bio idrolisi
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Reazioni di idrolisi
Circa 2/3 delle biotrasformazioni riportate su composti non-naturali negli ultimi 20 anni usano enzimi
idrolitici. Ci sono un certo numero di ragioni per questo:
Le idrolasi non richiedono cofattori;
Sono largamente ottenibili da fonti diverse;
Rimangono attive anche in mezzi non-acquosi dando luogo ha reazioni di formazioni di esteri, per
esempio, piuttosto che a reazioni di idrolisi
Mostrano frequentemente una rimarchevole chemo- regio- e stereoselettività anche accettando una
grande varietà di substrati:
Tra tutti i tipi di reazioni, che coinvolgono gli enzimi idrolitici, le idrolisi delle ammidi e degli esteri
sono quelle più utilizzate e sono anche le più facili. Queste reazioni coinvolgono proteasi, lipasi ed
esterasi.
Il meccanismo di una idrolisi enzimatica è molto simile a quello di una idrolisi chimica base catalizzata.
Un gruppo nucleofilico del sito attivo dell’enzima attacca il gruppo carbonilico dell’estere o dell’ammide.
Questo operatore chimico nucleofilo può essere il gruppo della serina, ad esempio l’esterasi estratta del
fegato del maiale (PLE), la subtilisina e le lipasi del pancreas suino (PPL) o da Mucor sp., il gruppo
carbossilico dell’acido aspartico (pepsina) o il tiolo della cisteina (papaina).
Il meccanismo proposto nello schema è quello della serina-idrolasi.
Due gruppi addizionali (acido aspartico e istidina) sistemati vicino alla serina, che è il nostro operatore
chimico formano la “triade catalitica”. Questa speciale configurazione aumenta l’acidità del gruppo
idrossilico e quindi la nucleofilicità che lo rende capace di attaccare il carbonile dell’estere (step I).
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Quindi il nucleofilo, normalmente l’acqua, può attaccare a sua volta l’acil-enzima intermedio rigenerando
l’enzima e rilasciando l’acido carbossilico.
Quando l’enzima opera in un mezzo dove la concentrazione di acqua è bassa (bassa attività di acqua)
qualsiasi altro nucleofilo può competere con l’acqua per dare varie biotrasformazioni.
L’attacco di un’altra molecola di alcol porta ad un altro estere (reazione di interesterificazione), l’entrata
di un’ammina produce un’ammide e quando l’ossigeno funge da nucleofilo si ha un peracido.
Le carbossil proteasi sono chiamate così perché hanno due residui essenziali di aspartato cataliticamente
essenziali. Erano anche chiamate proteasi acide perché sono attive ad un pH molto basso (2-3). Il
membro più noto di questa classe è la pepsina che è formata da un’unica catena polipeptidica con 327
amminoacidi. Il sito attivo è una regione estesa che può accomodare almeno 4 o 5 residui substrato.
L’enzima ha una preferenza per amminoacidi idrofobici su entrambi i lati da scindere. La pepsina
raramente catalizza l’idrolisi di esteri.
Le proteasi tioliche sono ampiamente distribuite in natura. La papaina, che è di origine vegetale, è un
polipeptide costituto da 212 amminoacidi. Il sito attivo è cisteina-25 aiutata da istidina-159.
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(cisteina-25) SH
istidina-159
NH
N
(cisteina-25) S
istidina-159
NH
N
H
R X
O
(cisteina-25) S
istidina-159
NH
N
O
R
HX
(cisteina-25) S
istidina-159
NH
N
O
RH2O
(cisteina-25) SH
istidina-159
NH
N
(cisteina-25) S
istidina-159
NH
N
H
RCOOH
Durante queste reazioni qualsiasi tipo di chiralità del substrato è riconosciuta dall’enzima e questo porta
ad una preferenza per una delle due direzioni possibili di attacco.
Il valore di questa discriminazione è detta selettività.
L’idrolasi può distinguere due enantiofacce di un substrato achirale come nel caso degli enol esteri.
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Se i substrati prochirali possiedono due gruppi identici (X) ma enantiotopici chiamati pro-R e pro-S sono
soggetti ad una idrolisi enzimatica, vi è una discriminazione nella scelta di X che viene trasformato in Y.
Numerosi diesteri meso sono trasformati in composti chirali usando questa discriminazione.
Dal momento che le reazioni idrolitiche si compiono in acqua, esse sono praticamente irreversibili. La
cinetica di queste reazioni ad un unico stadio (come quelle di un gruppo prochirale o di un composto
meso che vengono idrolizzati) dove i substrati sono trasformati nei due enantiomeri P e Q e regolata
dalle due costanti K1 e K2 rispettivamente.
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La selettività della reazione (�) è governata dal rapporto K1/K2 che è costante durante tutta la reazione.
