biologie de la réparation de l'os et du cartilage ... · médecine régénératrice la...
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Cellules souches mésenchymateuses et thérapie cellulaire du cartilage
Marie Maumus
IRMB - Inserm U1183, Equipe 1, Montpellier, France
DU Médecine Régénératrice – Montpellier – 26/11/2015
Médecine régénératrice
La médecine régénératrice est une stratégie thérapeutique visant à réparer, renouveler, restaurer ou régénérer des cellules, un tissu ou un organe malade grâce à des cellules souches qui vont se différencier ou qui vont induire une réponse adaptative de l’organisme.
Médecine régénératrice
Maladies cardiovasculaires
Maladies neurodégénératrices
Maladies musculaires
Hématologie
Peau
Cancers
Rétine - Cornée
Maladies autoimmunes
Maladies Ostéo-articulaires
Pancréas
Foie
Réparer Renouveler Restaurer Régénérer
La base de cette médecine est la thérapie cellulaire → intérêt des cellules souches.
Cellules souches
Une cellule souche est une cellule indifférenciée.
Qu’est-ce qu’une cellule souche?
Son auto-renouvellement qui est la capacité pour une cellule de proliférer indéfiniment tout en maintenant un état indifférencié.
Ses potentialités de différenciation qui sont les capacités pour une cellule de se différencier en un ou plusieurs types de cellules matures.
totipotence pluripotence multipotence unipotence progéniteur cellule
différenciée
Potentialités
Capacités d’auto-renouvellement
Spécialisation
Les différents types de cellules souches
Les cellules souches adultes
Renouvellement tissulaire
L’œuf fécondé = zygote
2 grands types de cellules souches
Embryon Annexes extra-embryonnaires
Thérapie cellulaire
Cellules totipotentes - Cellules rares, localisées dans certains organes
- Cellules multi- ou uni-potentes
Cellules souches embryonniques (ES) Pluripotentes
Cellules souches pluripotentes induites (iPS)
Renouvellement tissulaire en conditions physiologiques
En situation physiologique: - Un corps humain perd plus de 20 milliards de cellules par jour
Fuchs E, 2009
Épiderme - Poil/cheveux Barker N, 2008
Cellules souches de l’épiderme et du follicule pileux
Épithélium intestinal Watt FM, 2002
Cellules souches intestinales
Orkin SH and Zon LI, 2008 Cellules sanguines – Moelle osseuse
Cellules souches hématopoïétiques
- Certains organes se renouvellent peu ou pas
- D’autres sont en renouvellement constant
Cœur
Cerveau
Reins
Et le cartilage articulaire ???
Le cartilage articulaire - structure
Fin des os longs
Zone calcifiée (5-10%)
Zone superficielle (5-10%)
Zone moyenne (40-60%)
Zone profonde (30-40%)
Os souschondral
Cellularité Protéoglycans Collagène
Collagène type II
Comp
Intégrine
Fibronectine
Aggrecan
Hyaluronane
Link
Chondrocyte
Aspect morphologique du cartilage
Chondrocytes: cellules matures, différenciées, capacité limitée de proliférer (cellules quiescentes)
Différents types de lésions du cartilage
Défauts focaux
Essentiellement post-traumatiques - 20% de toutes les procédures
arthroscopiques (genou: 5-10% de patients jeunes et
plus de 60% de patients vieux)
Zones larges
Associées avec les maladies rhumastismales - Arthrite rhumatoïde:
0,3% de la population totale - Arthrose: 35% des femmes et
20% des hommes au dessus de 65 ans
Peu ou pas de réparation tissulaire par les chondrocytes et/ou les cellules souches endogènes → intérêt de l’utilisation des cellules souches mésenchymateuses en médecine régénératrice du cartilage !
