biodegradacion de plastico por rhyzopus sp
TRANSCRIPT
BIODEGRADACION DE PLASTICO POR Rhyzopus sp
María Teresa GONZALEZ CRUZ1 ; Gabriel CAMARENA GUTIERREZ2
Metodología Científica III; Unidad de Morfología y Función. FES Iztacala, UNAM.
Av. De los Barrios 1, 54090 México
RESUMEN
Los plásticos son polimeros extremadamente estables y no entran fácilmente en los
ciclos de degradación de la biosfera. El polietileno de alta densidad junto al polietileno
de baja densidad son los plásticos sintéticos más utilizados. Son lentos de degradar en
ambientes naturales, provocando graves problemas ambientales.
Recuperamos bolsas de plástico de un basurero, en el laboratorio separamos una
comunidad de hongos adherida a las bolsas, después se aisló un hongo del género
Rhyzopus. Se sembró Rhyzopus sp. sobre tiras de plástico de baja densidad en agar.
Bajo el microscópio se observó que el hongo crece sobre el plástico generando
cambios en el color, corrosión de la superficie, formación de agujeros o grietas en el
plástico. Nuestros resultados sugieren que los hongos del género Rhyzopus sp. forman
parte de una comunidad multicelular que puede ser más eficiente en la degradación de
plástico de baja densidad.
Palabras clave: biodregradación de plásticos, Rhyzopus, plástico
POLYETHILENE BIODEGRADATION BY Rhyzopus sp
ABSTRACTS
POLYETHILENE BIODEGRADATION BY Rhyzopus sp
ABSTRACTS
Plastics are polymers extremely stable and not easily fit into the cycles of degradation
of the biosphere. Both, the high density polyethylene and low density polyethylene are
the most widely used synthetic plastics. They are slow to degrade in natural
environments, causing severe environmental problems.
Plastic bags was recovered from a garbage dump, then we separate a fungi
community attached to the bags, then isolated a Rhyzopus fungi. Rhyzopus were
seeded over plastic of low density strips on agar. Under the microscope it was
observed that the fungus grows on the plastic creating changes in color, etching,
formation of holes or cracks in the plastic. Our results suggest that fungi of the genus
Rhyzopus sp. form a mutlcellular community that can be more efficient in the
degradation of low density plastics.
Key words: plastics biodegradation, Rhyzopus, plastic
INTRODUCCION
Se ha reconocido como un problema grave la presencia de plásticos y polímeros
sintéticos en las aguas residuales y en el suelo. Algunos tipos de plástico son
biodegradables, y sus mecanismos de degradación ahora empiezan a ser claros. La
biodegradación es el proceso mediante el cual las sustancias orgánicas se eliminan o
transforman por la acción de organismos vivos. El término biodegradación se utiliza a
menudo en relación con la ecología, la gestión de residuos, la remediación
(biorremediación) de los materiales de plástico (Göpferich, 1997). Los microorganismos
son responsables de la mayoría de la degradación de plásticos (Atagana, et al., 2004),
y los factores abióticos, como la fotodegradación o hidrólisis desempeñan un papel muy
secundario (Dietrich, 1990, Sasek, et al., 2003).
Durante la degradación, las exoenzimas de microorganismos descomponen polímeros
complejos a moléculas más pequeñas de cadenas cortas, por ejemplo, oligómeros,
dímeros y monómeros, que son lo suficientemente pequeños para pasar las
membranas semi-permeables de los hongos, y luego para ser utilizados como fuentes
de carbono y energía. Cuando los productos finales son el CO2, H2O, o CH4, la
degradación se llama mineralización (Frazer, 1994; Hamilton et al., 1995).
Se ha encontrado que el desarrollo de comunidades microbianas multicelulares
conocidas como biopelículas (biofilms), adheridas a las superficies de residuos
sintéticos, han resultado ser poderosos agentes degradantes en la naturaleza,
mostrando una mayor resistencia a los agentes antimicrobianos. También en la
mayoría de los ambientes naturales y artificiales, la mayoría de las poblaciones
microbianas forman biopelículas sobre superficies sólidas (Atkinson, 1974) y su
actividad metabólica es superior a la de los organismos individuales (Kirchman, 1982).
Por lo tanto, hay grandes posibilidades de desarrollo de una tecnología de biopelícula
para una mayor biodegradación de polímeros. En este estudio, nuestro objetivo fue
aislar e identificar hongos que degradan plástico, asociados con las bolsas de
polietileno que se utilizan en los supermercados y que son depositadas en los
basureros.
Material y Método
En un basurero al aire libre sobre el Río de los Remedios, Naucalapan, Estado de
México, se extrajeron 15 muestras de bolsas de plástico con biopelículas visibles,
enterradas a un metro de profundidad. Las muestras se guardaron en bolsas de papel y
fueron llevadas al laboratorio. Se lavaron las bolsas de plástico con agua destilada
estéril, quitando todos los residuos posibles, después las bolsas se sumergieron una
solución de cloramfenicol a 0.5mg/ml en agua destilada estéril, sin agitación por 60
minutos, para eliminar las bacterias presentes en la biopelícula. Posteriormente se
sumergieron las bolsas en agua destilada estéril por 30 minutos (Méndez R., 2007).
