biotecnologie farmacologiche lezione 8 biofarmaci e proteine terapeutiche: problematiche legate alla...
TRANSCRIPT
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
LEZIONE 8
BIOFARMACI E PROTEINE TERAPEUTICHE: PROBLEMATICHE LEGATE ALLA LORO FARMACOCINETICA/DINAMICA
CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO
Adriana Maggi
PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA GENERAZIONE
• INSULINA
• FATTORI DI CRESCITA DELL’EMATOPOIESI
• INTERLEUCHINE ED INTERFERONI
• ORMONE DELLA CRESCITA
• ENZIMI
• (ANTICORPI MONOCLONALI)
• (VACCINI)
• FATTORI DELLA COAGULAZIONE
NOMECOMMERCIALE
PROTEINATERAPEUTICA
AZIENDAFARMACEUTICA
PRINCIPALE INDICAZIONE
TERAPEUTICA IN USA
ANNO
HUMULIN INSULINA UMANA ELI LILLY DIABETE 1982
PROTROPIN ORMONE SOMATOTROPO GENENTECH DEFICIENZA GH 1985
INTRON A INTERFERONE ALFA 2b
SHERING-PLOUGH LEUCEMIA A CELLULE CAPELLUTE
1986
ROFERON A INTERFERONE ALFA 2a
HOFFMANN-LA ROCHE
LEUCEMIA A CELLULE CAPELLUTE
1986
HUMATROPE ORMONE SOMATOTROPO ELI LILLY DEFICIENZA GH 1987
ACTIVASE TPA GENENTECH INFARTO CARDIACO 1987
EPOGEN ERITROPOIETINA AMGEN ANEMIA RENALE 1989
ALFERON N INTERFERONEALFA N3
INTERFERON SCIENCES
PORRIGENITALI
1989
NEUPOGEN G-CSF AMGEN NEUTROPENIA DACHEMIOTERAPIA
1991
PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA GENERAZIONE
NOMECOMMERCIALE
PROTEINATERAPEUTICA
AZIENDAFARMACEUTICA
PRINCIPALE INDICAZIONE
TERAPEUTICA IN USA
ANNO
LEUKINE GM-CSF IMMUNEX TRAPIANTO MIDOLLOAUTOLOGO
1991
PROLEUKIN IL-2 CHIRON CARCINOMARENALE
1992
RECOMBINATE FATTOREANTIEMOFILIA
GENETICINSTITUTE
EMOFILIA A 1992
KOGENATE FATTORE VIII MILES EMOFILIA A 1993
BETASERON INTERFERONEBETA 1-B
CHIRON SCLEROSI MULTIPLA 1993
PULMOZYME DNasi GENENTECH FIBROSI CISTICA 1993
NUTROPIN GH GENENTECH DEFICIENZA CRESCITA DA INSUFFICIENZA
RENALE
1994
CEREZYME GLUCOCEREBROSIDASI GENZYME MALATTIA DI GAUCHER
1994
GONAL-F FSH SERONO INFERTILITA’ 1996
PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA GENERAZIONE
2000EMOFILIA AGENETICSINSTITUTE
FATTORE VIIIREFACTO
1999EMOFILIA A e BNOVONORDISK
FATTORE VIIaNOVOSEVEN
1997EPATITE CAMGENINTERFERONEALFACON-1
INFERGEN
1997EMOFILIA BGENETICSINSTITUTE
FATTORE IXBENEFIX
1996SCLEROSIMULTIPLA
BIOGENINTERFERONEBETA 1a
AVONEX
2000OSTEOPETROSIINTERMUNEINTERFERONEGAMMA 1b
ACTIMMUNE
ANNOPRINCIPALE INDICAZIONE
TERAPEUTICA IN USA
AZIENDAFARMACEUTICA
PROTEINATERAPEUTICA
NOMECOMMERCIALE
PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA GENERAZIONE
Le proteine terapeutiche oggi disponibili sono utilizzabili nella terapia di patologie quali:
Neoplasie (interferoni, anticorpi monoclonaliPatologie cardiovascolari, fibrosi cistica, morbo di Gaucher (Enzimi, fattori ematici) Diabete (Insulina) Anemia (Eritropoietina) Emofilia (fattori ematici di coagulazione)
Le terapie con proteine terapeutiche di maggiore utilizzo nel 2003 sono state: Johnson & Johnson Procrit trattamento per anemieAmgen Epogen trattamento anemia Schering-Plough: Intron A and Peg-Intron per il trattamento dell’epatite