Caractéristiques des MSCs Différentes sources
Propriétés
- Adhérentes au plastique
Les cellules souches mésenchymateuses = MSC Caractéristiques
CD34 CD106
CD90
HLA-DR
CD105
CD14 CD45
Counts
CD31
CD73 CD13
CD11b
Counts
C
ou
nts
Counts
C
ou
nts
Counts
Counts
C
ou
nts
C
ounts
Counts
C
ou
nts
- CD73+, CD90+, CD105+, (CD13+) - CD11b-, CD14-, CD19-, CD34-, CD45-, HLA-DR-, (CD31-, CD106-)
- Capacités de différenciation en adipocytes, ostéoblastes et chondrocytes
Adipocyte Ostéoblaste
Chondrocyte
- Immunophénotype
Cellule
endothéliale
Neurone
Myocyte
Cardiomyocyte
Hépatocyte Cellule
produisant
de l’insuline
Anti-apoptotic effects
VEGF, HGF, IGF-1, TGF-β, bFGF, GM-CSF, IL-6
MSC
Anti-bacterial effects
LL37
Angiogenic effects VEGF-A, VEGF-D, HGF, Ang-1, bFGF, IGF-1, PDGF, PIGF, IL6, EPO, MCP-1
Neuroprotective effects
BDNF, NGF, GDNF, galectin-1
Hematopoietic stem cell supportive effects TPO, SCF, TGFβ, M-CSF, LIF,
Ang-1, SDF-1
Proliferative effects
KGF, FGF-2, VEGF, IGF, PDGF, HGF
Anti-fibrotic effects
MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, HGF, bFGF, Ang-1, KGF
Chemoattractive effects
SDF-1, HGF, LIF, IGF, G-CSF, M-CSF, VEGF, CCL-2, -3, -4, -5, -6, -20, CXCL-
2,-3, -5,-8,-10 -11
Immunomodulation
IDO, PGE2, TGF-β, TSG-6, HGF, LIF, NO, HO-1, HLA-G, IL-6
Fonctions paracrines des MSC
Les MSCs sont facilement isolables et peuvent être produits en grandes quantités in vitro et de facon GMP
Les cellules souches mésenchymateuses = Localisation des MSC
Kobolak J et al, Methods, 2015
Tissus adultes
Tissus fétaux
Les cellules souches mésenchymateuses = Localisation des ASC in vivo
Lectine/CD34/Noyau
Immunohistochimie sur TA humain
NG2/CD34/Noyau
CD140b/CD34 /Noyau
Les ASC périvasculaires sont différentes des péricytes.
Localisation stromale et périvasculaire des ASC
Lectine: marqueur des cellules endothéliales CD140b (PDGF-R): marqueur des péricytes NG2 (chondroitin sulfate proteoglycan) : marqueur des péricytes
Péricytes?
Différentes sources de MSC
Tissus adultes (BM-MSC, ASC)
- Grandes quantités
- Peu invasif - Utilisation autologue
- Déjà utilisées dans de nombreux essais cliniques
- Différenciation A/O/C
- Cellules immunomodulatrices
Tissus fétaux (A-MSC, C-MSC, UC-MSC, WJ-MSC)
- Grandes quantités
- Pas invasif - Fort taux de prolifération
- Faible sénéscence - Utilisation allogénique
- Plus de potentiels de différenciation
(lignages neuronal, pancreatique) - Cellules immunomodulatrices
MSC
Application à l’arthrose
Ingénierie tissulaire: Réparation des défauts focaux
Chondrocyte MSC
Capacités de différenciation
Fonctions immunorégulatrices
Synovial Fibroblaste
IL1b, IL8,
TNF, PGE2, NO
MMP
ADAMTS
TGFβ
BMP
Chondrocyte
MMP
ADAMTS
TGFβ
BMP
Chondrocyte
Synoviocytes
IL1b, IL8,
TNF, PGE2, NO
Formation
d’osteophytes
Dégradation
du cartilage
Application à la polyarthrite rhumatoïde
Contrer l’inflammation
Thérapies cellulaires anti-inflammatoire
Chondroprotection et stimulation de la réparation
endogène
Fonctions trophiques
Différenciation en chondrocytes sur
biomatériaux
Applications cliniques des MSC en rhumatologie
MSC
Application à l’arthrose
Ingénierie tissulaire: Réparation des défauts focaux
Chondrocyte MSC
Capacités de différenciation
Fonctions immunorégulatrices
Synovial Fibroblaste
IL1b, IL8,
TNF, PGE2, NO
MMP
ADAMTS
TGFβ
BMP
Chondrocyte
MMP
ADAMTS
TGFβ
BMP
Chondrocyte
Synoviocytes
IL1b, IL8,
TNF, PGE2, NO
Formation
d’osteophytes
Dégradation
du cartilage
Application à la polyarthrite rhumatoïde
Contrer l’inflammation
Thérapies cellulaires anti-inflammatoire
Médecine régénératrice des défauts focaux du cartilage
Chondroprotection et stimulation de la réparation
endogène
Fonctions trophiques
Différenciation en chondrocytes sur
biomatériaux
Traitements pour les défauts focaux
Microfracture Mosaicplastie ou Greffes osteo-
chondrales
ACI: autologous chondrocyte implantation MACI: matrix-induced chondrocyte implantation
Faible intégration
Mortalité au site donneur
Limité aux petits défauts
Formation
d’osteophytes et fibrocartilage dans
la lésions
Mortalité au site donneur
Hypertrophie Du périoste
Résultats: ACI = microfracture > mosaicplaty
Mais quelques limitations
- Nouvelles approches pour l’ingénierie tissulaire - Nouvelles sources cellulaires
Traitements pour les défauts focaux
MSCs pour le traitement des défauts focaux
Faisabilité de l’implantation de BM-MSC authologues pour les maladies orthopédiques
- 1998: premier essai clinique utilisant les BM-MSCs dans 2 reports de cas (Wakitani S et al, 2004)
Amélioration importante des symptômes cliniques (douleur, marche…) mais fibrocartilage
- 2002: 24 patients avec OA du genou ont reçu des BM-MSCs dans des éponges de collagène sous un lambeau de périoste
Wakitani et al, Osteoarthr. Cart. 2002
Intérêt de l’utilisation des MSCs pour la réparation du cartilage !
