PRACTICA N ° 11

DEMOSTRACION DE LA DIGESTION Y ABSORCION DE LOS CARBOHIDRATOS: GLICEMIA PRE Y POST-PRANDIAL

I. INTRODUCCION:

La glucosa sanguínea es una de las fuentes de energía más importantes en el organismo y en algunos tejidos altamente especializados. En el cerebro y los glóbulos rojos es la única fuente de energía. Por todo esto, el organismo dispone de una compleja maquinaria metabólica que permite asegurar la constancia de la concentración de glucosa en la sangre y, con ella, la constante disponibilidad de este sustrato a los tejidos.

La glucosa en sangre, proviene de dos orígenes: de origen exógeno de los alimentos, y de origen endógeno, que proviene del hígado por glucogenólisis. Por otra parte, hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina, por lo tanto la concentración de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo.

Diversos factores que inciden sobre la absorción, producción endógena de glucosa así como la utilización y excreción de la misma, contribuyen a mantener constante la concentración de glucosa en sangre. En el caso del hígado, el transporte de glucosa al interior de las células es por difusión pasiva, siendo el hepatocito permeable para este metabolito. En casi todos los demás tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las células por simple difusión, sino que lo hace por un mecanismo de difusión controlada, en particular en el tejido adiposo, el corazón y el músculo esquelético. El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a través de las células de la mucosa intestinal no es muy conocido. Se cree que está íntimamente ligado al transporte de sodio. Este proceso, por ello, se llama cotransporte, y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentración de sodio en fluído extracelular. En este caso la glucosa entra en la célula, posiblemente porque se une a la misma proteína transportadora que lleva el sodio. A su vez, el sodio, por la bomba de sodio y potasio, volvería a salir de la célula. Este mecanismo requiere ATP como fuente de energía. La entrada de la glucosa en estas células está supeditada a que, al salir del Na+ mantenga alta concentración en el líquido extracelular. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a través de la membrana favorecería a otro. Los valores normales de glucosa en sangre son variables de acuerdo al método utilizado. Según el método de Folin Wu. Varía entre los 80 – 120 mg%; con el método de la glucosa oxidasa la concentración varía entre 70 – 110 mg/dl. El conocimiento de la glicemia es importante no sólo porque permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis metabólica existente, sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento.

La finalidad de la siguiente práctica es demostrar la digestión y absorción de la glucosa, cuantificando la glicemia pre y postprandial, por el método de Glucosa oxidasa; tanto en personas normales como en casos patológicos. 29

II. FUNDAMENTO TEÒRICO

La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico. El peróxido de hidrogeno(H2O2), producido se detecta mediante un aceptor cromo génico de oxígeno, fenol-ampirona en presencia deperoxidasa (POD):

REACCIÒN:

En el método GOD-POD, en unprimer paso la glucosa oxidasa cataliza la oxidación de la D-glucosa a ácido D-glucónico conformación de peróxido dehidrógeno. Éste es utilizado por la  peroxidasa para oxidar a la 4-aminofenazona y al fenol, dandolugar a una quinonaiminacoloreada. La intensidad de color será proporcional a laconcentración de glucosapresente inicialmente. (Enocasiones se utilizan otrossustratos en lugar de 4-aminofenazona+fenol, tales comoo-dianisidina, guayacol y ABTS.)Esquema de la reacción

III. REACTIVOS A UTILIZAR - Estándar: Solución de glucosa 1 g/l - GOD/POD: Solución de glucosa oxidasa (1,000 U/ml) y Peróxidasa (120 U/ml). - Reactivo 4- AF: Solución de 4 – aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.92 mol/l. - Reactivo Fenol: Solución de Fenol 55 mmol/l.

- Preparación del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada, 50 partes de Reactivo 4- AF, 50 partes de Reactivo Fenol y llevar a 1,000 partes con agua destilada. Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente homogenizadas. Mezclar por inversión sin agitar. Rotular y fechar.

IV. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES :

Se tomarán dos muestras de sangre : La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra. La segunda: Esta muestra se tomará después de una hora, como máximo, después de la ingesta alimenticia. En esos momentos, se extraerán 5 ml. de sangre de la flexura del codo, con jeringa hipodérmica de 10 ml. y con aguja N° 20. Colocar las muestras en tubos de ensayo, se deja reposar 10 minutos, luego se centrifuga a 3000 RPM por 10 minutos. Separar el suero. La determinación de la glicemia se realizará por el método Enzimático de la glucosa oxidasa. Utilizar 4 tubos de ensayo:

COMPONENTES B Dpre. Dpost.

