UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŽIVILSKA TEHNOLOGIJA

BIOTEHNOLOŠKA PROIZVODNJA BALZAMIČNEGA KISA*

Saša VOLK, Marjanca VIDMAR

(študentki tretjega letnika študija Živilske tehnologije)

prof. dr. Peter Raspor in asist. dr. Maja Paš (mentorja)

Ljubljana, 2003

*Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 2 1. UVOD............................................................................................................................. 3

SUMMARY ...................................................................................................................... 3

2. ZGODOVINA BIOPROCESA ............................................................................. 5

3. MIKROBIOLOŠKE OSNOVE BIOPROCESA ............................................ 7

3.1 SPLOŠNO O KVASOVKAH............................................................................................... 7 3.2 OZMOFILNE KVASOVKE ................................................................................................ 7 3.3 INHIBITORNI UČINEK OCETNE KISLINE NA OZMOFILNE KVASOVKE IZOLIRANE IZ BALZAMIČNEGA KISA.......................................................................................................... 8 3.4 SPLOŠNO O OCETNOKISLINSKIH BAKTERIJAH ............................................................. 11 3.5 OSNOVNE KARAKTERISTIKE RODU ACETOBACTER ..................................................... 11

4.BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA.................................................... 13

4.1 FERMENTACIJA ........................................................................................................... 13 4.1.1 Alkoholna fermentacija .................................................................................. 13 4.1.2 Ocetnokislinska fermentacija ......................................................................... 14

4.2 KEMIČNA SESTAVA BALZAMIČNEGA KISA .................................................................. 15 4.2.1 Glukonska kislina ........................................................................................... 16 4.2.2 Aminokisline .................................................................................................. 16 4.2.3 Kisline v kisu.................................................................................................. 16

4.3 NEENCIMSKO PORJAVENJE.......................................................................................... 17

5.BIOINŽENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA............................................... 21

5.1 PRIPRAVLJALNI POSTOPKI........................................................................................... 21 5.1.1 Obiranje grozdja ............................................................................................. 21 5.1.2 Kuhanje mošta ................................................................................................ 22 5.1.3 Priprava in lastnosti sodov.............................................................................. 23 5.1.4 Popravilo sodov .............................................................................................. 23

5.2 POTEK BIOPROCESA .................................................................................................... 24 5.2.1 Zorenje- staranje ............................................................................................. 24 5.2.2 Vzorčevanje .................................................................................................... 26

5.3 ZAKLJUČNI POSTOPKI ................................................................................................. 29 5.3.1 Avtoliza mikroorganizmov............................................................................. 29 5.3.2 Stekleničenje balzamičnega kisa .................................................................... 30

6. EKOLOŠKI ASPEKT BIOPROCESA ........................................................... 32

6.1 GOJENJE TRTE............................................................................................................. 32 6.2 VPLIV GNOJIL NA RAST ............................................................................................... 32 6.3 PESTICIDI.................................................................................................................... 32 6.4 OSTANEK PO STISKANJU-TROPINE............................................................................... 32

7. UPORABA BIOPROIZVODOV V PREHRANI......................................... 35

7.1 UPORABA BALZAMIČNEGA KISA KOT DODATKA OZIROMA ZAČIMBE........................... 35 7.2 BALZAMIČNI KIS KOT ZDRAVILO................................................................................. 36

8. REFERENCE............................................................................................................ 37

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 3 1. UVOD Balzamičen kis je poseben in zelo dragocen izdelek, ki ga že stoletja proizvajajo v pokrajini Modena in Reggio Emilia v Italiji. Dva glavna tipa balzamičnega kisa sta tradicionalni in industrijska različica. Tradicionalni balzamični kis zahteva več let staranja in je posledično tudi zelo drag. Izhodna surovina za izdelavo je grozdje sort Trebbiano in Lambrusco. Proizvodnja obsega 4 stopnje. Začne se z obiranjem grozdja, sledi stiskanje, kuhanje in koncentriranje mošta na polovico ali tretjino volumna in nato staranje. Mošt se po kuhanju pretoči v prvi in največji sod iz serije imenovane »baterija«.Vsak sod je iz drugačne vrste lesa. Najbolj pogosto so v uporabi hrastovi,češnjevi, jesenovi in kostanjevi sodi. Med najbolj cenjenimi pa so sodi iz murvinega in brinovega lesa. Baterije se nahajajo na podstrešjih, kjer je pozimi mrzlo in se mošt zbistri, ker se ustavijo procesi fermentacije, poleti pa je toplo in se ti procesi nadaljujejo. Mošt ponovno izhlapeva in se koncentrira.(www.balsamicvinegar.com) Fermentacija poteka dvostopenjsko, najprej poteče alkoholna fermentacija, ki jo vodijo ozmofilne kvasovke. Sledi še ocetnokislinska fermentacija z ocetnokislinskimi bakterijami rodu Acetobacter. Mošt se nato preliva iz večjih sodov v manjše. Da se balzamični kis lahko proda kot tradicionalni je potrebno vsaj 12 let staranja, čeprav ni nenavadno, da se v Modeni najdejo kisi, ki so stari 50 in več let. Preden balzamični kis prodajo je ocenjen in odobren v komiteju, ki ga je ustanovil konzorcij pridelovalcev tradicionalnega balzamičnega kisa iz Modene. Če odobrijo prodajo ga nato stekleničijo v majhne stekleničke, ki so enake za vse proizvajalce. Seveda je po pričakovanjih tradicionalni kis zelo drag in njegovo posebnost ceni le peščica ljudi, ki ga pijejo po nekaj kapljic po bogatem obroku. Obstaja tudi več komercialnih oziroma industrijskih različic balzamičnega kisa. V nekatere dodajajo vinski kis ali razne dodatke kot je karamela, za izboljšanje arome in okusa. Nekateri sledijo tudi tradicionalnim metodam proizvodnje, s tem, da močno skrajšajo čas staranja kisa.Ti komercialni tipi so cenejši in širše zastopani v trgovinah in mnogih kuhinjah. Imenujejo se Aceto balsamico di Modena.(Boscarol, 2000)

SUMMARY Balsamic vinegar is an exclusive and precious product for centuries made in Modena and Reggio Emilia in Italy.The two main types of balsamic are Tradicionale and industrial version. The raw material is obtained from the grapes Trebbiano and Lambrusco. The procedure necessary in order to obtain the traditional balsamic vinegar of Modena passes through four fundamental steps; the collection of the grape, the pressing, the cooking of must and aging. Than it is placed in the first in series of barrels called »batteria«. Each barrel is of a different type of wood such are oak, chesnut, cherry. And most precious mulberry barrels.These are placed in the attics where fermentation begins. The must is transfered from bigger to smaller barrel to obtain flavour and aroma. Variations of temperatures guarantee the quality of balsamic vinegar over the years. A minimum of 12 years of aging is required by law in order to be sold as balsamic Traditionale. Although 50 and more years is not uncommon in Modena. Before being put on the market, the vinegar must be certified and approved by a commitee set up by a consortium producers of balsamic vinegar of Modena. Once it has passed the commitee checks, the vinegar can be transferd to a small bottles, which are identical for all producers. Of course, as to be aspect it is very expensive and its speciallity can really be appreciated by few, who usually sip a few drops after a rich meal.

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 4 There are manny commercialized versions available. Some of these have vine vinegar or caramel added to enhance the taste. Others, basically follow the tradicional method but shorten the aging. These are more reasonably priced. They are called Aceto balsamico di Modena.

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 5 2. ZGODOVINA BIOPROCESA Kis in kuhan grozdni sok, sta se začela pojavljati že v tretjem tisočletju pred našim štetjem, in sicer na območju Egipta in Bližnjega vzhoda. Kasneje so ga Grki in Romani uporabljali za kisanje in konzerviranje hrane. Grozdnemu soku so dodajali vodo in tako ustvarili pijačo ali pa so ga kuhali skupaj z medom in dobili daleč razširjeno sladilo imenovano tudi defrutum sapa. V srednjem veku pa se je začel pojavljati tudi balzamični kis, oziroma laudatum acetum, ki so ga proizvajali na področju Cannose v Italiji. Balzamičen kis s tega področja je bil tradicionalen in je postal zelo znan in cenjen 1046, ko ga je dobil v dar grški cesar Henry III. od toskanskega markiza Bonifaca. Henry III. se je namreč na svoji poti v Rim, kjer je bil kronan, ustavil v Piacenzi-enemu najbolj znanih mest v provinci Reggio Emilie, od koder izvira najboljši tradicionalen balzamičen kis-in okusil »ta izvrstni kis«. Od tod se je rodil rek, ki pravi: »Tudi vas bo zanesla pot mimo Cannose«, kar bi pomenilo, da bi tudi vsakdo, ki bi zašel v te kraje, prosil za pokušino njihovega tradicionalnega balzamičnega kisa. Balzamični kis je bil v letu 1800 tako cenjen pri plemiških družinah, da je postal eden glavnih vrednosti, ki so jih podedovali sinovi plemičev. Tudi plemiške hčerke, ki so se poročile, so dobile za doto nekaj steklenic balzamičnega kisa ter garnituro majhnih sodčkov z enako vsebino. Kasneje, v 14. stoletju so obstoj balzamičnega kisa tudi dokumentirali. Proizvajala ga je rodbina Estensi in sicer na področju Modene v Italiji. Njihov kis je bil opisan kot mešanica starega kisa in sladila, s specifičnim grenko-sladkim okusom, po čemer se je tudi razlikoval od drugih kisov. V starih dokumentih je bil zabeležen tudi način proizvodnje balzamičnega kisa: zanj so uporabljali izključno belo in zelo sladko Trebbiansko grozdje, ki so ga stisnili. Ta sok so nato prenesli v stare sode, ki so že bili napolnjeni s starim kisom ter ga tako pustili dozorevati v balzamičen kis več let.(www.patryus.it)

