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Bio Aula01TRANSCRIPT
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Engenharia de Cultivos Celulares Engenharia de Cultivos Celulares para a Produpara a Produo de o de BiofBiofrmacosrmacos
Profa. Leda CastilhoCOPPE/UFRJ - Programa de Engenharia Qumica
Escola Piloto Virtual 2008
Aula 1: Introduo
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IntroduIntroduoo
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BiotecnologiaBiotecnologia
9Definio:
z Emprego de clulas ou componentescelulares para a obteno de produtos de utilidade para o homem
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ProcessosProcessos biotecnolbiotecnolgicosgicos
BiologiaBiologia xx BiotecnologiaBiotecnologia
Umaidia
Umapatente
Um artigocientfico
Um processo
Vaifuncionar?
Funcionouuma vez
Funcionoutrs vezes
Funcionasempre
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Produtos Produtos biotecnolbiotecnolgicosgicos
ProteinsPolypeptides
VP 2
VP 1
VirusesCapsidsCapsidomers
DNAPlasmids
Antibiotics and othersecundary metabolites
O
N
H
N
S CH3
MeOO
H H
Antibiticos e outrosmetablitos secundrios
Protenas DNAPlasmdeos
Vrus
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ValorValor agregadoagregado de de produtosprodutosbiotecnolbiotecnolgicosgicos
1
100
10.000
1 milho
100 milhes
Efluentes tratados
Protena de unicelular
Levedura de panificao
Vitamina B12
Protenas teraputicas obtidas pelocultivo de clulas animais
Penicilina
Preo por tonelada (US$) Produto
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ValorValor agregadoagregado de de produtosprodutosbiotecnolbiotecnolgicosgicos
Valor agregado
Escala deproduo Grau de pureza
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EstruturaEstrutura geralgeral de um de um bioprocessobioprocesso
Organismo sobconservao
Preparo domeio de cultivo
Propagao do inculoem escalas crescentes
Esterilizao do meioe de equipamentos
Biorreator
RPB1RPB2RPB3RPBn
Processos de recuperao e purificao de biomolculas (RPB)Formula-
o e em-balagem
Produto
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EstruturaEstrutura geralgeral de um de um bioprocessobioprocesso
Organismo sobconservao
Preparo domeio de cultivo
Propagao do inculoem escalas crescentes
Esterilizao do meioe de equipamentos
Biorreator
RPB1RPB2RPB3RPBn
Processos de recuperao e purificao de biomolculas (RPB)Formula-
o e em-balagem
Produto
Todas as reas do desenvolvimento de bioprocessosso interdependentes: a clula ou enzima empregada,
as condies de cultivo, os equipamentos de fermentao, as operaes de RPB.
Uma melhoria em uma rea pode gerar desvantagensem outras, logo o desenvolvimento de bioprocessos
deve ser feito de forma integrada.
