ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

García Andrés Juana J., Mora Mora Alberto, Ovando Roblero Amet, Pérez Hernández Yasmin J., Fredy U. Ramírez Santizo.

Resumen. El objetivo principal de esta práctica es aplicar la técnica de electroforesis en gel de agarosa al 1%

para verificar y cuantificar la cantidad de ADN cromosómico extraído de células bacterianas. Se realizó con

anticipación la extracción de DNA bacteriano a partir de once pasos establecidos en el protocolo la

cuantificación del DNA. Los resultados obtenidos mostraron que en la muestra problema de 25 µL se encuentra

105 ng de DNA total presente en células bacterianas (Rizhobium sp, Pseudomona mosselli, Acinetobacter

calcoaceticus y la Acinobacter sp).

Palabras clave: ADN, marcador, gel de agarosa, UV.

Introducción.

La electroforesis es un método analítico –

semipreparativo, en el que se separan biomoléculas,

en dependencia entre otros factores de su carga y

bajo la acción de un campo eléctrico, fue empleado

por primera vez por Tiselius en el año

1937. Raymond y Weintraub en 1959 emplearon

como soporte para la electroforesis un gel de

poliacrilamida (PAGE)1. Es uno de los métodos más

empleados para separar fragmentos de ADN se basa

en el hecho de que el ADN se encuentra cargado (-)

debido a los grupos P como consecuencia cuando se

aplica un campo eléctrico el ADN se desplaza desde

el polo (-) hacia el polo (+)2 .El presente trabajo

tuvo como objetivo Conocer y aplicar la técnica de

electroforesis horizontal en agarosa para verificar y

cuantificar la cantidad de ADN cromosómico

extraído de células bacterianas.

Materiales y Métodos.

Se Prepararon moldes dependiendo de la cantidad

de muestra a verificar, (50, 100, 200 ml)

seleccionando los peines correspondientes. El gel de

agarosa se preparó en un matraz Erlenmeyer de 250

ml, colocando 100 ml de solución TAE 1X

disolviendo 0.8 gr de agarosa tipo I, agitando

ligeramente, después licuar en el microondas (hasta

que la solución este totalmente diluida).

Posteriormente se colocó la agarosa en el molde de

la cámara de electroforesis cuidadosamente. Dejar

enfriar a 8°C durante 20 minutos. Sucesivamente se

colocaron las muestras en cada pozo

correspondiente en el gel de agarosa. En el pozo No.

1 colocar 2 μl del marcador DNA, previamente

mezclado con 3 µl de colorante Buffer azul. De la

misma manera se colocó las muestras problemas en

los pozos en su respectivo orden consecutivo. En

este caso se utilizó 6 μl ADN y mezclar con 3 μl de

colorante azul. Posteriormente se corrió a 110 Volts

durante 35 minutos. Se colocó el gel que ha sido

tratado en un recipiente el cual contenía bromuro de

etilio al 5% y se rebeló la muestra durante 10

minutos en la oscuridad. Después, se lavó el gel con

agua corriente durante 5 minutos. Se analizó el gel

de electroforesis en un transiluminador a una

longitud de 302 nm.

Resultados y discusiones

La primera banda de la fig. 1 es el marcador, las

banda 4, 5, 6, y 7 son las muestras que corrieron. El

marcador con 10000 bp indica 18 ng de DNA,

aproximadamente en la muestra contenían 14000

bp, es decir 25.2 ng de DNA. Por tanto en 25 μL de

muestra hay 105 ng de DNA.

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Fig.1.1.- Electroforesis en gel de agarosa al 1% del DNA bacteriano.

En la electroforesis la concentración del gel de

agarosa ayudó a la formación de poros grandes lo

cual permitió la migración de las moléculas de DNA,

en algunas de las bandas no corrió como se esperaba

esto puede estar influenciado por diferentes causas

como es el tiempo de corrida y en el uso de las

micro pipetas para el estudiante en el paso de

agregar la muestras en los posos.

En la revelación de las bandas también se pudieron

observar bandas muy pequeñas que no corrieron

mucho esto se debe a que entras bandas no se

encontraron presencia de ADN por lo tanto

pudieron haber presencia de proteínas, ácidos

nucleicos u otros componentes moleculares.

En este caso se realizaron dos prácticas de

electroforesis con muestras iguales para ver la

diferencia que estas se encontraban y por lo cual

esta prueba nos dio los mismos resultados.

En la banda 7 hubo más presencia de ADN y es ahí

donde la banda corrió más a diferencia de las otras

bandas que recorrieron de manera discontinua.

Conclusiones

La práctica de electroforesis nos permitió verificar y

cuantificar la cantidad de ADN cromosómico

extraídos de las células bacterianas ( Rhisobium sp,

acinetobacter y pseudomonas)en el cual se

encontraron un total de 14 000 bp (pares de bases).

Esta técnica fue muy eficiente y sencillas que nos

permite separar moléculas o fragmentos de

moléculas de ácidos nucleicos.

Bibliografía

¹Jorge Eduardo Zavala Castro. Manual de técnicas

básicas de bilogía molecular. 7ª edición.

Universidad autónoma de Yucatán, 2005. 2. Pérez De Castro AM. Electroforesis en gel de

agarosa. Universidad Politécnica de Barcelona.

(2011)

Fig.1. Fig. 1 electroforesis en gel de agarosa al 1% del DNA bacteriano.

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