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BIO10-329 Biofísica de ProteínasRegente: Célia R. Carlini
Atenção ! Use o modo “apresentação de slides” para ativar as animações
Proteomas e Espectrometria de Massa
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Principais componentes moleculares da bactéria Principais componentes moleculares da bactéria E. coliE. coli
Componentes Nº de moléculas diferentes Componentes Nº de moléculas diferentes % peso total% peso total
H2O 1 70Proteínas 3.000 15Ac. Nucléico 1 - DNA e 1000-RNA 7Carbohidratos 50 3Lipídeos 40 2Outros Íons - 12 3 Mol. Monoméricas - 500
A tabela mostra a percentagem em peso dos principais tipos de moléculas presentes em um célula simples, a bactéria Escherichia coli. Observe que as proteínas compõem o grupo mais diverso de moléculas.
Antes das técnicas de proteômica, para se obter informações sobre uma proteína em particular, era necessário separá-la de todas as outras que estão presentes na mesma fonte biológica.
Atualmente, é possível analisar-se um grande conjunto de proteínas ao mesmo tempo, e obter informações de uma proteína em particular sem separá-la das demais, graças às técnicas de espectrometria de massa acoplada com eletroforese 2D e/ou cromatografia líquida.
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• METABOLOMA - metabólitos
• GENOMA – DNA – 3,4 bilhões de nt
• SIGNALOSOMA – interações entre proteínas de uma via de sinalização
• TRANSCRIPTOMA – mRNA – 30 mil genes
• INTERACTOMA – interações entre proteínas
• PROTEOMA – Proteínas – 0,3-1,2 milhão proteínas
Homo sapiens
Atualmente, a capacidade de processamento de grandes volumes de informações e técnicas analíticas de alta resolução, entre as quais se destaca a espectometria de massas, permitem o estudo de células e
organismos inteiros – são os “OMAS.
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Estratégias experimentais• Do geral para o particular
– Analisar diversos proteomas em condições diferentes e identificar as diferenças
• Do particular para o geral
– Analisar uma única proteína e inferir suas funções no contexto do todo
Separação de proteínas nas amostras
Eletroforese bidimensional Cromatografia líquida (LC)
fragmentação
Determinação de massas para identificação
Peptide mass fingerprint Sequenciamento de novo
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL:• análise simultânea de até 5.000 proteínas
• permite comparação de todas as proteínas expressas por uma célula em dois momentos diferentes:
• análise do efeito de hormônios, • análise do efeito de drogas; • estados fisiológicos (desenvolvimento);• condições patológicas diversas (vírus, bactérias,etc.)
Eletroforese 2D de proteínas totais (proteoma) de células de
Escherichia coli
Proteínas com mesmo pI
Proteínas com a mesma massa
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Proteoma Comparativo ou Diferencial
condição condição
Sobreposição permite identificar diferenças nos padrões de bandas
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Sobreposição para análise das proteínas diferentemente expressas
Proteínas de cada condição são marcadas com tags fluorescentes diferentes para facilitar a visualização das diferenças
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Interatoma de C. elegans - proteínas individuais, representadas por círculos, agrupam-se
(indicado por linhas) conforme suas interações, formando uma rede que permite entender detalhes do controle das funções vitais do organismo.
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Identificação de Proteínas por MS: 10 passos
Espectro de massas dos fragmentos
virtuais
Tripsinização virtual
Banco de seqüências
(i.e. SwissProt)
Banda removida do
gel
Fragmentar com tripsina
Obter espectro de massas dos fragmentos
comparação
Ban
co d
e
esp
ect
ros
(1) (2) (3)
(4)
Espectro de massas
(5)(6)(7)
(8)
(9)
Identificação
(10)
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Peptide fingerprint ou impressão digital de peptídeos: proteínas são identificadas com base no tamanho dos
peptídeos resultantes da hidrólise com tripsina, comparando-se o espectro de massa real com o teórico,
obtido a partir dos bancos de dados de proteínas.
1529 1 478
1529.7 0.1 164
1529.73 0.01 25
1529.734 0.001 4
1529.7348 0.0001 2
Massa/carga Mass Tolerance (Da) # Hits in Database
Quanto maior a exatidão da medida de massas, maior a segurança na identificação da proteína (hits) que originou os peptídeos trípticos.
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Impressão digital de peptídeos: efeito de peptídeos múltiplos
1529.73 0.1 204
1529.73
1252.70
0.1 7
1529.73
1252.70
1833.88
0.1 1
Massa/carga m/z Mass Tolerance # Hits Database
A identificação de mais de um peptídeo triptíco de uma mesma proteína aumenta a confiabilidade da identificação dessa proteína por
espectrometria de massa.
