Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi

ECZ 344

Prof.Dr. Dilek AK

04.04.2014 /5. DERS

BİYOLOJİK SIVILAR

1

İDRAR

İdrarın % 95 i sudur.

% 5 i, şekerler, amino asitler, kreatinin, üre ve diğer

metabolizma ürünleridir.

İdrarın fiziksel ve kimyasal bileşimi oldukça

değişkendir, diyetin türü ve bileşimi ve endojen

metabolitlerin miktarı ile değişir. Ayrıca kilo, duygu

durumu metabolizma hızı vb de bağlıdır.

Taze idrar berraktır, ancak bekleyen idrarda, idrar

yollarından gelen mukus varlığı veya lipitlerin

bozulmasına bağlı olarak bulutumsu, bulanık bir

görünüm veya topaklı çökelti oluşur.

2

İDRAR

Elde edilmesi kolay olduğu için ilaç analizinde en yaygın kullanılan biyolojik örneklerden biridir.

Numune alma sırasında, kadınlar için mens dönemi, erkekler için sperm bulaşması konularında dikkatli olmak gerekir.

Farmakokinetik çalışmalarda detaylı talimatlara göre 24 saatlik idrar temiz kaplara toplanır.

Bakteriyel degredasyon ve dondurarak bekletme gibi durumlarda koruyucu maddelerin eklenmesi gerekebilir.

İdrar stabilitesini sağlamak için numune alma ve analiz arasındaki zamanı kısa tutmak en iyi çözümdür.

3

İDRAR

İdrar, plazma veya serumdan farklı olarak protein ve

lipid içermez.

Organik bir çözücüyle doğrudan ekstre edilebilir.

Bileşim olarak geniş bir çeşitliliğe sahiptir; gün

boyunca açık renkli olmasına rağmen gece

sonunda sabah ilk idrar koyu amber renklidir.

İdrarda bulunan bileşikler normalde suda çözünür

özelliktedir. İlaçların çoğu yağda çözünür ve uygun

bir çözücü ile idrardan doğrudan ekstre edilebilir.

4

İdrar

En büyük güçlüklerden biri sabit zaman aralıklarındaüretilebilen idrarın hacmidir.

Analitik testlerin çoğunda sabit bir numune hacmi ile analizyapmak yaygın bir uygulamadır.

Üriner atılma ile belirli aralıklarla ilgili maddenin bir miktarı atılırve derişim yerine derişimle hacmin çarpımından bulunan miktarı değerlendilir.

Burada problem 2 misli olur.

İdrar hacmi fazla ise numune seyreltiktir ve yöntem saptamasınırı yakınlarında işleyebilir ve düşük derişimlerdekanıtlanamayan hatalar hacim için ayarlamalarda misli olarakartacaktır.

İdrar ile atılım miktarının değerlendirilmesinde büyük bağılhatalar büyük mutlak hataya dönüşür.

5

İdrar

Bu yüzden tek bir hastadan toplanan idrarların bir

serisinde, bireysel idrar numuneleri farklı hatalara

maruz kalacaktır ve toplam ilaç atılmasında önemli

ölçüde belirsizlik olacaktır.

Toplam ilaç atılımının sonuçları değerlendirilirken bu

faktörü göz önüne almak gerekir.

6

İdrar

Örneğin bir yarışın ardından rasgele seçilen ve test numuneleri alınmış olan atletlerin idrarlarındaki özelliklekafeinin anormal miktarlarına karşılık gelen tayinlerinde benzer problemler ortaya çıkar.

Sporcuların idrarında kafein için bir derişim sınırı vardır;ancak atlet özellikle ter vb su kaybına maruz kaldığızaman idrar çok derişik olabilir ve kafeinin normal düzeyi kolayca yasaklı düzeye dönüşür.

Spor otoriteleri problemin bilimsel olmayan görünüşü veyorumlanmasını değerlendirirken dikkatli olmalıdır.

Diğer taraftan idrar numunesinin içeriği hatalınegatiflere neden olabilir.

7

İdrar

İdrar geniş bir pH aralığına sahiptir. İçeriği diyete

veya ilaç kullanımına bağlıdır.

Örneğin antiasitler absorbe olursa idrarı alkali

yapabilir; kuvvetli asit idrar daha az görülür.

İdrar için normal pH aralığı 5.5-7.0 dir.

Atılan ilacın davranışı bu durumda pH ya bağlıdır.

Amfetamin gibi zayıf bazik ilaçlar asit idrarda, zayıf

asidik ilaçlar ise alkali idrarda daha fazla atılırlar.