Slika 1: Geografski prikaz Modene, od koder izvira tradicionalen balzamični kis.(http://www.balsamicvinegar.com)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 6 Do leta 1930 so balzamičen kis proizvajale izključno družine iz Modene in sicer na tradicionalen način. Vsaka družina, ki ga je znala tako proizvesti (kar je bila velika skrivnost), je grozdni sok pustila dozorevati v balzamičen kis, v posebnih sodih, ki so bili narejeni iz različnih vrst lesa (hrastovega, kostanjevega, češnjevega, brinjevega in murvinega). Pogoj za dobro dozorevanje pa je bilo tudi to, da so bili sodi shranjeni v podstrešnih prostorih, kjer so dozorevali od 12-50 let. Kis so pridobivali v zelo majhnih količinah in so ga uporabljali kot digestiv po kosilu ali kot dodatek sirom, jagodam in zelenjavi. Tradicionalen balzamičen kis je bil in je še dandanes zelo drag, cena za 100 ml je približno 14.000 tolarjev. Po letu 1930 pa se je pojavila tudi druga različica balzamičnega kisa-industrijska verzija. Proizvodnja takega kisa ni tako zahtevna, naredili so ga s prevretjem grozdnega soka in dodatkom vinskega kisa ter barvil. Zato je industrijski balzamičen kis veliko cenejši in posledično tudi slabše kakovosti. Kljub temu pa ljudje raje posegajo po tej novi različici, ki je vsestransko uporabna, kot po tradicionalnem, ki je v današnjem času zelo težko dosegljiv.(http://www.showcook.co)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 7 3. MIKROBIOLOŠKE OSNOVE BIOPROCESA Pri pretvorbi mošta v balzamični kis sodelujejo ozmofilne kvasovke in ocetnokislinske bakterije. Odnos med kvasovkami in bakterijami predstavlja izmenično delovanje najprej kvasovk v alkoholni fermentaciji, nato ocetnokislinskih bakterij pri oksidaciji etanola. Kvasovke se nahajajo na površini izhodne surovine, na grozdju. (Turtura,1984)

3.1 Splošno o kvasovkah Kvasovke so evkariontske enocelične glive, ki so definirane glede na morfološke in fiziološke lastnosti. So filogenetsko različna skupina organizmov in pripadajo dvem glavnim taksonomom: Ascomycotina in Basidiomycotina. Nespolno se razmnožujejo z brstenjem, nekatere tudi s cepljenjem.(Raspor,1996) Velikost celic je različna, glede na pogoje rasti. Nekatere kvasovke so velike le 2-3µm, druge 20-50µm. Celice so lahko elipsoidne, cilindrične, ovalne, okrogle oblike. Za rast rabijo makro hranila, kot so viri ogljika, dušika, kisika, žvepla, fosforja, in elemente v sledovih (Ca, Cu, Fe, Mn, Zn). Rastni faktorji so vitamini, ki v metabolizmu služijo kot koencimi. Rastni pogoji so različni glede na vrsto. Večina kvasovk dobro raste v toplih, aerobnih razmerah. Najbolje rastejo pri 20-30°C, najnižja maksimalna temperatura za rast je okoli 20°C, najvišja pa okoli 50°C. Za rast rabijo dovolj vode. Dobro rastejo pri pH 4.5-6.5. V aerobnih razmerah metabolizirajo sladkorje, medtem ko imajo v anaerobnih razmerah sposobnost fermentacije le nekatere vrste. Fermentacijske sposobnosti kvasovk so bile ugotovljene že pred tisočletji, s proizvodnjo vina, piva, kruha in kisa. Najbolj poznana je tako imenovana »pekovska kvasovka« Saccharomyces cerevisiae. Razmnožuje se nespolno z brstenjem in spolno s konjugacijo. Dobro raste ob prisotnosti glukoze, fruktoze, manoze, galaktoze, saharoze in maltoze. Nekatere kvasovke lahko izkoriščajo pentoze (ksiloza, arabinoza). Glavni metabolni poti pri kvasovkah sta respiracija ali fermentacija. Fermentativne kvasovke uporabljajo organske substrate anaerobno kot donorje elektronov, kot akceptorje elektronov ali vir ogljika. Dva okoljna faktorja, ki največkrat uravnavata respiracijo ali fermentacijo sta Pausterjev in Crebtreejev efekt. Poleg vloge kvasovk v proizvodnji hrane, pijač in zdravil, so pomembne tudi kot model evkariontske celice pri biomedicinskih raziskavah. Celotni genom Saccharomyces cerevisiae je bil raziskan v letu 1996. (Ledenberg,1992)

3.2 Ozmofilne kvasovke Že leta 1888 je Laurent opazil, da so se nekatere pivske in vinske kvasovke lahko razmnoževale v raztopinah glukoze, maltoze in saharoze , tudi pri koncentracijah do 60%. Na osnovi teh lastnosti je van der Walt razdelil te kvasovke na ozmofilne in ozmotolerantne. So enocelične glive, okrogle, jajčaste ali podolgovate oblike. Imenovane so tudi blastomicete, to so organizmi najmanj občutljivi na visoke koncentracije sladkorja v substratu. Nekatere med njimi ne tvorijo spor, zato so uvrščene med Fungi imperfecti. Tudi Kroemer in Krumbholz sta razdelila ozmofilne kvasovke v dve skupini; v prvo skupino kvasovke, ki posebno ljubijo visoke koncentracije sladkorja in tvorijo majhne koncentracije prostih hlapnih kislin. V drugo skupino pa vrste, ki so tolerantne na visoke koncentracije sladkorjev in tvorijo večje količine prostih hlapnih kislin. V industriji smatrajo za ozmofilne kvasovke tiste, ki se razvijajo v nasičeni raztopini saharoze(67°Brix), pri 25°C. Glede na Loderjevo sistematično razdelitev spadajo k

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 8 ozmofilnim kvasovkam vrste: Saccharomyces rouxii, Saccharomyces bailii var. osmophilus, Saccharomyces bisporus var. mellis, Saccharomyces microellipsoides var.osmophilus. K ozmotolerantnim pa: Debaryomyces, Schizosaccharomyces in Pichia. Ozmofilne kvasovke imajo navadno majhno fermentacijsko aktivnost ogljikovih hidratov. Saccharomyces bisporus var.mellis fermentira samo glukozo, v redkih primerih počasi fermentira saharozo. Saccharomyces rouxii fermentira glukozo, saharozo in maltozo pa zelo počasi. Saccharomyces bailii se smatra za vmesno vrsto med Saccharomyces bisporus in Saccharomyces rouxii, ker ne more izkoriščati maltoze. Čeprav lahko ozmofilne kvasovke fermentirajo visoke koncentracije sladkorjev, količina proizvedenega etanola ni velika.(Turtura,1984) Aquarone je to potrdil z raziskavami na rodovih Saccharomyces bisporus var. mellis in Saccharomyces bailii; prvi je ozmofilen, drugi pa ozmotoleranten rod. V tej raziskavi je ugotovil: a.) V ozmofilnih vrstah se fermentacija odvija počasi in na ta proces vpliva osmotski tlak, temperatura in pH vrednost. Visok osmotski tlak povzroča upočasnitev procesa, medtem ko višje temperature med 26 in 34°C povzročijo, da fermentacija poteka hitreje in bolj učinkovito. V vseh primerih se končni pH izrazito zniža v primerjavi z začetnim. b.) Vrste zahtevajo v hranilih prisotnost vitaminov, kot so biotin, tiamin in pantotenska kislina. c.) Saccharomyces bailii je veliko bolj temperaturno odporen kot Saccharomyces bisporus var. mellis. Namreč pri tlaku 20 atm prvi ostane aktiven po 15 minutah pri 70°C, drugi pa samo 5 minut pri 55 °C. d.) V zvezi s fermentacijskimi produkti je bilo ugotovljeno: proizvod etilnega alkohola je bil pri obeh vrstah skromen, čeprav so različno odporne na osmotski tlak in pH. Količina proizvedenih prostih hlapnih kislin je pri obeh vrstah v normalnih mejah. Očitno na njih ne vplivajo spremembe osmotskega tlaka. Proizvod glicerina je manjši pri Saccharomyces bisporus var. mellis in se pri obeh vrstah spreminja z osmotskim tlakom. Tvorba nukleinskih kislin se spreminja glede na okolje v katerem se odvija fermentacija. Ozmofilne kvasovke so prvotno spadale k rodu Zygosaccharomyces, ki ga je definiral Barker (1901). Ozmofilne vrste rodu Zygosaccharomyces so: Saccharomyces rouxii, Saccharomyces bailii var. osmophilus in Saccharomyces bisporus var. mellis. Ozmofilne kvasovke po geografski razporeditvi najbolj pogosto rastejo v področjih z vročim podnebjem. Ponavadi so prisotne v medih, marmeladah, sirupih, sadnih sokovih, koncentriranih moštih in grozdju. (Turtura,1984)

3.3 Inhibitorni učinek ocetne kisline na ozmofilne kvasovke izolirane iz balzamičnega kisa V prejšnjem stoletju so se začeli ukvarjati s preučevanjem kemijsko–fizikalnih karakteristik balzamičnega kisa. Z mikrobiološko sestavo balzamičnega kisa se je prvi začel ukvarjati Sacchetti (1970). S svojimi poskusi,ki jih je izvedel na podlagi vzorcev tradicionalnih balzamičnih kisov s področja Modene in Reggio Emilie, je pojasnil pomembno vlogo ozmofilnih kvasovk in ocetnokislinskih bakterij pri fermentaciji kuhanega (oziroma prevretega) mošta. Tako Sacchetti kot tudi drugi, ki so se ukvarjali s poskusi, so ugotovili, da ozmofilne kvasovke in ocetnokislinske bakterije delujejo v združbi, spontano in stimulativno-in vitro ter in vivo. Ozmofilne kvasovke fermentirajo sladkorje v alkohol, ocetnokislinske bakterije pa oksidirajo etanol v ocetno kislino. Žal pa tega niso mogli dokazati v živo, tudi po večkratnem in dolgotrajnem poskušanju mešanja obeh vrst mikroorganizmov med seboj. Njihov rezultat je bil vedno enak: kvasovke so ob