Come conseguenza la purezza ottica (ee) non dipende dalla conversione. La selettività in questo caso
può essere cambiata solo cambiando l’ambiente di reazione (modificazione del substrato, scelta di un
altro enzima, addizione di un cosolvente organico, variazione delle temperatura e del pH).
D’altra parte per alcuni diesteri la reazione non si ferma ad un unico stadio ma può procedere all’idrolisi
dell’altra funzione dando un prodotto R achirale.
Facciamo un esempio di una reazione ad un singolo stadio e di una reazione a due stadi.
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In questa reazione l’eccesso enantiomerico è regolato dal rapporto K1/K2 ed è costante lungo tutto l’arco
della reazione.
La purezza ottica in questo caso dipende da tutte e quattro le costanti dal momento che il secondo stadio
idrolitico non può essere evitato. Dal momento che l’enzima mantiene sempre la preferenza per la stessa
chiralità, si può concludere che se S (substrato) è trasformato più velocemente in P , Q sarà idrolizzato
più velocemente di P nel diolo R. La selettività in questo caso sarà governata da K1 > K2 e da K4 > K3
La purezza ottica (ee) in questo caso sarà funzione della conversione. La prima parte della reazione sarà
governata dalla K1 ma quando il secondo stadio idrolitico inizierà la sua richiesta stereochimica
aumenterà la purezza del primo stadio.
Quando un substrato racemico viene sottoposto ad idrolisi enzimatica si ha la discriminazione tra i due
enantiomeri dei quali uno reagirà più velocemente dell’altro perché fitterà meglio con il sito attivo
dell’enzima.
Questo porterà ad una risoluzione cinetica del racemato. In ogni caso in queste reazioni la resa teorica
sarà al massimo al 50%.
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Idrolisi di ammidi L’idrolisi enzimatica di un legame ammidico è legata alla chimica degli amminoacidi e dei peptidi. La
produzione mondiale di amminoacidi enantiomericamente puri è superiore a 0.5 milioni di tonnellate di
materiale ed ha un mercato di 2 bilioni di dollari l’anno. I tre amminoacidi, che dominano questa area,
sono l’acido glutammico, la lisina e la metionina racemiche, e sono prodotti per fermentazione o per
via chimica.
Gli L-amminoacidi sono usati sempre di più come additivi o come prodotti di partenza per la sintesi di
farmaci, prodotti per l’agricoltura e dolcificanti artificiali. Recentemente alcuni amminoacidi che
possiedono la non-naturale configurazione D vengono usati come composti biologicamente attivi o come
componenti di tali prodotti. Per esempio la D-fenilglicina e il suo p-idrossi derivato vengono utilizzati
nella sintesi di antibiotici come l’ampicillina e l’amoxicillina.
Tra i principali metodi per la sintesi di amminoacidi enantiomericamente puri vi è la risoluzione della
miscela racemica utilizzando enzimi idrolitici come la proteasi e l’esterasi, che è certamente il più
comune, mentre le reazioni con liasi e deidrogenasi sono più complesse.
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Gli amminoacidi possono essere idrolizzati da proteasi ed esterasi quando il gruppo amminico è protetto
come gruppo acilico. In queste reazioni si possono utilizzare anche proteasi non specifiche come quelle
delle cellule di lievito di birra.
Le ammidi degli amminoacidi sono idrolizzate anche da amidasi (chiamate anche amminopeptidasi)
ottenute da vari microrganismi come Pseudomonas, Aspergillus o Rhodococcus.
Le amminoacilasi, isolate da Aspergillus e Penicillium catalizzano invece l’idrolisi di N-acil-
amminoacidi.
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Idrolisi di esteri
A differenza del grande numero di lipasi disponibili poche esterasi sono utilizzabili (come quelle estratte
dal fegato del maiale, PLE, e del cavallo, HPLE) e la conseguenza era che quando l’idrolisi di un estere
non procede selettivamente non è facile cambiare enzima. Per ovviare il problema spesso vengono
utilizzati i microrganismi come tali anche se il controllo di queste reazioni è più complicato.
Le strutture dei substrati che vengono idrolizzati da esterasi e proteasi si possono ricondurre alle seguenti
strutture generali.
Tra le esterasi quella estratta dal fegato del maiale (PLE) è la più usata data la sua grande versatilità che
probabilmente è dovuta al ruolo giocato da questo enzima nella dieta del maiale. Una delle peculiarità di
questo enzima sono le blande condizioni di utilizzo che permettono di evitare reazioni di decomposizione
anche in prodotti molto sensibili alle condizioni di idrolisi chimica.
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Anche cellule di alcuni microrganismi sono utilizzate per l’idrolisi di esteri, come Bacillus subtilis,
Brevibacterium ammoniagenes, Bacillus coagulans, Pichia miso e Rhizopus nigricans.
