biología molecular en asistencia e investigación
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Biología Molecular en asistencia e investigación. Conferència donada per Sílvia Pairet als alumnes de 2on de CFGS de Laboratori a l’IES Pedraforca (26-11-09). Hospital del Mar. PRBB. Y después del CFGS, ¿Qué?. Tenemos varias opciones: - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Biología Molecular en asistencia e investigación
PRBBHospital
del Mar
Conferència donada per Sílvia Pairet als alumnes de 2on de CFGS de Laboratori a l’IES Pedraforca (26-11-09)
Y después del CFGS, ¿Qué?
Tenemos varias opciones:
- Seguir estudiando una carrera: enfermería, fisioterapia, biología, biotecnología, medicina, farmacia...
- Estudiar otro ciclo formativo: anatomía patológica
- Ponernos manos a la obra :
Dónde podemos trabajar...
• Laboratorios Privados
Tarea asistencial
• Centros Hospitalarios :
Diagnóstico y seguimiento
• Laboratorios de investigación :
Investigación básica conocer los fundamentos
Investigación traslacional práctica clínica
3 tipos de técnicos:
1) El técnico que se especializa
2) El técnico ayuda de manera general en el
laboratorio
3) El técnico asociado a un proyecto
El técnico de laboratorio
Esquema
• Bases de la Biología Molecular
• Biología del Cáncer
• El laboratorio de Biología Molecular
• Fundamentos de las técnicas
Bases de la Biología MolecularBiología del CáncerEl laboratorio de Biología MolecularFundamentos de las técnicas
Bases de la biología molecular
El genoma
Los cromosomas están formados por ADN que contiene toda la información genética de una célula.Los genes determinan nuestro código genético.
El genotipo
• La secuencia de nucleótidos constituye la cadena de ADN y el conjunto de genes de un organismo
• Es el contenido genético de un individuo en forma de ADN
El fenotipo
• Las características físicas de cada persona
vienen determinadas por nuestro código genético
• El Fenotipo es la
expresión del
Genotipo
de cada persona
individualmente
Un repaso a la molécula de ADN
Azúcar+
Base Nitrogenada
+ Grupo fosfato
Codón
Proteína
CODÓN
AMINOÁCIDO
¿Qué información nos están dando los genes?
Sehr angenehm.
Es tut mir leid.
Al formar una frase lo que hacemos es enlazar un conjunto de palabras :
Para poder descifrar la información que contiene necesitaremos traducirlo. En el código genético, este paso sería conocido como:
Dogma Central de la Biología
ADN
Síntesis de proteínas
Una enzima sintetiza un ARNm
que mantiene la información de
la secuencia de ADN para formar
una proteína.
Dicha proteína está
expresando la información
contenida en los genes de una
célula determinada
ARNpolimerasa
La insulina es el resultado de la información codificada
que contenía el ADN.
Sin la correcta intervención
de todos estos componentes,
no tendríamos la Insulina
como expresión de
la información genética.
Expresión genética
Todas las células de un individuo tienen los mismos genes
99%homología
Fenotípicamente, son muy diferentes…Porqué?
Es la combinación de qué genes están activos y cuáles inactivos lo que hace que cada célula sea diferente
Expresión génica
Expresión
Genes inactivos
Biología del cancer
Bases de la Biología Molecular Biología del Cáncer El laboratorio de Biología
Molecular Fundamentos de las técnicas
Enfermedad genética producida por la mutación de determinados genes en una célula determinada.
Cáncer: Un problema de frenos y acelerador
2 tipos de genes implicados en el cáncer...
Oncogenes
Genes supresoresde tumores
Mutación
Alteración de la secuencia del ADN original. Esto provoca cambios en la información genética del individuo.
Oncogenes
• En condiciones normales hacen
que la célula avance en su ciclo y
se divida.
• Si están hiperactivados debido a
una mutación, la célula se
reproduce sin control.
Aceleradores
• Cuando estos genes se expresan más de la cuenta,
pueden causar cáncer.
Genes supresores de tumores
• Regulan el ciclo de división
celular, arreglan anomalías ADN y
si la célula tiene una lesión en el
ADN apoptosis
• Mutados, la célula es incapaz de
suicidarse y continúa
dividiéndose de manera
defectuosa
Frenos
• Cuando estos genes no se expresan, pueden causar
cáncer
El laboratorio de biología molecular
Perspectivas de futuro
Bases de la Biología Molecular
Biología del Cancer
El laboratorio de Biología Molecular
Fundamentos de las técnicas
Estudio de los procesos que se
desarrollan en los seres vivos desde
un punto de vista molecular.
Biología molecular:
OBJETIVO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR (I)
Conocer:
Cómo se regulan los genes
Cómo funcionan las proteínas resultantes
Cómo se alteran en situaciones patológicas específicas
Translocación
OBJETIVO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR (II)
Para hacer:
Un diagnóstico adecuado
Acciones terapéuticas curativas(tratamientos dirigidos a la alteración molecular)
Permitir el diseño de pautas preventivas(seguimiento del paciente)
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08-may-0631-jul-06
30-abr-07
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13-feb-06
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06-nov-06
17-dic-07
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0,01
0,1
1
10
100
Rat
io B
CR
-AB
L/G
US
(%
)
Diagnóstico de la LMC (I)
Esta enfermedad presenta una alteración molecular debido a la translocación de 2 cromosomas, que dan lugar al cromosoma Filadelfia.