8

İdrar

Bekletilen idrar karbondioksitini yavaşca kaybeder

ve daha alkali olur bu da inorganik fosfatların

çökmesine yol açar.

pH değişikliğine ilave olarak bu durum analitin

bozunmasına da yol açabilir.

Analit bu fosfatlarla da çökebilir ve analiz için

kaybedilir.

Bu yüzden bekletilmiş idrar taze idrardan farklı bir

bileşime sahip olacaktır. Analitik yöntem ve bu

matrikste ilacın stabilitesinin sağlanması her iki tipin

özellikleri için değerlendirilmelidir.

9

İdrar

Kantitatif çalışmalarda kullanıldığı zaman idrar ile

ilgili önemli diğer bir konu numune alma yöntemi ve

alınan numune miktarıdır.

Acaba hasta mesanesini tamamen boşaltmış mıdır,

böylece belli bir zaman periyodunda ilaç ya da

metabolitinin tamamı idrara geçen miktar olarak

hesaplanabilir mi?

Hastadan bir numune sağlaması istendiğinde

minimum düzeyde idrar verebilir ve bu orta bir

numune yerine ilk yakalanmış düzey olabilir ve

numune bütünü temsil etmeyebilir.

10

Numune Hazırlama

Bir çok ilaç idrar ile konjugatları halinde atılır. Bu

nedenle analizden önce dekonjugasyon işlemi için

asit hidroliz veya beta glukuronidaz enzimi ile hidroliz

edilir.

İlacın kanda kaybolması, idrarda ortaya çıkmasına

neden olur.

Genellikle seyreltme ve tamponlama işlemi

uygulanır. İçeriğinde katı varsa santrifüj veya süzme

işlemi uygulanır.

11

İdrarın Asit Hidrolizi

5 ml idrar üzerine iç standart ve 500 µL derişik

hidroklorik asit eklenir ve karıştırılır.

Otoklav: 121 oC de20 dk tutulur

Su banyosu: (kaynayan su ortamı) 20 dk tutulur.

Isıtıcı blok: 90 oC de 30 dk tutulur.

Soğutulduktan sonra 10 dk 670 g de santrifüj edilir,

pellet atılır.

1 ml 7.4 M NH4OH eklenir ve karıştırılır. Numune pH sı

6.0 ± 0.5 değerine fosforik asit ile ayarlanır.

12

İdrarın enzimatik hidrolizi

5 ml idrara 2 ml ß-glukuronidaz çözeltisi eklenir.

ß-glukuronidaz çözeltisi pH 5.0 olan 1.0 M asetat

tamponu içerisinde hazırlanır.

65 oC de 3 saat hidroliz edilir ve soğutulur.

670 g de 10 dk santrifüj edilir ve pellet atılır.

Numune pH sı 6.0 ± 0.5 değerine 700 µL 1.0 M NaOH

ile ayarlanır.

13

SÜT

Süt ilaçların analizi için çok alışılmış bir sıvı değildir, ancakanneden bebeğe bu yolla ilaçların geçip geçmediğinibelirlemek için nadiren ilgilenilir.

Çoğunlukla idrar veya serum için uygulanan mevcut yöntemlerfazla güçlükle karşılaşmadan anne sütüne de uygulanabilir.

Temel problem sütte bulunan yağlardır. Ergin insan meme sütünde yaklaşık % 4,5 yağ bulunur.

Fillokuinon için önerilen bir yöntemde, HPLC analizinden öncenumunedeki yağları hidroliz etmek için lipaz enzimi kullanılmıştır.

Alternatif olarak plazma numuneleri için yukarıda önerilenyağdan arındırma basamakları yeterli olabilir, insan sütündefenoksikam analizi için yağlar 0,5 mL sütün pH 3-4 e tamponlanıp 10 mL n-hekzanla yıkanmasıyla uzaklaştırılmıştır.

14

BEYİN OMURİLİK SIVISI

Beyin omurilik sıvısı, ilaçların ve doğal biyolojikajanların plazma veya serumda tayin edilenleregöre, etki yerine daha yakın olduğu düşünülen diğerbir biyolojik sıvıdır.

Bu sıvıda genellikle ağrı kesici (pain-killing) aktiviteliilaçların analizine yönelik uygulamalar bulunur. Analiz numunelerinin kolayca elde edilememesinekarşın, numune mevcut ise plazma veya serum içingeliştirilmiş olan yöntemler kolayca uygulanabilir.

Bu tip modifiye olmayan tayinler beta endorfinler ve diğer peptidler ve yanısıra enkefalin, morfin ve nimodipin için bildirilmiştir.

