BIOTEKNOLOGI

PENGERTIAN BIOTEKNOLOGI

• Bio : Hayati

• Logi : Ilmu

• Tekno : Terapan

Suatu cabang ilmu terapan yang menggunakan makluk hidup dalam pengaplikasiannya ,guna menghasilkan produk unggul bagi manusia

Hayati : Sebagai agen proses ,bagian MH. Yang termasuk organ ,jaringan,sel, molekul, atau bahan ang dihasilkan MH seperti : enzim, hormon, dll.Terapan : Yang bisa diaplikasikan dalam kehidupan sehari hari

CIRI CIRI BIOTEKNOLOGI

• Memberikan kepastian• Ada sifat unggul • Selalu melibatkan manusia• Selalu berkembang• Memanfaatkan makluk hidup

Contoh Bioteknologi

1. Kultur Jaringan2. stripping/bayi tabung

GENGen Menyesuaikan Terhadap Lingkunganya

Gen

Lingkungan

Phenotype

FENOTIPEFenotipe adalah suatu karakteristik (baik struktural, biokimiawi, fisiologis, dan perilaku) yang dapat diamati dari

suatu organisme yang diatur oleh genotipe danlingkungan serta interaksi keduanya.

Pengertian fenotipe mencakup berbagai tingkat dalam ekspresi gen dari suatu organisme. Pada tingkat organisme,

fenotipe adalah sesuatu yang dapatdilihat/diamati/diukur, sesuatu sifat atau karakter. Dalam tingkatan ini, contoh fenotipe

misalnya warna mata, berat badan, atau ketahanan terhadap suatu penyakittertentu. Pada tingkat biokimiawi, fenotipe

dapat berupa kandungan substansi kimiawi tertentu di dalam tubuh. Sebagai misal, kadar gula darah atau kandungan

protein dalam beras. Pada taraf molekular, fenotipe dapat berupa jumlah RNA yang diproduksi atau terdeteksinya pita DNA

atau RNA pada elektroforesis.

Fenotipe ditentukan sebagian oleh genotipe individu, sebagian oleh lingkungan tempat individu itu hidup, waktu,

dan, pada sejumlah sifat, interaksi antara genotipe dan lingkungan. Waktu biasanya digolongkan sebagai aspek lingkungan

(hidup) pula. Ide ini biasa ditulis sebagai P = G + E + GE, dengan P berarti fenotipe, G berarti genotipe, E berarti lingkungan,

dan GE berarti interaksi antara genotipe dan lingkungan bersama-sama (yang berbeda dari pengaruh G dan E sendiri-sendiri.

GEN

• Gen (dari bahasa Belanda: gen) adalah unit pewarisan sifat

bagi organisme hidup.

• Bentuk fisiknya adalah urutan DNA, yang menyandi suatu protein, polipeptida, atau seuntai RNA yang memiliki fungsi bagi organisme yang memilikinya.

• Batasan modern gen adalah suatu lokasi tertentu pada

genom yang berhubungan dengan pewarisan sifat dan

dapat dihubungkan dengan fungsi sebagai regulator

(pengendali), sasaran transkripsi, atau peran-peran

fungsional lainnya.

SEJARAH

Gregor Mendel telah berspekulasi tentang adanya suatu bahan yang terkait dengan suatu sifat atau karakter di

dalam tubuh suatu individu yang dapat diwariskan dari satu generasi ke generasi berikutnya. Ia menyebutnya

'faktor'. Oleh Hugo de Vries, konsep yang serupa ia namakan pangen (baca: "pan-gen") pada buku karangannya

Intracellular Pangenesis (terbit 1889). Belum membaca tulisan Mendel, de Vries mendefinisikan pangen sebagai

"partikel terkecil yang mewakili satu penciri terwariskan". Wilhelm Johannsen lalu menyingkatnya sebagai gen dua

puluh tahun kemudian. Pada 1910, Thomas Hunt Morgan menunjukkan bahwa gen terletak di kromosom.

Selanjutnya, terjadi 'perlombaan' seru untuk menemukan substansi yang merupakan gen. Banyak penghargaan

Nobel yang kemudian jatuh pada peneliti yang terlibat dalam subjek ini. Pada saat itu DNA sudah ditemukan dan

diketahui hanya berada pada kromosom (1869), tetapi orang belum menyadari bahwa DNA terkait dengan gen.

Melalui penelitian Oswald Avery terhadap bakteri Pneumococcus (1943), serta Alfred Hershey dan Martha Chase

(publikasi 1953) dengan virus bakteriofag T2, barulah orang mengetahui bahwa DNA adalah bahan genetik.