El gen ABL es un proto-oncogén que actúa de forma normal como un acelerador en la célula.
Diagnóstico de la LMC (II)
La proteína BCR-ABL actúa como acelerador del ciclo
celular haciendo que las células se dividan de forma
descontrolada e inhibiendo la reparación por daño al ADN
Translocación
Si se detecta la presencia de esta alteración molecular podemos corroborar el diagnóstico con la ayuda de otros criterios
Activación del gen
Fármaco que impide la activación del gen
Diagnóstico de la LMC (III)
Existen tratamientos con fármacos que van dirigidos a bloquear la proteína que se activa por la fusión de este gen BCR-ABL, y de esta manera evitar la proliferación descontrolada
Diagnóstico de la LMC (IV)
La pauta preventiva se realizaría comprobando la cantidad de copias del gen durante el seguimiento del paciente para determinar si este gen sigue expresándose o no.
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)
Gráfica del seguimiento del paciente
Técnicas de biología molecular
Bases de la Biología Molecular Biología del cáncer El laboratorio de Biología Molecular Fundamentos de las técnicas de Biología Molecular
Técnicas Moleculares para el Diagnóstico de la LMC
1. Extracción de ácidos nucleicos2. Cuantificación 3. RT-PCR 4. PCR Convencional5. Secuenciación Directa 6. PCR Cuantitativa
Recepción de muestras
• Recepción de muestras : SP, MO, Tejido, Citologías
• Extracción de ADN y/o ARN
• Valoración de la calidad
• Diferentes técnicas en función de los estudios relacionados con las diferentes neoplasias
Empieza el juego...
Densidad
pH
1. Separación de las células que nos interesan
mediante centrifugación por Gradientes de densidad.
Separación de células
Los componentes de la mezcla se reparten en diferentes fases en función de la densidad y de la afinidad por los componentes químicos que utilizamos
Obtención de los ácidos nucleicos
2. Desnaturalización de los ácidos nucleicos. Se provoca la ruptura de la pared celular para que el ADN quede libre en la mezcla
3. Purificación del resto de componentes mediante centrifugación
Precipitación de los ácidos nucleicos
3. Precipitación de los ácidos nucleicos para formar un pellet celular que resuspenderemos en un tampón adecuado y a una concentración óptima
Valoración calidad/pureza
El Espectrofotómetro mide la absorbancia de la luz a través
de la muestra a una longitud de onda determinada
RATIO: Abs 260/280
Concentración (ng)
de ácidos nucleicos
Restos de proteínas y alcoholes
Técnicas Moleculares para el Diagnóstico de la LMC
1. Extracción de ácidos nucleicos2. Cuantificación 3. RT-PCR 4. PCR Convencional5. Secuenciación Directa 6. PCR Cuantitativa
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
+ =
Es como hacer un caldo...
1. DNA MOLDE. Segmento de ADN de doble cadena que contiene la secuencia diana que queremos amplificar
2. PRIMERS. Pequeños fragmentos de ADN de cadena simple. Complementarios a los extremos flanqueantes del ADN molde. Marcarán el punto de partida y delimitarán la zona de ADN a amplificar
PCR (I)
4. DNA POLIMERASA. (Taq Polimerasa) Enzima que produce las copias de ADN
3. dNTPs. Suplemento de nucleótidos. Sustrato que usará la Polimerasa cuando produzca el nuevo ADN
5. Tampón y MgCl2 . Adición de sales y un tampón que mantenga el pH adecuado en la mezcla
PCR (II)
A C G T
Veamos que pasa dentro del caldo...
Ciclos de amplificación
La muestra se lleva a una temperatura de 94-96°C para que se rompan los puentes de hidrógeno y las dos cadenas del ADN molde se separen
Desnaturalización
Los primers o cebadores que hemos añadido en la muestra actúan a una temperatura de entre 50 y 70ºC para unirse uno por cada extremo a las cadenas de ADN molde de manera complementaria. De esta manera delimitarán la zona a amplificar
Hibridación
La ADN polimerasa actúa a 72ºC para que se realice
la extensión de las cadenas de ADN por
complementariedad de bases entre los dNTPs y la
cadena molde
Extensión
Y esto es lo que ocurre...
En 32 ciclos, al 100% de eficiencia, se crean más de mil millones de copias del
ADN de interés!
En 32 ciclos, al 100% de eficiencia, se crean más de mil millones de copias del
ADN de interés!
Original DNA target region
Thermal cycle
Identificación de bandas
Para visualizar el producto
de la PCR utilizamos la
electroforesis en gel de
agarosa. Como conocemos
el tamaño del gen a
estudiar, visualmente
podemos observar si está o
no presente en la muestra.
PCR enTiempo Real
Es una variante de la PCR que permite cuantificar el
producto de la amplificación.
Añadimos un fluorocromo que emitirá una fluorescencia con
cada copia del ADN. Esto nos indicará si el gen está presente
o no en la muestra, y de ser positivo, si se encuentra en mayor
o menor cantidad
PCR+
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L/G
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)
MUCHA SUERTE!!