Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi

ECZ 344

Prof.Dr. Dilek AK

28.03.2014 /4. DERS

BİYOLOJİK SIVILAR

1

PLAZMA ve SERUM

Kan, antikoagülan ilave edilmeden bir tüpe alınır ve

pıhtılaşması için bekletilirse pıhtı yumağından sarı

renkli bir sıvının ayrıldığı görülür. Buna serum denir.

Serumda kanın pıhtılaşmasında görev alan bazı

pıhtılaşma faktörleri ve proteinler özellikle fibrinojen

ve bazı pıhtılaşma faktörleri (proteinlerin % 2.0-2.5 i)

bulunmaz. Bu yüzden seruma fibrinojensiz plazma

denir.

2

Plazma ve Serum

Plazma ve serumun en önemli özelliği büyük

miktarda protein içermesidir. Protein ölçülecek

küçük moleküllü ilaçtan kimyasal ve fiziksel olarak

farklıdır.

Plazmanın toplam protein içeriği: 7.0-7.5 g/100 ml

plazma

Ancak proteinler ve ilaçlar arasında güçlü bir afinite

vardır ve ultrafiltrasyon veya diyalizle proteinin

uzaklaştırılması, ilacın büyük bir fraksiyonununda

uzaklaştırılmasına neden olur.

3

4

Plazma ve Serum

Diğer taraftan ilacın doğrudan ölçümü mevcuttoplam ilaç ve ölçülen serbest ilacın karışmasına yolaçar.

Mikrobiyolojik tayinlerde sadece serbest ilaç ölçülürancak standartlar da ölçülecek aynı sıvıda çalışıldığıiçin sonuçların mevcut antimikrobiyal ajanın toplammiktarına karşı geldiği kabul edilir.

Serbest ilacın fizyolojik olarak önemli varlığıtartışılmasına karşın ilaçların çoğu protein bağlıolarak bulunur ve serbest konsantrasyonu önemliölçüde düşüktür. Plazma veya serum numunelerindetoplam ilacı ölçme yolu kullanılır.

5

Plazma ve Serum

Bu yüzden problem ilacın proteine bağlanmasınıfizyolojik olarak tahrip edilmesi ve analiz için toplamilacın ekstre edilmesidir.

Bağlı fraksiyon, toplamın sabit bir yüzdesi olduğu ve analizcinin analizi basitleştirmesi için bir yükseltmefaktörünü kullanması söz konusudur.

Günümüzde bu durum bağlı olmayan fraksiyon içinanalizcinin çok duyarlı yöntemler geliştirmesinigerektirmediği için şanslı bir durumdur; ancak bazıilaçların metastabil conformerlerinin aktif formdaolabileceği iddiaları mevcuttur.

Eğer bu iddialar doğruysa farmakokinetiklerininaydınlatılması biyolojik sıvılarda spesifik conformerlerinanalizi gerekir.

6

Plazma ve Serum

Analiz için plazma veya serum numunesinin

hazırlanmasında ilk basamak proteinsiz sulu çözelti

elde etmek ve bir organik çözücü ile uygun

ekstraksiyondur.

En basit ve eski yöntem proteinleri çöktürmek ve

filtratı (supernatan) izole etmektir.

Protein çöktürme ile denature edilir ve ilaç bağlama

yeteneği zarar görür. Böylece toplam ilaç filtrata

salınır.

7

Plazma ve Serum

Kostik çözeltiler, plazma ve serumda proteinlerin

denature edilmesi ve çöktürülmesi için eşit etkinlikte

olmasına karşın bunlar genellikle ekstraksiyonda

zorluklara neden olan sabun oluşturma

özelliklerinden dolayı tercih edilmezler.

Protein çöktürülmesi için yaygın kullanılan asidik

reaktifler trikloroasetik asit, perklorik asit ve tungstik

asittir ancak bu tip kuvvetli asitler ekstre edilecek

ilaca zarar veren etkiye sahip olabilir.

Böyle bir prosedür klasik genel reaktiflerle kullanılan

biçim yerine standart bileşiklerle test edilmelidir.

8

Plazma ve Serum

Stevens ve Bunker bu asitlerin yanı sıra 80 oC de 5 M

HCl, alüminyum klorür ve amonyum sülfatın kullanımı

üzerine bir araştırma yapmış ve genel olarak hiçbir

yöntemin uygulanabilir olmamasına karşın tüm

kanda proteinlerin çöktürülmesi için alüminyum

klorürün en güvenli reaktif olduğu, bazı ilaçların

düşük geri kazanımlarının ilaçların proteinlerle

çökmesine ve degredasyonuna bağlı olduğu

sonucuna varmışlardır.

9

Plazma ve Serum

Düşük pH da ilaçların stabil olmaması, proteinlerindenaturasyonu ve çöktürülmesi için organik çözücülerinkullanımı ile önlenebilir.

Dell, bütün plazma proteinlerini çöktürmek için en az ikimisli hacmi gerekli olan metanol veya etanolü tavsiyeeder.

Diğer bir popüler çözücü özellikle HPLC de yaygın kullanılan asetonitrildir. Mathies ve Austin, antikonvülzanve analjeziklerin analizi için plazmanın eşit hacimasetonitrille karıştırıldığı ve çözeltinin sodyum bisülfat/sodyum klorür ile doyurulduğu ve üst fazın doğrudankromatografik kolona enjekte edildiği bir yöntem tarifeder.