SEJARAH

Pada tahun 1940an, George Beadle dan Edward Tatum mengadakan percobaan dengan

Neurospora crassa. Dari percobaan tersebut, Beadle dan Tatum dapat menarik hipotesis bahwa

gen mengkode enzim, dan mereka menyimpulkan bahwa satu gen menyintesis satu enzim (one

gene-one enzyme theory). Beberapa puluh tahun kemudian, ditemukan bahwa gen mengkode

protein yang tidak hanya berfungsi sebagai enzim saja, dan beberapa protein tersusun dari dua

atau lebih polipeptida. Dengan adanya penemuan-penemuan tersebut, pendapat Beadle dan

Tatum, one gene-one enzyme theory, telah dimodifikasi menjadi teori satu gen-satu polipeptida

(one gene-one polypetide theory).

STRUKTUR GEN

Pada sel eukariot, gen terdiri dari:

domain regulasi inisiasi transkripsi, yang terdiri antara lain dari:[5] deret GCCACACCC, ATGCAAAT, kotak GC, kotak CCAAT dan

kotak TATA.

intron

ekson, merupakan area kodikasi protein yang dapat ditranskripsi secara overlapping atau

nonoverlapping.[6] Sebagai contoh, pada kode dengan tiga deret nukleotida (kodon triplet) AUU GCU CAG, dapat secara dibaca

nonoverlapping sebagai AUU GCU CAG atau dibaca secara overlapping sebagai AUU UUG UGC GCU CUC CAG. Walaupun pada

sekitar tahun 1961, telah diketahui bahwa asam amino dikodikasi oleh kodon secara nonoverlapping, telah ditemukan protein

berbeda hasil transkripsi dengan pergeseran overlapping kodon.[7]

domain regulasi akhir transkripsi

”

“ Ekspresi gen

Ekspresi gen adalah proses dimana kode-kode

informasi yang ada pada gen diubah menjadi proteinprotein

yang beroperasi hanya di dalam sel. Ekspresi

gen terdiri dari dua tahap:

1. Transkripsi, proses pembuatan salinan RNA.

2. Translasi, proses sintesis polipeptida yang spesifik

di dalam ribosom.

RNA (ASAM RIBONUKLEAT)

Asam ribonukleat (bahasa Inggris:ribonucleic acid, RNA) adalah satu dari tiga makromolekul

utama (bersama dengan DNA dan protein) yang berperan penting dalam segala bentuk

kehidupan. Asam ribonukleat berperan sebagai pembawa bahan genetik dan memainkan peran

utama dalam ekspresi genetik. Dalam genetika molekular, RNA menjadi perantara antara

informasi yang dibawa DNA dan ekspresi fenotipik yang diwujudkan dalam bentuk protein.

STRUKTUR RNA

Struktur dasar RNA mirip dengan DNA. RNA merupakan polimer yang tersusun dari sejumlah nukleotida. Setiap nukleotida memiliki satu gugus fosfat, satu gugus pentosa, dan satu gugus basa nitrogen (basa N). Polimer tersusun dari ikatan berselang-seling antara gugus fosfat dari satu nukleotida dengan gugus pentosa dari nukleotida yang lain.

Perbedaan RNA dengan DNA terletak pada satu gugus hidroksil cincin gula pentosa, sehingga dinamakan ribosa, sedangkan gugus pentosa pada DNA disebut deoksiribosa.[1] Basa nitrogen pada RNA sama dengan DNA, kecuali basa timina pada DNA diganti dengan urasil pada RNA. Jadi tetap ada empat pilihan: adenina, guanina, sitosina, atau urasil untuk suatu nukleotida. Selain itu, bentuk konformasi RNA tidak berupa pilin ganda sebagaimana DNA, tetapi bervariasi sesuai dengan tipe dan fungsinya.

TIPE-TIPE RNA

RNA hadir di alam dalam berbagai macam/tipe. Sebagai bahan genetik, RNA berwujud sepasang pita (Inggris

double-stranded RNA, dsRNA). Genetika molekular klasik mengajarkan, pada eukariota terdapat tiga tipe

RNA yang terlibat dalam proses sintesis protein:

• 1. RNA-kurir (bahasa Inggris: messenger-RNA, mRNA), yang disintesis dengan RNA polimerase I.

