bioenergética e oximetria antonio · pdf fileoximetria e a bioenergética ......
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Oximetria e a Bioenergética Mitocondrial
Instituto de Bioquímica Medica - IBqM Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ.
Programa de Biofísica e Bioquímica Celular.
Laboratório de Bioenergética e Fisiologia Mitocondrial Email: [email protected]
C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + Calor “A respiração é portanto uma combustão, muito lenta é verdade, mas de qualquer forma perfeitamente semelhante à combustão do carvão ou de qualquer outra matéria orgânica. Ela ocorre no interior dos pulmões sem produzir luz perceptível, porque a matéria liberada pelo fogo é imediatamente absorvida pela umidade dos tecidos”. (Lavoisier, 1787, vol. II, 331)
Lavoisier (Tratado de Quimica Elementar, 1789)
Lei da conservação das massas:
“Matéria não se cria nem se destroi, se transforma”
O Respirômetro de Warburg
Otto Warburg
A vida se iniciou na água, e ela é fundamental para a vida na Terra atual.
A quantidade de oxigênio dissolvido na água seria então comparável a presente na Atm atual?
4 3 2 1 00
5
10
15
20
25 Dinossauros
1o metazoário ?
Explosão do Cambriano (animais e plantas)
Oxi
gê
nio
atm
osf
éric
o (
%)
Billhões de anos (passado)
Cianobactérias
Origem da vida na Terra?
Pre- cambriano
Baixo oxigênio é normóxia "Oxigênio molecular compreende cerca de 20% da nossa atmosfera, mas menos de 5% deste montante é dissolvido em equilíbrio na água. Como conseqüência dessa baixa solubilidade em água do mar, em água doce e em fluidos corporais aquosa, as células vivas são submetidos a um problema universal da disponibilidade de oxigênio." E. Gnaiger (1983) in Polarographic Oxygen Sensors. Aquatic and Physiological Applications. Springer, Berlin, Heidelberg, New York. “Os níveis de oxigênio atmosférico eram provavelmente 0,1% dos níveis atuais quando a mitocôndria se associou com as células eucarióticas cedo durante a evolução. Tais condições de baixo oxigênio persistem em ambientes extremos, e pressões de oxigênio tão baixas como 0,3-0,4 kPa (2-3 mmHg) são observados no microambiente intracelular de mitocôndrias nos tecidos sob normóxia. Mesmo assim, em estudos típicos com mitocôndrias isoladas, essas organelas são artificialmente expostas à alta pressão parcial de oxigênio na saturação do ar (cerca de 20 kPa), apesar do fato de que esta condição ser efetivamente uma hiperóxia rara em condições fisiológicas, e favorece o estresse oxidativo" Gnaiger E, Méndez G, Hand SC (2000) High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11080-11085.
Cascata respiratória dos
organismos
Sistema de Transporte de eléctrons
PO2≅ 21 kPa
PO2≅ 13 kPa
PO2≅ 10 kPa
PO2≅ 6 kPa
PO2≅ 0.3 kPa (cytoplasm)
PO2 50%≅ 0.05 kPa (cytochrome oxidase)
O eletrodo do tipo Clark consiste de uma Pt-(A) e uma referência Ag / AgCl-eletrodo (B) coberta por uma película de meia-KCl saturado electrólitos (C) dentro de uma membrana de Teflon (D), que é realizada no local por um anel de borracha (E). A tensão de alimentação (F) eo instrumento eletrônico para a medição da corrente de saída é mostrada (G).
Dr. Leland Clark
Clark, L.C. et al. (1953) J. Appl. Physiol. 6. 189-193
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Determinação da PO2 • A concentração de oxigênio num líquido pode ser medida pela
técnica da polarografia. Faz-se a corrente elétrica fluir entre um pequeno eletrodo negativo (-) e a solução. Caso a voltagem do eletrodo apresente uma diferença maior que -0,6 volt em relação à voltagem da solução, o oxigênio irá reagir com o eletrodo.
• Além disso, a taxa de fluxo da corrente pelo eletrodo será
diretamente proporcional à concentração do oxigênio (e, portanto, também à PO2).
O oxigênio dissolvido é reduzido no catôdo: O2 + 4H+ + 4e- → 2 H2O A prata é oxidada no anôdo: 4 Ag + 4 Cl- → 4AgCl + 4e-
A corrente gerada é proporcional a concentração de O2
The Clark or oxygen electrode.