Pas d’amélioration significative comparé au groupe collagène/périoste.
Meilleur score arthrospique et histologique dans le groupe traité avec les MSC avec un grand contenu en cartilage hyalin dans les biopsies 10 mois après l’implantation.
Col I Col II
Col X PG
Efficacité des BM-MSCs comparée à l’implantation des chondrocytes autologues?
- MSCs sont aussi efficaces que les chondrocytes pour la réparation (n=36) - amélioration de la qualité de vie des patients et de leurs activités dans la vie courante et sportives - formation de cartilage hyalin (1an) - l’implantation des chondrocyte est meilleure pour les patients <45 ans et pas de différences en rapport avec l’age pour le groupe MSC
Nejadnik et al, Am J. Sports Med, 2010
Les MSCs peuvent être utilisées comme une alternative aux chondrocytes pour la réparation du cartilage - couts réduits, - une opération en moins, - minimiser la morbidité au niveau du site donneur
MSCs pour le traitement des défauts focaux
- Sécurité des implantation de BM-MSC autologues pour les maladies orthopédiques?
- 2005-2009: 10 ± 7 mois de suivi pour 227 patients traités pour différentes conditions orthopédiques.
(Centeno et al, Curr Stem Cell Res Ther 2010) Pas de tumeur au site d’implantation - 1998-2009: 5 mois à 11 ans de suivi de 41 patients ayant reçu
une transplantation de BM-MSC (Wakitani et al, J Tissue Eng Regen Med 2010)
Pas de tumeur ni d’infection enregistré
Sécurité des MSC en thérapie?
“If the cells are harvested for therapy well before the cultures reach senescence, there is a very low probability of malignant transformation and tumor formation in patients”
(Prockop et al, Cytotherapy september 2010)
MSCs pour le traitement des défauts focaux
Combinaison optimale des 3 composants indispensables:
Signaux inducteurs (facteurs de croissance)
Mesenchymal Stem Cell
Biomatériaux (synthétique or
naturel)
MSCs pour l’ingénierie du cartilage
H2O
H2O
PAMs (Pharmacological active microcarriers) pour la libération prolongée de TGF-b3 pour la différenciation de MSC
Collagen II Aggrecan
Aggrecan Collagen II
Bouffi et al, Biomaterials, 2010
d21 d21
h1 d1 d7
Implantation sous-cutanée des TGF-β3-PAMs in vivo
Cu
mu
lative
rele
ase (
µg/m
l)
0
1
2
3
4
0 4 8 12 16 24 32
Day
released functional
d20
MSCs pour l’ingénierie du cartilage
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 10 20 30 40
Cu
mu
late
d r
ele
ase
of
TGFβ
3 (
%)
Time (days)
Augmentation significative du relargage: 3 X TGFβ3 bioactif
X3
P188 1:10 PLGA
P188 1:20 PLGA-P188-PLGA
P188 1:10 PLGA-P188-PLGA
Protein:additive polymer ratio
Total protein Bioactive protein
H2OH2O
Optimisation du relargage du TGFβ3
PAMs pour l’ingénierie du cartilage
Adhérence à 4h Survie à 24h Prolifération à 7 jours
0
100
200
300
400
500
600
Cells PLGA PAMs PLGA-P188-PLGAPAMs
Cel
l nu
mb
er (
%)
24h
7days
** *
H2OH2O
Adhésion et meilleure prolifération
A B
DC
E
F
Zeta potential (mV)
PLGA MS -8.1 ± 1.6
PLGA PAMs +15.4 ± 0.3
PLGA-P188-PLGA MS - 8.1 ± 2.3
PLGA-P188-PLGA PAMs +7.9 ± 0.8
A B
DC
E
F
Zeta potential (mV)
PLGA MS -8.1 ± 1.6
PLGA PAMs +15.4 ± 0.3
PLGA-P188-PLGA MS - 8.1 ± 2.3
PLGA-P188-PLGA PAMs +7.9 ± 0.8
MAB IF anti-FN 0
100
200
300
400
500
600
Cells PLGA PAMs PLGA-P188-PLGA PAMs
Cel
l su
rviv
al (%
)