Se cortaron tiras de las bolsas de plástico alrededor de una biopelícula visible y se
sembraron en cajas de Petri con agar Czapeck- Dox a pH 5,0 al que se le adicionó
extracto de levadura al 3% y se incubaron a 30°C por 48 horas (Méndez R., 2007) .
Después se tomó una muestra del consorcio de hongos en la caja de Petri y se
realizaron diluciones seriadas y se sembraron en papa dextrosa pH 5 y se incubaron a
37 ºC por 48 horas (Koneman W. et al., 1985). Para la obtención de colonias puras de
hongos, se realizó la técnica de microcultivó en porta objetos (Koneman W. et al.,
1985). Se extrajeron círculos de medio agar glucosa Sabouraud, y se colocaron en el
centro de un porta objetos estéril; con una asa de siembra se tomó una muestra de la
caja con la mayor dilución y se depositó en la orilla del círculo de agar y se colocó un
cubreobjetos
Posteriormente el porta objetos se coloco dentro de una caja de Petri que contenía
papel filtro estéril y encima una varilla de vidrio, esto con la finalidad de mantener el
portaobjetos elevado sobre la superficie de la caja, se tapo la caja y se incubo a
temperatura ambiente por 5 días.
Al día cinco se observó el crecimiento de hongos en los portaobjetos y en los casos
donde se observaron dos o más tipos de hongos, se tomo una muestra de cada uno y
se sembraron en portaobjetos como se indicó antes. Este proceso se repitió hasta
observar el crecimiento de una colonia homogenea de hongo en el portaobjetos.
Generalmente los hongos se adhieren al cubreobjetos, el cual se retiró y se colocó
sobre un portaobjetos que tenía una gota de azúl de anilina en lactofenol, y los
montajes se preservaron sellando los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas
transparente. Con estas laminillas se observaron las características morfológicas en
un microscópio Nikon. La identificación de los hongos encontrados se realizo siguiendo
a Koneman et al., (1985) y Frutis, et al., (2009).
Actividad del hongo sobre el plástico.
Seleccionamos a Rhyzopus sp para observar su actividad sobre el polietileno de baja
densidad, seguimos a Kavelman y Kendrick (1978) con las siguientes modificaciones:
se cortaron cuadros de 1.0 por 1.0 cm y se eliminaron los que mostraron grietas o
perforaciones bajo el microscópio. Los cuadros se lavaron con HClO al 0.5% y se
lavaron tres veces con agua destilada estéril y después se sumergieron en
cloramfenicol a 5 mg/ml durante 30 minutos, después se lavaron 3 veces con agua
destilada estéril durante 20 minutos.
Los cuadros de plástico se colocaron en agar Czapeck sin sacarosa, el cual fue
preparado como sigue: 3.0 gr de nitrato de sodio, 1.0 gr de fosfato de potasio, 0.5 gr
de cloruro de potasio, 0.5gr de sulfato de magnesio, 0.01 gr de sulfato ferroso, 15.0 gr
de agar-agar, se ajustó el pH a 5.0 y otro a pH 7.0 y se diluyeron en 1000mL de agua .
Se esterilizó y vació a cjas de Petri (Koneman W. et al., 1985). Después de tres días
se colocaron los cuadros de plástico de baja densidad sobre el agar; se mantuvieron a
37 ºC por dos días, con la finalidad de asegurar que no había contaminación.
De los cultivos puros de hongos se tomó una muestra para diluirlos y alcanzar una
turbidez de 5 en la escala de MacFarland, con la finalidad de tener una concentración
conocida. De ésta dilución, con una asa de siembra se depositó a Rhyzopus en las
puntas del cuadro de plástico; las cajas se mantuvieron a 28 y 30 ºC durante 4
semanas. Las cajas se abrieron para observación en el microscopio. Se tomaron
fotografías a 20 X de las cajas control y en las que se sembró Rhyzopus sp.
Finalmente se separaron del agar los plásticos sobre los que creció Rhyzopus sp y con
cuidado se lavaron 5 veces con agua destilada, se montaron sobre portaobjetos y se
fotografiaron al microscopio.
RESULTADOS
La técnica de microcultivo permitió separar los hongos que formaban la biopelícula
como se ve en la figura 1. Rhyzopus sp. creció sobre el plástico de baja densidad; se
puede observar la actividad de biodegradación como cambios de color y perforaciones.
El crecimiento del hongo en la interfase plástico-agar se observa en la figura 2. El
plástico sobre agar, sin hongos, durante el periodo del experimento se observa en la
figura 2a. El crecimiento de Rhyzopus en la interfase agar-plástico se observa en la
figura 2b ; el crecimiento invasívo del hongo sobre el plástico se observa en la figura 2c
y 2d.