Sebbene il controllo di queste reazioni sia più difficile, la selettività è di norma migliore di quella degli
enzimi isolati. Un esempio è la risoluzione di alcoli secondari per idrolisi degli acetati con Bacillus sp.
Per evitare il problema del controllo della reazione si può utilizzare l’immobilizzazione di cellule
cresciute come l’esempio dato dal lievito di birra.
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L’importanza degli α-aril e degli α-arilossi derivati dell’acido propionico come antiifiammatori
(Naproxen) e prodotti chimici per l’agricoltura (Diclofop), in cui l’attività maggiore è in uno solo dei due
enantiomeri (S nel caso del Naproxen), ha portato alla loro risoluzione con carbossil esterasi estratta da
ceppi di Bacillus.
Un altro esempio di idrolisi di un agente antinfiammatorio è il Ketorolac che viene risolto per idrolisi del
suo estere con una proteasi ottenuta da Streptomyces griseus. Quando l’idrolisi viene condotta a pH > 9
vi è una spontanea racemizzazione del prodotto di partenza che porta alla risoluzione totale (risoluzione
cinetica dinamica).
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L’ottimizzazione della selettività di questi enzimi si può ottenere per modificazione del substrato. Questo
concetto è applicabile a tutte le reazioni enzimatiche infatti l’abilità degli enzimi a riconoscere la chiralità
di un dato substrato dipende fortemente dalla forma sterica del substrato stesso.
Questa variazione si può ottenere semplicemente variando i gruppi protettori.
La variazione del solvente con l’aggiunta di cosolventi organici miscibili con l’acqua come metanolo
acetone, diossano, dimetilformammide è un metodo usato frequentemente per migliorare la selettività
dell’enzima. Si utilizza il cosolvente da un minimo del 10% ad un massimo del 50%. A concentrazioni
superiore si rischia di inattivare l’enzima.
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L’ottimizzazione delle condizioni di reazione come l’aggiustamento del pH e la variazione di temperatura
danno risultati inferiori.
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Idrolisi di epossidi Gli epossidi enantiomericamente puri e i corrispondenti dioli ottenibili da loro sono intermedi importanti
in sintesi organica e quindi molti metodi chimici e biochimici sono stati studiati per ottenerli. Tra i
metodi biochimici viene riportata la diretta epossidazione degli alcheni con monoossigenasi isolate
(citocromo P 450) o monoossiganasi batteriche (da pseudomonadacee, mycobatteri, xanthobatteri,
corynebatteri e nocardia). Le rese sono basse ma gli eccessi enantiomerici alti. D’altra parte gli epossidi
prodotti hanno configurazione R e i batteri hanno un’alta specificità di substrato. L’ultimo approccio
biocatalitico è dato dalla risoluzione cinetica o tramite lipasi, ma esiste la necessità della presenza nella
molecola di una funzione esterea, acida o alcolica, o tramite diretta idrolisi con epossido idrolasi. O
R1 R2
Epossido idrolasi OHHO
R1 R2 Le epossido idrolasi sono isolate da una grande varietà di organismi. Si trovano in tutte le specie di
mammiferi e la più studiata è quella estratta dal fegato dei mammiferi (mEH). Fino a poco tempo fa si
riteneva che le epossido idrolasi derivanti da altre fonti fossero rare, soprattutto quelle prodotte da
microrganismi che avrebbero permesso una produzione su larga scala. Invece un buon numero di
epossido idrolasi sono state recentemente purificate da microrganismi, patate, insetti e semi di soia.
L’apertura degli anelli epossidici avviene con attacco del nucleofilo in posizione anti all’ossigeno
dell’anello con inversione di configurazione del carbonio attaccato.
L’idrolisi dei cis-epossidi perciò produce dioli la cui configurazione assoluta è treo in proiezione di
Fischer e anti nella struttura a zigzag. Così l’idrolisi dei trans-epossidi porta agli anti (eritro) dioli.
O
O
H2O
H2O
HO
HO
OH
OH
OH
OH
syn
C3H7
anti
HO
OH
C3H7
C3H7
OH
OH
C3H7
eritro
treo
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L’epossido idrolasi estratta dal fegato dei mammiferi (mEH), che di gran lunga la più studiata, è una
singola catena peptidica con un peso molecolare tra 48.5 e 49.5 kDa e il pH ottimale di lavoro è compreso
tra 8.9 e 9.4.
Sono proposti due meccanismi per questa idrolisi.
Il primo è un meccanismo generale base catalizzato dove un residuo di istidina prende un protone da una
molecola di acqua intrappolata nel sito attivo dell’enzima. Questo genera un anione idrossilico libero che
attacca una delle due estremità dell’epossido, che d’altra parte può essere attivato da una parziale
protonazione, per esempio, da un residuo di lisina.