• 2. RNA-ribosom (bahasa Inggris: ribosomal-RNA, rRNA), yang disintesis dengan RNA polimerase II

• 3. RNA-transfer (bahasa Inggris: transfer-RNA, tRNA), yang disintesis dengan RNA polimerase III

Pada akhir abad ke-20 dan awal abad ke-21 diketahui bahwa RNA hadir dalam berbagai macam

bentuk dan terlibat dalam proses pascatranslasi. Dalam pengaturan ekspresi genetik orang

sekarang mengenal RNA-mikro (miRNA) yang terlibat dalam "peredaman gen" atau gene

silencing dan small-interfering RNA (siRNA) yang terlibat dalam proses pertahanan terhadap

serangan virus

FUNGSI RNA

Pada sekelompok virus (misalnya bakteriofag), RNA merupakan bahan genetik. Ia berfungsi sebagai penyimpan

informasi genetik, sebagaimana DNA pada organisme hidup lain. Ketika virus ini menyerang sel hidup, RNA

yang dibawanya masuk ke sitoplasma sel korban, yang kemudian ditranslasi oleh sel inang untuk menghasilkan

virus-virus baru.

Namun, peran penting RNA terletak pada fungsinya sebagai perantara antara DNA dan protein dalam proses

ekspresi genetik karena ini berlaku untuk semua organisme hidup. Dalam peran ini, RNA diproduksi sebagai

salinan kode urutan basa nitrogen DNA dalam proses transkripsi. Kode urutan basa ini tersusun dalam bentuk

'triplet', tiga urutan basa N, yang dikenal dengan nama kodon. Setiap kodon berelasi dengan satu asam amino

(atau kode untuk berhenti), monomer yang menyusun protein. Lihat ekspresi genetik untuk keterangan lebih

lanjut.

Penelitian mutakhir atas fungsi RNA menunjukkan bukti yang mendukung atas teori 'dunia RNA', yang

menyatakan bahwa pada awal proses evolusi, RNA merupakan bahan genetik universal sebelum organisme

hidup memakai DNA.

INTERFERENSI RNA

Suatu gejala yang baru ditemukan pada penghujung abad ke-20 adalah adanya mekanisme

peredaman (silencing) dalam ekspresi genetik. Kode genetik yang dibawa RNA tidak

diterjemahkan (translasi) menjadi protein oleh tRNA. Ini terjadi karena sebelum sempat

ditranslasi, mRNA dicerna/dihancurkan oleh suatu mekanisme yang disebut sebagai

"interferensi RNA". Mekanisme ini melibatkan paling sedikit tiga substansi (enzim dan protein

lain). Gejala ini pertama kali ditemukan pada nematoda Caenorhabditis elegans tetapi

selanjutnya ditemukan pada hampir semua kelompok organisme hidup.

DNA

DNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun dari subunit

atau monomer nukleotida.

Komponen penyusun nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula

pentosa (deoksiribosa), basa nitrogen, dan gugus fosfat. Basa nitrogen

terdiri dari basa purin [adenin (A) dan guanin (G)] dan basa pirimidin

[cytosin (C) dan tymin (T)]. Jumlah adenosin sama dengan jumlah timin,

sedangkan jumlah guanin sama dengan jumlah sitosin. Monomer

nukleotida mempunyai gugus hidroksilpada posisi karbon 3’, gugus fosfat

pada posisi karbon 5’ dan basa pada posisi karbon 1’ molekul gula.

Basa purin atau pirimidin yang berikatan dengan gugus gula disebut nukleosida, sedangkan

nukleotida merupakan ester dari asam fosfaat dan nukleosida. Nukleotida satu dengan yang lainnya

berikatan melalui ikatan fosfodiester antara gugus 5’fosfat dengan gugus 3’hidroksil yang akan menjadi

Masing-masing basa purin dan pirimidin dihubungkan oleh ikatan hidrogen. Meskipun ikatan-ikatan hidrogen ini sangat lemah, namun setiap nukleotida mengandung begitu banyak basa sehingga rantai-rantai komplementernya tidak pernah terpisah secara spontan pada kondisi fisiologis. Akan tetapi, jika DNA terkena pengaruh suhu yang mendekati titik didih, maka banyak pasangan DNA yang putus sehingga heliks gandanya terbelah menjadi rantai-rantai komplementernya (denaturasi).tulang punggung DNA membentuk struktur asam nukleat. Guanin berikatan dengan Citosin dengan 3 ikatan hidrogen, dan Adenosin berikatan dengan Timin dengan 2 ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen inilah yang mempengaruhi energi yang dibutuhkan untuk denaturasi, sehingga, pada saat desain primer untuk PCR , penentuan melting point dilihat dari komposisi G-C nya.

Proses transkripsi DNA menjadi mRNA dan translasi

mRNA menjadi sebuah polipeptida disebut dogma

sentral (central dogma). Dogma sentral berlaku pada

prokariot dan eukariot. Namun, pada eukariot ada

tahap tambahan yang terjadi di antara transkripsi dan

translasi yang disebut tahap pre-mRNA. Tahap premRNA

adalah untuk menyeleksi mRNA yang akan

dikirim keluar nukleus untuk ditranslasikan di ribosom.

