biyoloji laboratuvarı i-mbg113 Öğr. gör. dr. fatma...
TRANSCRIPT
Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU
1
17.12.2014/Çarşamba
Laboratuvar 10
KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER: Kromotografi ve
Spektrofotometri
AMAÇ: Moleküler biyolojide kullanılan temel tekniklerler olan kromotografi ve
spektrofotometrinin çalışma prensibini anlamak.
KAZANIMLAR:
Bitkilerde fotosentezde yer alan pigmentleri ve ekstraksiyon ve tayin yöntemlerini
öğrenir.
Kromatografi ile klorofil ve karotoneidlerin ayrılmasını öğrenir.
Spektrofotometre kullanabilmeyi öğrenir.
GENEL BİLGİ:
Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri sabit diğeri hareketli faz olmak
üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve saflaştırılması yöntemidir. İlk
kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903) tarafından geliştirilen bir yöntemdir. Tsvett bu
yöntemi bitki pigmentlerinin renkli bileşenlerini ayırmakta kullanmıştır. Kullandığı kolonda
renkli bantlar oluştuğundan, bu ayırma yöntemine kromatografi adını vermiştir.
Kromotografinin kolon, kağıt, sıvı, gaz ve ince tabaka gibi çeşitleri vardır.
Spektrofotometri, ışık kaynağı ile prizma arasına yerleştirilen renkli maddenin ışık
spektrumunun bazı renklerini absorplaması ve konsantrasyona göre spektrumda zayıf veya
kuvvetli bant göstermesi özelliğine dayanan miktar tayin yöntemidir. Analiz edilen örnek
üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak ayıran ve gönderen aletler kolorimetre
veya fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği
yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar.
Spektrofotometreler, madde renginin yoğunluğunun ölçülmesiyle madde miktarının
veya konsantrasyonunun bulunmasını sağlayan cihazlardır. Spektrofotometrelerde
konsantrasyonu bilinen bir standart çözeltinin absorpladığı ışık miktarı (absorbans, optik
dansite) ile konsantrasyonu bilinmeyen çözeltinin absorpladığı ışık miktarı karşılaştırılır.
Spektrofotometrelerde kullanılacak ışık, çözeltinin kuvvetli absorpladığı dalga boyunda
seçilir; örneğin kırmızı renkli sıvı için yeşil dalga boyunda (yeşil renkli sıvı için kırmızı dalga
boyunda), mavi renkli sıvı için sarı dalga boyunda (sarı renkli sıvı için mavi dalga boyunda)
ışık seçilir.
Spektrofotometrelerde çözeltideki madde için uygun seçilen dalga boyundaki ışığın
örneğe ve standarda (bilinen konsantrasyondaki çözelti) ait absorbansları veya optik
densiteleri (A, OD) karşılaştırılıp matematiksel işlemler yapılarak örnekteki maddenin
konsantrasyonu bulunur.
Bir spektrofotometre düzeneği; başlıca ışık kaynağı, dalga boyu seçicisi
(monokromatör), dedektörden oluşur; dedektörde elektrik sinyaline çevrilen optik sinyal
bir kaydedici veya bir galvanometre ile ölçülür (Şekil 1).
Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU
2
Şekil 1: Spektrometre kısımları.
Spektrofotometrede doğru bir ölçüm yapabilmek için;
Dalga boyuna uygun, birbiriyle uyumlu, iyi kalite küvetler kullanılmalı,
Küvetlerin temiz ve çizilmemiş olmasına dikkat edilmeli,
Aşınma ve eskimeden gelebilecek farklılıkları belirlemek için küvetler düzenli olarak
birbirlerine karşı kalibre edilmeli,
Küvetler cihaza yerleştirilirken ışık giriş ve çıkış yönlerine küvetlerin cilalı kısımlar
gelmeli,
Kullanım esnasında cilalı olan kısımlardan tutulmamalı,
Küvetler kurutma veya başka amaçlarla ısıtılmamalıdır.