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 9 prisotnosti ocetnokislinskih bakterij podlegle njihovemu vplivu. V poskusu, ki ga je izvedel Sacchetti, je bil dokazan inhibitorni učinek ocetnokislinskih bakterij na ozmofilne kvasovke. Za poskus je vzel vzorec koncentriranega in prevretega mošta, ki je bil pripravljen na naslednji način: mošt je bil pretočen v enega izmed sodov »baterije« do ¾ celotnega volumna, kjer je zorel več let. Ta postopek je ponavljal vsako leto, vsakič s pretakanjem mošta v nov sod, kjer se je predhodno nahajal mošt iz prejšnjega leta. Tako so se z novim moštom zapolnile izgube starega mošta, ki je s staranjem počasi izhlapeval. Izoliral je kvasovke in ocetnokislinske bakterije. Vse izolirane ozmofilne kvasovke so bile izpostavljene ocetni kislini,v različnih koncentracijah: 0.25, 0.5, 0.75, in 1 % w/v, za koncentracijo glukoze 5, 20, 40, 60 % w/v, kar tudi prikazuje graf 2 . Poskus so izvedli v epruvetah, ki so jih nato inkubirali pri 25oC, dva tedna. Dobljeni rezultati so dokazali, da ne obstaja istočasna prisotnost in razvoj ozmofilnih kvasovk in ocetnokislinskih bakterij. Kvasovke pri fermentiranju splavajo na vrh soda in začnejo že ob najmanjšem razvijanju ocetno kislinskih bakterij odmirati. Ta proces se lahko prične že v moštu stoječem dve leti in se lahko odvija tudi pri zmanjšanem delovanju ocetnokislinskih bakterij v starih balzamičnih kisih. V mladem moštu je bila najdena prevladujoča vrsta kvasovk Zygosaccharomyces rouxii, kot sta to dokazala tudi Sacchetti (1970) in Turtura (1984). To dokazuje velik pomen te vrste pri spontani alkoholni fermentaciji prekuhanih, koncentriranih moštov. V zorečem moštu sta bili izolirani predvsem dve vrsti: ponovno je bila najdena vrsta Zygosaccharomyces rouxii, in sicer s pomočjo obogatitve z dodatkom 60 % glukoze, ter vrsta Saccharomycodes ludwigii, s pomočjo 20 % obogatitve z glukozo. V nobenem drugem primeru ni bilo prisotnih ostalih vrst kvasovk, saj je za na primer Zygosaccharomyces bailii značilno, da tolerira tudi do 2.5 % w/v ocetne kisline (Thomas in Devenport, 1985 ). Vse izolirane vrste Zygosaccharomyces rouxii so pokazale tudi pomembno stopnjo ozmofilnosti (razvidno iz grafa 1 (A in B )); in so se hkrati tudi pokazale kot izredno občutljivi na ocetno kislino. Že pri koncentraciji 1 % w/v ocetne kisline so bile popolnoma inhibirane (krivulja 1 na grafu 2) . Obratno pa so se na ocetno kislino odzvale vrste Saccharomycodes ludwigii, saj so pokazale večjo rezistentnost nanjo, a veliko občutljivost na koncentracijo sladkorjev. Vendar pa, po vsem tem, izoliranim in z glukozo obogatenim vrstam kvasovk ne moremo pripisati posebne vloge pri staranju in zorenju balzamičnega kisa. Na podlagi tega poskusa, smo hoteli predstaviti, kako na fermentacijo balzamičnega kisa vplivata dva različna razreda mikrobov-kvasovk in ocetnokislinskih bakterij. Fermentacijo bi lahko opisali kot skalaren proces, katerega začno kvasovke s fermentiranjem sladkorjev v alkohol in zaključijo ocetnokislinske bakterije z oksidiranjem etanola v ocetno kislino. Delovanje ocetnokislinskih bakterij, ob tvorbi ocetne kisline, popolnoma zavre rast kvasovk. Tako se alkoholna fermentacija zaključi in nastopi ocetnokislinska fermentacija. Inhibicija te vrste so že dolgo poznali (Gilliland in Lacey, 1966, Margheri 1971, Joyeux s sodelavci 1984a, 1984 b) in so ravno zaradi poznavanja delovanja obeh vrst mikrobov najprej dodajali kot starter kulture kvasovke, šele nato pa ocetnokislinske bakterije.(Sacchetti,1991)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 10

Graf 1: Toleranca izoliranih kvasovk na glukozo. Na abscisi so prikazane koncentracije glukoze pomnožene z sto, na ordinati pa procent rasti ozmofilnih kvasovk. Krivulji A in B prikazujeta Zygosaccharomyces rouxii, krivulja C pa vrsto Saccharomycodes ludwigii. (Turtura,1984)

Graf 2: Prikaz tolerance izoliranih ozmofilnih kvasovk na ocetno kislino. Na abscisni osi so podane različne koncentracije ocetne kisline, na ordinati pa procent rasti kvasovk ob prisotnosti različnih koncentracij ocetne kisline. Krivulja 1 prikazuje rod Zygosaccharomyces rouxii, krivulja 2 pa vrsto Sacccharomycodes ludwigii. (Turtura,1984)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 11 Močno vrelne kvasovke Rod Saccharomyces so močno vrelne kvasovke. Lahko povrejo sladkor v alkohol z volumskim deležem 9-12 %. Iz rodu Saccharomyces pridobivajo s selekcijo populacijo najboljših sevov za relativno ali absolutno čisto alkoholno vrenje.(Cör,1997) Šibko vrelne kvasovke So prisotne predvsem na površini grozdja in začnejo spontano alkoholno vrenje. Njihovo delovanje preneha v 3-6 dneh, ko jih začne ovirati lastno proizvedeni alkohol.(Cör,1997) Od selekcioniranih kvasovk se zahteva:

• Kratka faza razmnoževanja in hiter pričetek alkoholnega vrenja, tako lahko hitro prevladujejo nad nezaželjenimi kvasovkami

• Alkoholno vrenje mora potekati enakomerno, brez zastojev • Pri vrenju naj se tvori čim manj pene, da prihranimo na vrelni prostornini • Pri pretvorbi sladkorjev naj bo malo hlapnih kislin • Nastali sekundarni proizvodi alkoholnega vrenja naj bodo takšni, da povečujejo

kakovost izdelka(Cör,1997)

3.4 Splošno o ocetnokislinskih bakterijah Bakterije, ki omogočajo proizvodno kisa, pripadajo rodu Acetobacter in Gluconobacter. Slednje producirajo veliko količino glukonske kisline iz glukoze, ne tvorijo filma na površini tekočega medija, slabo rastejo na etanolnih substratih in ne povzročajo superoksidacije ocetne kisline v CO2 in H2O, zaradi nepopolnega ciklusa trikarboksilnih kislin.(Ramuš,1996) Ocetnokislinske bakterije, ki pripadajo rodu Acetobacter in Gluconobacter, so sorodne in pripadajo isti družini Acetobacteraceae. Od ostalih rodov se ločijo po tem, da prenesejo nizke pH vrednosti substrata. Fermentacijski substrat mora vsebovati etanol, vodo in hranilne snovi. Praksa je pokazala, da je največji volumski delež etanola, ki ga ocetnokislinske bakterije še prenesejo 15 %.(Ramuš,1996)

3.5 Osnovne karakteristike rodu Acetobacter So obligatno aerobne bakterije, nahajajo se v zraku, v alkoholnih tekočinah v vinskih kleteh in sodih. Celice so elipsoidne do paličaste oblike ali rahlo ukrivljene, dolge 0.6-0.8 do 1.0-4.0 µm, nahajajo se posamezno, v parih ali verigah. Bakterijske celice so lahko negibljive ali gibljive. Slednje imajo peritrihe ali lateralne bičke. Endospore niso formirane. So Gram negativne in obligatni aerobi. Metabolizem je respiratorni, nikoli fermentativni. Tvorijo blede kolonije, večina vrst ne producira pigmentov. Test na prisotnost katalaze pri bakterijah rodu Acetobacter je pozitiven, na prisotnost oksidaze pa negativen. Prav tako ne

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 12 utekočinjajo želatine, ne formirajo inola niti H2S. Oksidirajo etanol v ocetno kislino, acetat in laktat pa oksidirajo do CO2 in H2O (superoksidacija), ker imajo vse encime Krebsovega cikla. Najboljši viri za rast teh bakterij so etanol, glicerol in laktat. Ne hidrolizirajo škroba, niti laktoze. Optimalna temperatura za rast ocetnokislinskih bakterij je 25-30°C, najnižje temperature, pri katerih lahko še živijo so 6-10°C, optimalna pH vrednost pa je 5.4-6.3. Kratkotrajno segrevanje na 48-50°C je dovolj, da bakterije odmrejo. Bakterije rodu Acetobacter na površini tekočega medija tvorijo prstan, opno ali film. V nekaterih primerih povzročajo enakomerno motnost medija in usedlino. Vrste rodu Acetobacter razgrajujejo sladkorje v heksoza monofosfatni poti in v ciklusu trikarboksilnih kislin Bakterije Acetobacter metabolizirajo le heksoze. Oksidacija glukoze je katalizirana z glukoza-oksidazo, ki uporablja kot prostetitično skupino FAD.(Ramuš,1996)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 13 4.BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA

4.1 Fermentacija Fermentacija je splošni izraz za anaerobno razgradnjo glukoze in drugih organskih hranil, za pridobitev energije v obliki ATP. Anaerobna razgradnja glukoze je najstarejši biološki proces pridobivanja energije iz energijsko bogatih molekul, ravno zato, ker so prvi živeči organizmi rasli v okolju brez kisika. Skozi evolucijo se je kemizem zaporednih reakcij fermentacije popolnoma ohranil in ostal nespremenjen, glikolitični encimi so si še vedno podobni po aminokislinski sestavi in 3D strukturi. Končni fermentacijski produkt je odvisen od vrste mikroorganizmov, ki izvajajo fermentacijo.(Lehninger,2nd ed.) Kis je razredčena raztopina ocetne kisline, dobljen v dvofaznem postopku. V prvi fazi se fermentirajoči sladkorji spremenijo v alkohol ob delovanju kvasovk, v drugi fazi pa se etanol oksidira do ocetne kisline (Adams, 1985).