Ekson merupakan mRNA yang akan dikirim keluar nukleus untuk ditranslasikan, sedangkan intron merupakan mRNA yang akan tetap berada di dalam nukleus karena kemungkinan mRNA tersebut akan membentuk protein yang tidak fungsional (tidak berguna) jika ditranslasikan. Intron kemudian akan terurai kembali untukmembentuk rantai mRNA baru.

Ketahui pula bahwa beberapa kesalahan yang disebut mutasi dapat terjadi pada proses ekspresi gen ini.

Proses penyeleksian mRNA

REPLIKASI DNA

Replikasi DNA adalah proses penggandaan rantai ganda DNA. Pada sel, replikasi DNA terjadi sebelum pembelahan sel. Prokariota terusmenerus melakukan replikasi DNA. Pada eukariota, waktu terjadinya replikasi DNA sangatlah diatur, yaitu pada fase S siklus sel, sebelum mitosis atau meiosis I. Penggandaan tersebut memanfaatkan enzim DNA polimerase yang membantu pembentukan ikatan antara nukleotidanukleotida penyusun polimer DNA. Proses replikasi DNA dapat pula dilakukan in vitro dalam proses yang disebut reaksi berantai polimerase (PCR).

Replikasi DNA yang terjadi,disebut replikasi semikonservatif,karena masing-masing dari keduarantai DNA induk bertindaksebagai cetakan/templat untukpembuatan dua rantai DNA denganuntai ganda yang baru.

GARPU REPLIKASIGarpu replikasi atau cabang replikasi (replication fork) ialah struktur yang terbentuk ketika DNA

bereplikasi. Garpu replikasi ini dibentuk akibat enzim helikase yang memutus ikatan-ikatan hidrogen yang

menyatukan kedua untaian DNA, membuat terbukanya untaian ganda tersebut menjadi dua cabang yang masing-

masing terdiri dari sebuah untaian tunggal DNA. Masing-masing cabang tersebut menjadi "cetakan" untuk

pembentukan dua untaian DNA baru berdasarkan urutan nukleotida komplementernya. DNA polimerase

membentuk untaian DNA baru dengan memperpanjang oligonukleotida yang dibentuk oleh enzim primase dan

disebut primer.

DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan menambahkan nukleotida—dalam hal ini,

deoksiribonukleotida—ke ujung 3'-hidroksil bebas nukleotida rantai DNA yang sedang tumbuh. Dengan kata lain,

rantai DNA baru disintesis dari arah 5'→3', sedangkan DNA polimerase bergerak pada DNA "induk“ dengan arah

3'→5'. Namun demikian, salah satu untaian DNA induk pada garpu replikasi berorientasi 3'→5', sementara untaian

lainnya berorientasi 5'→3', dan helikase bergerak membuka untaian rangkap DNA dengan arah 5'→3'. Oleh karena

itu, replikasi harus berlangsung pada kedua arah berlawanan tersebut

Pembentukan leading strand

Pada replikasi DNA, untaian pengawal (leading

strand) ialah untaian DNA yang disintesis dengan

arah 5'→3'

secara berkesinambungan. Pada untaian ini, DNA

polimerase mampu membentuk DNA

menggunakan ujung 3'-

OH bebas dari sebuah primer RNA dan sintesis DNA

berlangsung secara berkesinambungan, searah

dengan arah pergerakan garpu replikasi.

Pembentukan lagging strand

Lagging strand ialah untaian DNA yang terletak pada sisi yang

berseberangan dengan leading strand pada garpu replikasi.

Untaian ini disintesis dalam segmensegmen yang disebut

fragmen Okazaki. Pada untaian ini, primase membentuk

primer RNA. DNA polimerase dengan demikian dapat

menggunakan gugus OH 3‘ bebas pada primer RNA tersebut

untuk mensintesis DNA dengan arah 5'→3'. Fragmen primer

RNA tersebut lalu disingkirkan (misalnya dengan RNase H dan

DNA Polimerase I) dan deoksiribonukleotida baru ditambahkan

untuk mengisi celah yang tadinya ditempati oleh RNA. DNA

ligase lalu menyambungkan fragmenfragmen Okazaki tersebut

sehingga sintesis lagging strand menjadi lengkap.