Clark, L.C. et al. (1953) J. Appl. Physiol. 6. 189-193
H+ H+ H+ H+
I III IV V
ADP+Pi
ATP
II
NADH NAD+
SUCCINATE FUMARATE
O2 H2O
H+ H+ H+
4 H+
III IV V
ADP+Pi
ATP
II
NADH NAD+
SUCCINATO FUMARATO 2 O2 2 H2O
Matriz
Espaço Intermembranas
Cyt C
UbQH2
UbQ
UbQH2
UbQ
I
2 e-
4 e-
Potencial Elétrico ΔΨ
(Matriz negativa)
Síntese de ATP Impulsionada pela
Força Proton-motriz
(Δp = ΔΨ - Z ΔpH)
Potencial Químico ΔpH
(Matriz alcalina)
H+ H+ H+ H+
I III IV V
ADP+Pi
ATP
II
NADH NAD+
SUCCINATE FUMARATE
O2 H2O
H+ H+ H+ H+
NADH NAD+
O2 H2O
Matriz
Espaço Intermembranas
Cyt C
UbQH2 UbQ
UbQH2 UbQ
H+
H+ H+
+ +
(+)
+
-
(-)
-
+ +
SUCCINATO FUMARATO
O2•- H2O2
H2O + O2 SOD Cat
Alto ΔΨm
2 e- 2 e-
2 e-
O2
Δp
ATP
ADP + Pi
H2O + CO2 + Heat + NAD+ + FAD
Oxidative Phosphorylation: Coupling
CHO + NADH + FADH2
O2 Δp
ATP
ADP + Pi H2O + CO2 + Heat + NAD+ + FAD
Oxidative Phosphorylation: Inhibition of ATP synthesis (Oligomycin) – proton leak
CHO + NADH + FADH2
X O2
Δp
ATP
ADP + Pi
Oxidative Phosphorylation: Uncoupling (FCCP) – ETS capacity
CHO + NADH + FADH2
H2O + CO2 + Heat + NAD+ + FAD
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Electron Transport System
O2
aa3
H+
bc1
H+
Q c
F 1
H+ H+
II
S F
I
H+
NADH ADP ATP
III IV
A. Definition of ETS capacity. B. Measurement in mitochondria and
permeabilized cells. C. Measurement in intact cells.
Which metabolic state represents electron transport capacity?
Oxidative Phosphorylation in Top Gear
Gold standard to assess maximum aerobic capacity in cultured cells: → Uncoupled flux
• Villani, Attardi (1997) PNAS 94: 1166
Res
pira
tion [p
mol·s
-1·1
0-6 ]
0
90
180
360
270
0 20 40 60 80 Time [min]
Routine Ama
Oligo-mycin
FCCP Rot
But intact cells do not have uncoupled mitochondria !
Range [h:min]: 1:301:301:151:000:450:300:150:00
O2
Con
cent
ratio
n (A
) [nm
ol/m
l] 250
200
150
100
50
0 O2
Flow
per
cel
ls (A
) [pm
ol/(s
*Mill
)]200
160
120
80
40
0
oligo oligo FCCP FCCP FCCP FCCP FCCP FCCPABERTURA AntiA AntiA cianeto
Range [h:min]: 1:301:301:151:000:450:300:15
O2
Con
cent
ratio
n (B
) [nm
ol/m
l] 200
160
120
80
40
0 O2
Flow
per
cel
ls (B
) [pm
ol/(s
*Mill
)]200
160
120
80
40
0
abertura Oligo oligo FCCP FCCP FCCP FCCP FCCP FCCP AntiA AntiA
Fibroblastos
iPS
Paulsen, B.; Santos, R e colaboradores Cell Transplantation 2011 in press.
Range [h:min]: 1:301:301:151:000:450:300:150:00
O2
Con
cent
ratio
n (A
) [nm
ol/m
l] 250
200
150
100
50
0 O2
Flow
per
cel
ls (A
) [pm
ol/(s
*Mill
)]200
160
120
80
40
0
oligo oligo FCCP FCCP FCCP FCCP FCCP FCCPABERTURA AntiA AntiA cianeto
Range [h:min]: 1:301:301:151:000:450:300:15
O2
Con
cent
ratio
n (B
) [nm
ol/m
l] 200
160
120
80
40
0 O2
Flow
per
cel
ls (B
) [pm
ol/(s
*Mill
)]50
40
30
20
10
0
abertura Oligo oligo FCCP FCCP FCCP FCCP FCCP FCCP AntiA AntiA
Fibroblastos
iPS 4x
Paulsen, B.; Santos, R e colaboradores Cell Transplantation 2011 in press.
1:10 1:00 0:50 0:40 0:30 0:20
O2 C
once
ntra
tion 200
160
120
80
40
0 O2 F
low
per
cel
ls 250
200
150
100
50
0
Time [h:min] endogen.
ROUTINE
+c
c
Cytochrome c test: Intact mitochondrial outer membrane
+uncoupler
F F
ETS
CI CI
+ADP
ADP
OXPHOS
GMN
GM
+Dig
CI
LEAK
Permeab.
CI Substrates
High-Resolution Respirometry in Permeabilized Cells
1:10 1:00 0:50 0:40 0:30 0:20
O2 C
once
ntra
tion 200
160
120
80
40
0 O2 F
low
per
cel
ls 250
200
150
100
50
0
Time [h:min]
CeR
endogen.