15

SAFRA

Safra, ilaçların analizinde çok sık kullanılmayan kompleks vedeğişken bir sıvıdır. Analiz numunesi sağlanması kolay değildir. Ayrıca araştırılan proses ile girişim yapabilecek, safrauzaklaştıran herhangi bir sistem analizde zorluklara neden olabilir.

Özellikle konjugasyon enzimleri ile ilgili araştırmaların yapıldığı invivo karaciğer perfüzyon çalışmalarında, safra, analiz numunesi olarak kullanılır.

Diğer sıvılar için geliştirilmiş uygun yöntemler safra için kolaycauygulanamaz.

Örneğin kan, idrar, vitrös humör ve BOS da morfin için ticari RIA kitleri kullanılarak doğrudan analiz yapılabilir, ancak safraanalizlerinde numunenin bazik yapılması vediklorometan:propanol ile ekstre edilmesi gerekir ve kalıntıserumda çözüldükten sonra analiz yapılır.

16

TÜKRÜK/SALYA

Salya, renksiz, saydam veya yarı saydam, düşük

viskoziteli bir sıvıdır.

İlaç analizi için cazip olmasının nedeni,

girişim yapan maddelerden bağıl olarak uzak olması,

organik çözücülerle kolayca ekstre edilmesi ve

kanda proteine bağlı olmayan ilaç düzeyini

yansıtmasıdır.

Steroidler gibi iyonize olmayan ilaçlar , plazmadan

salyaya kolayca geçebilir ve bu yol ilaç izlemenin

noninvaziv bir yöntemini temsil eder.

17

Salya, ağız boşluğunda başlıca üç salgı bezi

tarafından salgılanır:

(1) Parotid gland: Ağız boşluğu tavanında bulunur, kan

plazmasından kaynak alan salyanın salgılanmasından

sorumludur (Seröz sıvı)

(2) Sublingual gland: Ağız boşluğunun yan taraflarında

bulunur, hem seröz sıvı hemde musin salgılar.

(3) Submandibular gland: Bademciklerin altında

bulunur, hem seröz sıvı hem musin salgılar.

Musin salyaya yapışkan özellik kazandırır.

18

TÜKRÜK/SALYA

Normal kişiler 24 saatte 2 litre salya üretebilir.

Yemekler arasında 15 mL/saat altında ya da üzerinde devamlıakış sağlar.

Uyarılmamış salyanın pH değeri 5.6-7.0 aralığındadır.Uyarıldığında max pH 8.0 olur.

Uygun zaman sürecinde uygun bir numunenin toplanması güçbir işlemdir, ancak parafilm gibi bir inert materyal çiğneyerekveya sitrik asit kullanarak glandların uyarılması ile daha büyüknumuneler kolayca elde edilebilir.

Schramm ve arkadaşları ağız içine yerleştirilen poliüretan bağlıselüloz yarı geçirgen membranlarda hapsedilmiş sukrozgranülleri içeren bir cihazı ultrafiltre salya toplamak içinkullanmış ve değerlendirmişlerdir. Bu dâhice cihaz sıvınıntoplanması ve işlenmesi ile ilgili bazı problemleri ortadan kaldırmıştır. Uyarılmış salyanın kendi pH değeri ile daha uyumluolduğu da bildirilmiştir (pH 7.0 ile 7.8 arası).

19

Salya, Kan, Plazma ve Serum bileşimlerinin

karşılaştırılması

Salya Kan Plazma Serum

Su 99.5% - 90-95% 90-95%

Özgül ağırlık 1.002-1.008 1.05-1.06 1.025-1.029 1.024-1.028

pH 5.17-6.77 7.36 7.32 7.32

Toplamprotein

262 mg/100ml - 6550 mg/100 ml

-

Toplam lipit 2.8 mg/100 ml - 500 mg/100 ml -

Fibrinojen - - 330 mg/100 ml -

Kolestrol <1 mg/100ml - - 200 mg/100ml

Klorür 102.8 mg/100ml

300 mg/100ml 350 mg/100ml 350 mg/100ml

Hemoglobin 0 15 g/100 ml - -

20

Salya

Salyadaki ilaçların tayini için analitik yöntem geliştirenaraştırmacılar plazma veya serum gibi diğer sıvılar içinmevcut yöntemlerin salyadaki analizlereuygulanmasında önemli güçlüklerle karşılaşmamışlardır.Bu durum terapötik ilaç izleme ve adli uygulamalardaönemli kolaylık sağlar.

Karşılaşılan küçük problemler ise salyada bulunanmukoit proteinlere ilaçların (örn. fenitoin) adsorpsiyonuve ilaçların uyarıcı materyal tarafından seyrek de olsaadsorbe edilmesidir.