Replikasi DNA. Mula-mula, heliks ganda DNA (merah) dibuka menjadi dua untai tunggal olehenzim helikase (9) dengan bantuan topoisomerase (11) yang mengurangi tegangan untai DNA. Untaian DNA tunggal dilekati oleh protein-protein pengikat untaian tunggal (10) untuk mencegahnya membentuk heliks ganda kembali. Primase (6) membentuk oligonukleotida RNA yang disebut primer (5) dan molekul DNA polimerase (3 & 8) melekat pada seuntai tunggal DNA dan bergerak sepanjang untai tersebut memperpanjang primer, membentuk untaian tunggal DNA baru yang disebut leading strand (2) dan lagging strand (1). DNA polimerase yang membentuk lagging strand harus mensintesis segmen-segmen polinukleotida diskontinu (disebut fragmen Okazaki (7)). Enzim DNA ligase (4) kemudian menyambungkan potongan-potongan lagging strand tersebut.

REKAYASA GENETIKA

Istilah rekayasa genetika sering digunakan untuk menggambarkan organisme

yang diubah secara genetik atau direkayasa. Ilmu rekayasa genetika

dikembangkan dengan tujuan membangun gen untuk transformasi genetik.

Sistem transformasi genetik memiliki tiga komponen utama:

1) Sebuah mekanisme untuk pengenalan DNA asing ke dalam sel target.

2) Sebuah sel atau jaringan yang cocok untuk transformasi.

3) Sebuah metode untuk identifikasi dan seleksi sel berubah atau individu.

DINAMIKA PADA GARPU REPLIKASI

Bukti-bukti yang ditemukan belakangan ini menunjukkan bahwa enzim dan protein yang terlibat dalam replikasi DNA tetap berada pada garpu replikasi sementara DNA membentuk gelung untuk mempertahankan pembentukan DNA ke dua arah. Hal ini merupakan akibat dari interaksi antara DNA polimerase, sliding clamp, dan clamp loader. Sliding clamp pada semua jenis makhluk hidup memiliki struktur serupa dan mampu berinteraksi dengan berbagai DNA polimerase prosesif maupun non-prosesif yang ditemukan di sel. Selain itu, sliding clamp berfungsi sebagai suatu faktor prosesivitas. Ujung-C sliding clamp membentuk gelungan yang mampu berinteraksi dengan protein-protein lain yang terlibat dalam replikasi DNA (seperti DNA polimerase dan clamp loader). Bagian dalam sliding clamp memungkinkan DNA bergerak melaluinya. Sliding clamp tidak membentuk interaksi spesifik dengan DNA. Terdapat lubang 35A besar di tengah clamp ini. Lubang tersebut berukuran sesuai untuk dilalui DNA dan air menempati tempat sisanya sehingga clamp dapat bergeser pada sepanjang DNA. Begitu polimerase mencapai ujung templat atau mendeteksi DNA berutas ganda (lihat di bawah), sliding clamp mengalami perubahan konformasi yang melepaskan DNA polimerase.

Clamp loader merupakan protein bersubunit banyak yang mampu menempel pada sliding clamp

dan DNA polimerase. Dengan hidrolisis ATP, clamp loader terlepas dari sliding clamp sehingga DNA

polimerase menempel pada sliding clamp. Sliding clamp hanya dapat berikatan pada polimerase

selama terjadinya sintesis utas tunggal DNA. Jika DNA rantai tunggal sudah habis, polimerase

mampu berikatan dengan subunit pada clamp loader dan bergerak ke posisi baru pada lagging

strand. Pada leading strand, DNA polimerase III bergabung dengan clamp loader dan berikatan

dengan sliding clamp.

REPLIKASI DI PROKARIOTAReplikasi DNA kromosom prokariota, khususnya bakteri, sangat berkaitan dengan siklus pertumbuhannya. Daerah ori pada E. coli, misalnya, berisi empat buah tempat pengikatan protein inisiator DnaA, yang masingmasing panjangnya 9 pb. Sintesis protein DnaA ini sejalan dengan laju pertumbuhan bakteri sehingga inisiasi replikasi juga sejalan dengan laju pertumbuhan bakteri. Pada laju pertumbuhan sel yang sangat tinggi; DNA kromosom prokariota dapat mengalami reinisiasi replikasi pada dua ori yang baru terbentuk sebelum putaran replikasi yang pertama berakhir. Akibatnya, sel-sel hasil pembelahan akan menerima kromosom yang sebagian telah bereplikasi.

Protein DnaA membentuk struktur kompleks yang terdiri atas 30 hingga 40 buah molekul, yang masing-masing akan terikat pada molekul ATP. Daerah ori akan mengelilingi kompleks DnaA-ATP tersebut. Proses ini memerlukan kondisi superkoiling negatif DNA (pilinan kedua untai DNA berbalik arah sehingga terbuka). Superkoiling negatif akan menyebabkan pembukaan tiga sekuens repetitif sepanjang 13 pb yang kaya dengan AT sehingga memungkinkan terjadinya pengikatan protein DnaB, yang merupakan enzim helikase, yaitu enzim yang akan menggunakan energi ATP hasil hidrolisis untuk bergerak di sepanjang kedua untai DNA dan memisahkannya.