24h 48h 7days
**24h
48h
7days
50 µm 50 µm
100µm 100µm
25µm 25µm
A. B.
*
PLGA PAMs
PLGA-P188-PLGAPAMs
0
100
200
300
400
500
600
Cells PLGA PAMs PLGA-P188-PLGA PAMs
Cel
l su
rviv
al (%
)
24h 48h 7days
**24h
48h
7days
50 µm 50 µm
100µm 100µm
25µm 25µm
A. B.
*
PLGA PAMs
PLGA-P188-PLGAPAMs
48h Day 7
PAMs pour l’ingénierie du cartilage
TGFβ3-PLGA PAMs
TGFβ3-PLGA-P188-PLGA PAMs
PLGA-P188-PLGA PAMs
Augmentation de la formation de
matrice avec la nouvelle formulation
H2OH2O
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
D0 TGF-β3 PLGA PAMs
NewPAMs
TGF-β3 New
PAMs
0
20000
40000
60000
80000
100000
D0 TGF-β3 PLGA PAMs
NewPAMs
TGF-β3 New
PAMs
0
500
1000
1500
2000
2500
D0 TGF-β3 PLGA PAMs
NewPAMs
TGF-β3 New
PAMs
**
Collagen II Aggrecan Collagen X
New PAMs
PLGA PAMs
Fo
ld in
cre
ase
** **
Différenciation in vitro (jour 21)
Morille et al., J. Control Release, 2013
PAMs pour l’ingénierie du cartilage
H2OH2O
Formation de cartilage in vivo
Injection intra-articular
de collagenase
d0 d2 d42
Sacrifice
d10
TGFβ3
Injection PAM/MSC
Histological scoring 3D imaging of cartilage
PAMs pour l’ingénierie du cartilage
H2OH2O
Imagerie 3D du cartilage (CLSM)
Evaluation quantitative de la structure 3D du cartilage grâce à la propiété d’autofluorescence du tissu (le volume 3D est recontruit à partir de l’empilement des images 2D)
Echantillon
CLSM CLSM
1er scan
(coupe)
CLSM
3ème scan
(coupe)
CLSM CLSM
Lateral plateau Median plateau Tibial plateaux
Stok K. and Müller R. Microscopy research and technique 2009
PAMs pour l’ingénierie du cartilage
H2OH2O
Imagerie 3D du cartilage (CLSM)
*
*
median lateral Tibial plateau
colla
gena
se
PAM
PA
M/T
GF
β3
Les paramêtres du cartilage indiquent une meilleure intégrité tissulaire.
PAMs pour l’ingénierie du cartilage
Morille M et al. En Préparation
MSC
Application à l’arthrose
Ingénierie tissulaire: Réparation des défauts focaux
Chondrocyte MSC
Capacités de différenciation
Fonctions immunorégulatrices
Synovial Fibroblaste
IL1b, IL8,
TNF, PGE2, NO
MMP
ADAMTS
TGFβ
BMP
Chondrocyte
MMP
ADAMTS
TGFβ
BMP
Chondrocyte
Synoviocytes
IL1b, IL8,
TNF, PGE2, NO
Formation
d’osteophytes
Dégradation
du cartilage
Application à la polyarthrite rhumatoïde
Contrer l’inflammation
Thérapies cellulaires anti-inflammatoire
Médecine régénératrice des maladies auto-inflammatoires: application à l’arthrite
Chondroprotection et stimulation de la réparation
endogène
Fonctions trophiques
Différenciation en chondrocytes sur
biomatériaux
0
40
80
120
MSC:responder ratio
1:1 1:10 1:100 0:1
Rela
tive p
rolif
era
tive
respon
se (
% ±
SD
)
Djouad et al., Blood 2003
0
20
40
60
80
100
120
140
allo MSC MSC + transwell
Pro
lifera
tion
(%
± S
D)
L’effet immunosuppresseur des MSC est dose-dépendant et passe par des facteurs solubles.