4.1.1 Alkoholna fermentacija Alkoholna fermentacija je anaeroben proces, kjer potekajo velike biokemijske spremembe. Anaerobnost se vzpostavi postopno, ko ves CO2 izpodrine zrak in kvasovke porabijo preostali kisik s svojo metabolno aktivnostjo. Etanol ne nastane direktno iz glukoze,temveč iz piruvata. Tega kvasovke tvorijo iz glukoze v zaporedju več reakcij, ki jim skupno pravimo Embden-Mayerhoff-Parnasova pot razgradnje glukoze. V prvi reakciji, ki jo katalizira piruvat dekarboksilaza se piruvat pretvori v acetaldehid, ki se na koncu reducira z alkohol dehidrogenazo v etanol.(Boscarol,2000) Ustvarijo se anaerobne razmere, pH pade in koncentracija etanola se dvigne, to pa ima tudi ihnhibitorni učinek na mnoge mikroorganizme. Na koncu fermentacije, ko kvasovke porabijo ves sladkor, se spet vzpostavijo aerobne razmere in dovoljujejo rast ocetnokislinskim bakterijam na površini tekočine oziroma kisa. Ves sladkor se ne pretvori v etanol, ker vstopa tudi v druge metabolne cikle. Zato so izkoristki alkoholne fermentacije manjši od 90 %.(Cör,1997) GLUKOZA PIRUVAT ACETALDEHID ETANOL Shema 1: Pretvorba glukoze v etanol Optimalna temperatura za razmnoževanje kvasovk je med 25-28°C. Večja odstopanja od temperature imajo negativen vpliv na potek alkoholnega vrenja. Višja temperatura povzroča oblikovanje stranskih produktov alkoholnega vrenja. Če je temperatura previsoka, lahko pride do prekinitve alkoholnega vrenja. Tudi nizka temperatura ni primerna, ker prav tako pride do zastojev vrenja.(Cör,1997) Teoretično iz 1 g glukoze nastane pri alkoholni fermentaciji 0.51 g etanola. Ta teoretična vrednost ni nikoli dosežena zaradi tvorbe nekaterih drugih metabolitov.Čas trajanja alkoholne fermentacije je odvisen od več dejavnikov, večinoma pa je zaključena v 48 do 72 urah.(Boscarol,2000)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 14 4.1.2 Ocetnokislinska fermentacija Ocetno kislino dobljeno s fermentacijo imenujemo kis. Ta fermentacija je močno oksidativna pri čemer ocetnokislinske bakterije oksidirajo razredčeno raztopino etanola s kisikom iz zraka v ocetno kislino in vodo (Jernejc in Legiša 1992). Zaradi nastajanja in kopičenja ocetne kisline, se pH zniža do vrednosti 3 ali manj. Sposobnost ocetnokislinskih bakterij, da oksidacijo etanola izvajajo pri tako nizkem pH, jih razlikuje od vseh ostalih bakterij. Ocetnokislinsko fermentacijo spremljajo tudi sekundarne fermentacije, ki kombinirano proizvajajo vonj in tipično aromo kisa. Oblikujejo se majhne količine hlapnih substanc, ki se spreminjajo od kisa do kisa, odvisno od osnovne surovine, ki mu dajejo pestrost vonja, okusa, barve in ostalih lastnosti.(Plessi,1993) Ocetnokislinska fermentacija je najbolj pogosto prikazana s kemijsko reakcijo: CH3-CH2OH CH3COOH + H2O Pretvorbo etanola do ocetne kisline sestavljata dve zaporedni reakciji: Prva stopnja je nastanek acetaldehida, ki reagira z vodo in nastane hidriran acetaldehid. V drugi stopnji se ta acetaldehid oksidira oziroma dehidrogenira v ocetno kislino.(Cor,1997) Ti dve reakciji katalizirata membransko vezani alkohol dehidrogenaza in aldehid dehidrogenaza. Obe sta vezani na zunanjo površino periplazmatične membrane in katalizirata reakcije v periplazmatskem prostoru. Celotni aldehid se ne pretvori v ocetno kislino, ampak ga nekaj ostane v mediju kot aromatična komponenta.(Ramuš,1996) Potek celotnega procesa prikazuje shema:

Shema 2: Shematični prikaz produkcije kisa (Adams, 1985)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 15 Dejstvo, da pri ocetnokislinski fermentaciji govorimo o oksidaciji, nam pove, da mora biti za uspešno kisanje bakterijam na voljo dovolj zraka oziroma kisika. Teoretično je za oksidacijo 1 l etanola potrebnih 430 l kisika pri 30°C. Ker kisik predstavlja cca 20 % zraka in ker bakterijska oksidacija ni kvantitativen proces, je potrebna količina zraka vsaj 10-krat večja. Sprošča se tudi energija, in sicer 118 kJ/ mol. Fermentacija največkrat poteka pri 30°C. Čas trajanja ocetnokislinske fermentacije je predvsem odvisen od načina proizvodnje.(Boscarol,2000) Teoretično iz 1 g glukoze dobimo 0.51 g etanola, iz tega pa nato 0.67 g ocetne kisline. Praktično je končnega produkta vedno manj za 15-20 %, predvsem zato, ker so alkohol, acetaldehid in ocetna kislina hlapne spojine. Za 1 % ocetne kisline je v praksi potrebno vsaj 2 % sladkorja v začetni surovini.(Cör,1997)

Shema 3: Shematični prikaz kemizma oksidacije etanola v ocetno kislino (Lafon-Lafourcade, 1983)

4.2 Kemična sestava balzamičnega kisa Dobro kakovost, barvo in vrednost dajejo kisu njegove kemijske snovi iz grozdja. Glede na vsebnost kemijskih snovi ločimo dve vrsti kisa, in sicer »Aceto balsamico di Modena« In »Aceto balsamico tradizionale di Modena«. Po zakonu mora industrijski balzamični kis vsebovati:

a.) temno barvo, sladko-kisel okus in karakteristično aromo b.) celotno kislino 6 g/100 ml( izraženo v g ocetne kisline /100 ml kisa) c.) maksimalno količino alkohola1.5 % d.) suho snov (sladkorjev) minimalno 30 g/l (Sacchetti,1991)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 16 Za tradicionalen balzamični kis veljajo naslednje zahteve:

a.) biti mora temno rjave, svetlikajoče in polne barve b.) imeti mora primerno gostoto (1.5) c.) prav tako mora imeti kompleksen, dišeč, prodoren in specifičen vonj d.) tudi okus mora biti karakterističen, ustvarjen preko dolgega zorenja. Okus mora biti

v popolni harmoniji z vonjem.(Sacchetti,1991) Za potrditev vseh teh karakteristik se morajo opraviti senzorične analize kisa, pregled mikrostrukture,vonja in barve in kemijske analize. Senzorična analiza je nepogrešljivo dopolnilo kemijskim analizam za celostno oceno kakovosti kisa. Vzorec analitiki pripravijo tako, da kis razredčijo z vodo ali ga nevtralizirajo z bazo na 1 % ocetne kisline. Degustirajo v majhnih odmerkih, nekaj kapljic z direktnim nanosom na jezik, z vmesnimi premori. Pri razredčevanju vzorcev se je potrebno zavedati, da je tako uničena prvotna aroma. (Trček,1996)

4.2.1 Glukonska kislina Glukonska kislina je kazalnik prisotnosti tradicionalnega balzamičnega kisa. Raziskave so pokazale, da vsebuje tradicionalni balzamični kis v primerjavi z komercialnim ali običajnim vinskim kisom, veliko večje količine glukonske kisline. Vrednosti glukonske kisline se v tradicionalnem kisu gibljejo od 0.27 do 3.38 g/100 g proizvoda. V komercialnem kisu so te vrednosti od 0.04 do 0.15 g/100 g kisa. Vsebnosti glukonske kisline v vinskem kisu so še manjše. Pojasnilo teh razlik je v tem, da je tradicionalni balzamični kis veliko bolj koncentriran od ostalih kisov. Tako različna sestava je tudi posledica različnega mikrobiološkega poteka procesa.Ugotovili so, da pri procesu ocetnokislinske fermentacije tradicionalnega kisa verjetno sodelujejo bakterije rodu Gluconobacter ssp.(Trček,1996)

4.2.2 Aminokisline Aminokisline v kisu izvirajo iz izhodne surovine, v tem primeru iz grozdja, ali so produkt alkoholne fermentacije ali pa nastanejo pri ocetnokislinski fermentaciji. Prevladujoče proste aminokisline v balzamičnem kisu so prolin, alanin, asparaginska kislina, glutaminska kislina. Prolin predstavlja 46 % celotne vrednosti prostih aminokislin. Njegov glavni izvor je grozdje.(Trček,1996) Na podlagi vsebnosti prolina lahko napovemo celotno vsebnost aminokislin v kisu (Gonzales s sod., 1987).

4.2.3 Kisline v kisu Kisline v kisu; vinska, jabolčna, citronska izvirajo iz osnovne surovine za pridobivanje kisa. Med alkoholno fermentacijo in ocetnokislinsko fermentacijo nastajajo še jantarna, jabolčna in ocetna kislina. Skupne soli kislin varirajo glede na tip kisa. Zelo so visoke v Tradicionalnem balzamičnem kisu, manjše vrednosti so v vinskem kisu ali sintetično proizvedenih kisih. Vinska kislina je v kisu v obliki K- tartrata in vpliva na barvo in bistrost kisa. Citronska kislina je v kisu v minimalnih količinah, prispeva k stabilnosti izdelka. Jabolčna kislina je v kisu zastopana v majhnih koncentracijah. Vsebnost te kisline je odvisna od sestave osnovne surovine, alkoholne fermentacije( kvasovke jo porabljajo ali sintetizirajo). Jantarno kislino prav tako sintetizirajo kvasovke med fermentacijo. Ocetna

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 17 kislina predstavlja 98 % skupnih kislin v kisu in je značilen proizvod oksidacije pod vplivom ocetnokislinskih bakterij. Skupna kislost v balzamičnem kisu je okrog 6.25 %. Določena je s titracijo kisa z standardno alkalno raztopino, izražena je z grami ocetne kisline na 100 ml kisa. V kisu je karakteristična prisotnost acetaldehida, ki je vmesni produkt fermentacije. Kvalitativna in kvantitativna določitev organskih kislin v kisu je mogoča z uporabo kolone na tekočinskem kromatografu visoke ločljivosti. Dobljeni rezultati so zanesljivi in hitri.(Trček,1996)

4.3 Neencimsko porjavenje Porjavenje živil med toplotno obdelavo in skladiščenjem- v našem primeru med dolgotrajnim staranjem kisa v sodih- nastane kot posledica Maillardove reakcije. Ta obsega reakcije med sladkorji in aminokislinami, peptidi in beljakovinami, oksidacije askorbinske kisline in karamelizacije sladkorjev z ali brez katalitičnega delovanja kislin. Pri proizvodnji balzamičnega kisa gre izključno za reakcije med sladkorji (pridobljenimi iz grozdja) in aminokislinami , ki v kis splavajo ob avtolizi mikroorganizmov. Tvorba temno obarvanih pigmentov v živilih med predelavo in skladiščenjem je zelo splošen pojav. Pri tem gre za spremembo okusa, barve in hranilne vrednosti. V številnih primerih so omenjene spremembe prijetne, kot na primer pri peki kruha, pripravi toastov, praženju kave, kakava in vsekakor tudi pri balzamičnem kisu, ki mora tudi po Zakonu biti temne barve. V drugih primerih pa sta sprememba barve in okusa neprijetna, kot na primer pojav rjave barve steriliziranega in uparjenega mleka. Čeprav so končni rezultati praktično enaki, so reakcije ki vodijo k rjavemu obarvanju živil (posebno zadnja stopnja tvorbe pigmentov), lahko smatramo, da obsega neencimsko porjavenje živil ter različne mehanizme:

a) Maillardovo reakcijo, ki se prične z interakcijo med amino skupino aminokislin, peptidov ali proteinov z glikozidno hidroksilno skupino sladkorjev in se konča s tvorbo rjavih dušikovih polimerov ali melanoidinov.

b) Reakcije, ki obsegajo oksidacijo askorbinske kisline c) Karamelizacijo sladkorjev z ali brez katalitskega delovanja kislin.