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Il secondo meccanismo coinvolge l’attacco di un residuo carbossilato, nucleofilico, all’epossido che
viene ancora attivato per protonazione. Questo dà origine ad un α-idrossiestere intermedio, legato in
maniera covalente al sito attivo dell’enzima. L’intermedio è idrolizzato da un anione idrossido, ancora
generato dalla deprotonazione di una molecola d’acqua operata da un residuo di istidina. Il rilascio del
diolo rigenera il carbossilato nucleofilo. Questo sembra essere il meccanismo più probabile di azione di
questo enzima.
In aggiunta agli studi sul loro ruolo biologico e al loro meccanismo, si è focalizzata l’attenzione sul loro
possibile impiego come catalizzatori nella sintesi organica.
In generale mEH mostra una grande enantioselettività e si è visto che gli epossidi monosostituiti con
una larga parte idrofobica sono degli ottimi substrati, i cis- e gli 1,1-disostituiti sono ancora
ragionevolmente accettati, mentre i trans-disostituiti, i tri- e i tetra sostituiti non sono substrati accettabili.
Alta stereoselettività si ha anche nell’apertura di epossidi aril sostituiti.
O
Ph
O
Ph
mEH
mEH
O
PhHO
OH
PhR
HO
OH
PhRR
S
O
Ph
SR
Lo stirene ossido viene idrolizzato dando l’R diolo otticamente puro al 12% di conversione, mentre al
78% di conversione viene lasciato l’S-epossido enantiomericamente puro. Per quanto riguarda il metil
stirene ossido si ottengono entrambi i prodotti enantiomericamente puri.
Gli stessi R,R-dioli si ottengono con cis-epossidi alifatici. Ampi studi su questa idrolasi hanno
dimostrano che questa agisce secondo queste linee guida:
L’anello epossidico è sempre aperto per attacco anti rispetto all’ossigeno;
L’attacco avviene sul carbonio meno stericamente impedito: questo è normalmente un primario o
secondario, mai un terziario;
Se l’epossido è come nella figura l’attacco avviene inizialmente sul carbonio di sinistra;
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Il problema della reperibilità delle epossido idrolasi derivanti dal fegato dei mammiferi non si pone per
gli enzimi ottenuti da microrganismi. Solo recentemente sono stati isolati questi enzimi da batteri e funghi
e hanno dimostrato una buona selettività oltre alla possibilità di fare reazioni su larga scala non essendoci
limitazioni alla loro produzione.
Una delle prime idrolasi è stata estratta, dopo un ampio screening su varie specie batteriche, da
Rhodococcus sp. e si è dimostrata capace di idrolizzare una serie di epossidi monosostituiti e 1,1-
disostituiti.
OH3C
RRhodococcus sp
OCH3
RR
CH3
R
OH
OH
S
Substrato R = Conversione % Epossido ee% Diolo ee%
n-pentile 43 71 (R) 96 (S)
n-eptile 20 25 (R) 98 (S)
n-nonile 36 55 ( R) >99 (S)
All’aumentare della catena aumenta la selettività. Altre specie come Rhodococcus equi, Rhodococcus
ruber, Mycobacterium paraffinicum e Nocardia hanno alta selettività verso epossidi 1,1-disostituiti.
In tutti i casi esaminati, l’idrolisi procede con inversione del carbonio ossiranico non-sostituito portando a
ritenzione di configurazione nel diolo prodotto.
67% 56%33%44%
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Dai dati finora ottenuti (pochi data la recente sperimentazione) possiamo dire che l’alta enantioselettività
di questi enzimi si esplica solo su substrati con struttura ben definita e questo indica che il gruppo
metilico in C-2 gioca un ruolo importante nella selettività quando lo confrontiamo con gli epossidi
monosostituiti.
Molti funghi possiedono delle EH che hanno strereospecificità in alcuni casi diversa. Un esempio è
l’idrolisi di stirene ossido con Aspergillus niger e Beauveria sulfurescens.
O
O
O
S
R
OH
OH
R
OH
OH
R
A. niger
B. sulfurescens
Entrambe le specie danno lo stesso R-diolo ma lasciano l’epossido opposto. Questo indica che A. niger
idrolizza l’R-stirene ossido con ritenzione di stereochimica (attacco al C-2) e che B. sulfurescens
idrolizza l’S-stirene ossido con inversione di stereochimica (attacco al C-1 in posizione benzilica).
Altra spiegazione è l’attacco in posizione benzilica di un gruppo nucleofilico del sito attivo con la
formazione di un complesso enzima-substrato (prima inversione) che viene idrolizzato da una molecola
d’acqua (seconda inversione).
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O
R ritenzione
H2O
OH
OH
R
O
R
Enz X
OH
X
Enz
S
H2O
OH
OH
Rinversione inversione
A. niger
O
S inversione
H2O
OH
OH
R
B. sulfurescens
E’ del 1997 la scoperta di un lievito, Rhodotorula glutinis, in grado di idrolizzare con enantioselettività
eccezionalmente alta sia epossidi alchilici che arilici ed aliciclici.