Effet immunosuppresseur des MSC
Facteurs solubles impliqués dans l’effet immunosuppresseur des MSCs
Djouad et al, Nat Rev Rheum 2009
IDO
iNOS
Inhibition de la
différenciation et de
la maturation
Fonction de présentation des
Ag diminuée
Inhibition de la prolifération et
des fonctions cytotoxiques
Inhibition de la prolifération
& fonction des CD8 cytotoxic
Prolifération et fonction
Inhibition de la prolifération
et différenciation des
cellules sécrétrices
d’anticorps
Tyndall A et al, Immunology letters, 2015
Effets immunosuppresseurs des MSCs
Intérêt de l’utilisation des MSC dans les maladies autoimmunes
(© 2001 Terese Winslow)
Inflammation tissulaire - douleur
Destruction tissu-specifique - chondrocytes dans la RA - cellules pancreatiques β dans le diabetes - cellules rénales dans le lupus
Différents traitements: - anti-inflammatoire (methotrexate) - agents immunosuppresseurs (steroids) - biotherapies (anti-TNF,…) Mais: résistance, pas d’amélioration
Perte de tolérance
Activation des lymphocytes T CD4
Prolifération et activation des lymphocytes T CD8 et
Lymphocytes B
Destruction des tissus
L’arthrite: maladie inflammatoire chronique, auto-immune, d’origine multifactorielle (génétique et/ou environnementale), caractérisée par une destruction progressive des articulations
Traitement médicaux: - anti-douleurs: soulager les douleurs inflammatoires (paracétamol, anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ou encore corticoïdes) - immunosuppresseurs: réduisent la réponse immunitaire locale responsable de l’inflammation (méthotrexate: traitement de référence) - biothérapies: immunosuppresseurs spécifiques (anticorps ou protéines qui inhibent de manière spécifique une protéine de l’immunité): anti-TNFα (etanercept, infliximab, adalimumab)
La polyarthrite rhumatoïde = PR
Intéret de la thérapie cellulaire utilisant les MSCs pour diminuer l’inflammation.
- Implication de nombreux types cellulaires (macrophages, lymphocytes B et T, chondrocytes, ostéoclastes et synoviocytes) contribuant à la destruction articulaire. - Activation du système immunitaire, réponses inflammatoires aberrantes, perte de la tolérance avec production d’auto-antigènes
…Mais: résistance, pas d’amélioration
Djouad et al., Arthr. Rheum 2005
** ** Control
4x106 C3-Luc / d0
4x106 C3-Luc / D21
106 C3-Luc / d0
106 C3-Luc / d21
0
0,1
0,2
0,3
0,4
20 25 30 35 40 45 50
Day after immunization
Pa
w s
ww
elli
ng
(m
m)
**
MSC MSC
Effet des MSC dans une modèle préclinique d’arthrite
modèle préclinique d’arthrite = CIA (Collagen Induced Arthritis)
Il y a une fenètre spécifique d’injection des MSC qui est indépendante de la souche des souris.
Control
d18+d24
d18+d32
d18
Pa
w s
we
llin
g in
cre
ase
(m
m)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
21 26 31 36 41 Day following arthritis induction
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
18 21 24 27 30 33 36 39 42
Day after arthritis induction P
aw
sw
elli
ng
incre
ase (
mm
)
Control
allogeneic MSC
Effet d’une injection de MSC syngenique à distance de l’immunisation ou du boost
* * * * * * *
Effet des MSC dans une modèle préclinique d’arthrite
Days after arthritis induction
Paw
sw
elli
ng incre
ase (
mm
)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
19 21 23 25 27 29 31
Control wt MSC IL6-/- MSC iNOS-/- MSC
Effet des MSC déficientes pour iNOS ou IL-6 dans le modèle d’arthrite (CIA)
% p
rolif
era
tion
0
20
40
60
80
100
ConA wt iNOS-/- IL-6-/-
C57BL/6 MSC
*
*
*
PG
E2 (
pg/m
l)
ConA wt iNOS-/- IL-6-/-
C57BL/6 MSC
10
102
103
104
105
106
1
10
102
103
IL-6
(ng/m
l)
La sécrétion dépendante de l’IL6 inhibe l’inflammation locale dans la CIA.