Untai DNA tunggal hasil pemisahan oleh helikase selanjutnya diselubungi oleh protein pengikat untai tunggal atau single-stranded binding protein (Ssb) untuk melindungi DNA untai tunggal dari kerusakan fisik dan mencegah renaturasi. Enzim DNA primase kemudian akan menempel pada DNA dan menyintesis RNA primer yang pendek untuk memulai atau menginisiasi sintesis pada untai pengarah. Agar replikasi dapat terus berjalan menjauhi ori, diperlukan enzim helikase selain DnaB. Hal ini karena pembukaan heliks akan diikuti oleh pembentukan putaran baru berupa superkoiling positif. Superkoiling negatif yang terjadi secara alami ternyata tidak cukup untuk mengimbanginya sehingga diperlukan enzim lain, yaitu topoisomerase tipe II yang disebut dengan DNA girase. Enzim DNA girase ini merupakan target serangan antibiotik sehingga pemberian antibiotik dapat mencegah berlanjutnya replikasi DNA bakteri.

Seperti telah dijelaskan di atas, replikasi DNA terjadi baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal. Pada untai tertinggal suatu kompleks yang disebut primosom akan menyintesis sejumlah RNA primer dengan interval 1.000 hingga 2.000 basa. Primosom terdiri atas helikase DnaB dan DNA primase.

Primer baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal akan mengalami elongasi dengan bantuan holoenzim DNA polimerase III. Kompleks multisubunit ini merupakan dimer, separuh akan bekerja pada untai pengarah dan separuh lainnya bekerja pada untai tertinggal. Dengan demikian, sintesis pada kedua untai akan berjalan dengan kecepatan yang sama.

Masing-masing bagian dimer pada kedua untai tersebut terdiri atas subunit a, yang mempunyai fungsi polimerase sesungguhnya, dan subunit e, yang mempunyai fungsi penyuntingan berupa eksonuklease 3’– 5’. Selain itu, terdapat subunit b yang menempelkan polimerase pada DNA.

Begitu primer pada untai tertinggal dielongasi oleh DNA polimerase III, mereka akan segera dibuang dan celah yang ditimbulkan oleh hilangnya primer tersebut diisi oleh DNA polimerase I, yang mempunyai aktivitas polimerase 5’ – 3’, eksonuklease 5’ – 3’, dan eksonuklease penyuntingan 3’ – 5’. Eksonuklease 5’ - 3’ membuang primer, sedangkan polimerase akan mengisi celah yang ditimbulkan. Akhirnya, fragmen-fragmen Okazaki akan dipersatukan oleh enzim DNA ligase. Secara in vivo, dimer holoenzim DNA polimerase III dan primosom diyakini membentuk kompleks berukuran besar yang disebut dengan replisom. Dengan adanya replisom sintesis DNA akan berlangsung dengan kecepatan 900 pb tiap detik.

Kedua garpu replikasi akan bertemu kira-kira pada posisi 180 °C dari ori. Di sekitar daerah ini terdapat sejumlah terminator yang akan menghentikan gerakan garpu replikasi. Terminator tersebut antara lain berupa produk gen tus, suatu inhibitor bagi helikase DnaB. Ketika replikasi selesai, kedua lingkaran hasil replikasi masih menyatu. Pemisahan dilakukan oleh enzim topoisomerase IV. Masing-masing lingkaran hasil replikasi kemudiandisegregasikan ke dalam kedua sel hasil pembelahan.

REPLIKASI DNA EUKARIOTAPada eukariota, replikasi DNA hanya terjadi pada fase S di dalam interfase. Untuk memasuki fase S diperlukan

regulasi oleh sistem protein kompleks yang disebut siklin dan kinase tergantung siklin atau cyclin-dependent

protein kinases (CDKs), yang berturut-turut akan diaktivasi oleh sinyal pertumbuhan yang mencapai permukaan

sel. Beberapa CDKs akan melakukan fosforilasi dan mengaktifkan protein-protein yang diperlukan untuk inisiasi

pada masing-masing ori.

Berhubung dengan kompleksitas struktur kromatin, garpu replikasi pada eukariota bergerak hanya dengan

kecepatan 50 pb tiap detik. Sebelum melakukan penyalinan, DNA harus dilepaskan dari nukleosom pada garpu

replikasi sehingga gerakan garpu replikasi akan diperlambat menjadi sekitar 50 pb tiap detik. Dengan kecepatan

seperti ini diperlukan waktu sekitar 30 hari untuk menyalin molekul DNA kromosom pada kebanyakan

mamalia.