Los efectos de la actividad de biodegradación de Rhyzopus sp. sobre el plástico se
observan en la figura 3. El cambio de color en las orillas del plástico de baja densidad,
por efecto del crecimiento de Rhyzopus sp se observan en la figura 3a y 3b; se observa
la erosión del plástico provocado por el crecimiento de Rhyzopus sp. en la figura 3c y
3d; se observan perforaciones sobre el plástico en las zonas donde creció el hongo.
DISCUSIÓN
La evaluación de los cambios visibles en los plásticos es un método semicuantitativo
que se puede realizar en casi todas las pruebas. Los efectos utilizados para describir la
degradación incluyen corrosión de la superficie, la formación de agujeros o grietas, la
fragmentación, los cambios en el color o la formación de bio-películas en la superficie
como se ve en las figuras. Estos cambios no demuestran un proceso metabólico de
biodegradación, pero el parámetro de cambios en la observación puede ser utilizado
como un primer indicador de cualquier ataque microbiano. Este método se aplica
generalmente con microorganismos que pueden degradar un polímero determinado
(Nishida y Tokiwa, 1993; Abou-Zeid, 2001), pero también puede ser utilizado para
obtener resultados semi-cuantitativos (Ishigaki 2004).
El empleo de plásticos está aumentando en la vida del hombre y está aumentando la
presión sobre la capacidad para disponer de los plásticos de desecho; de manera que
la fabricación de plásticos biodegradables y la biodegradación de los plásticos de
desecho han incrementado su importancia (Ying y Yanful 2005). El papel de los hongos
en la biorremediación de suelos contaminados está siendo investigado (D’Annibale, et
al., 2006); mientras que poco se sabe de la ecología de las comunidades que forman
biopelículas y su actividad en la degradación de plásticos en los basureros.
Agradecimientos
El trabajo se realizó gracias al apoyo del programa PAPIME PE203609 de la
Universidad Nacional Autónoma de México
Referencias
1.- Méndez C. R. , Vergaray G., Béjar V. R., Cárdenas K. J.2007. Aislamiento y
caracterización de micromicetos biodegradadores de polietileno. Avances de las
ciencias biológicas en el Perú.Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM. Rev. peru.
biol. número especial 13(3): 203 - 205.
2.-Frutis M. I., Huidobro S. Ma. E. 2009. Micologia basica, manual teorico-practico.
FES-Istacala, UNAM. Mexico. 151 Pp.
3. Koneman, E.W., Allen, S.D., Janda, W.M., Schreckenberger, P.C. & Washington,
C.W. 1985. Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas Color. Editorial Médica
Panamericana.
D'Annibale A, F. Rosetto, V. Leonardi, F. Federici, y M. Petruccioli 2006. Role of
Autochthonous Filamentous Fungi in Bioremediation of a Soil Historically Contaminated
with Aromatic Hydrocarbons. Applied and Environmental Microbiology, 72:28-36
Abou-Zeid, 2001
Ishigaki T, Sugano W, Nakanishi A, Tateda M, Ike M, Masanori Fujita M. 2004. The
degradability of biodegradable plastics in aerobic and anaerobic waste landfill model
reactors Chemosphere 54: 225–233
Atagana, H. J. 2004. Biodegradation of phenol, o-cresol, m-cresol and p-cresol by
indigenous soil fungi in soil contaminated with cresolate. World J. Microbiol. Biotechnol.
20:851-858.
Atkinson, B. y Fowler, H. W., 1974. Adv. Biochem. Eng., 1974, 3, 224–277.
Dietrich, D. M., and R. T. Lamar. 1990. Selective medium for isolating Phanerochaete
chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol.56:3088-3092
Frazer, 1994;
Hamilton et al., 1995).
Frutis, et al., (2009).
Göpferich, 1997
Kirchman, D. y Mitchell, R., 1982. Appl. Environ. Microbiol., , 42, 200–209.
Koneman W. et al., 1985
Méndez R., 2007
Nishida y Tokiwa, 1993
Sasek, V., J. A. Glaser, and P. Baveye. 2003. The utilization of bioremediation to
reduce soil contamination: problems and solution. Kluwer Academic Publishers,
Amsterdam, The Netherlands.
Ying Zheng y Ernest K. Yanful 2005 A Review of Plastic Waste Biodegradation. Critical
Reviews in Biotechnology, 25:243–250, 2005
Fig. 1. Hongos creciento en microcultivo para aislar los hongos que forman la
biopelícula.
Fig. 2. Se observa el crecimiento de Rhyzopus sp. sobre el plástico de baja densidad.
2a Plástico de baja densidad, sin hongos, sobre agar. 2b. la flecha indica el
crecimiento de Rhyzopus en la interfase plástico-agar. 2c y 2d se observa la formación
de una biopelícula sobre el plástico.
Figura 3. muestra los efectos de la actividad de biodegradación de Rhyzopus sp. sobre
el plástico de baja densidad. 3a y 3b Cambio de color en las orillas del plástico de baja
densidad donde se sembró a Rhyzopus. 3c y 3d se observa la erosión del plástico
provocado por el crecimiento de Rhyzopus sp., se observan perforaciones sobre el
plástico en las zonas donde creció el hongo.
Plástico: control medio agar Czapek-Dox sin sacarosa.