Bouffi et al., PLoSONE 2010
* *
*
Effet des MSC dans une modèle préclinique d’arthrite
Gonzales et al., Arthr. Rheum. 2009
La tolérance médiée par hASC passe par la génération de lymphocytes T régulateurs.
Effet des ASC dans une modèle préclinique d’arthrite
Effet des ASC dans une modèle préclinique d’arthrite
Effet des ASC sur la perte osseuse dans le modèle d’arthrite (CIA)
Garimella MG et al., J Immunol. 2015
Les ASC protègent contre la perte osseuse péri-articulaire et systémique en inhibant l’ostéoclastogenèse.
Ctrl CIA CIA+ASCs
Liu et al., Arthr. Res. Ther. 2010
Xenogeneic human UC-MSCs are efficient in reducing the arthritic symptoms
Effet des UC-MSC dans une modèle préclinique d’arthrite
MSC
Application à l’arthrose
Ingénierie tissulaire: Réparation des défauts focaux
Chondrocyte MSC
Capacités de différenciation
Fonctions immunorégulatrices
Synovial Fibroblaste
IL1b, IL8,
TNF, PGE2, NO
MMP
ADAMTS
TGFβ
BMP
Chondrocyte
MMP
ADAMTS
TGFβ
BMP
Chondrocyte
Synoviocytes
IL1b, IL8,
TNF, PGE2, NO
Formation
d’osteophytes
Dégradation
du cartilage
Application à la polyarthrite rhumatoïde
Contrer l’inflammation
Thérapies cellulaires anti-inflammatoire
Médecine régénératrice pour les maladies dégénératrices: application à l’arthrose
Chondroprotection et stimulation de la réparation
endogène
Fonctions trophiques
Différenciation en chondrocytes sur
biomatériaux
Arthrose (OA): maladie chronique caractérisée par une destruction lente du cartilage articulaire menant à une invalidité et à une perte de fonction. 16% personnes > 65 ans, affecte environ 4 millions de français
Besoins médicaux non satisfaits: -Absence de traitement efficace. - Les traitements symptomatiques les plus efficaces sont les AINS qui améliorent <50% du score WOMAC
- Nécessité de traitements plus sûrs: les AINS traditionnels donnent des complications gastro-intestinales importantes et les inhibiteurs COX-2 augmentent les risques cardiovasculaires
apoptosis
Cartilage
degenerescence
Osteophyte
formation
fibrosis
Chondrocyte
& Synovial
inflammation
hypertrophy
Arthrose (Osteoarthritis = OA)
Intéret de la thérapie cellulaire utilisant les MSCs pour la protection du cartilage et sa régénération.
Chondroprotection – données préliminaires
Données pré-cliniques: • OA chez la chèvre
• Résection du ACL + menistectomie
• Injection IA de 107 GFP+ BM-MSC
+ HA à 6 semaines
Recueil des données à 6 et 20 semaines
• Régénération des ménisques pour 4/6 chèvres (moins fibrillation, moins perte PG, meilleure intégrité du cartilage)
• Peu de MSC GFP+ dans le cartilage
6 weeks
Murphy et al., Arthr Rheum 2003
La majorité des effets de l’injection des BM-MSC injection n’est pas due à l’intégration des cellules mais à leur activité trophique (stimulation des précurseurs endogènes)
Effets sur la prolifération des chondrocytes
ASC
0.4 µm transwell membrane
DMEM/
Ascorbic acid/
Proline/
Sodium pyruvate
Assays
Chondrocytes
2 or 7 days
Chondrocytes Chondro+ASC
Cou
nts
Annexin V
Effet anti-apoptotic des
ASCs
Effets sur l’apoptose des chondrocytes %
pro
lifera
tion
0
50
100
150
200
250
Chondro Chondro
+ASC