Oggi le classi terapeutiche più utilizzate sono:EritropoietinaAnticorpi monoclonaliInterferoni
FARMACOCINETICA E FARMACODINAMICA
FARMACO LEGATO A PROTEINA
CONCENTRAZIONE PLASMATICA
FARMACO LEGATO A TESSUTO
CONCENTRAZIONE TISSUTALE
DOSEASSORBIMENTO
DISTRIBUZIONE
FARMACO NEL COMPARTIMENTODI EFFETTO
FARMACO LEGATO ARECETTORE/EFFETTORE
EVENTI POST- RECETTORIALI
EFFETTO BIOCHIMICO
RISPOSTA FARMACOLOGICA
METABOLISMO ED ESCREZIONE
ELIMINAZIONE
ASPETTI FARMACOCINETCI E FARMACODINAMICI DI FARMACI PROTEICI O PEPTIDICI
LA FARMACOCINETICA STUDIA LA CINETICA DEI PROCESSI
RESPONSABILI DELLA VARIAZIONE TEMPORALE DEI
LIVELLI DEI COMPOSTI ESOGENI NELL’ORGANISMO
IMPORTANZA DELLA RELAZIONE TRA ASPETTI FARMACOCINETICI
E FARMACODINAMICI NELL’AZIONE DI UN FARMACO
I PROCESSI SONO:
•ASSORBIMENTO
•DISTRIBUZIONE
•METABOLISMO
•ESCREZIONE
1) VIA ORALE
2) VIA PARENTERALE
3) VIE ALTERNATIVE
ENDOVENOSAINTRAMUSCOLARESOTTOCUTANEAINTRAPERITONEALE
TRANSNASALEBUCCALERETTALETRANSDERMICAPOLMONARE
SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE
SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE
VIA ORALE controindicata a causa di:
A. ELEVATA DEGRADAZIONE
B. SCARSO ASSORBIMENTO
•Endopeptidasi presenti a livello intestinale (pepsina, tripsina, chimotripsina, elastasi)•Esopeptidasi (carbossipeptidasi A e B)
•Molecole di grande dimensioni•Assenza di meccanismi di trasporto attivo
ECCEZIONE: VACCINI ORALIle cui cellule bersaglio sono linfociti e antigen presenting
cells (APC) presenti nelle PLACCHE DEL PAYER
FOLLICOLO LINFOIDE:gruppo di cellule
contenenti le cellule M disperse in cellule epiteliali
centro germinale(area delle cellule B)
celluleepiteliali
lume intestinale
parete intestinale
cellule M
VIA PARENTERALE via d’elezione:
La scelta della via endovenosa,intramuscolare, sottocutanea e intraperitoneale dipende dall’emivita della proteina stessa e dalla concentrazione ematica necessaria per ottenere l’effetto farmacologico
Es: l’emivita del TPA è di pochi minuti, mentre quella di un
anticorpo monoclonale è di alcuni giorni
SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE
si può passare dalla somministrazione per via i.v. a quella i.m.
o s.c. tenendo conto che:
1. La prolungata residenza nel sito d’iniezione aumenta l’esposizione a reazioni di degradazione (es.”insulino-resistenza” di diabetici dovuta ad alte concentrazioni di peptidasi tissutali)
2. Dopo iniezione s.c. il farmaco può entrare nei capillari linfatici e non utilizzare il torrente circolatorio dando una differente biodisponibilità
si possono operare modificazioni nella proteina
(mutagenesi)
SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE
PER AUMENTARE L’EMIVITA
VIE ALTERNATIVE: POLMONARE TRANSDERMICA TRANSNASALE
Nel caso di una azione sistemica queste vie hanno limitata rilevanza, mentre possono essere valide qualora sia richiesta una azione locale.