Pri živilih, ki predstavljajo kompleksen sistem, pride do kombinacije vseh treh mehanizmov. Najpomembnejše sestavine živil, ki sodelujejo pri neencimskem porjavenju, so nizkomolekularni ogljikovi hidrati in njihovi derivati (sladkorji, sladkorne kisline, askorbinska kislina), proste aminokisline in proste amino skupine proteinov in peptidov. Porjavenje pa lahko nastane tudi v odsotnosti dušikovih spojin. Produkti začetnih reakcij, ki vodijo do porjavenja, so brezbarvni. Nadaljevanje reakcij karakterizira tvorba spojin, ki so vedno močnejši reducenti. Tvorijo se nenasičene vezi karbonilne skupine, odceplja se voda iz ogljikovih hidratov in CO2 iz aminokislin. Reakcije porjavenja spremlja tvorba hlapnih snovi, ki so odgovorne za tvorbo karakterističnih vonjev. Končno stopnjo procesa obsega polimerizacijske reakcije, katerih rezultat je tvorba temnih pigmentov. (Zelenik-Blatnik,1986)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 18 Maillardova reakcija Francoski kemik Maillard je bil prvi, ki je študiral kondenzacijo sladkorjev z aminokislinami in leta 1912 objavil, da se pri segrevanju omenjenih spojin tvorijo rjave snovi. Potek neencimskega porjavenja kot posledice Maillardove reakcije, lahko delimo v naslednje stopnje: a) Tvorba N-substituiranega glikozilamina

b) Amadori odnosno Heynsova premestitev glikozilamina c) Pretvorba produktov premestitve v dikarbonilne spojine d) Nadaljna pretvorba dikarbonilnih spojin e) Streckerjeva razgradnja f) Tvorba melanoidinov

Opis posamezne reakcije: a) Glikozilamin se tvori pri reakciji aldoze ali ketoze s primarno aminoskupino aminokisline, peptida ali beljakovine. Aldehidi reagirajo s spojinami, ki posedujejo aminoskupine po naslednji shemi:

Sladkorji tvorijo slične spojine z amini, aminokislinami. To je prva stopnja Maillardove reakcije. Adicija amina se vrši na karbonilno skupino odprte verige sladkorja, odcepi se voda in obroč se razpre.

Za reakcijo med glukozo in glicinom lahko napišemo:

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 19 Aktivnost reaktantov je odvisna od tipa sladkorja in aminokisline. Pentoze so bolj reaktivne od heksoze, aldoze na splošno bolj kot ketoze, monosaharidi bolj kot disaharidi. Pri aminokislinah so močno bazične bolj reaktivne (lizin). b)Amadori odnosno Heynsova premestitev N-glikozilaminov; Če reagira aldoza z amino spojino vsebuje reakcijska zmes kmalu derivate ketoz- ketozamine. Obratno, derivati aldoz se tvorijo, če je izhodni sladkor ketoza. Za stopnjo kondenzacije sledi stopnja premestitve. Premestitev glikozamina da fruktozamin (1-amino-1-deoksi fruktoza). Amadori premestitev:

Izomerizacija aldozaminov v ketozamine je znana kot Amadori premestitev. Izomerizacija ketozilaminov pa sledi Heynsovi premestitvi. Heynsova premestitev:

c) Pretvorba produktov premestitev v dikarbonilne spojine. Produkti premestitve so sekundarne aminospojine in morejo reagirati z drugo molekulo sladkorja. Pri tem nastale diketoze-aminokisline so za nadaljnji potek reakcije zelo pomembne. Pretvorijo se namreč v dikarbonilne spojine preko 1,2 enolizacije. Na ta način se razgradijo tudi Fruktozamini, vendar počasneje kot difruktozamini. Potek 1,2 enolizacije:

Fruktozamin se najprej izomerizira v enolno obliko (1). Nato se eliminira OH skupina na mestu 3, pri čemer se tvori Schiffova baza (3). Pri hidrolizi naslednje nastane 3-deoksisuloza (4) v enolni obliki. Po odcepitvi vode se tvori nenasičena osuloza (1,2 dikarbonilna spojina), ki pride v hidroksimetil furfural (6) z odcepitvijo druge molekule vode.

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 20 Rezultat zgornjih reakcij je odcepitev aminoskupine in postopna dehidratacija sladkornih derivatov. Druga pot tvorbe dikarbonilnih spojin poteka s pomočjo 2,3 enolizacije produktov Amadori premestitve. Intermediati te preosnove so reduktoni, spojine naslednje strukture:

Te spojine dobimo s ketozaminov na sledeč način:

d) Nadaljna pretvorba dikarbonilnih spojin. Dikarbonilne spojine, ki se tvorijo pri 1,2- enolizaciji (osuloze) se z odcepitvijo vode pretvorijo v hidroksimetilfurfural, če je začetni sladkor heksoza. Dikarbonilne spojine, ki pa nastanejo pri 2,3- enolizaciji, se pretvorijo v reduktone, ki se lahko cepijo v manjše molekule kot ocetno kislino, piruvaldehid in druge. Reduktoni vsebujejo metilno skupino, kar je dokaz za obstoj mehanizma 2,3- enolizacije. e) Streckerjeva razgradnja. Ena najvažnejših reakcij dikarbonilnih spojin je Streckerjeva razgradnja aminokislin, ki se dekarboksilirajo:

Pri reakciji pride do simultane deaminacije in dekarboksilacije aminokisline v aldehid. Poskusi so pokazali, da izvira 90-100% odcepljenega CO2 pri Maillardovi reakciji od aminokislin in ne od sladkorjev. Kot dikarbonilne spojine pri Streckerjevi razgradnji služijo osuloze in reduktoni. f) Tvorba melanoidinov. Pri modelnih poskusih sistema, ki sestoji iz sladkorja in aminokisline kmalu nastane kompleksna zmes zelo reaktivnih spojin: furfural in derivati, deoksi in nenasičene osuloze, aldehidi Streckerjeve razgradnje, aldehidi in ketoni od cepitve sladkorjev… Končna stopnja reakcije porjavenja živil obsega polimerizacijo karbonilnih intermediatov z ali brez udeležbe aminokislin. Polimerizaciji karbonilnih spojin sledi aldolna kondenzacija, ki jo katalizira prisotnost aminokislin. Kopolimerizacija karbonilnih spojin s prisotnimi amino skupinami je možen mehanizem tvorbe rjavih pigmentov. Končni produkti reakcije, rjavi melanoidini, sokompleksni visokomolekularni pigmenti neznane strukture. Tvorbo sličnih rjavih pigmentov kot nastanejo pri predelavi živil, je bilo mogoče ponoviti tudi z različnimi modelnimi poskusi. K melanoidinom vodi torej več različnih poti.(Zelenik-Blatnik,1986)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 21 5.BIOINŽENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA

5.1 Pripravljalni postopki

5.1.1 Obiranje grozdja Obiranje se začne pozno jeseni, ko je razmerje med kislinami in sladkorji povišano. Grozdje je predvsem iz bele sorte Trebbiano, rdeče Lambrusco grasparorosso in tudi bele sorte Occhio di Gatta. Trebbiano sorta se uporablja najbolj pogosto, ker dozori bolje in ima bolj sladek sok. Grozdje se nato zdrobi in rahlo stisne na prešah. Nato je potrebno mošt filtrirati in odcediti, da ga v celoti ločimo od trdnih delcev in umazanije.(www.acetum.it)

Slika 2: Grozdje Trebbiano in Lambrusco za izdelavo balzamičnega kisa (www.italianfoodforever.com)

Slika 3: Obiranje grozdja (www.patryus.com)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 22

5.1.2 Kuhanje mošta Mošt moramo vsaj 24 ur po stiskanju kuhati, da se izognemo fermentaciji. Kuhamo ga zato, da se koncentrira, njegov volumen zmanjšamo za polovico ali za tretjino. V preteklosti so mošt kuhali v bakrenih kotlih na odrtem ognju. Lastnosti bakra povečajo izločanje sladkorja. Danes poteka proces kuhanja večinoma v posodah iz nerjavečega jekla s plinskimi gorilniki. Nerjaveče jeklo poskrbi za večjo površino kuhanja. Temperaturo kontrolira termostat, zato da se sok ne zažge, ampak se počasi greje in koncentrira. Kotli niso zaprti, zato da lahko nemoteno poteka evaporacija in redukcija mošta. Kuhamo ga vsaj 24 ur, po kuhanju je vsebnost sladkorjev v moštu 24- 30 %. Skoncentriran mošt nato prelijemo v lesen sod, kjer nekaj mesecev poteka fermentacija. (www.napoleoncoo.com)

Slika 4: Priprava sodov, stiskanje in kuhanje mošta nekoč ter danes (www.napoleoncoo.com)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 23