10%
FCS
*** ***
Pas d’effet sur la proliferation des
chondrocyte
Camptothecin-induced apoptosis
ratio 1:8
Chondroprotection – méchanismes d’action
% o
f an
nexin
V +
cho
ndro
cyte
s
0
10
20
30
40
*
Chondro Chondro
+ ASC
Effets sur le phenotype des chondrocyte
SC Abdo ASC
BM-MSC
Ge
ne
exp
ressio
n
(fo
ld c
ha
nge
)
Agg Col IIB Link Sox9 0
1
2
3
*
*
Ge
ne
exp
ressio
n
(fo
ld c
ha
nge
)
MMP13 AP Col I Col III 0
1
2
3
** ***
***
Ge
ne
exp
ressio
n
(fo
ld c
ha
nge
)
Agg Col IIB Link Sox9 0
1
2
3
Ge
ne
exp
ressio
n
(fo
ld c
ha
nge
)
MMP13 Col X Col I Col III 0
1
2
3
** ** **
Effets anti-fibrotique et anti-hypertrophique des
ASC et MSC
Chondroprotection – méchanismes d’action
Quantification of secreted factors
No secretion of TNF-α, IL-1β and MMP-9
IL-1
RA
co
ncentr
atio
n
(pg/m
L)
0
25
50
75
100
ND
Ch
alone
ASC
alone
Co-
culture
IL-1RA
TIM
P-2
co
ncentr
atio
n
(ng/m
L)
0
10
20
30
40
50
Ch
alone
ASC
alone
Co-
culture
TIMP-2 MMP-1
MM
P1
co
ncentr
atio
n
(ng/m
L)
0
500
1000
1500
Ch
alone
ASC
alone
Co-
cultureT
IMP
-1 c
oncentr
atio
n
(ng/m
L)
0
200
400
600
800
Ch
alone
ASC
alone
Co-
culture
TIMP-1
TG
F- b
1 c
once
ntr
atio
n (
pg/m
L)
0
200
400
600
Ch
alone
ASC
alone
Co-
culture
ND
******
TS
P-1
co
ncentr
atio
n (
pg/m
L)
0
20
40
60
80
100
Ch
alone
ASC
alone
Co-
culture
**
TSP-1 TGF-β1
Chondroprotection – méchanismes d’action
Quantification of HGF secretion
HGF protein quantification HGF mRNA quantification
Induction of HGF secretion by ASCs in co-culture
HG
F c
oncentr
atio
n (
pg/m
L)
0
50
100
150
200
ND
Ch
alone
ASC
alone
Co-
culture
HG
F e
xpre
ssio
n (
2-
CT)
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
Ch Ch
-co
ASC
*
ASC
-co
Chondroprotection – méchanismes d’action
Co-culture with a neutralizing anti-HGF antibody
Réversion de l’effet anti-fibrotic des ASC en utilisant un anticorps anti-HGF
Col1 Col3
Col
I ex
pre
ssio
n
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
***
*
Chondrocytes
ASC
HGF-Ab Isotype control
+ + + + +
+ - - - - + + + - -
+ - - - - rhHGF (50ng/mL) - - - - +
Col
III
expre
ssio
n
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*** *
Chondrocytes
ASC
HGF-Ab Isotype control
+ + + + +
+ - - - - + + + - -
+ - - - - rhHGF (50ng/mL) - - - - +
MMP13 AP
MM
P13 e
xpre
ssio
n
0.0
0.5
1.0
1.5
***
** **
**
Alk
alin
e phosp
hat
ase
0.0
0.5
1.0
1.5
*** *
Maumus M et al., Stem cell research, 2013.
Chondroprotection – méchanismes d’action
Chondrocyte inflammation Synoviocyte inflammation
Effets sur le phenotype inflammatoire des chondrocytes et synoviocytes
Manferdini C et al., A&R, 2013
Manferdini C et al, Osteoarthritis Cartilage. 2015
Effet anti-inflammatoire des ASCs sur les chondrocytes et synoviocytes
Chondroprotection – méchanismes d’action
Role des ASCs dans des modèles animaux d’arthrose
ter Huurne M et al., Arthritis Rheum., 2012 Nov. Desando et al. Arthritis Research & Therapy, 2013
Modèle murin Modèle lapin
Protège contre la destruction du cartilage
Diminue la formation d’ostéophyte Diminue l’inflammation de la synoviale
Effets thérapeutiques des ASC dans des modèles d’arthrose chez la souris et le lapin.
