自动选择最小

的Chi2，得到拟合结果（推荐）。

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6) 拟合结束后将自动显示结果报告（窗口下方）。Quality Control是Biacore分析软件的一大特色，在报告中，系统将

会对数据拟合结果进行智能化的评估。绿色打勾图标表明结果符合模型要求，是高质量的数据结果。黄色惊叹号图标

表明，部分结果比较接近模型预期的临界状态，需要进一步检查数据。红色惊叹号图标说明结果有不符合模型的地方，

需要着重分析原因。

7) 选择Report栏。该栏中列出了所有的分析数据结果，包括结合、解离速率常数（ka&kd），亲和力（KD），Rmax，

Chi2等重要数据。请结合培训课程中的理论知识，充分理解每个参数的意义。

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8) Residuals是Biacore分析软件的另一特色，可以直观表现传感图中实际曲线和拟合曲线之间的离散情况。如果大部分

的点都位于绿色直线范围之内，表明拟合曲线非常符合实际的数据曲线。如果超出红色直线范围，表明拟合结果的偏

差较大，需要具体分析原因。

9) Parameters栏中列举了部分数据的标准差（SE，Standard Error）。在发表文章的时候可能需要引用该部分数据。

10) 点击Finish按钮，完成分析，结果也会加入左侧的Evaluation Explorer中。之后可以继续采用其他模型或参数进行

分析。

11) 点击Save按钮，可以将分析结果保存为.bme后 的结果文件。

12) 数据输出：

可以在File→Export导出多种格式的数据。

如果要选择图形输出，可以在图片上点击右键，选择Copy Graph。然后直接粘贴在Windows画图工具或Word、PPT等

软件中。

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七 设备维护

良好的日常维护可以保证设备处于稳定的运行状态，有助于获得可靠的数据结果。本章节将介绍一些常用的维护

方法。

7.1芯片的保存系统手册中会推荐两种方法：干法保存和湿法保存。在这里，我们将介绍一种更为简便有效的方法—半干保存法。

1) 将芯片盒有字一面朝下放置，推出芯片内片。

2) 取大约100ul 适合保存蛋白的缓冲液，滴到金膜上，完全覆盖金膜区域即可。注意：枪头不要接触金膜！

3) 将内片推回芯片盒内，水平放入50ml 离心管。拧紧离心管盖，4摄氏度冰箱保存。不要剧烈晃动，以免液滴脱落。

此方法实际的可存放时间，主要取决于固定的生物分子的性质。

4) 再次使用芯片时，将芯片内片取出，甩干至金膜区域不残留任何液体。注意：不可接触或者水洗金膜区域！检查

确保芯片所有区域（包括芯片盒、内片、金膜）没有残留液体、盐析出。将芯片内片推回，即可使用。

7.2 Desorb和SanitizeDesorb程序主要目的是去除系统管路中残留的样品以及沉积的盐类。推荐每周一次，以确保管路的清洁。Sanitize程

序的目的是除菌，防止管路中微生物生长导致阻塞。一般每月一次即可。在本练习中，我们将详细介绍Desorb的方法。

Desorb程序

1) 将维护芯片放入系统！

2) 准备500ml去离子水，放置在左侧托架上。将缓冲液A管放入瓶中。

3) 选择工具栏中Tools→More tools。

4) 点击Maintenance目录下的Desorb，点击Start。

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5) 准备两个试管。一个试管中放置Desorb solution 1（0.5% SDS），另一个放Desorb solution 2（50mM Glycine

-NaOH）。这两个试剂可在Biacore Maintenance Kit, type 2中找到（产品号：BR100651）。放置的体积和位置请遵照

程序中的要求。

注意：Desorb solution 1是SDS，平时请不要放在冰箱中。使用前请确认是否有沉淀，若有沉淀会导致系统管路阻塞。

如果室温过低造成沉淀，请在使用前放在水浴中化开。

6) 试管放置好后，点击Start，开始运行Desorb程序。

Sanitize程序

Sanitize程序需要和Desorb程序一起运行，可在Maintenance目录下选择Desorb and sanitize。该程序除了需要Desorb

solution 1和2之外，还要用到BIAdisinfectant solution（次氯酸钠）。该溶液保存在避光瓶中，使用前需要稀释。稀释比

例为1.5ml 次氯酸钠加20ml 去离子水。配制时请带上手套操作。

其余步骤请参照程序中的提示进行，此处不再展开。

7.3系统检测 System Check

当系统状态出现异常的时候，用户可以通过系统检测来确认。工程师可以通过系统检测的结果来判别故障的种类和原因。

系统检测的流程如下：

1) 将一块新的、干净的CM5芯片放入系统（系统检测不影响芯片的正常使用）。

2) 缓冲液换成HBS-N，Prime系统。

3) 选择工具栏中Tools→More tools。

4) 点击Test tools目录下的System Check，点击Start。

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5) 选择需要进行系统检测的项目，全部选择的话检测时间需要90分钟

6) 如果选择了Buffer Selection，需要将四根进样管都放入缓冲液瓶。

7) 按照Rack Position示意的位置，放置相应的试剂和试管。BIAtest solution可在Biacore Maintenance Kit, type

2中找到。点击Start。

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8) 将系统检测结果保存到指定目录下。

9) 系统检测完成后，会弹出系统检测报告。

7.4关机程序 Shut downBiacore T200 Standby的最长时间是7天。如果客户超过7天不使用设备且无法及时更换去离子水，我们建议将设备关机。

关机的具体步骤如下：

1) 选择Tools→Shut down。根据系统提示，按步骤进行操作。

2) 准备一瓶70%乙醇，将4根进样管插入瓶中。点击命令进行系统清洗。

3) 换上去离子水，点击命令，进行系统冲洗。

4) 将4根进样管拔出悬空，点击命令，排空系统内的残余液体。

5) 打开右侧的门，将蠕动泵的管夹松开（下次使用前务必复位）。

6) 关闭系统电源，关闭Biacore 控制软件。

7) 打开样品舱盖，擦洗进样针。倒掉废液瓶中的废液。

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