5.1.3 Priprava in lastnosti sodov Ključ za proizvodnjo dobrega balzamičnega kisa je v sodih. Vsak sod je narejen iz različne vrste lesa, ki doprinese k aromi in okusu končnega izdelka. V »bateriji« mora biti 6-12 različnih sodov skozi katere »potuje« balzamični kis. Pridelovalci imajo razlike v zaporedju, količin in iz kakšnega lesa je sod. Sodi so ponavadi iz kostanjevega, hrastovega, češnjevega, akacijevega, jesenovega, murvinega, in brinovega lesa. Hrastov in kostanjev les se uporabljata zato, da se izločijo tanini, ki dajejo kisu barvo. Jesenov, akacijev in les divje češnje se uporabljajo, ker dajejo kisu sladkast okus. Najbolj cenjen je brinov in murvin les, ker izboljšujeta aromo in specifično težo kisa. Les, ki je mehek se uporablja na začetku, trden les pa na koncu procesa proizvodnje balzamičnega kisa. Več let traja, da se nov sod pripravi. Nov sod najprej napolnijo z vrelo slano vodo. Ta voda nato ostane v sodu dva dni, da se iz lesa izloči nekaj taninov. Nato se slana voda odlije in sod se ponovno napolni z vrelim vinskim kisom. Po tem se sod spet izprazne in napolni z vinom, ki se v enem letu spremeni v kis. Ta proces v les »vcepi« ocetnokislinske bakterije, ki so kasneje potrebne za proces ocetnokislinske fermentacije, ko je dodan mošt. Sod se še enkrat oplakne z vinskim kisom. Nato ga postavijo v »baterijo«. Pripravljen je, da vanj nalijemo mošt. Sod potem ni nikoli več popolnoma prazen ali napolnjen. Vedno je vsaj 25 % prostora v sodu zapolnjeno z zrakom. (www.napoleoncoo.com)

5.1.4 Popravilo sodov Po tem, ko je vrednost starega soda vložena v to, da daje aromo, okus in barvo, se nanj, na notranji strani začno nabirati skorjaste obloge mikroorganizmov, ki ovekovečujejo specifičnost kisa. Hkrati pa povzročajo razjede, zato je potrebno sode obnoviti. Za to poskrbijo izurjeni sodarji: sod, namenjen popravilu postavijo na polico, kjer previdno odstranijo obroče. Pri tem trdno zvežejo lesene doge z robustnimi vrvmi, da sod ne razpade. Nato pa stare doge eno za drugo prevlečejo z novimi dogami. Tako sodi postajajo vse debelejši in s tem ohranimo dragocene organizme v notranjosti.

Slika 5: Prikaz popravila soda.(Sacchetti,1991)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 24

5.2 Potek bioprocesa Kot je znano, je kis ki nastane ob počasnem kisanju veliko bolj kvaliteten in cenjen kot kis, ki nastane s hitro pretvorbo alkohola v ocetno kislino. Pri hitro nastalem kisu ima mošt, ki je istočasno pretvorjen v kis, enako stopnjo alkohola, kot vstopni mošt. Ta proces se odvija s hitro oksidacijo mošta, katerega mikrobna biomasa pride v stik z alkoholom in ga v nekaj urah pretvori v ocetno kislino. V tem procesu ni nobenih sekundarnih produktov, ki bi obogatili nastali kis, je kis manj kvaliteten. Razlike med tradicionalnim in industrijskim balzamičnim kisom so dokazali z analizo dna, oblog in vsebine sodov. Zorenje je pri tradicionalnem balzamičnem kisu več stopenjski proces, pri katerem sodelujejo encimi v povezavi z avtolizo in kvasovke. Staranje je bolj dolgotrajno in ga izvajajo predvsem ocetnokislinske bakterije. Pri staranju lahko prenehajo biokemijski procesi in se odvijajo samo še procesi vezani na kisik. (Sacchetti,1991)

5.2.1 Zorenje- staranje Zorenje oziroma staranje poteka v »baterijah«, to so linije 5, 6, 7 ali več sodov, različnih velikosti, od največjega do najmanjšega. Ta prostor je ponavadi na podstrešju, kjer je svetlo, zračno in je izpostavljen temperaturnim spremembam. Pozimi mora biti mrzlo, da se proces fermentacije in delovanja encimov upočasni in se mošt posede in zbistri. Nizke temperature omogočijo, da sod absorbira majhne količine mošta in tako moštu daje aromo lesa. Preden se otopli se opravi tudi pretakanje z večjih v manjše sode. V največji sod dolijejo kuhan mošt iz letošnje trgatve, zato da od mošta, ki je že v sodu prevzame aromo. Pretakanje ima namen, da ima kis na koncu čim več arome. Ta proces nato proizvajalci ponavljajo vaj 12 let, lahko pa tudi 50 in več let, dokler kis ne doseže idealnega okusa, barve in vonja. Končni izdelek se imenuje tradicionalni balzamični kis iz Modene.

Slika 6: Zorenje in staranje balzamičnega kisa na podstrešju (http://www.balsamicvinegar.com)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 25 Postopek pri industrijskih različicah balzamičnega kisa je podoben. Staranje in zorenje pa poteka bistveno manj časa. Pri tej proizvodnji mošt prav tako shranijo v več sodov, kjer se nato odvija fermentacija. Ta kis dozoreva največ 12 let. Proizvajalci opravljajo kemijske, fizikalne in senzorične analize, da ugotovijo stopnjo dozorelosti. Temu kisu dodajajo različne arome in barvila, največkrat je to karamela. Nekatere komercialne različice pa so tudi vinski kisi, razredčeni z vodo. Dodajo jim sladkor, karamelo, vaniljo in začimbe oziroma zelišča. Ti kisi so lahko narejeni v enem dnevu. So tudi širše dostopni v trgovinah zaradi veliko nižje cene. Ti kisi so v različnih stekleničkah, in so zelo različni glede na kvaliteto in ceno. (www.aged.htm)

Slika 7: »baterija«(http://acetaidelcristo.it)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 26

5.2.2 Vzorčevanje Jemanje vzorcev poteka tako, da odvzamejo reprezentativen del celotne tekočine balzamičnega kisa. To delo analizatorji opravljajo ročno, in sicer tako, da iz odprtine, ki se nahaja na zgornjem delu soda zajamejo malo starega kisa, kisa v stadiju produkcije in kuhanega mošta.

Slika 8: Jemanje vzorcev(http://www.deliaonline.com) Analitična določila Če želijo dobiti celotno sliko o različnih sestavnih komponentah, njihovem razvoju in pretvorbi preko produktivnega cikla balzamičnega kisa morajo analizatorji preveriti naslednje:

• Suh ekstrakt • Celotno kislino • Pepel • Vsebnost prolina • Vsebnost magnezija

Pregled suhega ekstrakta, kisline in pepela je nujno potreben za uvrstitev balzamičnega kisa kot tradicionalnega ali navadnega. Pregled prolina in magnezija je potreben za ocenitev izvora grozdja. Vzorce analizirajo v laboratorijih s kromatografskimi in spektrofotometričnimi metodami; s plinsko kromatografijo (GC), plinsko kromatografijo z masno spektrometrijo (GC-MS), in z visokotlačno tekočinsko kromatografijo (HPLC)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 27 Tabela 1: Primerjava vzorca iz »baterije« in komercialnega vzorca (Turtura,1984) Suha snov

(g/l) Alkohol (%w/v)

Celotna kislina (g CH3COOH/100ml)

Pepel (g/l)

Prolin (mg/l)

Magnezij(mg/l)

Vzorci vzeti

med ciklom produkcije 1:Star kis

504.4 / 5.46 6.90 485 200

Vzorec 4: «Baterija« 547.1 / 5.72 7.21 439 270

Vzorec 9: Delno

fermentiran mošt

49.6 / 2.10 2.69 378 80

Vzorec 10: Kuhan Mošt

87.1 / 7.50 2.88 305 210

Industrijski Balzamični

Kis 170.9 <1% 6.72 3.50 276 90

Rezultati V tabeli so prikazani rezultati vzorcev. Če primerjamo suhi ekstrakt petih vzorcev, opazimo velik porast 4. vzorca iz »baterije«. Porast je posledica staranja in številnih pretakanj, ki povzročijo koncentriranje kisa in s tem večanje deleža suhe snovi. S koncentriranjem kisa narašča tudi količina mineralnih snovi, kar je razvidno kot porast pepela v primerjavi z drugimi štirimi vzorci. Ponavadi imajo vzorci z visoko koncentracijo suhe snovi tudi večjo količino magnezija, prolina in pepela. Prolin je bistveni indikator pri razločevanju med tradicionalnim in industrijskim balzamičnim kisom. Industrijski balzamični kis ga vsebuje veliko manj. Podobno je z vsebnostjo magnezija, ki je najvišja pri vzorcu iz »baterije«(270 mg/l) in najnižja pri industrijskem kisu (90 mg/l). Iz rezultatov dobljenih preko GC, GC-MS in MS, lahko zaključimo, da vzorci, ki vsebujejo veliko suhe snovi, prolina, magnezija in pepela,( to so vzorci vzeti med produkcijo), vsebujejo tudi veliko etilacetata in etanola. Pri vzorcih industrijskega balzamičnega kisa je prisotna nizka vsebnost etilacetata in etanola. S primerjavo obeh balzamičnih kisov so tako dokazali, da je tradicionalni kis veliko bolj kakovosten od industrijskega, ki vsebuje nizke koncentracije snovi, ki bogatijo balzamični kis. Čeprav se proizvodnji obeh kisov ne razlikujeta preveč je industrijski kis revnejši, ker ga razredčujejo. (Turtura,1984)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 28 Pojav temne barve Pojav temne barve balzamičnega kisa razlagata dve hipotezi. Prvi, ki se je ukvarjal s tem pojavom je bil Sestini. Ta je leta 1867 v svojem laboratoriju z dializo ekstrahiral humusno kislino, ki je zelo spominjala na temno glukonsko kislino in tako zaključil svojo analizo z rezultatom, da so balzamični kisi prve materije v katerih naravno nastane glukonska kislina(C12H18O9). Formira pa se zaradi počasnega delovanja prostih kislin na sladkorje, ki se tako pretvorijo v črne humusne substance, ki dajejo balzamičnemu kisu značilno temno barvo. (Sestini,1867) Humus oziroma črna barva kisa je pravzaprav nastala z mikrobnim razkrojem celuloze, oziroma z avtolitičnim delovanjem mikrobov na celulozo. Obstaja pa tudi druga hipoteza. Ta govori o črni barvi humusa nastalega z melanoidini.Ta hipoteza ima trdnejše osnove, saj je bila že večkrat raziskana in potrjena. Gre za Maillardovo reakcijo, pri kateri se z zmesjo reducirajočih sladkorjev (glukoze in fruktoze) in aminokislin tvori CO2 in dobimo črnorjav produkt, imenovan melanoidin. Ta reakcija, ki poteče v eni do dveh urah pri temperaturi 100-130oC, poteka pri sobni temperaturi zelo dolgo časa- od par tednov do par mesecev. Maillardova reakcija se tako odvija v sodih, omogoča jo velika koncentracija glukoze in fruktoze, ki se nahajata v moštu in avtoliza celic kvasovk, ki s pomočjo delovanja proteolitičnega encima katepsina celice razgradijo in v okolje splavajo proste aminokisline. Reakcija poteka pri optimalnem pH za proteolitični encim, kar je med 3.5 in 6. Iz prostih aminokislin, reducirajočih sladkorjev in potrebnega časa se nato ustvarijo pogoji za tvorbo melanoidinov, ki počrnijo balzamični kis.(Sacchetti,1991)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 29