Standard

Muestra (suero preprandial)

Muestra (suero postprandial)

Reactivo de trabajo

-----

-----

-----

2 ml

-----

20 ul

-----

2 ml

-----

-----

20 ul

2 ml

Incubar todos los tubos 10 minutos en baño de agua a 37 ºC

Leer en Espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco.

Cálculo de los resultados :

1.00 g/l

Glucosa (g/l) = D x f donde f = -----------

S

y D = Dpre. y Dpost.

Antes de multiplicar D x f, Restar a D el Blanco (B) y el resultado se multiplica por f.

IV. CUESTIONARIO:

CUESTIONARIO

1. ¿Actualmente, cuál es el rango considerado normal para la glicemia basal? Explique las variaciones en los valores, que Ud. puede encontrar por ejemplo en una intolerancia a la glucosa.

-La glicemia basal es 70-110 mg/dl para la prueba de la glucosa oxidasa

Glucosa basal alta

Las causas de unos niveles altos de glucosa en ayunas son un mal funcionamiento del páncreas.

Los síntomas de niveles altos de glucosa en sangre (hiperglucemia: niveles superiores a 110 mg/dl) son pérdida de peso, sed, aumento de apetito, de orina, cansancio y debilidad.

Ante un resultado alto en los niveles de glucosa es recomendable seguir una serie de pautas, como realizar ejercicio físico, eliminar en la medida de lo

posible los hidratos de carbono de la dieta. En este enlace encontrareis un montón de consejos sobre cómo bajar los niveles de azúcar.

Glucosa basal baja

Los síntomas de niveles bajos de glucosa (hipoglucemia: niveles inferiores a 60 mg/dl) son dificultades en la concentración y en el habla, confusión, dolor de cabeza, palidez, palpitaciones, irritabilidad, sudores, sensación de hambre y la posibilidad de desencadenar en un coma.

Las causas más comunes que provocan hipoglucemia son el consumo inadecuado de medicamentos hipoglucemiantes, carencias alimentarias, ejercicio físico excesivo y, en el peor de los casos, tumores pancreáticos.

2. ¿Cómo esperaría encontrar los valores de la glicemia dosada en la sangre venosa y en la sangre arterial?

La concentración de glucosa en la sangre arterial es más elevada que en la sangre venosa debido al consumo de glucosa por parte de las células. En ayunas estas diferencias son del orden de 0.10-0.25 mmol/L, pero después de la ingestión de alimentos puede ser de hasta 0.80 mml/L.

3. ¿Conoce otros métodos para determinar la glicemia? Explique su fundamento

Los métodos para la determinación de la glucosa sanguínea se basan en el uso de glucosa como agente reductor o en su oxidación enzimática para formara ácido glucorónico. En la técnica de Folin Wu la glucosa se determina en un filtrado de sangre libre de proteínas por reducción del sulfato cúprico alcalino y la reacción ulterior con el reactivo de ácido fosfomolibdico o arsenomolibdico, para formar un complejo color azul que puede estimarse por colorimetría. El método de Nelson-Somogyi se basa en el uso de un filtrado de sangre libre de proteínas preparado con hidróxido de cinc para remover la mayoría de las sustancias reductoras interferentes.

La presencia de un grupo aldehído terminal en la molécula de glucosa es la base de una determinación colorimétrica con reactivos hidroxifenolicos(fenol en metilsalicilato acuoso o 1,3-dihidroxibenceno fosforilado) en presencia de ácido sulfúrico fuerte y calor.

El procedimiento de la o toluidina es una reacción de color específica para las hexosas. Dado que normalmente las aldohexosas que no sean glucosa se encuentran en muy bajas concentraciones, los resultados de este método se aproximan al verdadero valor de la glucosa. En acido glacial la o toluidina se

condensa con la glucosa para dar un cromógeno verde a través de la formación de una mezcla en equilibrio de una glucosamina y una base de Schiff.

4. ¿Cuáles son los criterios bioquímicos relacionados con la glicemia para el diagnóstico de la diabetes mellitus?

A1C ≥ 6,5%. La prueba debe realizarse en un laboratorio que use un método certificado y estandarizado.

FPG ≥126mg/dl. El ayuno se define como la no ingesta calórica por lo menos 8horas.

Glucemia 2 horas posprandial ≥200mg/dl durante la prueba de tolerancia a la glucosa. La prueba debe realizarse como lo indica la OMS, con una carga de glucosa que contiene el equivalente de 75 g de glucosa anhidra disuelta en agua.

En un paciente con síntomas clásicos de crisis de hiperglucemia o hiperglicemia; una glucemia al azar >200 mg/dl.

En ausencia de hiperglucemia inequívoca, los criterios deben ser confirmados por pruebas repetidas.