4% RSA 2.106 ASC
4% RSA 2.106 ASC
Protège contre la destruction du cartilage
Synovial
Fibroblaste
IL1b, IL8,
TNF, PGE2, NO
MMP
ADAMTS
TGFβ
BMP
Chondrocyte
Synovial
Fibroblaste
IL1b, IL8,
TNF, PGE2, ROS
MMP
ADAMTS
TGFβ
BMP
Chondrocyte
Osteophyte
formation
Degradation
TIMP-1, -2
Inflammation
Immunomodulateur
(IDO, iNOs, PGE2, TSG-6,…)
Anti-apoptotique (HGF, Sfrp1)
Anti-fibrotique
Protecteur
Effets pléiotropiques dans des modèles de maladie dégénératives
Objectif scientifique: Sureté d’une injection IA d’ASC autologues à des patients avec une arthrose sévère du genou.
Design de l’étude: Etude bicentrique ouverte de phase I
Buts primaires: Sureté et tolérance de l’injection d’ASC
Buts secondaires: Evaluation fonctionnelle et globale (WOMAC, VAS, examen physique)
Critères d’inclusion: Hommes et femmes (agés de 50 à 75 ans) avec
une arthrose modérée/sévère du genou
Critères d’exclusion: Maladie ou traitement affectant le métabolisme de l’os ou du cartilage
Nombre de patients: 18 patients (6/dose)
Doses: 2 – 10 – 50 x106 ASC IA
Temps d’évaluation: semaine 2-4-8-12 (bi-annuel/5 ans)
ADIPOA = ADIPose stem cells-based therapy for OA
ADIPOA, essai clinique
> 6 w 0 w 1 w 60 w 12 w
18 Patients (end-stage knee OA)
Primary endpoint: Safety and tolerability Secondary Endpoints: efficacy - Patient global assessment, ROM, laboratory investigations - X-ray/MRI (dGEMRIC-MRI) - WOMAC-, KOOS- VAS- SF36- score - Synovia Analysis
- Immunomonitoring
Harvest of ASCs
2 w
Intraarticular injection of ASCs
4 w
Knee joint replacement
2.106 n = 6
10 .106 n = 6
50 .106 n = 6 Adverse Events (AE, SAE) monitoring
Procédure clinique – injection des cellules souches
ADIPOA, essai clinique - Résultats
Diminution de la douleur et amélioration de la
fonction.
Pas de pose de prothèse (11/12 patients)
Augmentation du contenu en PG et épaisseur du cartilage (3/6 patients)
11/26/2015
CD25hCD127loFoxP3+ in CD4+ CD14++CD16- classical monocytes
0 7 30 90 Controls
0
2
4
6
8
10
Days
* P= 0.0151
** P= 0.0054
ADIPOA, essai clinique - Résultats
Augmentation des lymphocytes T régulateurs
Diminution des monocytes inflammatoires
Pers YM et al., Stem Cells Translational Medicine, en révision.
ADIPOA 2
Objectif scientifique: Efficacité d’une injection IA d’ASC autologues à des patients avec une arthrose sévère du genou.
Design de l’étude: Etude multicentrique à l’aveugle de phase II (10 centres)
Buts : Efficacité de l’injection d’ASC comparée à un placebo
Critères d’inclusion: Hommes et femmes (agés de 50 à 75 ans) avec
une arthrose modérée/sévère du genou
Critères d’exclusion: Maladie ou traitement affectant le métabolisme de l’os ou du cartilage
Nombre de patients: 150 patients (50/dose)
Doses: 2 – 10 x106 ASC IA ou placebo
http://adipoa2.eu/
Remerciements
Inserm U1183 – Equipe 1 Montpellier Biologie de la cellule souche mésenchymateuse et
thérapies du cartilage Christian Jorgensen
Danièle Noël Karine Toupet Marie Maumus Maxime Ruiz Claire Bony
Stella Cosenza Guillaume Fonteneau
Alexandre Maria Philippe Guilpain Yves-Marie Pers
Sanofi-Aventis, Montpellier Gautier Roussignol
Isabelle Bentz Régis Steinberg
Géraldine Penarier
Laboratorio di Immunoreumatologia e Rigenerazione Tissutale, Bologna,
Italy Andrea Facchini
Gina Lisignoli Cristina Manferdini
A. Piacentini Elena Gabusi
Stromalab, Toulouse Louis Casteilla Philippe Bourin Roxane Blattes
Yannick Jeanson Julie-Anne Peyrafite
Cellules souches multipotentes
Cellules souches embryonniques Pluripotentes
(ES)
Cellules souches pluripotentes induites
(iPS)
Cellules spécialisées
Cellules souches totipotentes
Les différents types de cellules souches