5.3 Zaključni postopki

5.3.1 Avtoliza mikroorganizmov Ko celica preneha delovati, zanjo nastopi smrt. V tem stadiju začno še pred kratkim normalno delujoči encimi nekontrolirano delovati-organske substance ne pretvarjajo več v produkte za nadaljnjo uporabo, temveč jih mineralizirajo. Pri tem pa moramo upoštevati dva različna tipa smrti in sicer: naravna smrt ter smrt povzročena zaradi bolezni. Življenje mikroorganizmov nastaja vedno znova iz predhodnih celic, torej s podvojevanjem. Po drugi strani pa zato stare celice mikroorganizmov odmirajo in pri tem gre za naravno smrt. Tu se torej življenje rojeva in ugaša tako, da je doseženo ravnotežje. Na drugi strani pa lahko na rast mikroorganizmov zelo močno vpliva njihovo zdravje. Čim se podvojevanje celic začne zmanjševati lahko nastopi bolezen, ki poruši ravnovesje med številom živih in mrtvih celic in nastopi smrt, ki kmalu pokonča celotno populacijo. Bolezen, ki je vstopila v celice v njih povzroči kaos: encimi, ki so bili v njih zadržani in obvarovani, prevzamejo kontrolo nad delovanjem celice in jo vodijo v proces razgradnje. To so tako imenovani proteolitični encimi ali proteaze, ki vodijo celico v »avtofagijo«, kot je to imenoval Pasteur ali (kot so ta proces kasneje poimenovali) v avtolizo. Če so mikrobne celice delovale v vodnem okolju, so se v njem razgradile in njihova vsebina se je v njem raztopila. Za primer lahko navedemo celice Zygosaccharomyces. Te celice, ki so alkoholno fermentacijo v moštu, so se v njem tudi razmnoževale, po drugi strani pa ga bogatile z odmrlimi celicami. Mošt je bil tako obogaten z aminokislinami, nukleinskimi kislinami, bazami, raznimi sladkorji in ogljikovimi hidrati, ki so prešli v vodno okolje ob delovanju proteolitičnih encimov. Podobne spremembe doletijo tudi ocetno-kislinske bakterije. Pri avtolizi celic Acetobacter xylinum pa moramo upoštevati tudi sintezno vlogo »mater«, ki sintetizirajo celulozo iz ogromnih količin glukoze, ki se nahaja v moštu. Prvi korak pri pretvorbi glukoze v celulozo je nastanek celobioze, nato pa celuloze. Ta se nalaga na celične membrane, ki tako celice ščitijo pred napadi encimov in kemičnih snovi ter poveča celično rezistenco.Tako zaščitene celice lahko nato razgradimo le s celulaznimi encimi, ki celulozo razgradijo v disaharid celobiozo ter s celobioznimi encimi, ki hidrolizirajo celobiozo v glukozo. Pri avtolizi celic Acetobacter xylinum, se z razgradnjo celuloze razgradi in počrni tudi notranjost sodov, ki nato z dodatno pomočjo kisa, ki razje te predele, začno puščati. Take sode je potrebno obnoviti.(Saccheti,1991)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 30

5.3.2 Stekleničenje balzamičnega kisa Vsi balzamični kisi iz Modene se prodajajo v 100 ml stekleničkah, ki imajo enako obliko in nalepko. Oblikoval jih je Giugiaro Design Studio. Oblika te stekleničke je patentirana, uporabljajo jo lahko le člani konzorcija proizvajalcev balzamičnih kisov iz Modene za pridelavo balzamičnega kisa. Seveda so napisi na stekleničkah različni, vendar po obliki lahko ločimo ali gre za pravi balzamični kis ali ponaredek. Po predpisu je prepovedano na nalepko napisati starost kisa, saj je za kakovost odločujoč okus in ne starost kisa. Vsaka steklenička je zapečatena z belo »plombo, ki jo imajo kisi, ki so starani vsaj 12 let. Kisi, ki so starani 25 in več let imajo zlato »plombo«.(www.avalonnaturals.com)

Slika 9:Tradicionalne steklenice z belo in zlato plombo(http://users.tns.net) Vsako stekleničko konzorcij registrira in oštevilči. Pred stekleničenjem gre balzamični kis skozi vrsto testov. Test se začne, ko član konzorcija prinese svoj vzorec. Skupina strokovnjakov se zbere in preizkusi vzorec. Ta skupina ne ve kdo je proizvajalec. Nato izvedejo okoli 90 organoleptičnih in kvalitativnih testov in podajo ocene. Če kis dobi dovolj točk, ga lahko poimenujejo »tradicionalni«. Če ne zbere dovolj točk ga vrnejo lastniku. Odobrenih je ponavadi le ena tretjina vzorcev. Da zagotovijo, da je v steklenički le kis, ki je zbral dovolj točk izvaja stekleničenje konzorcij. Dajo ga v stekleničko, ga oštevilčijo in ga zapečatijo. Vsaka steklenička je registrirana v posebni knjigi v konzorciju. Konzorcij ima podatke o vsakem članu, o tem koliko kisa je pridelal. Člani konzorcija ne smejo prodati več proizvodov, kot so jih registrirali.Po italijanski zakonodaji je balzamični kis narejen iz kuhanega mošta, dozoreva v dolgem postopku preko 12 let, v različnih sodih. Ne sme se mu dodajati nobenih aditivov in arom. Kvaliteto redno nadzoruje konzorcij za balzamični kis. Komercialni balzamični kisi se polnijo na avtomatiziranih polnilnih linijah, kjer redno kontrolirajo kakovost in higieno. Pred polnjenjem gredo skozi 3 procese filtracije. Stekleničke za polnjene komercialnega balzamičnega kisa so različnih oblik in imajo različne nalepke. Komercialna različica je približno 6-krat cenejša od tradicionalnega balzamičnega kisa. (www.vinegarman.com)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 31

Slika 10: Prikaz steklenice za tradicionalni balzamični kis (http://www.balsamicvinegar.com)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 32 6. EKOLOŠKI ASPEKT BIOPROCESA Med proizvodnjo balzamičnega kisa ne nastaja veliko odpadkov, ki bi bili škodljivi za okolje. Glavni odpad predstavljajo tropine, ki pa jih lahko uporabimo v različne namene.

6.1 Gojenje trte Posamezne sorte trte imajo svoje zahteve. Splošno trta najbolje raste na legi, ki je obrnjena proti jugu. Največ sladkorja se tvori pri 28-29°C, pri večji ali nižji temperaturi se kakovost in količina pridelka močno zmanjšujeta. Najbolj kvalitetno grozdje se torej prideluje v subtropskem območju, kjer je zmerno toplo in je primerno število sončnih ur, ki jih trta rabi v rastni dobi.(Colnarič,1988)

6.2 Vpliv gnojil na rast Gnojenje pomeni dodajanje organskih ali mineralnih gnojil, ki vsebujejo trti dostopna hranila. Hranila, ki jih trta potrebuje in jih redno dodajamo so dušik, fosfor, kalij, kalcij, magnezij in bor. Preveliko ali premajhno gnojenje, skratka nepravilno gnojenje ima negativen vpliv na rast trte. Ob pomanjkanju hranil se na trti razvijejo vidni znaki pomanjkanja, kot so bledi listi, temni listi, pegavost, odmiranje listov, porumenitev listov in tako dalje. Preveč gnojenja pa negativno vpliva v smislu, da trta preveč bujno raste, količina in kakovost pridelka močno upade. Pride tudi do spiranja hranil v globje plasti zemlje. Preden uporabimo katerokoli gnojilo je prav, da opravimo analizo založenosti tal s hranili.(Colnarič,1988)

6.3 Pesticidi Podobno kot druge rastline tudi trto napadajo bolezni in škodljivci, ki ogrožajo pridelek. Najbolj pogosto trto napadejo glive, virusi, žuželke in pršice. Pri zatiranju bolezni in škodljivcev zato uporabljamo pesticide. Za glivične bolezni uporabljamo fungicide, pri zatiranju žuželk insekticide, proti pršicam akaricide in proti plevelom herbicide. Lahko uporabljamo naravi bolj prijazne pripravke kot so Žveplo ali bakreni pripravki, proti žuželkam pa uporabimo ekstrakte iz različnih zelišč.(Colnarič,1988)

6.4 Ostanek po stiskanju-tropine Po odcejanju mošta ostanejo tropine. Količina tropin se glede na količino grozdja giblje v mejah od 15 do 25 %. Po odcejanju mošta vsebujejo tropine več snovi, tako da so zanimive za nadaljnjo izkoriščanje. Celotna količina mošta se ne odcedi povsem, ampak ostane v tropinah do 30 % soka. Za uporabo tropin je odločujoča njena kemijska sestava. Za izkoriščanje je zanimiva vsebnost sladkorjev in vinske kisline, kakor tudi vsebnost olja v pečkah. Vsebnost preostalega sladkorja v tropinah je odvisna od tega koliko sladkorja je vsebovalo grozdje iz katerega dobimo tropine, kakor tudi od načina stiskanja. Če je bilo grozdje bogato s sladkorjem, bodo tudi tropine vsebovale več sladkorja in obratno. Z močnejšim stiskanjem se v sok oziroma mošt izloči več sladkorja, manj ga ostane v tropinah. Prav tako tropine predstavljajo vir vinske kisline oziroma njenih soli. Vsebnost vinske kisline v tropinah pred fermentacijo je 1.2 do 2.5 % . Po fermentaciji pa vsebujejo do 5 % vinske kisline (Toksič). Pečke kot del tropin se odlikujejo z veliko količino olja. Glede na podatke različnih avtorjev je v pečkah 15 do 20 % olja. Pečke predstavljajo