Spektrofotometrelerin Çalışma Prensibi
Spektrofotometrelerin temel çalışma prensibi, hazırlanan çözeltiden belirli dalga
boyunda ışık geçirilmesi ve bu ışının ne kadarının çözelti tarafından tutulduğunun bulunması
esasına dayanır. Çözeltinin içerisindeki madde miktarı ne kadar fazla ise çözelti tarafından
tutulan ışın miktarı da o oranda fazla olur. Çözelti içerisindeki bütün maddeler, ışının bir
dalga boyunu tutarken diğerlerini yansıtır veya geçirir. Maddenin belli bir dalga boyundaki bir
ışını tutması, onun diğer fiziksel ve kimyasal özellikleri (yoğunluk, erime, kaynama noktası,
donma noktası vb.) gibi sabit bir özelliğidir.
Spektrofotometrik Ölçümün Yapılışı
Spektrofotometrede ölçüm yapılırken numuneye belirli bir dalga boyundaki ışın
gönderilerek numunenin absorbe ettiği ışın miktarı ölçülür. Yapılan analize göre ölçümde
hangi dalga boyundaki ışının kullanılacağı analiz metodunda belirtilmektedir. Kullanılacak
ışın dalga boyu bilinmiyorsa miktarı tespit edilecek maddenin 1 molar çözeltisi hazırlanıp
çeşitli dalga boylarındaki absorbans değerleri ölçülür. En yüksek değerin ölçüldüğü dalga
boyu belirlenerek kullanılır. Spektrofotometre bu dalga boyuna ayarlanarak çözeltilerin
ölçümüne geçilir.
Spektrofotometrik ölçüm için üç tip çözelti hazırlanır. Bunlar: Kör, numune ve
standart çözeltileridir.
1- Kör (tanık, şahit) Çözelti: Spektrofotometrede okuma yapmadan önce absorbansı
sıfıra veya % transmittansı 100’e ayarlamak için kullanılan çözeltidir. Bu amaçla yapılan
işleme “kör ayarı” veya “0 ve 100 ayarı” denir.
Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU
3
2- Standart Çözelti: Miktarı bulunmak istenen maddenin bilinen
konsantrasyonlardaki çözeltisidir. Bir veya birden fazla olabilir. Birden fazla olduğunda
grafik çizilir.
3- Numune Çözeltisi: İçindeki madde miktarını tespit etmek istediğimiz çözeltidir.
Spektrofotometrik ölçüm yapılırken şu aşamalar takip edilir:
Ölçümden yeterli süre önce cihaz çalıştırılarak ısınması sağlanır.
Cihaz ölçümün yapılacağı dalga boyuna ayarlanır.
Küvete kör çözelti konularak cihaza yerleştirilir.
Kör çözelti ile cihazın 0 ve 100 ayarı yapılır.
Küvete standart çözeltilerden konularak cihaza yerleştirilip okumaları yapılır.
Küvete numune çözeltisi konularak cihaza yerleştirilip okuması yapılır.
Kalibrasyon (absorbans) eğrisi çizilerek, numunenin konsantrasyonu hesaplanır.
Hesaplamalar
Milimetrik kâğıt üzerinde hazırlanan kalibrasyon grafiğinde, numuneye ait absorbans
değerinin grafikle kesiştiği nokta işaretlenip bu noktanın x ekseni (apsis) ile kesiştiği
noktadaki konsantrasyon tespit edilir. Bulunan bu değer numune çözeltisinin
konsantrasyonudur.
Bu metotla konsantrasyon hesaplanmasında;
Öncelikle standartlara ait kalibrasyon eğrisi hazırlanıp y eksenine (ordinat) numunenin
absorbans değeri (cihaz okuması) işaretlenir.
İşaretlenen noktadan kalibrasyon eğrisine dik bir doğru çizilip kesişme noktası tespit
edilir.
Çakışma noktasından x eksenine (apsis) dik bir doğru çizilir.
Çizilen dik doğrunun apsisle kesişme noktası numunenin konsantrasyonunu verir.
Numune çözeltisine seyreltme uygulanmışsa analiz numunesine ait konsantrasyon
tespit edildikten sonra bu değer seyreltme faktörü ile çarpılarak numuneye ait gerçek
konsantrasyon tespit edilir.