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EstruturaEstrutura geralgeral de um de um bioprocessobioprocesso
Preparo edesenvolvimento
do inculo
Preparo eesterilizao
do meio de cultivo
Processos de recuperao e purificao do produto (downstream processing)Cultivo(biossntese)
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SSntesentese ququmicamica x x biossbiossntesentese
Matria-prima Intermedirios Produto
AC D E
B
9Molculas obtidas por converso qumica
9Produtos biotecnolgicos
F
Matria-prima Clula Produto
A F
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ProdutosProdutos biotecnolbiotecnolgicosgicos
9Exemplos de frmacos obtidos por sntese qumicaz Paracetamol (analgsico) MM = 151,16 Daz Cetamina (anestsico) MM = 237,74 Daz Aciclovir (anti-viral) MM = 225,20 Daz Zidovudine (anti-viral) MM = 267,20 Daz Misoprostol (anti-lcera) MM = 382,50 Da
9Exemplos de biofrmacos produzidos por via biotecnolgicaz Insulina tratamento de diabetesz Enzimas agentes trombolticos, digestivos, etc.z Fatores sanguneos tratamento de hemofiliaz Anticorpos tratamento de diferentes tipos de
cncer
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ProdutosProdutos biotecnolbiotecnolgicosgicos
Anticorpo C225C6466 H9982 N1726 O2024 S40(frmula da sequncia de aminocidos)
(MM = 146.000)
O
O
OH
O
cido acetil saliclicoC9H8O4
(MM = 180)
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ProdutosProdutos biotecnolbiotecnolgicosgicos
Anticorpo C225C6466 H9982 N1726 O2024 S40(frmula da sequncia de aminocidos)
(MM = 146.000)
O
O
OH
O
O
O H
O
Colocandoem escala:
cido acetil saliclicoC9H8O4
(MM = 180)
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Produtos Produtos biotecnolbiotecnolgicosgicosaplicados aplicados rea da sarea da sadede
9Produtos biotecnolgicos para a sade humana:z Biofrmacos
Protenas recombinantes
Anticorpos monoclonais
cidos nucleicos para terapia gnica ou RNAi
z Vacinas Virais
Bacterianas
Sub-unidade, recombinantes
Gnicas
z Molculas para diagnstico
z Terapias celulares
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Principais Principais reas de aplicareas de aplicao de produtos o de produtos biotecnolbiotecnolgicos aplicados gicos aplicados rea da sarea da sadede
NBEs NCEs % NBEs(biol.) (qum.) (biol.)
Imunologia/ 28 23 55InflamaoVirologia* 19 28 40Oncologia 40 76 34Cardiovascular 8 40 17Pneumologia 5 30 14Metabolismo 7 53 12Genito-Urologia 3 27 10ZNS 5 89 5Outros 21 48 30
136 414
*principalmente vacinas NCE: new chemical entity; NBE: new biological entity
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AplicaAplicaeses do do cultivocultivo de de cclulaslulasanimaisanimais in vitroin vitro
Vacinas (viraise recombinantes)
Terapia gnica Terapias celularese clulas tronco
Diagnstico (in vitro e in vivo)
Protenase anticorposteraputicos
Cultivo de clulas animais
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9Protenas teraputicas:z avanos no entendimento da base molecular das doenas
revelaram a existncia de protenas de potencialteraputico
z produzidas naturalmente pelo organismo em mnimasquantidades inicialmente desincentivou a sua produopara aplicao mdica em larga escala
9Produo em larga escala possibilitada a partir de:z tecnologia do DNA recombinantez tecnologia de hibridomas
ProteProtenas teraputicasnas teraputicas
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9Protenas teraputicas obtidas por meio que no a extrao a partir de fontes naturais biofrmacos
9Usados no tratamento de doenas importantes:z cncer (anticorpos monoclonais)z anemia (eritropoetina, EPO)z hemofilia (fatores de coagulao VIII e IX recombinantes)z neutropenia (estimulantes hematopoticos: G-CSF e
GM-CSF)z infarto agudo do miocrdio (ativador de plasminognio
tecidual, t-PA)
ProteProtenas teraputicasnas teraputicas
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O O exemploexemplo do do FatorFator IX IX humanohumano
-carboxi-lao (Gla)
Glicosilao(CHO), sulfatao(SO3) e fosforilao(PO3)
Hidroxilao(OH)
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O O exemploexemplo dada EPO EPO recombinanterecombinante
Eritropoetina
N-Glicosilao: Asn (24,38,83)
Nac-Glc
Nac-Glc
1-4Fuc1-6
1-4Man
ManMan
1-6 1-3Nac-Glc
Nac-Glc Nac-Glc
Nac-Glc
1-6
1-2 1-2
1-4
Gal Gal
Gal Gal
1-4
1-41-4