IMPORTANZA VIA NASALEIMPORTANZA VIA NASALE
SOMMINISTRAZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE
ASSORBIMENTO DI PROTEINE TERAPEUTICHE
Aumento permeabilità delle barriere d’assorbimento (attraverso iontoforesi, uso liposomi, aggiunta di acidi grassi/fosfolipidi,acidi biliari, enamine derivate dalla fenilglicina, detergenti, derivati salicilici, ciclodestrine)
Diminuzione attività peptidasica nel sito
di assorbimento (attraverso l’uso di inibitori di proteasi)
Aumento della resistenza contro la degradazione (attraverso modificazioni della struttura molecolare)
Aumento tempo d’esposizione (con PEG-polietilenglicol)
APPROCCI PER AUMENTARE
ASSORBIMENTO
Approcci per il controllo della velocità di somministrazione
SISTEMI APERTI:•POMPE MECCANICHE•POMPE OSMOTICHE
SISTEMI CHIUSI:•COMBINAZIONI POMPE BIOSENSORI•SISTEMI AUTOCALIBRANTI•CELLULE SECRETORIE MICROINCAPSULATE
• SOMMINISTRAZIONE PULSATILE
• INFUSIONE CONTINUA
• TEMPI FLESSIBILI
Problemi:
1. Controllo del flusso (erogazione corrente,flusso nell’ago, perdita liquido dal catetere…)
2. Stabilità del farmaco a lungo termine (il farmaco deve essere stabile a t°ambiente e a 37 C°)
3. Anche con le pompe più sofisticate è necessario raccogliere dati per aggiustare il flusso (questo implica la raccolta invasiva di fluidi corporei)
POMPE MECCANICHE
Problemi:
1. Controllo del flusso (la velocità di rilascio è costante, condizione non sempre desiderabile)
2. Stabilità del farmaco (la dispersione/soluzione di proteina
deve essere stabile alla temperatura corporea)
POMPE OSMOTICHE
MEMBRANA SEMIPERMEABILE(DOVE ENTRA ACQUA)
RESERVOIR
AGENTE OSMOTICO
MEMBRANA IMPERMEABILEDEL RESERVOIR
MODERATORE DEL FLUSSO
CAPPUCCIO RIMUOVIBILE
SOLUZIONE DI FARMACO USCENTE
ESEMPIO DI MINIPOMPA OSMOTICA IMPIANTABILE
SOTTOCUTANEA
REAZIONI ENZIMA SUBSTRATO
Sono basati sul cambiamento di pH quando il glucosio viene convertito in
ac.gluconico. Il pH induce
cambiamenti nei polimeri acido-
sensitivi che iniziano così a rilasciare
insulina.
SISTEMI AUTOCALIBRANTIil rilascio della proteina viene controllato da
uno stimolo corporeo attraverso diverse strategie
concavalinaAconcavalinaA
concavalinaAconcavalinaA
beads di sefarosio beads di sefarosio
COMPETITIVE DESORPTION
GLUCOSIO INSULINA
E’ preferibile l’uso di una membrana che escluda le componenti umorali e cellulari del sistema immunitario per permettere alla cellule di vivere senza l’ausilio di agenti immunosuppressivi
CELLULE SECRETORIE MICROINCAPSULATE
CELLULE PRODOTTI DI SECREZIONE
NUTRIENTI
PORI DELLA MEMBRANA
SOMMINISTRAZIONE SITO-SPECIFICA
ANTICORPI MONOCLONALI UMANIZZATI
ANTICORPI BISPECIFICI
ANTICORPI CONIUGATI CON COMPOSTI ATTIVI
LIPOSOMI
A differenza dei farmaci sintetici, per i quali lo studio della biodistribuzione è necessario per
evitare l’accumulo di metaboliti tossici in particolari tessuti, la biodistribuzione di proteine terapeutiche indica solo l’avvenuta distribuzione del farmaco in un particolare tessuto, dato che gli
aminoacidi della proteina possono essere riutilizzati
BIODISTRIBUZIONE DI FARMACI PROTEICI
La misurazione della biodistribuzione viene effettuata con farmaci marcati (presenza di tirosine e lisine)
La difficoltà nell’eseguire studi di biodistribuzione impone di utilizzare l’intensità e la durata dell’effetto farmacologico come prova e misura dei livelli di un farmaco in un particolare tessuto
BIODISTRIBUZIONE DI FARMACI PROTEICI
SANGUE
DRUG
LINFA
SITO D’INIEZIONE
FA
RM
ACO
A B
ASSO
P.M
.