ROUTINE
CI
+D
D
OXPHOS
+c
c
CI+II
+S
S1
S
F
CII
+Rot
Rot
+u
F F
ETS
CI
High-Resolution Respirometry in Permeabilized Cells
Am
a
+Ama GMN
GM
+Dig
CI
LEAK
PC
ETS capacity with CI+II substrates
O2 c
once
ntra
tion
(50
nmol
/mL)
20 minutes
HepG2 Cells incubated with 150 µM 3BrPA by 30 min.
Control HepG2 Cells
FCCP
ADP, 50µΜSuc
oligo
Pyr/Mal ADP, 50µΜRot
750
500250
Oligo
ADP, 50µΜ
Succ
ADP, 50µΜRot
Pyr/Mal
10 min.
O2 F
low
10 p
mol
s/se
c.m
illio
n of
cel
ls FCCP, nM
JO2 = -dCo2/dt . 103 – (CO2.b0 + a0)
Pyr/Mal
+ADP
St4(PM)
Rot
Succ+
ADP
St4(Suc
)Olig
oFC
CP
0
20
40
60
80
100
120
*
Oxy
gen
Flow
(pm
ol/s
ec.m
illio
n ce
lls)
No Glucose No Glucose + 150 µM 3-BrPA
Pyr/Mal
+ADP
St4(PM)
Rot
Succ+
ADP
St4(Suc
)Olig
oFC
CP
0
20
40
60
80
100
120
*
*
*
Glucose Glucose + 150 µM 3-BrPA
*
Glutamine Glucose
X X X H+
Complex I Complex II Complex III Complex IV Complex V Complex I Complex II Complex III Complex VI Complex V
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Control
Control
NaB
NaB
Seahorse XF Cell Bioenergetics
XF96 Extracellular Flux Analyzer for 96-well microplate assays.
XF24 Extracellular Flux Analyzer for 24-well microplate assays.
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5
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O primeiro trabalho no Brasil a fazer uma análise Metabolômica.
● 30 min. ○ 60 min. ■ 90 min. Δ 180 min.
X Antimycin A
150 µM 3-BrPA 37oC
60 min.
○ Controle ● 3-BrPA
Δ Controle ▲3-BrPA
Glicose (Glicose + Glutamina)
Sem Glicose (Glutamina)
Remoção de meio DEMEN com soro
em uso .
Adição de DEMEN com 150 µM 3-BrPA e
5 mM glicose C13 37oC
60 min.
Adição de DEMEN controle
5 mM glicose C13 37oC
60 min.
HepG2 intactas adicionadas
ao tubo de RMN 400 MHz
3-BrPA
HepG2 intactas adicionadas
ao tubo de RMN 400 MHz
Controle
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3-BrPA
Controle
NMR spectrum of 13C-Glucose metabolism in intact HepG2 cells
1- F1,6BP 2- R5P 3- G6P 4- GA3P 5- DHAP 6- F6P 7- G1P 8- 6PGluconato 9- 2PG 10- L-Asp 11- L-Asn 12- L-Ala 13- L-Glu 14- Lactato 15- 2-acetolactato
http://www.hmdb.ca
Human Metabolome Database KEGG PATHWAY Database Wiring diagrams of molecular interactions, reactions, and relations
KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes A grand challenge in the post-genomic era is a complete computer representation of the cell, the organism, and the biosphere, which will enable computational prediction of higher-level complexity of cellular processes and organism behaviors from genomic and molecular information. Towards this end we have been developing a bioinformatics resource named KEGG as part of the research projects of the Kanehisa Laboratories in the Bioinformatics Center of Kyoto University and the Human Genome Center of the University of Tokyo.
http://www.genome.jp/kegg/
3-BrPA
3-BrPA
Glucose
GLUT 1 or 9
3-BrPA
Controle
1- F1,6BP 2- R5P 3- G6P 4- GA3P 5- DHAP 6- F6P 7- G1P 8- 6PGluconato 9- 2PG 10- L-Asp 11- L-Asn 12- L-Ala 13- L-Glu 14- Lactato 15- 2-acetolactato
- Dra. Ana Paula Pereira da Silva - UFRRJ - Dra.Tatiana EL-Bacha - IBqM - Nattascha Kyaw - IBqM - Reinaldo Sousa dos Santos - IBqM - Dr Wagner Seixas Da-Silva - IBqM - Dr Fabio C. L. Almeida – IBqM CNRMN - Dr Andrea T. Da Poian – IBqM
- Dr Nívea Dias Amoedo - IBqM - Mariana Figueiredo Rodrigues - IBqM - Paula Pezzuto - IBqM - Rodrigo Madeiro da Costa - IBqM - Franklin David Rumjanek – IBqM
- Bruna da Silveira Paulsen - LaNCE - Renata de Moraes Maciel - LaNCE - Mariana Souza da Silveira - IBFCCF - Stevens Kastrup Rehen – LaNCE.
- CNPq - FAPERJ - INCTEN
Agradecimentos