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 33 bogato kalorično surovino. Lahko pa tudi služijo za ekstrakcijo taninov, ker so najbogatejši vir tanina v grozdni jagodi. Jagodna kožica vsebuje tudi nekaj antocianov, vendar se ti večinoma izločijo pri stiskanju v mošt. Tako količina antocianov v tropinah ni dovolj velika, da bi imela racionalni pomen. Na koncu postopka, ko se iz tropin izločijo zgoraj navedene snovi, uporabimo »osiromašene« tropine kot dodatek krmi za živali ali pa jih uporabimo kot organsko gnojilo. V industrijski predelavi grozdja je predelava tropin velikega ekonomskega in tehnološkega pomena. Pri predelavi velikih količin grozdja, ostajajo relativno velike količine tropin, iz katerih pridobivajo ne malo produktov. Zbiranje velikih količin tropin na enem mestu omogoča možnost organiziranega izkoriščanja z ustreznim postopkom.Večina večjih kleti, ki se ukvarjajo s predelavo tropin ima posebne oddelke v ta namen. V takih oddelkih se tropine večinoma uporabljajo za pridobivanje žganih pijač, s pomočjo destilacije. In le malo kdaj pridobivajo vinsko kislino ali tanine, ker je to z ekonomskega stališča manj zanimivo. Problem predstavljajo prostori za shranjevanje in konzerviranje velikih količin tropin. Tropine se po stiskanju prenesejo na prostor, kjer nato poteče alkoholna fermentacija. Tu se konzervirajo do uporabe. Za shranjevanje tropin obstaja več možnosti, katere so odvisne od količine le-teh in od načina na katerega jih želimo dalje uporabiti. Za shranjevanje manjših količin se uporabljajo kadi in podobne posode. Za večje količine tropin pa se morajo zgraditi posebni bazeni oziroma silosi iz armiranega betona, kot stalni gradbeni objekt. Shranjevanje tropin na odprtem prostoru, kjer so tropine pokrite s folijo je najslabši način. Pod takimi pogoji so tropine izpostavljene velikim izgubam alkohola. Med zračenjem so procesi oksidacije hitrejši in na površini se pojavijo plesni. Ko tropine dajemo v kad ali bazen jih je potrebno raztrositi. To opravimo ročno ali s posebnim strojem, raztrosevalcem tropin. V bazenu morajo biti tropine izpostavljene čim manjšim količinam zraka. Prisotnost zraka omogoča dobre pogoje za razvoj ocetnokislinskih bakterij in plesni. Tako tropine izgubljajo kakovost in lahko postanejo povsem neuporabne. Da jih zaščitimo pred škodljivimi vplivi jih konzerviramo. Konzerviranje poteka na dva načina,in sicer na suh ali na vlažen način. Konzerviranje na suh način: Po raztresanju je potrebno tropine dobro stlačiti, sloj za slojem. Paziti je potrebno na težje dostopna mesta pri zidovih, kjer se lahko zadržuje zrak.Ko tropine natrosimo do vrha bazena, jih potrosimo z kalijevim metabisulfatom v prahu. Nato na tropine damo sloj slame in pokrijemo s zemljo. Po tem se začne fermentacija. Konzerviranje na vlažen način: Tropine damo prav tako v bazen. Razlika je v tem, da jih ne stlačimo. Da odstranimo zrak nalijemo na tropine preko tropin vodo, tako da jih povsem prekrije. Nato gor položimo deske in gor nasujemo pesek. Na ta način je prostor za shranjevanje slabše izkoriščen. Vendar je ta način konzerviranja boljši, ker se tropine izpirajo. Slaba stran vlažnega konzerviranja je v tem, da so ustvarjeni mnogo boljši pogoji za rast škodljivih bakterij. Namesto, da tropine izpostavimo alkoholni fermentaciji in jih nato dalje izkoriščamo, jih lahko izpiramo sveže. Tako izločeni sladkor nato izpostavimo fermentaciji. Na ta način dobljeno vino uporabimo za destilacijo in proizvodnjo vinskih destilatov. Istočasno z izločanjem sladkorjev se izloči tudi vinska kislina oziroma njene soli. Iz izpranih tropin ločimo pečke. Kar ostane pa uporabimo za dodatek k živalski krmi. Pečke se izkoristijo kot visoko kalorični material v surovem stanju prav tako za krmljenje živali, ali pa se iz njih ekstrahira olje. Ločevanje pečk se izvrši pred destilacijo iz svežih tropin, ali po destilaciji. V vsebnosti olja ni razlike kdaj jih ločimo. (Vuković) Tako je vseeno kdaj jih ločimo. Je pa bolj praktično, da to storimo pred destilacijo, ko so tropine še relativno suhe. Če jih ločujemo po destilaciji, moramo tropine najprej odcediti in posušiti.

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 34 Ločevanje pečk iz fermentiranih tropin ne pride v poštev pred destilacijo, saj bi tako izgubili skoraj ves alkohol. V industriji se za ločevanje uporabljajo posebni ločevalniki. Po ločitvi se pečke pošlje v tovarne, kjer se ekstrahira olje. Pred tem jih morajo osušiti. Vsebujejo lahko največ 10 % vlage. Ta ukrep je potreben zato, da jih zaščitimo pred plesnimi in drugimi kvarljivci.(Radovanović,1986)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 35 7. UPORABA BIOPROIZVODOV V PREHRANI

7.1 Uporaba balzamičnega kisa kot dodatka oziroma začimbe Uporaba balzamičnega kisa v prehrani je odvisna od tega ali kuhamo s tradicionalnim ali komercialnim balzamičnim kisom, ki je bolj široko zastopan v kuharske namene. O kuhanju z balzamičnim kisom obstajajo knjige in nekateri trdijo, da si ne morejo predstavljati kuhinje brez balzamičnega kisa.(www.aged.it) Pri kuhanju se dodaja balzamični kis za izboljšanje arome in okusa jedi. Vse komercialne različice se uporabljajo pogosto kot samostojni prelivi za solate ali v kombinaciji z olivnim, orehovim ali lešnikovim kisom. V kombinaciji z olivnim oljem se dobro poda k morskim jedem. Ali kot omaka, v katero namakajo kruh. To se uporablja kot predjed. Z orehovim oljem se uporablja z zelenjavo, kot je korenje, repa ali paradižnik. Balzamični kis se uporablja v vseh sladko-kislih jedeh, kot na primer v sladko-kislih omakah zraven race ali svinjine. Cenjen je tudi kot dodatek k divjačini. Nepogrešljiv je tudi v marinadah, ki so pripravljene zraven rib ali perutnine. Zelo dobra je čebula ali por začinjena z balzamičnim kisom, kot tudi mešanica paradižnika, mocarele s kapljicami balzamičnega kisa.(www.patryus.com) V Italiji je tradicionalna sladica po kosilu hruške s parmezanom in balzamičnim kisom. Prav tako tradicionalen je kot nadomestek aperitiva oziroma likerja po večerji, v majhnih kozarčkih. Prav tako se uporablja kot napitek; v majhnih količinah se meša z mineralno vodo. Tudi zelenjava ali meso pečeno na žaru je bolj okusno, če je po pečenju začinjeno z balzamičnim kisom. Sadje kot na primer hruške, melone, breskve in še posebej jagode dobijo več okusa, če jih »poškropimo« z balzamičnim kisom. Mnogi ga uporabljajo v kombinaciji z vanilijevim sladoledom.(www.menu-cucinatradizionale.com)

Slika 11: Pršenje balzamičnega kisa (www.cybercucina.com) Tradicionalni balzamični kis praviloma ne uporabljamo pri kuhanju, saj zaradi toplote izgubi okus in aromo. Dodamo ga na koncu, ko so jedi že pripravljene. Uporablja se zmerno, po kapljicah zraven jagod ali zelo kvalitetnih posladkov, pa tudi v solatnih prelivih.(www.menu.it)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 36

Slika 12:Uporaba balzamičnega kisa v prehrani (http://www.wineenthusiast.com)

7.2 Balzamični kis kot zdravilo Ime balzamični prihaja iz italijanske besede balsamico, kar pomeni balzam. Balzamični kis se je v preteklosti uporabljal tudi izven kuhinje kot zdravilo za manjše zdravstvene težave. Pili so ga v majhnih količinah, po kapljicah s čajno žličko za izboljšanje prebave ali za pomoč pri prebavnih težavah. Pili so ga za večjo moč ali kot napitek, ki je ljudi razveselil, ko so bili žalostni. Včasih pa so ga preprosto pili, ko so bili žejni.

Slika 13: Balzamični kis se pije kot zdravilo po čajnih žličkah (http://www.menu.it)

Biotehnološka proizvodnja balzamičnega kisa, Seminar, Študij živilske tehnologije, 2003 37 8. REFERENCE

Boscarol, M. 2000, diplomska naloga Sekundarni metaboliti pri proizvodnji jabolčnega kisa, str. 5-11 Colnarič, J., Vrabl, S. 1988 Vinogradništvo, ČZP Kmečki glas, str.260-262, 269,76-80, 21-23, 233-240 Cör, S. 1997, diplomska naloga Vpliv sestave jabolčnika na kakovost jabolčnega kisa, str. 4-5, 14-18 Ledenberg J. Encyclopedia of microbiology. 2nd ed.New York, volume1, volume 4, str. 939-947, 13-17 Lehninger, .M.,Nelson, D.L., Cox,M.M, Principles of biochemistry, 3rd edition, str.528-530 Radovanović, V.1986, Tehnologija vina. Beograd, str.152-158 Ramuš, J. 1996, diplomska naloga Delna fenotipizacija in analiza prisotnosti IS1380 v ocetnokislinskih bakterijah, str. 6-12 Raspor, P.1996 Biotehnologija, Ljubljana, Bia, str 70 str. 100-106 Sacchetti, M., 1991, L¨aceto balsamico Modenese, Edagricole-Edizioni agricole Trček, J.1996, Kemična in senzorična analiza različnih vrst kisa, Sodobno kmetijstvo, str. 417-421 Turtura, G.C.1984, La microflora dell¨aceto balsamico naturale, Industrie delle bevande, Zelenik-Blatnik, M., Toplotna obdelava živil, Bitančevi živilski dnevi 1986, Ljubljana Strani iz interneta www.acetaidelcristo.itwww.acetum.itwww.aged.itwww.avalonnaturals.comwww.balsamicvinegar.comwww.cybercucina.comwww.deliaonline.comwww.italianfoodforever.comwww.menu.itwww.menucucinatradizonale.comwww.napoleonco.comwww.patryus.comwww.showcook.co. www.users.tns.netwww.vinegarman.comwww.wineenthusiast.com