Salyada ilaçların analizi ile ilgili temel problem teknolojikbir problem değildir. Ancak böyle analizlerinsonuçlarının uygunluğu belirlenmelidir.

21

Salya

Kandan salyaya ilacın transferinin pasif difüzyon ile

olduğu kabul edilirse, salya ve kan derişimleri

arasındaki ilişki teorik olarak ifade edilebilir.

Araştırmacılar beklenen düzeylerin analitik

kapasiteleri içerisinde olup olmadığına karar

verebilirler ve salya içerisindeki analitik değerler elde

edilirse kandaki derişimleri belirlemek için uygun

ekstrapolasyonlar yapabilirler.

Henderson- Hasselbach eşitliğini uygulayarak zayıf

bir asidin salya ve plazmadaki ilaç derişimleri oranı

şöyle ifade edilebilir:

22

Salya

23

Plazma ve salyadaki zayıf bazik ilaçlar için derişim oranı

Oran = 1+ 10(𝑝𝐾𝑎−𝑠𝑎𝑙𝑦𝑎 𝑝𝐻)

1+ 10(𝑝𝐾𝑎−𝑝𝑙𝑎𝑧𝑚𝑎 𝑝𝐻) 𝑥𝑝𝑙𝑎𝑧𝑚𝑎𝑑𝑎 𝑏𝑎ğ𝑙ı 𝑜𝑙𝑚𝑎𝑦𝑎𝑛 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖𝑦𝑜𝑛

𝑠𝑎𝑙𝑦𝑎𝑑𝑎 𝑏𝑎ğ𝑙ı 𝑜𝑙𝑚𝑎𝑦𝑎𝑛 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖𝑦𝑜𝑛

Plazma ve salyadaki zayıf asit ilaçlar için derişim oranı

Oran= 1 + 10𝑠𝑎𝑙𝑦𝑎 𝑝𝐻−𝑝𝐾𝑎

1 + 10𝑝𝑙𝑎𝑧𝑚𝑎 𝑝𝐻−𝑝𝐾𝑎 𝑥𝑝𝑙𝑎𝑧𝑚𝑎𝑑𝑎 𝑏𝑎ğ𝑙ı 𝑜𝑙𝑚𝑎𝑦𝑎𝑛 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖𝑦𝑜𝑛𝑠𝑎𝑙𝑦𝑎𝑑𝑎 𝑏𝑎ğ𝑙ı 𝑜𝑙𝑚𝑎𝑦𝑎𝑛 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖𝑦𝑜𝑛

Salyadaki ilaç derişimi salyanın pH sına ve uyarılma derecesine

bağlıdır.

Salya

Plazma pHsı 7.4 olduğunda ve asit ve bazilaçların salya/plazma oranlarıhesaplandığında salyada proteinbağlanmasının minimum olduğu gösterilmiştir.

Salyanın pH’sı dağılım üzerine dramatik etkiyesahip olabilir. Düşük pH larda ve plazmaproteinlerine %99 bağlanan asidik ilaçlar içinsalyadaki derişim plazmadakinin 0.0004 katıolabilir.

Bu yüzden anlamlı bir yorum için salyatoplandığında pH’sını ölçmek önemlidir.

24

BLİSTER SIVISI

Blister sıvısı (yeni bir ayakkabının ayakta içi sulu kese

oluşturması, yanık sırasında oluşan kese, sürtünme

nedeniyle el ve ayakta tahriş, kimyasal maruziyeti

gibi) hafif iltihaplı reaksiyonlarda salınan ve

interstisyal sıvıya benzer olan bir sıvıdır ve protein ve

lipid içerir.

İbuprofenin farmokokinetiğinin çalışılmasında

kullanılmıştır.

25

SİNOVİAL SIVI

Eklem kıkırdakları arasında bulunan sıvıdır.

Antiinflamatuar ilaçların sinovial sıvıda analizi için

HPLC ile yapılan analizler plazma için kullanılanlar ile

aynıdır.

Eklem romatizmalı hastaların sinovial sıvı ve

plazmasında flurbiprofenin enantiyomerlerinin analizi

için benzer yöntemler kullanılır; sinovial sıvının

sınırlaması sadece numunenin küçük miktarıdır.

Diklofenak tayininde plazma için kullanılan

ekstraksiyon yöntemi sinovial sıvı için de aynı şekilde

kullanılmıştır.

26

AKÖZ HUMOR

Kornea ile lens arasını dolduran

sıvıdır.

İmipenemin bu sıvıdaki HPLC

yöntemi ile analizi, plazmadaki

tayini için kullanılan yöntem ile

aynıdır.

27

İlginiz için teşekkür ederim.

28