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Lipasi I lipidi sono gli elementi chiave nella chimica della vita. La maggior parte degli organismi usa la chimica
supramolecolare inerente ai fosfolipidi per formare membrane. Molte piante ed animali immagazzinano
energia sotto forma di trigliceridi che non sono solubili in acqua. Per il riciclo di tali sostanze e altre
molecole biologiche, essi producono esterasi, enzimi che sono in grado di idrolizzare legami di esteri
solubili in acqua. Le esterasi, che possono idrolizzare trigliceridi all’interfaccia acqua/olio, sono chiamate
lipasi o più sistematicamente triacilglicerolo idrolasi e quelle che attaccano i fosfolipidi sono chiamate
fosfolipasi.
Entrambi i tipi di enzimi hanno ricevuto recentemente grande attenzione. Mentre le fosfolipasi sono
coinvolte in molti processi metabolici, quali il ripristino delle membrane, le lipasi hanno diverse
funzioni nella degradazione dei cibi e dei grassi. Esse trovano anche applicazioni nelle biotecnologie
(in particolare come additivi di detergenti) e come catalizzatori per la produzione di speciali prodotti
oleochimici e per la sintesi organica.
Questa larga potenzialità sintetica è dovuta al fatto che le lipasi, a differenza di molti altri enzimi,
accettano una grande varietà di substrati, sono abbastanza stabili in solventi organici non-acquosi e a
seconda del sistema solvente usato possono dare reazioni di idrolisi e di esterificazione.
OAc
OAc OAc
OAc
OAc OAc
HOAc
HOAc
H2O
OAc
OAc OH
OAc
OH OHHOAc
H2O
OH
OH OHHOAc
H2O
HOAc
In aggiunta le lipasi possono ospitare una grande varietà di substrati, oltre ai trigliceridi, come gli esteri
alifatici, aliciclici ed aromatici e reagiscono con alta enantio- e regioselettività.
Infine l’acil-enzima intermedio nelle reazioni catalizzate da lipasi non è solo formato da esteri
carbossilici, ma da molti altri substrati come tioesteri ed ammine attivate, che allargano
considerevolmente la potenzialità sintetica delle lipasi.
Pur essendo ubiquitarie e quindi estraibili da tessuti animali e vegetali, le lipasi che si trovano in
commercio sono derivate da microrganismi. Dall’avvento delle tecniche di ingegneria genetica un
crescente numero di lipasi sono preparate da ricombinanti batteri e lieviti.
Un esempio è la “lipasi detergente” ottenuta dal fungo Humicola lanuginosa che è commercialmente
prodotta in larga scala (parecchie tonnellate all’anno) per fermentazione di Aspergillus oryzae in cui è
stato clonato il gene che codifica per la lipasi di Humicola lanuginosa.
Nella tabella sono riportate importanti lipasi commerciali.
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Tabella. Importanti lipasi commerciali
ORIGINE SIGLA M (kDa) SPECIFICITA’ APPLICAZIONI
da mammiferi
lipasi pancreatica umana HPL 50 sn-1,3 lipasi gastrica umana HGL 50 sn-3 Sintesi organica, aiuto
digestivo lipasi pancreatica suina PPL 50 sn-1,3 da funghi
Candida rugosa CRL 60 non-specifica Sintesi organica Candida antarctica B CAL 60 sn-1,3 Sintesi organica Geotrichum candidum GCL 60 acidi grassi
insaturi Oleochimica
Humicola lanuginosa HLL 30 non-specifica Detergenti Rhizomucor miehei RML 30 sn-1,3 Produzione formaggi Aspergillus orizae AOL 30 Produzione formaggi Penicillium camamberti PEL 41 sn-1,3 Monogliceridi Rhizopus delemar RDL 41 sn-1,3 Oleochimica Rhizopus oryzae ROL 41 sn-1,3 Oleochimica Rhizopus arrhizus RAL 41 sn-1,3 Oleochimica da batteri
Pseudomonas glumae PGL 33 non-specifica Enzima detergente, sintesi organica
Burkholderia cepacia BCL 33 non-specifica Sintesi organica Pseudomonas pseudoalcaligenes PPL 33 sn-1,3 Detergenti Pseudomonas mendocina PML 33 sn-1,3 Detergenti Chromobacterium viscosum CVL 33 sn-1,3 Sintesi organica Bacillus thermocatenulatus BTL-2 43 sn-1,3 Fusarium solani FSl 22 Detergenti
Sebbene le lipasi idrolizzino e formino il legame estereo come le esterasi e le proteasi, hanno un
meccanismo differente.