FARMACO AD ALTO P.M.
La biodistribuzione nei vasi linfatici dopo iniezione s.c. rappresenta l’unico meccanismo di trasporto per macromolecole, che raggiungono il torrente circolatorio indirettamente attraverso il sistema linfatico: composti con P.M. maggiore di 16kD vengono assorbiti dai vasi linfatici, mentre i composti inferiori a 1kD non vi penetrano quasi per nulla
ELIMINAZIONE DI FARMACI PROTEICI
1. PROTEOLISI
2. ESCREZIONE E METABOLISMO RENALE
3. METABOLISMO EPATICO
4. ELIMINAZIONE RECETTORE-MEDIATA AD OPERA DI ALTRE CELLULE
ELIMINAZIONE RENALE DI PROTEINE
aminoacidi
Tubulo Prossimale
Filtrato Glomerulare LumeAngiotensinaBradichinina
Tubulo Distale
Vaso Peritubulare
IL-2Insulina
CalcitoninaOrmone paratiroideo
vasopressina
Recettore
Lisosomi
Non mediato
ProteineGlomerulo
• Solo per piccole proteine (P.M.<68kD,raggio>20nm)
• La clearance renale è più alta per molecole caricate positivamente rispetto a quelle caricate negativamente
• Dopo la filtrazione glomerulare le proteine possono essere riassorbite dal tubulo prossimale tramite endocitosi e,una volta idrolizzate nelle cellule ad amminoacidi, ritornare nel circolo sistemico.
proteineproteine
METABOLISMO EPATICO
Diffusione passiva (solo per piccole proteine molto idrofobiche quali ciclosporina e peptidi ciclici)
Trasporto energia-dipendente (per peptidi di dimensioni più elevate)
Endocitosi mediata da recettore (per insulina ed EGF)
Recettori che legano gli zuccheri (per glicoproteine)
Proteine correlate al recettore per LDL- LRP (per t-PA, u-PA, trombospondina)
METABOLISMO EPATICO
La velocità di eliminazione intra-epatocita dipende dalla sequenza proteica e dalla presenza di siti di riconoscimento di endopeptidasi
Proteine a vita media elevata sono degradate in lisosomi
Gli oligopeptidi risultanti dall’attacco di endopeptidasi sono ulteriormente degradati da esopeptidasi e poi rientrano nel pool metabolico cellulare
ELIMINAZIONE RECETTORE-MEDIATA
AD OPERA DI ALTRE CELLULE
M-CFS viene eliminato dai reni quando è presente in elevate quantità: a
concentrazioni minori viene captato dai macrofagi con un
meccanismo recettore mediato saturabile
G-CSFe un suo derivato
(nartograstima) sono captati dal midollo
osseo attraverso un processo saturabile recettore mediato
PROTEINE DI LEGAME PLASMATICHE
Riportate per IGF-I, IGF-II, t-PA, GH, Dnase,NGF…
Il legame di proteine terapeutiche a proteine circolanti nel plasma rende
particolarmente complesse le cinetiche di distribuzione ed
eliminazione
ASPETTI FARMACODINAMICI DI FARMACI PROTEICI
La costruzione di curve DOSE-RISPOSTA è particolarmente utile nella sperimentazione di fase II dato che aiuta a scegliere la dose ottimale per la fase III
Si ritiene che i farmaci biotecnologici manifestino talora una curva dose-risposta a campana
SCALING INTERSPECIE
Le tecniche per la predizione di parametri farmacocinetici in una specie da dati derivanti da una specie diversa usando equazioni allometriche permettono di stimare il range di dosi da studiare, anche se non possono sostituire gli studi stessi.