1-4
S
S S
S
2-3
2-3 2-3
2-3
Fonte: Kratje (2004)
O-Glicosilao:
Ser (126)
Nac-Gal
Gal
S
2-3
1-3S2-6
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TecnologiaTecnologia do DNA do DNA recombinanterecombinante
9 Empregada, entre outrascoisas, para expressarprotenas humanas de interesse mdico-farmacutico em diferenteshospedeiros, tais comomicrorganismos e clulasanimais
9 Permite a produo destasprotenas em larga escala
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HibridomasHibridomas e e anticorposanticorposmonoclonaismonoclonais
9 Hibridomas (Khler e Milstein, 1975):z clulas hbridas: fuso de mielomas, linfcitos tumorais de
crescimento infinito que perderam a capacidade de produziranticorpos, com linfcitos B normais, extrados do bao (de roedores) que, antes da fuso, tm vida em cultura in vitrolimitada
9 Anticorpos monoclonais (AMs):z derivados de 1 nico clone, com especificidade nica ao seu
alvo, menor risco de reaes adversasz normalmente murinos:
dificuldades de obteno de AMs humanos devido instabilidade de mielomas humanos e dificuldade de imunizar voluntrios humanospara muitos imungenos
risco de resposta HAMA (human anti-mouse antibody) reduo da HAMA atravs da humanizao de
AMs murinos
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TecnologiaTecnologia de de hibridomashibridomas((anticorposanticorpos monoclonaismonoclonais))
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AnticorposAnticorpos monoclonaismonoclonaisquimquimricosricos e e humanizadoshumanizados
~30% murino
5 a 10% murino
Fonte: Maranho e Brgido (2001)
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CClulaslulas animaisanimais -- HistHistricoricoAno Evento
1949 Crescimento de vrus em cultivo de clulas (Enders e col.)
1954 Vacina inativada Salk contra a poliomielite (cl. rim de macaco)
1955 Vacina atenuada Sabin contra a poliomielite (cl. rim de macaco)
1963 Vacina contra o sarampo (clulas de embrio de galinha)
1964-69 Vacinas contra raiva, caxumba e rubola (cl. WI-38)
1975 Produo de anticorpos monoclonais (Khler e Milstein)
1979 Primeira linhagem de clula recombinante
1980 Ampliao para escala de produo de 8.000 L (vac. febre aftosa)
1981 Primeiro kit diagnstico com anticorpo monoclonal
1982 1 frmaco oriundo da tecnologia do rDNA (insulina; microrganismo)
1986 1 biofrmaco produzido em clulas animais (CHO): t-PA recombin.
1986 1 AM de uso teraputico: OKT3 (rej. a transplante; produz. camund.)
desde Testes clnicos e aprovao de diversos produts oriundos da1990 tecnologia do DNA recombinante e tecnologia de hibridomas
(fatores sanguneos VIII e IX, AMs, interferon, EPO)
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LinhagensLinhagens celularescelulares comumentecomumenteempregadasempregadas
Linhagem Tecido de origem Aplicaes
CHO Ovrio de hamster chins Prot. recombinantes
BHK-21 Rim de filhote de hamster Vacinas veterinrias
Prot. recombinantes
Vero Rim de macaco verde africano Vacinas p/ humanos
HeLa Tumor humano Estudos
HEK-293 Rim de embrio humano Terapia gnica
Estudos
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ProduProduoo de de proteprotenasnas recombinantesrecombinantesemem cclulaslulas animaisanimais
9Sistema de expresso preferido para a produo de protenas recombinantes de uso teraputico:
z secretam a protena no meio de cultivo facilidade de purificao
z modificaes ps-traducionais carboxilao, hidroxilao, sulfatao, fosforilao e
especialmente a glicosilao
conferem atividade biolgica e estabilidade
sua ausncia pode causar problemas de imunogenicidade
CHO.K1 BHK-21
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GlicosilaGlicosilaoo
9 Em glicoprotenas, a glicosilao influi fortemente sobre a atividade biolgica da protena, a sua eficcia in vivo e o seu perfil teraputico
9 Bactrias no glicosilam, leveduras tm padres distintos de glicosilao
9 Nenhum sistema heterlogo de expresso realiza a glicosilao de modo absolutamente idntico ao da fonte original da protena
9 Clula hospedeira mais usada: clulas CHO (Chinese hamster ovary cells)z padro de glicosilao adequadoz baixa susceptibilidade a vrus que afetam humanos
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ExemplosExemplos de de proteprotenasnas jj aprovadasaprovadasProduto Indicao Clula Aprov.