Sederetan sekuens tandem yang terdiri atas 20 hingga 50 replikon mengalami inisiasi secara serempak pada

waktu tertentu selama fase S. Deretan yang mengalami inisasi paling awal adalah eukromatin, sedangkan deretan

yang agak lambat adalah heterokromatin. Daerah sentromer dan telomer dari DNA bereplikasi paling lambat.

Pola semacam ini mencerminkan aksesibilitas struktur kromatin yang berbeda-beda terhadap faktor inisiasi.

Seperti halnya pada prokariota, satu atau beberapa DNA helikase dan Ssb yang disebut dengan protein

replikasi A atau replication protein A (RP-A) diperlukan untuk memisahkan kedua untai DNA. Selanjutnya,

tiga DNA polimerase yang berbeda terlibat dalam elongasi. Untai pengarah dan masing-masing fragmen untai

tertinggal diinisiasi oleh RNA primer dengan bantuan aktivitas primase yang merupakan bagian integral enzim

DNA polimerase a. Enzim ini akan meneruskan elongasi replikasi tetapi kemudian segera digantikan oleh DNA

polimerase d pada untai pengarah dan DNA polimerase e pada untai tertinggal. Baik DNA polimerase d

maupun e mempunyai fungsi penyuntingan. Kemampuan DNA polimerase d untuk menyintesis DNA yang

panjang disebabkan oleh adanya antigen perbanyakan nuklear sel atau proliferating cell nuclear antigen

(PCNA), yang fungsinya setara dengan subunit b holoenzim DNA polimerase III pada E. coli. Selain terjadi

penggandaan DNA, kandungan histon di dalam sel juga mengalami penggandaan selama fase S.

Mesin replikasi yang terdiri atas semua enzim dan DNA yang berkaitan dengan garpu replikasi akan

diimobilisasi di dalam matriks nuklear. Mesin-mesin tersebut dapat divisualisasikan menggunakan mikroskop

dengan melabeli DNA yang sedang bereplikasi. Pelabelan dilakukan menggunakan analog timidin, yaitu

bromodeoksiuridin (BUdR), dan visualisasi DNA yang dilabeli tersebut dilakukan dengan imunofloresensi

menggunakan antibodi yang mengenali BUdR

Ujung kromosom linier tidak dapat direplikasi sepenuhnya karena tidak ada DNA yang dapat menggantikan

RNA primer yang dibuang dari ujung 5’ untai tertinggal. Dengan demikian, informasi genetik dapat hilang dari

DNA. Untuk mengatasi hal ini, ujung kromosom eukariota (telomer) mengandung beratus-ratus sekuens repetitif

sederhana yang tidak berisi informasi genetik dengan ujung 3’ melampaui ujung 5’. Enzim telomerase

mengandung molekul RNA pendek, yang sebagian sekuensnya komplementer dengan sekuens repetitif tersebut.

RNA ini akan bertindak sebagai cetakan (templat) bagi penambahan sekuens repetitif pada ujung 3’.

Hal yang menarik adalah bahwa aktivitas telomerase mengalami penekanan di dalam sel-sel somatis pada

organisme multiseluler, yang lambat laun akan menyebabkan pemendekan kromosom pada tiap generasi sel.

Ketika pemendekan mencapai DNA yang membawa informasi genetik, sel-sel akan menjadi layu dan mati.

Fenomena ini diduga sangat penting di dalam proses penuaan sel. Selain itu, kemampuan penggandaan yang

tidak terkendali pada kebanyakan sel kanker juga berkaitan dengan reaktivasi enzim telomerase

Keberhasilan dalam transformasi spesies apapun tergantung pada tiga komponen tersebut. Jelas, masing-masing harus dioptimalkan dan, oleh karena itu, karena teknologi berkembang, transformasi harus menjadi aktivitas yang lebih rutin. Tujuan akhir dalam transformasi adalah pengenalan sifat baru dalam individu. Ketika sifat yang diinginkan ada di setiap individu lain yang kompatibel secara seksual, alternatif pertama harus mentransfer sifat melalui persilangan dan seleksi, seperti yang telah dilakukan dalam pemuliaan konvensional sejak abad ke-19. Kedelai Modern, jagung, kapas, dan varietas gandum, serta babi, sapi, dan jalur unggas yang digunakan dalam pertanian untuk memberi makan dunia, pada awalnya diperoleh dengan metode tradisional persilangan dan seleksi.