La differenza più importante sta nella interazione con il substrato. Mentre le esterasi e le proteasi seguono
la normale legge di Michaelis-Menten in cui l’attività dell’enzima dipende dalla concentrazione del
substrato, le lipasi invece non mostrano quasi attività fino a che sono disciolte nel mezzo, mentre quando
la concentrazione del substrato cresce fino al limite della sua solubilità, vi è un repentino aumento di
attività.
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La prima struttura tridimensionale di una lipasi (raggi X nel 1990) suggerisce che l’attivazione
interfacciale sia dovuta alla presenza di un gancio peptidico amfifilico che copre il sito attico dell’enzima
in soluzione, proprio come un coperchio. Dalla struttura di un cocristallo tra una lipasi e il substrato, vi è
un’evidenza che quando avviene il contatto con l’interfaccia lipide/acqua, questo coperchio si riarrangia
e rende il sito attivo accessibile al substrato.
Le idrolisi catalizzate da lipasi quindi avvengono in un sistema bifasico. E’ sufficiente impiegare il
substrato ad alte concentrazioni in quanto esso stesso costituisce la fase organica o un solvente organico
immiscibile con l’acqua per aver l’attivazione dell’enzima.
E’ da tenere presente che non tutte le lipasi mostrano il fenomeno dell’attivazione interfacciale e quindi
non è questo il criterio per classificarle ma rimane quello della loro capacità di idrolisi degli acil gliceroli
a lunga catena.
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Comunque tutte le lipasi finora studiate idrolizzano i legami esterei attraverso una “triade catalitica”
composta da una serina nucleofilica attivata da un legame idrogeno con l’istidina e aspartato o
glutammato.
Mentre molte lipasi hanno grandi somiglianze, piccole variazioni nell’architettura del sito di legame
dell’enzima hanno grandi ripercussioni sulle proprietà catalitiche, la temperatura e la stabilità della lipasi
in un solvente.
Applicazioni in oleochimica Mentre la maggior parte dei 60 milioni di tonnellate di grassi e oli prodotti ogni anno sono direttamente
usati nei cibi, più di 5 milioni di tonnellate sono una fonte chimica rinnovabile per applicazioni non-
alimentari (oleochimica) come saponi, trigliceridi transesterificati e monogliceridi.
a) Saponi
La maggior applicazione dei trigliceridi è nella produzione dei saponi. Il processo chimico fornisce rese
quantitative (2 milioni di tonn/anno) in pochi minuti a 100°C partendo da qualsiasi tipo di grasso.
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La produzione di sapone con lipasi (34 h a 30°C) oggi è effettuato soltanto da una ditta giapponese
(Miyoshi Yushi) che produce saponi usando lipasi da Candida rugosa.
A favore dell’utilizzo di lipasi sta il minor costo d’impianto, il miglior colore del sapone e la produzione
di glicerolo acquoso al 20% invece del diluitissimo glicerolo che si ottiene con il processo chimico
mediante vapore.
b) Trigliceridi transesterificati
Molte lipasi mostrano una specificità sn-1,3 e possono quindi essere usate in reazione di
transesterificazione delle posizioni 1 e 3 di un trigliceride naturale: bisogna però sopprimere la tendenza
degli acili a migrare dalla posizione 2 alle posizioni 1 e 3.
Tre tipi di trigliceridi modificati hanno oggi importanza commerciale:
1. Grassi con alta spalmabilità
2. Equivalenti del burro di cacao
3. Trigliceridi altamente digeribili
Grassi con alta spalmabilità
Il punto di fusione di un grasso è modulato sul numero di doppi legami presenti nelle catene alchiliche.
Nella produzione di margarine dopo il processo di idrogenazione , bisogna modificare la quantità di acidi
grassi saturi per renderle morbide e questo viene fatto con lipasi sn-1,3 e reazioni di transesterificazione.
Equivalenti del burro di cacao
Nel 1995 sono state importate dai paesi tropicali 100.000 tonnellate di burro di cacao. Il burro di cacao ha
un grande uso alimentare perché fonde alla temperatura del corpo umano e quindi ha un gradevole sapore
in bocca. I trigliceridi predominanti nel burro di cacao sono glicerolo con in posizione sn-2 acido oleico e
in posizione sn-1 e sn-3 acido stearico e palmitico (SOS o SOP).
Questi equivalenti del burro di cacao vengono preparati chimicamente o con lipasi attraverso reazioni di
transesterificazione di trigliceridi naturali come la frazione intermedia di olio di palma (POP) o di olio di
girasole con alto contenuto di oleico (OOO) con la tristearina (SSS).
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Poiché i gruppi idrossilici primari sono più reattivi del secondario, i trigliceridi del tipo SOP e SOS si
formano in maniera predominante. L’Unichema produce parecchie tonnellate di “grasso di cioccolata”
da olio di girasole OOO con acido stearico usando lipasi da Rhizomucor miehei.