Avonex (-interferon) esclerose mltipla CHO 1996Benefix (fator IX) hemofilia B CHO 1997
Epogen (EPO) anemia CHO 1989
TNKase (t-PA) doenas cardacas CHO 2000
Herceptin/Trastuzumab (AM) cncer de seio CHO 1998
Refacto (fator de coagulao) hemofilia A CHO 2000
Prosta Scint (AM diagnstico in vivo) cncer de prstata n.d. 1996Simulect/Basixilimab (AM) rejeio a mieloma
transplante de rim de rato1998
Campath (AM) leucemia CHO 2001
Avastin/Bevacizumab (AM) cncer colorretal CHO 2004
Xolair/Omalizumab (AM) asma CHO 2003
Soliris/Eculizumab (AM) hemoglobinuria (PNH) NS0 2007
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AspectosAspectos de de mercadomercado
-
Mercado Mercado biofarmacuticobiofarmacutico mundialmundial
(~10-15% das vendas mundiais da indstria farmacutica)
Worldwide revenues of $41.3 billion2002 Canada
4%
Asia/Pacific3%
U.S.73%
Europe20%
-
Mercado Mercado biofarmacuticobiofarmacutico mundialmundial
*estimadoem 2000
0
5
10
15
20
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45S
a
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b
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)
andere (1500 Firmen)Top 4 - 10Top 3
andere (1500 Firmen) 2 2.5 3 2.5 5 12 9Top 4 - 10 1.5 2 2 3.5 4 10 17Top 3 4.5 4.5 5 6 7 16 15
1996 1997 1998 1999 2000 2005* 2002 IST
V
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Outros .
Outros .
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Os dez biofOs dez biofrmacos rmacos mais vendidos no mundo (Top 10)mais vendidos no mundo (Top 10)
Nome comercial Empresa Produto
Erypo/Procrit Amgen Eritropoetina Epogen Amgen Eritropoetina Remicade Centocor AM InfliximabNeupogen Amgen G-CSFMabThera/Rituxan Genentech AM RituximabAvonex Biogen Interferon--1aEnbrel Amgen TNF--ReceptorViraferon Schering-Plough Interferon--2bBetaferon Chiron Interferon--1bHumalog Eli Lilly Insulina
Dados de 2002
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AprovaAprovaoo de de produtosprodutosbiotecnolbiotecnolgicosgicos
9 Atualmente, ~30% dos produtos aprovados so de origembiotecnolgica
9 Em 2010, este nmero deve chegar a 50%
0
5
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15
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30
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94-95 96-97 98-99 00-01 02-03
Ano
F
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(
%
)
Fonte: Pharma Projects (2003)
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TiposTipos de de produtosprodutos aprovadosaprovados nosnosltimosltimos anosanos
9Produtos biotecnolgicos aprovados em 2004 (UE e EUA)
z 12 produtos
z ~60% produzidos em clulas animais
z anticorpos monoclonais: 50%
z 1 oligonucleotdeo sinttico
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ProdutosProdutos aprovadosaprovados e e ememdesenvolvimentodesenvolvimento
1
Fonte: Walsh (2003)
-
ProdutosProdutos emem desenvolvimentodesenvolvimento clclniconicoporpor tipotipo de de molmolculacula
Total: ~370
Fonte: Walsh (2003)
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Desenvolvimento de anticorpos Desenvolvimento de anticorpos monoclonais teraputicosmonoclonais teraputicos
Probabilidade de aprovao de anticorpos monoclonaisTarget
ValidationLead
CompoundPreclinic
29%Phase I
23%Phase II
53%Phase III
55%Registration
95%
0 100 200 300
Preclinic
Phase I
Phase II
Phase III
MAb Murine Chimar Human Other
0100020003000400050006000700080009000
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