Milimetrik Kâğıtta Kalibrasyon Eğrisi Çizme
Milimetrik kâğıtta kalibrasyon eğrisi şu şekilde çizilir:
Öncelikle milimetrik kâğıt üzerine koordinat düzlemi çizilir.
Konsantrasyonlar x eksenine (apsis), konsantrasyonlara ait absorbans değerleri y
eksenine (ordinat) işaretlenir.
Her bir konsantrasyonun absorbans değerleri ile birleşme noktaları işaretlenir.
İşaretlenen noktalar birleştirilerek kalibrasyon eğrisi elde edilmiş olur.
Konsantrasyonlar ve absorbans değerleri koordinat düzlemine yerleştirilirken 0
noktasından başlanarak küçükten büyüğe doğru ve büyüklüklerine uygun aralıklarla
yerleştirilmelidir. İki değer arasındaki aralık değerlerin büyüklüğü ile doğru orantılı olmalıdır.
En küçük değer yerleştirildikten sonra takip eden değerler bununla orantılı olarak
yerleştirilmelidir.
Örnek: Konsantrasyonları ve bu konsantrasyonlara ait absorbans değerleri aşağıda verilen
standart çözelti serisine ait kalibrasyon eğrisinin çizilmesi ile Şekil 2’deki grafik elde edilir.
Konsantrasyonlar (mg/l) Absorbans Değerleri
0,0 0,0
0.5 0.2
1.0 0.4
1.5 0.6
2.0 0.8
Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU
4
Şekil 2. Kalibrasyon grafiği.
UYGULAMA 1: Bitkilerde fotosentezde yer alan pigmentlerinin ekstraksiyonu ve
klorofilin bazı özelliklerinin belirlenmesi
Fotosentezde rol alan pigmentlerin en önemli görevi güneş ışınlarını absorbe etmektir.
Bu pigmentlerin cinsi, organizmadan organizmaya değişebilir. Bunlar klorofiller,
karatenoidler, ve fikobilinlerdir. Klorofiller yeşil renkli pigmentler olup fotosentezde esas
rolü üstlenmişlerdir. Klorofil a, klorofil b, klorofil c ve klorofil d olmak üzere dört ayrı tipi
vardır. Karotenoid pigmentleri renkleri sarıdan mora kadar değişen lipid yapısındaki
bileşiklerdir. Fotosentezde rollerine ilave olarak, başka görevlerde yaparlar. Fikobilinler ise
fikobilin adı verilen pigment maddesi ve proteinlerin oluşturdukları komplekslerdir.
Fikoeritrin ve fikosiyanin gibi fikobilin çeşitleri fotosentez olayında ışık absorbe ederek
klorofil moleküllerine yardımcı olurlar ve yüksek bitkilerde bulunmazlar.
MATERYAL:
Yeşil bitki yaprağı (ıspanak)
Santrifüj
Havan ve havan eli
Spektrofotometre
Pipet
%80’lik aseton
Santrifüj tüpü
Eppendorf tüpü
Tülbent
YÖNTEM:
a) Fotosentezde Rol Alan Pigmentlerin Ekstraksiyonu
Bitkilerin yeşil yapraklarından (örn. Ispanak) 0,1 g tartarak, bir havanda 5 ml, %80
aseton içerisinde iyice ezilir.
Elde edilen pigment ekstraktı 3000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilir.
Süpernatant (üstte kalan kısım) kısmı bir tüpe aktarılır.
Spektrofotometre küvetine %80’lik aseton konularak alet sıfırlanır.
Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU
5
Başka bir küvete aynı miktarda aseton ve 6 damla ekstrakt ilave edilerek karıştırılır.
Küvet spektrofotometreye yerleştirilir; 380 nm dalga boyundan başlanarak 700 nm’e
kadar 20 birimlik aralıklarla değişik dalga boylarında absorbans değerleri kaydedilir.
Grafiğin apsisine dalga boyları, ordinatına ise absorbans değerleri yazılır ve elde
edilen noktalar birleştirilerek bir grafik çizilir ve maksimum absorbans gözlenen pik
yerleri belirlenir (Şekil 3).