Trigliceridi altamente digeribili
L’assorbimento dei trigliceridi nell’intestino tenue dipende dalla struttura del trigliceride. I trigliceridi
che contengono acido palmitico in posizione sn-2, come nel latte umano, sono assorbiit molto bene.
L’Unichema produce OPO, che viene utilizzato nella dieta dei neonati prematuri, da tripalmitina (PPP)
con acido oleico utilizzando lipasi da Rhizomucor miehei.
c) Monogliceridi
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Nel 1993 sono state prodotte 120.000 tonnellate di mono- e digliceridi via glicerolisi di trigliceridi. I
monogliceridi sono dei blandi emulsionanti e sono permessi come additivi alimentari.
L’applicazione industriale include l’emulsificazione dei cibi, dei cosmetici e dei farmaci. Dal punto di
vista economico questo processo enzimatico non è ancora conveniente perché comunque si ottengono
miscele di mono- e digliceridi.
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Applicazioni come detergenti Dopo il grande successo commerciale delle proteasi come additivi di detergenti, sono state studiate le le
lipasi per lo stesso scopo. Si sperava che le lipasi competessero con i tensioattivi chimici in modo da
poter cambiare la formulazione dei detersivi in modo da abbassare le temperature di lavaggio e diminuire
l’impatto ambientale. Un liquido di lavaggio standard contiene tensioattivi anionici e non-ionici, ossidanti
e agenti complessanti a pH di circa 10 e a temperature di 50°C che sono un ambiente ostile per gli
enzimi. D’altra parte l’utilizzo di lipasi portava ad un netto miglioramento delle prestazioni di lavaggio
soprattutto quando sui tessuti erano presenti macchie di rossetto.
La prima compagnia a commercializzare lipasi come detergenti è stata la Novo-Nordisk che ha prodotto
la LIPOLASE, una lipasi fungina ricombinante da Humicola lanuginosa espressa in Aspergillus oryzae.
Oggi le lipasi sono usate in molte formulazioni di detergenti. I maggiori prodotti commerciali sono nella
tabella.
Tabella. Lipasi usate in formulazioni di detergenti
Nome corrente Compagnia Origine pH ottimale T ottimale
Lipolase Novo-
Nordisk
Humicola lanuginosa, clonata ed espressa
in Aspergillus oryzae
10 40°C
Lipomax Gist-
Brocades
Pseudomonas pseudoalcaligenes,
riclonata ed espressa nello stesso
organismo
11 45°C
Lumafast Genencor Pseudomonas mendocina, clonata ed
espressa in Bacillus
10.5 40°C
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Applicazioni nell’industria alimentare Il caglio, isolato dallo stomaco dei ruminanti, è una miscela di enzimi tradizionalmente usata per la
preparazione di formaggio. Il componente attivo del caglio è la chimosina, un aspartato proteasi
coinvolta nella coagulazione del latte attraverso l’idrolisi della caseina: inoltre le lipasi ed le esterasi
contenute del caglio contribuiscono alla maturazione del formaggio.
Quando in America sono state proibite le importazioni di cagli dall’Europa, proteasi e lipasi sono state
usate largamente nella produzione di formaggi. La specificità delle lipasi per lunghezze di catena diversa,
hanno permesso di innalzare il profumo dei formaggi, di rendere più veloce la maturazione o preparare
“formaggi modificati enzimaticamente” (EMC).
Nella tabella vengono indicati alcuni esempi di lipasi utilizzate nella produzione di formaggi o
nell’accelerazione della loro maturazione.
Tabella. Esempi di lipasi utilizzate nella produzione di formaggi
FORMAGGIO LIPASI
Romano, domiati, feta Lipasi pregastriche da agnello o capra, Mucor
miehei
Mozzarella, parmigiano, provolone Lipasi pregastriche da agnello o capra
Fontina, ras, romi Mucor miehei
Cheddar, manchego, blue Aspergillus oryzae, Aspergillus niger
A seconda della specificità di lunghezza di catena delle lipasi, c’è la predominante liberazione di acidi
grassi a corta catena (C4-C6) che porta ad un odore intenso, o di acidi grassi a media o lunga catena
(>C12) che portano ad un sapore di sapone che vengono rapidamente metabolizzati dai consorzi
microbici che si trovano nei formaggi ad latri odori e sapori.
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Applicazioni come biocatalizzatori in sintesi organica Se vengono considerate solo le specifiche e limitate funzioni nel metabolismo, le lipasi dovrebbero avere
uno scarso interesse in chimica organica mentre si è finora visto che è uno degli enzimi più versatili per
poche e semplici ragioni:
A causa del grande dominio enzimatico richiesto per legare il gruppo acilico e il comportamento
non-definito delle catene aciliche, le lipasi possono ospitare una grande varietà di substrati
sintetici mantenendo ancora enantio- e regioselettività.