Vendas de monoclonais teraputicos (em milhes de US$)
Monoclonais teraputicos em desenvolvimento (2002)
Fonte: Pharma Projects (2003)
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Mercado Mercado brasileirobrasileiro
9Produtos de elevado valor agregado:z princpios ativos importados em sua totalidadez incio da produo em 2009/2010: EPO e IFN na Fiocruz
9Altos gastos do Ministrio da Sade:z medicamentos excepcionais (EPO, G-CSF, interferons, etc)z fatores de coagulao sangunea
17,80727,059
48,88839,581
47,125
81,36388,284
010,00020,00030,00040,00050,00060,00070,00080,00090,000
Mil R$
1
9
9
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1
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6
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8
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1
Gastos do Governo Federal apenas com eritropoetina (EPO):
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Mercado Mercado brasileirobrasileiro
Jornal do Brasil, 13/03/2004
Jornal do Brasil, 27/07/2004
-
Mercado Mercado brasileirobrasileiro
Jornal do Brasil - 05/04/2003
Jornal do Brasil - 10/04/2004G-CSF, GM-CSF, EPO, monoclonais
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Grande Grande demandademanda porpor um AM um AM antianti--cncercncer jj aoao longolongo de de seuseu
ciclociclo de de desenvolvimentodesenvolvimento
1
10
100
1000
10000
100000
Pr-Clnica Fase I/II Fase II/III Comercial I Comercial II
Fase do desenvolvimento
D
e
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(
g
)
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Como Como produzirproduzir emem grandesgrandesquantidadesquantidades??
1
10
100
1000
100 1000 10000 100000
Volume do(s) biorreator(es) (L)
P
r
o
d
u
o
a
n
u
a
l
(
k
g
)
10 mg/L/dia
30
50
100
300
500
t*V*adeprodutividanual.prod biorreat=
-
Como Como aumentaraumentar a a produtividadeprodutividade??
9Otimizao do meio de cultivo
9Engenharia metablica
9Otimizao da expresso de protenas
9Otimizao de biorreatores
9Otimizao do modo de operaode biorreatoresz processos em perfuso
9Otimizao das etapas de recuperao e purificao
Engenharia de cultivos celulares!
Patentes expirando: inovao tecnolgica
Engenharia de Cultivos Celulares para a Produo de BiofrmacosIntroduoBiotecnologiaProcessos biotecnolgicos Biologia x BiotecnologiaEstrutura geral de um bioprocessoEstrutura geral de um bioprocessoEstrutura geral de um bioprocessoSntese qumica x biossnteseProdutos biotecnolgicosProdutos biotecnolgicosProdutos biotecnolgicosProdutos biotecnolgicos aplicados rea da sadePrincipais reas de aplicao de produtos biotecnolgicos aplicados rea da sadeAplicaes do cultivo de clulas animais in vitroProtenas teraputicasProtenas teraputicasO exemplo do Fator IX humanoO exemplo da EPO recombinanteTecnologia do DNA recombinanteHibridomas e anticorpos monoclonaisTecnologia de hibridomas(anticorpos monoclonais)Clulas animais - HistricoLinhagens celulares comumente empregadasProduo de protenas recombinantes em clulas animaisGlicosilaoExemplos de protenas j aprovadasAspectos de mercadoMercado biofarmacutico mundialMercado biofarmacutico mundialAprovao de produtos biotecnolgicosTipos de produtos aprovados nos ltimos anosProdutos aprovados e em desenvolvimentoProdutos em desenvolvimento clnico por tipo de molculaMercado brasileiroMercado brasileiroMercado brasileiroGrande demanda por um AM anti-cncer j ao longo de seu ciclo de desenvolvimentoComo produzir em grandes quantidades?Como aumentar a produtividade?