2 peptídeos
3 peptídeos
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Thomson, 1897 – fez descoberta do elétron e inventou a espectrometria de massa, com a primeira medida da razão massa/carga de uma partícula.
Prêmio Nobel de Química, 2002 – foi para os inventores de métodos de ionização branda em espectrometria de massa, que permitiu análise de macromoléculas como proteínas
John B. Fenn (E.U.A.) - Electrospray (ESI) Koichi Tanaka (Japão) - Soft Laser Desorption (SLD).
Espectrometria de Massas
Espectrômetros de massas usam diferenças na razão massa-carga (m/z) de átomos ou moléculas ionizadas para separá-los, e/ou para determinar a composição e a estrutura química. Moléculas fragmentam-se de maneiras diferentes, sendo que a análise MS dos fragmentos permite sua caracterização estrutural.
O poder de separação de íons de um MS é descrito por sua resolução, que é definida como:
R = m / m sendo m, a massa do íon m, a diferença de massa entre dois picos no
espectro de massa
Ex: um MS com resolução de 1000 consegue separar íons com m/z de 100.0 e 100.1
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O espectro de massas de uma molécula consiste de uma família de picos, correspondendo a espécies carregadas que diferem de 1 unidade de massa e carga. A “deconvolução” desses picos, gerando o gráfico acima, dá a massa de uma molécula com precisão de 0,01%
A massa de uma molécula pode ser determinada a partir dos m/z de quaisquer dois picos vizinhos, que diferem por 1 carga (+) ou 1 próton:
(m/z)1 = M + n2x n2
M é a massa da moléculan2 é o número de cargasX é a diferença entre dois picos
(m/z)2 = M + (n2x +1)X n2 + 1
Temos duas equações e dois desconhecidos, M e n2, que podem ser calculados resolvendo-se esse sistema de equação:
n2 = (m/z)2 – X (m/z)2 – (m/z)1
M = n2 [(m/z)2 – X]
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MS de setor magnético:
Ionização: um feixe de elétrons de alta energia é utilizado para ejetar um elétron de uma molécula, formando um radical catiônico designado como íon molecular. Se o íon molecular for muito instável ele poderá se fragmentar em íons menores.
Analisador de massa: os íons moleculares são focalizados, formando um feixe, são acelerados através de um campo magnético, sendo defletidos (desviados) de acordo com as massas dos íons.
Analisadores de massa
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Analisadores de massa
Quadrupolo - consiste de quatro eletrodos (tubos metálicos), dois positivos e dois negtivos. A voltagem aplicada afeta a trajetória de íons passando através aos eletrodos. Para uma dada condição de corrente e voltagem, somente íons com uma dada razão massa/carga seguem o trajeto entre os tubos, e todos os outros são desviados para fora do quadrupolo. Obtem-se um espectro de massas variando-se gradualmente a corrente e voltagem para detectar-se todos os íons presentes.
MS quadrupolo de transmissão: consiste de um ionizador, lentes para acelerar e focalizar os íons para a entrada no quadrupolo, o quadrupolo com controles de V e A, um detector de íons. Todo o sistema necesssita de alto vácuo. Resolução: separa íons com diferenças de 0.3 m/z
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A equação que governa a separação de íons por TOF é:
m/z razão massa/carga do íonE potencial do pulso de extraçãos comprimento do setor em que E é aplicadod comprimento do tubo de vôot tempo de vôo do íon
A energia cinética de um íon é 0.5mv2, assim ions mais leves têm velocidade maior que os pesados e atingem o detector em menos tempo.
MS tempo de vôo: íons são acelerados a partir do ionizador até um tubo de vôo, sem campo elétrico ou magnético, onde se movem na direção do detector com uma velocidade proporcional a m/z. Ao contrário de outros MS, não há limite superior de detecção de m/z. O TOF-MS é afetado pela energia inicial dos íons antes de serem acelerados. Para corrigir, utiliza-se um conjunto de campos elétricos, o reflectron, que refocalizam os íons de mesma m/z com velocidades diferentes. É o mais preciso de todos os MS, permitindo análise elementar. Podem fazer até 100 espectros por segundo. Originalmente desenvolvido na década 1950, foi obscurecido pelos MS quadrupolos até o desenvolvimento do MALDI nos anos 1980.