Salah satu keterbatasan utama perbaikan genetik konvensional adalah bahwa peternak terbatas pada ciri-ciri di antara spesies yang kompatibel secara seksual. Misalnya, dalam bidang kacang adalah spesies kaya akan asam amino yang mengandung sulfur. Namun, kacang-kacangan secara alami kekurangan dalam lisin. Di sisi lain, beras alami kaya lisin, tetapi kekurangan asam amino yang mengandung sulfur. Hal ini tidak mungkin untuk secara alami persilangan spesies ini, sehingga pemulia tanaman konvensional tidak mampu untuk mengembangkan ladang kacang varietas baru dengan tingkat lisin tinggi atau kultivar padi kaya akan asam amino yang mengandung sulfur. Transformasi genetik memungkinkan pertukaran gen antara organisme yang sebelumnya dibatasi oleh ketidakcocokan seksual.

Dengan rekayasa genetika dan transformasi, adalah mungkin untuk mentransfer gen antara bakteri, hewan, tumbuhan, dan virus. Bahkan, salah satu bidang penelitian di bidang bioteknologi adalah perbaikan profil nutrisi pada tanaman. Kacang yang baru, lebih banyak gizi dan varietas beras sekarangdapat dikembangkan melalui kemajuan dalam rekayasa genetika. Alat dasar untuk transformasi genetik enzim restriksi, yang digunakan untuk memotong DNA pada situs tertentu, dan ligases, yang mengkatalisis penggabungan fragmen DNA. Menggunakan enzim restriksi yang tepat, adalah mungkin untuk memotong lingkaran DNA plasmidbakteri, menyebabkan ia melinearisasi. Denganligase, adalah mungkin untuk menambahkan fragmen DNA yang mengandung gen yang diinginkan dan bergabung dengan mereka ke plasmid linierisasi. Dalam kondisi yang tepat, ujungujung plasmid, sekarang dengan fragmen DNA ditambahkan, bergabung untuk menciptakan sebuah plasmid lingkaran baru dengan beberapa modifikasi DNA. Plasmid baru dapat diperkenalkan ke bakteri tertentu melalui proses yang disebut elektroporasi, dan bakteri kemudian dapat digunakan untuk mentransfer transgen ke spesies sasaran. Jika DNA plasmid terintegrasi ke dalam genom spesies penerima dan gen ditransfer telah diekspresikan, individu dianggap diubah atau transgenik.

Transformasi genetik pada bakteri

PERCOBAAN GRIFFITH

Percobaan Griffith, dilakukan pada tahun 1928 oleh Frederick Griffith, adalah salah satu percobaan pertama yang menunjukkan bahwa bakteri dapat memindahkan informasigenetik melalui proses yang disebut transformasi, Griffith menggunakan dua galur Pneumococcus (yang menginfeksi tikus), galur tipe III-S dan tipe II-R. Galur III-S memiliki kapsul polisakarida yang membuatnya tahan terhadap sistem kekebalan inangnya sehingga mengakibatkan kematian inang, sementara galur II-R tidak memiliki kapsul pelindung tersebut dan dapat dikalahkan oleh sistem kekebalan tubuh inang.

Percobaan Griffith menemukan "prinsip transformasi"dalam bakteri pneumococcus

Dalam eksperimen ini bakteri galur III-S dipanaskan hingga mati, dan sisa-sisanya ditambahkan ke

bakteri galurII-R. Meskipun tikus tidak akan mati bila terkena baik sisa-sisa bakteri galur III-S (yang

sudah mati) ataupun galur II-R secara terpisah, gabungan keduanya mengakibat kematian tikus inang.

Griffith berhasil mengisolasi baik galur pneumococcus II-R hidup maupun III-S hidup dari darah tikus

mati ini. Griffith menyimpulkan bahwa bakteri tipe II-R telah tertransformasikan menjadi galur III-S

oleh sebuah prinsip transformasi yang entah bagaimana menjadi bagian bakteri galur III-S yang mati.

Kini kita mengetahui bahwa prinsip pentransformasi yang diamati oleh Griffith adalah DNA bakteri

galur IIIS. Meskipun bakteri itu telah mati, DNA-nya bertahan dari proses pemanasan dan diambil oleh

bakteri galur IIR. DNA galur III-S mengandung gen yang membentuk kapsul perlindungan. Dilengkapi

dengan gen ini, bakteri galur II-R menjadi terlindung dari sistem kekebalan inang dan dapat

membunuhnya. Verifikasi DNA sebagai prinsip pentransformasi ini dilakukan dalam percobaan oleh

Avery, McLeod dan McCarty dan oleh Hershey dan Chase.

SEKIAN

TERIMA KASIH THANK YOU MATOR SUWON