P= a.Wb
P: parametro farmacocineticoW: peso corporeoa: coefficiente allometricob: esponente allometrico
IMMUNOGENICITA’
LA FORMAZIONE DI ANTICORPI AVVIENE IN GENERE DOPO SOMMINISTRAZIONE CRONICA DI PROTEINE TERAPEUTICHE
Gli anticorpi possono neutralizzarel’attività biologica
della proteina e possono modificarne la farmacocinetica
e farmacodinamica
La risposta immunitaria viene di solito indotta quando la proteina è estranea all’ospite:
inoltre le iniezioni extravascolari stimolano maggiormente
la produzione di anticorpi rispetto alla somministrazione per endovena
FORMULAZIONE DI PROTEINE/PEPTIDI TERAPEUTICI
2.DECONTAMINAZIONE VIRALE: analisi dei m.o. e cellule deputate alla produzione. Rischio nell’utilizzo di eccipienti derivati ematici (albumina)
1.STERILITA’: la produzione deve essere fatta in condizioni di sterilità per l’impossibilità di utilizzare sistemi di sterilizzazione quali radiazioni ionizzanti, gas e calore
fosfato Acido grasso
lipideA core catena antigenicalipopolisaccaride
zucchero
n
STRUTTURA DI UNA ENDOTOSSINA
3. RIMOZIONE PIROGENI: generalmente derivanti da batteri, funghi, virus che contaminano la preparazione (endotossine da Gram negativi quali LPS). In genere sono caratterizzati da carica negativa elevata. Stabili in condizioni standard di sterilizzazione in autoclave, vengono distrutti in presenza di temperature elevate a secco (>250° per 30 min.)
ECCIPIENTI USATI NELLA FORMULAZIONE DI PRODOTTI BIOTECNOLOGICI
1)AGENTI SOLUBILIZZANTI
2)AGENTI ANTIAGGREGANTI
3)AGENTI PER IL MANTENIMENTO DEL pH
4)CONSERVANTI ED ANTIOSSIDANTI
5)AGENTI OSMOTICI
6)TAMPONI
7)CARRIERS
AGENTI ANTIAGGREGANTI
Sono necessari per ridurre l’assorbimento della proteina terapeutica alle superfici della fiala, siringa, ago…. Es.assorbimento insulina su superficie idrofobica
CONSERVANTI ED ANTIOSSIDANTI
Per il blocco dell’ossidazione di metionina, cisteina, triptofano, tirosina e istidina in genere l’ossigeno viene sostituito con un gas inerte o tramite l’aggiunta di ascorbato.
Superficie idrofobica
cristallimonomeri
aggregati insolubili
AGENTI OSMOTICI
Si tratta di soluzioni saline e di mono/disaccaridi.Possono influenzare la termostabilità della proteina.
AGENTI SOLUBILIZZANTI
Bloccano l’aggregazione di proteine, soprattutto non glicosilate e ne evitano la precipitazione limitando interazioni idrofobiche e/o elettrostatiche.Il pH ha notevole importanza nel mantenimento del prodotto in soluzione: l’aggiunta di aminoacidi come lisina o arginina o di surfattanti come sodiododecilfosfato possono aumentare la solubilità.
Es.Effetto della concentrazione di argininasulla solubilità del TPA
ARGININA-FOSFATO
SO
LU
BIL
ITA
’
AGENTI PER IL MANTENIMENTO DEL pH
pH
hG
H m
g/m
l
Es. Solubilità del GH in funzione della variazione di pH
Tamponi usati per la formulazione di prodotti biotecnologici sono di solito fosfato, acetato, citrato
4 5
CONSERVAZIONE DELLE PROTEINE TERAPEUTICHE
SOLUZIONE ACQUOSA
FORME LIOFILIZZATE
TAVOLETTE
BIBLIOGRAFIA
•Wierda et al.”Immunogenicity of biopharmaceuticals in laboratory animals, Toxicology,(158)71-74,2001
•Bickel et al.”Delivery of peptides and proteins through the blood-brain barrier”,Advanced Drug Delivery Reviews,(46)247-79,2001
•Stoll et al.”A mechanistic analysis of carried-mediated oral delivery of protein therapeutics”,Journal of Controlled Release,(64)217-28,2000
•Stayton et al.”Molecular engineering of proteins and polymers for targeting and intracellular delivery of therapeutics”, Journal of Controlled Release,(65)203-220,2000
•Yang et al.”Effect of zinc binding and precipitation on structures of recombinant human GH and NGF”,Journal of Pharmaceutical Sciences, (89)1480-5,2000
•Witschi et al.”In vitro evaluation of microparticles and polymer gels for use as nasal platforms for protein delivery”,Pharmaceuticals Research,(16)382-90,1999