MS-TOF
Analisadores de massa
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Espectrômetro de massa por tempo de vôo
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MS Íon-trap: formado por um quadrupolo tridimensional
Consiste de eletrodos cilíndricos simétricos, que formam dois “end caps” e um anel. Pode ser bastante pequeno, com somente 1-2 cm separando os eletrodos. A face interna de cada eletrodo tem uma superfície hiperbólica. Uma corrente e voltagem são aplicadas ao eletrodo em forma de anel, enquanto os “end caps” ficam aterrados. De maneira análogo ao MS quadrupolo linear, variando-se a voltagem ocorrem rápidas inversões na direção do campo, com os íons sendo alternadamente acelerados e desacelerados na direção axial e vice versa na direção radial, aprisionando-os. Aumentando-se a voltage, os íons assumem trajetórias instáveis e saem do trap, numa ordem de m/z crescente. Ainda que a resolução do MS ion trap seja mais baixa, apresenta como vantagem a pré-concentração do íon de interesse antes da análise.
Analisadores de massa
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Ionização por impacto de eléctrons (EI) As moléculas são vaporizadas e bombardeadas com elétrons de alta energia (70 eV), formando de íons moleculares (+) quando esses elétrons colidem com a molecula e deslocam eléctrons mais externas. Alguns desses íons são instáveis e de fragmentam em íons menores. Adequada para compostos não termolábeis.
Dessorpção por Laser assistida por matriz (Matrix Assisted Laser Desorption) (MALDI):
Técnica desenvolvida por Karas e Hillkamp em 1988, para ionização de peptídeos e proteínas, oligossacarídeos, glicolipídeos, nucleotídeos, etc. As amostras são co-cristalizadas com uma matriz (substância que absorve luz ultravioleta). Para proteínas, utiliza-se o ácido sinapínico, que absorve a radiação de 337 nm do laser de nitrogênio. A energia absorvida pela matriz é transferida para as moléculas, evitando sua decomposição por calor. Após a incidência do pulso de laser, uma grande quantidade de energia é absorvida pela matriz e há uma "explosão" com emissão de um gás com íons moleculares com uma carga.
Técnicas de Ionização
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Mass SpectrometryMatrix-assisted laser desorption ionizaton – time of flight
Maldi-Tof
Técnicas de Ionização
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Ionização por electronspray (ESI)
Método adequado para análise de moléculas termolábeis, como proteínas. O processo de ionização das moléculas ocorre pela nebulização de gotículas (nanolitros) de uma solução em um campo elétrico intenso, formando gotículas altamente carregadas. Quando o solvente evapora, formam-se íons moleculares de simples ou múltiplas cargas. Podem ser formados íons (-) ou (+), de acordo com o campo eléctrico aplicado. No modo positivo, observam-se adutos alcalinos (protonados) dos analitos e no modo negativo, os íons são desprotonados.
Técnicas de Ionização
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Sequenciamento de novo de proteínas por espectrometria de massas
Para sequenciar proteínas é preciso obter o espectro MS/MS de seus peptídeos.
Isso significa 2 etapas de MS acopladas. Depois de fazer o MS da molécula inteira, esta é fragmentada dentro do aparelho por colisão com gases.Os fragmentos são então separados e analisados por MS.
hélio ou argônio
A ligação peptídica se quebra formando fragmentos típicos, como os íons b e y mostrados na figura acima, que terão massas diferentes de acordo com o radical R de cada aminoácido.
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Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a fragmentação gera uma família de fragmentos peptídicos com massas que vão diferir uma da outra em valores que correspondem a um íon b, permitindo a identificação de cada aminoácido.
Sequenciamento de novo de proteínas
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A sequência obtida pela análise dos íons de uma série pode ser confirmada pela determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso do exemplo, os íons y.
Sequenciamento de novo de proteínas
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Espectro MS/MS do peptídeo tríptico
GLSDGEWQQVLNVWGK.
AA Codes Mono. AA Codes Mono.
Gly G 57.021464 Asp D 115.02694
Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858
Ser S 87.032029 Lys K 128.09496
Pro P 97.052764 Glu E 129.04259
Val V 99.068414 Met M 131.04048
Thr T 101.04768 His H 137.05891
Cys C 103.00919 Phe F 147.06841
Leu L 113.08406 Arg R 156.10111
Ile I 113.08406 CMC 161.01467
Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333
- - - Trp W 186.07931
Analiza-se o espectro buscando diferenças de m/z equivalentes a um resíduo de aminoácido, que permitem conhecer
a seqüência do peptídeos
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perda de amônia = 17 u.m.
perda de H2O = 18 u.m.perda de CO2= 28 u.m.
Sequenciamento de novo
Espectro MS/MS do peptídeo
GLSDGEWQQVLNVWGK.
Íons b e a
Íons y
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http://prospector.ucsf.edu/
http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/index.html
http://www.ionsource.com/