� Biblioteca de DNA genómico

� Biblioteca de DNA complementario (cDNA)

� Colecciones de fragmentos de DNA clonado de un organismo particular contenidos dentro de bacterias o virus como hospederos

DNA cromosómico se aisla y se digiere con enzimas de restricción

Un plásmido o un vector

bacteriófago se digiere con la misma enzima

La DNA ligasa une los trozos de DNA genómico más el

vector

Vectores Recombinantes se

usan para transformar

bacterias

Cada clon de célula bacteriana contendrá un plásmido con fragmentos de DNA genómico

� Los fragmentos que no codifican para proteínas (intrones) se clonan.

� Genoma grande dificulta la búsqueda de gen.

� Esta se construye a partir de mRNA de un tipo particular de célula, se produce cDNA utilizando transcriptasa inversa la cual produce DNA de una banda que va a convertirse en DNA de dos bandas con la enzima DNA polimerasa I. Este DNA se somete en forma adecuada a la reacción de transferencia terminal y luego el DNA resultante se clona.

� Transcriptasa Inversa (RT) •  Enzima viral formada por un Retrovirus

mRNA del tejido de intéres se

aisla

Se hibrida un oligonucleótido a

la cola de poliadenilación

El mRNA se digiere con NaOH o RNAsa La DNA

polimerasa sintetiza una

segunada cadena utilizando

secuencias cortas como primers

Se añaden los linkers

Se digieren los vectores

plásmidicos y el cDNA y

después se ligan con DNA

ligasa

Se introducen

los plásmidos

en las bacterias

� Genes expresados lo que reduce el DNA que se clona.

� Se pueden construir y rastrear para aislar gen de interés.

� Desventaja-Pueden ser difícil de construir y rastrear bibliotecas de cDNA si no está disponible un tejido fuente con una gran cantidad de mRNA para el gen.

� Hibridación de Colonias

TERMOCICLADOR TUBOS PARA PCR

� Desarrollado a mediados de los 80’s por Kary Mullis.

� PCR es una técnica para hacer copias y ampliar una secuencia específica del DNA en un corto tiempo.

� Desnaturalización- Separación de DNA en cadena simple

� Hibridación (anillamiento)- Primers crean enlaces de hidrógeno con las bases complementarias situadas en extremos opuestos

� Alargamiento-DNA polimerasa copia el DNA uniendosé a los extremos 3’ de cada cebador(primer) utilizándolos como moldes.

� Enzima clave � Taq DNA polimerasa

•  Thermus aquaticus •  1989- Molécula del Año

� Utiliza oligonucleótidos con moléculas fluorogénicas y termocicladores especializados que permiten a los investigadores cuantificar las reacciones de amplificación a medida que ocurren.

� Investigaciones y medicina � Fabricación de sondas de DNA � Estudio de expresión génica � Amplificación de cantidades pequeñas

de DNA � Amplificación para diagnosticar

enfermedades genéticas � Resolucción de crímenes

� Es importante saber algo de la secuencia de DNA que flanquea el gen de interés para el diseño de los primers.

� Si se ha clonado el gen en otra especie es más fácil clonar mediante PCR.