Şekil 3. Klorofil a, b ve karotenoidlerin absorbsiyon apektrumu ile fotosentez hızı
arasındaki ilişki
Not: Aletin her defasında sıfırlanması gerekir.
b) Klorofil ve Karotenoid Pigmentlerinin Kantitatif Tayini
Elde edilen pigment ekstraktının 645 ve 663 nm’lerdeki absorbans değerleri aşağıdaki
formüllerde yerine konarak; kla, klb ve toplam klorofil miktarları mg/1000 ml
cinsinden hesaplanır.
Klorofil a = 12,7 x A663 – 2,69 x A645
Klorofil b = 22,9 x A645 – 4,68 x A663
Toplam Klorofil = 20,2 x A645 + 8,02 x A663
Aynı zamanda ekstraktın 450 nm’deki absorbans değeri ölçülerek, ve yukarıda
hesaplanan kla ve klb miktarları aşağıdaki formülde yerine konularak karotenoid
miktarı mg/1000 ml cinsinden hesaplanır.
Toplam karotenoid (mg/1000 ml) = 4,07 x A450 – (0,0435 x kla miktarı + 0,3367 x
klb miktarı)
Not: Kalan pigment ekstraktları bir tüpe konarak ağzı sıkıca kapatılır ve bir sonraki
uygulamada kullanılmak üzere buzdolabında muhafaza edilir.
Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU
6
UYGULAMA 2: Fotosentezde Yer Alan Bitki Pigmentlerinin Kromotografi Yöntemiyle
Ayrılması
Burada kullanacağımız ince tabaka yönteminin esası, tabakalar üzerine yayılmış
silikajel destek ortamında, yürütücü (etanol) kullanarak pigmentleri ayırmaktır. Pigmentler,
etanolde çözünme durumlarına ve molekül büyüklüklerine göre birbirinden ayrılırlar.
Etanolde iyi çözünen ve molekül boyutu küçük olanlar daha hızlı yürür.
MATERYAL:
4 adet pasteur pipeti
Cetvel
4 adet beher
Alüminyum folye
Silikajel veya Whatmann Kağıdı (No1,3)
Pigment ekstresi
200 ml etanol
YÖNTEM:
Silikajelli yürütme plakları dikkatlice alınarak masanın üzerine konur.
Alt kısmından 1,5 cm olacak şekilde işaretlenerek; daha önceki deneyde hazırlanan
pigment ekstraktından pasteur pipetiyle 5-6 damla damlatılır. Damlatma işlemi
esnasında bir önceki damlanın kuruması beklendikten sonra diğeri damlatılmalıdır
(Şekil 4)
Şekil 4. Destek ortamlar ve numune uygulaması
Kromatografi tankına veya bir behere 1 cm yüksekliğinde etanol konarak ağzı sıkıca
kapatılır (Şekil 5).
Şekil 5. Pigmentlerin yürütülmesi
Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU
7
Ekstrakt damlatılan plaklar işaretli kısmı aşağıya gelecek şekilde tanka yerleştirilir.
Etanol yukarıdan 2 cm yüksekliğe ulaştığında plaklar tanktan çıkarılır ve pigmentlerin
yerleri (renklerine bakılarak) ile etanolün en son vardığı yer işaretlenir (Şekil 6).
Şekil 6. Kromotogram
Damlatma noktasından itibaren etanolün ve her pigmentin yürüdüğü mesafe cetvelle
ölçülerek kaydedilir ve aşağıdaki formül kullanılarak her pigment için Rf değerleri
hesaplanır ve tabloya yazılır (Tablo 1).
Rf = Pigmentin aldığı yol / etanolün aldığı yol
Bu şekilde çok sayıda ayrım yapıldıktan sonra pigmentlerin bulundukları yerlerdeki
silikajel bir kap içerisine kazınarak, biraz etanol veya aseton ilave edildikten sonra
santrifüjlenerek üstteki sıvı kısmı alarak her pigmenti ayrı olarak elde etmek ve ayrı
ayrı absorbsiyon spektrumlarını tayin etmek mümkündür.
Tablo 1: Kromatogram bulguları
Pigmentin adı Rf Değeri