Le lipasi agiscono all’interfaccia acqua/lipide, che esibisce un’alta energia interfacciale. Per resistere
all’effetto denaturante dell’interfaccia, le lipasi hanno strutture stabili che possono sopravvivere
anche in presenza di un solvente organico.
L’energia libera dell’idrolisi degli acidi grassi è vicino a 0 kJ/mol. Come risultato, gli equilibri
termodinamici sono governati dalla concentrazione dei reagenti, e l’idrolisi di esteri in acqua
catalizzate da lipasi possono essere reversibili. In mezzi non-acquosi si possono avere
l’esterificazione e la transesterificazione.
L’acil-lipasi formato nel primo stadio della reazione enzimatica può essere formalmente considerato
un agente acilante. La grande specificità di substrato di questa classe di enzimi porta all’acilazione di
nucleofili diversi dai gruppi idrossilici, per esempio idroperossidi, ammine e tioli.
Il risultato è l’utilizzo delle lipasi in una grande varietà di reazioni. Un terzo circa delle biotrasformazioni
sono operate da lipasi.
Quando si usano composti polifunzionali, isomeri o substrati racemici o prostereogenici, le lipasi di
solito mostrano regio- e stereoselettività.
Così PPL che idrolizza i trigliceridi da la esterificazione regioselettiva di dioli e RML catalizza la
OH
OH
AcOEt
PPLOAc
OH
transesterificazione enantioselettiva in alte rese di biciclo eptenolo acetilato.
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H
H
AcO
HH
H
AcO
PhCOOMe
RMLHH
H
AcO
HH
H
PhCOO
H
Il solo grave inconveniente delle lipasi è la loro ristretta specificità verso il gruppo acilico degli esteri.
La maggior parte delle lipasi accettano gruppi alifatici lineari molto meglio che grossi gruppi aromatici.
Il fatto che le lipasi siano capaci di idrolizzare esteri diversi dai triacilgliceroli le rende molto utili
soprattutto nella risoluzione dei racemati.
Dal momento che i substrati naturali sono esteri di un alcol chirale, il glicerolo, con un acido achirale, ci
si aspetta che le lipasi siano più utili nell’idrolisi di esteri di alcoli chirali (struttura tipo I) più che di acidi
chirali (struttura tipo II).
Assumendo che la sequenza sia largo > piccolo l’enantiomero del tipo I preferito dalla lipasi avrà
configurazione R al centro alcolico ed é esattamente l’opposto di quello preferito dalla maggior parte
delle proteasi ed esterasi.
La richiesta sterica delle varie lipasi presenti in commercio è abbastanza differente. Mentre le lipasi
estratte da Aspergillus sono in grado di idrolizzare anche substrati piuttosto voluminosi e quindi
dimostrano scarsa selettività per quelli di dimensioni ridotte, le lipasi da Candida sp. sono meno
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vincolate. In questo ambito invece le lipasi estratte da Pseudomonas e da Mucor mostrano una elevata
selettività per substrati di dimensioni ridotte non accettano substrati voluminosi.
In un caso di racemato, le lipasi vengono sfruttate per ottenere la risoluzione cinetica della miscela fino
alla resa teorica del 50%. Inoltre le reazioni catalizzate da lipasi sono di solito reversibili e bisogna tenere
presente che la reazione inversa porta a racemizzazione. Così se l’acilazione di un alcol racemico
fornisce prevalentemente l’S-alcol e l’R-estere, la reazione inversa dell’alcol achirale ottenuto R3OH con
l’R estere porterà alla formazione dell’R-alcol.
R1 OHR2 OR3
O
R,S
R1 OH R3 OHR2 OR1
O
S R Questo porta ad una diminuzione di purezza enantiomerica. Si può ovviare a questo eliminando l’acqua
durante l’esterificazione o utilizzando un grande eccesso (solvente) di acil donatore.
Il metodo migliore finora usato è quello di utilizzare enolesteri ( di solito vinil o isopropenil). L’alcol
primario che si forma isomerizza a composto carbonilico che non può partecipare alla reazione inversa.
R1
OH
R1
OHO
O R2
lipasiR1
O
R1
OH
O
R2
O
racemo
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Le lipasi sono anche utilizzate nelle acilazioni regioselettive di gruppi alcolici come quelli del
cloramfenicolo e sobrerolo.
O2N
OH
OH
NHCHCl2
cloramfenicolo
HO
OH
sobrerolo
Vengono anche risolti gli stereoisomeri E/Z di un alcol allilico: nella miscela geraniolo (E) e nerolo (Z),
il geraniolo viene acetilato più velocemente del nerolo in un rapporto 4:1.
OH
OH
(E) geraniolo (Z) nerolo