10

Plazma ve Serum

Proteinler, proteolotik enzimler kullanılarak da denature edilebilir.Kimyasal denaturasyon kullanıldığında analitin zarar görmeolasılığını azaltmak için uygun bir yoldur.

Proteolitik enzimler genellikle doku preparatlarındaki ilaç analizi içinuygulanır. Ancak subtilizin enzimi plazma proteinlerinin dijesyonu içinbaşarıyla kullanılmıştır.

Osselton, bütün kan ve plazmanın analizinde, doğrudanekstraksiyon ile enzim hidrolizini karşılaştırdığı çalışmasında dokudanilacın geri kazanımında enzim hidrolizi ile daha iyi geri kazanım eldeedildiğini göstermiştir.

Osselton’un prosedüründe 200 µL plazma 50 µL TRIS tamponu ile pH10.5 değerine tamponlanır, enzim katılır ve karışım 50 µL bütil asetatile ekstraksiyondan önce 55 C de 1 saat inkübe edilir. Organik fazdaha sonra uygun bir yöntemle analiz edilir.

Osselton spesifik bir bileşik için normal ekstraksiyon işlemlerininoptimizasyonunun olanaklı olmadığı koşullarda genel taramaişlemleri için enzim hidrolizinin çok kullanışlı olduğunu bildirir.

11

Analit içeren çözeltiden proteinlerin ayrılması icin

yöntemler

Yöntem Yorum

90 oC de 5-15 dk ısıtmak Çok etkin değildir. Analit dekompoze olabilir.

Dondurma – çözündürme siklusları Çok etkin değildir. Zaman alıcı bir işlemdir.

Amonyum sülfat ile doyurma Orta düzeyde etkindir. Supernatanda yüksek tuz derişimi, final pH 7.0 dolayındadır

ZnSO4 - sulfosalisilik asit Temiz bir çözelti, RIA için uygun

ZnSO4 – sodyum hidroksit Mükemmel verim, pH 7.0 dolayında ince bir çökelti, düşük sıcaklıklarda uygun

Metafosforik asit Mükemmel verim, reaktifin soğuk tutulması gerekir, asitlik (pH<3) analiti dekompoze edebilir.

Perklorik asit Mükemmel verim, reaktifin soğuk tutulması gerekir, patlayıcı reaktif, final pH analite zararlı olabilir. Bir çok bazik ilaç güvenle ekstre edilebilir.

Trikloroasetik asit İyi verimlilik, reaktifin soğuk tutulması gerekir, analitten uzaklaştırılması

zor olabilir.

Tungstic asit

Etanol İki hacim etanol tamamlanmış denaturasyon için gereklidir. Düşük pHda ilaç dayanıksız ise uygundur.

Asetonitril Tamamlanmış denaturasyon için 1.5 hacim gerekir. Zayıf floc analitinbirlikte çökmesini engeller. Özellikle takiben HPLC varsa uygundur.

Aluminyum klorür Bazik bileşikler için amonyum sülfat ve tungstik asitten daha

uygundur.

12

Plazma ve Serum

Proteinlere bağlanma ilacın kanda transportu için ve

bazen de ilacın çözünürlüğü için önemli bir olaydır.

Yukarıda açıklandığı gibi ekstraksiyonun alışılmış

yöntemleri bu tip bağlanmayı kırma eğilimindedir.

Böylece genellikle sıvılardaki toplam ilaç ölçülür.

Normal olarak proteine bağlanma kapsamından

habersiz olarak serbest ilaç ölçülmek istendiğinde

bazı durumlarla karşılaşılabilir. Barbituratlar gibi asidik

ilaçlar kuvvetli bağlanır. Bazik ilaçların bağlanma

eğilimi yoktur. Fenitoinin proteinlere bağlanması

valproik asitten etkilenir.

13

Plazma ve Serum

Plazma çok kompleks bir sıvı olmasına karşınkompozisyonu önemli ölçüde stabildir ve hastalardabile içeriğinde büyük değişiklik olmaz.

pH 7.30 ile 7.50 aralığındadır ve bu aralığın dışınaçıkmaz. Toplam protein ve tuz konsantrasyonları da iyikontrol edilir.

Ancak yağ içeriği yemeğin zamanına ve cinsine göreönemli ölçüde değişebilir.

Plazma konsantrasyonu-zaman grafiği çizildiği zamanyağ içeriği analizi etkileyen bir faktör olabilir ve özellikleyağlı numunelerde yağları uzaklaştırmak için özel birekstraksiyon basamağı gerekebilir.

14

Plazma ve Serum

Plazma bileşenlerindeki bazı değişikliklerin ilacın gerçek düzeyiüzerine etkisi olabilir. Örneğin bazı ilaçlar protein bağlanmakısımlarında diğerleriyle yer değiştirebilir. Böyle durumlardailacın fizyolojik etkisi sadece serbest ya da bağlanmayankonsantrasyona bağlı olabilir. Çünkü daha az bağlanma yerlerimevcut olduğu için ölçülen toplam ilaç gözlenen etki için sonderece düşük görünecektir. Bu yüzden bir çok araştırmacıserbest ilacın analizini gerçek bir indikatör olarak savunur.

Bu tip tayinlerde serbest ilacın bağlı ilaçtan ayrılması için ticarifiltrelerin kullanıldığı ultrafiltrasyon yöntemleri popülerdir. Ancakserbest ilacın düşük konsantrasyonları saptama sınırının dışındakalabilir.

Alternatif bir işlem toplam ilaç için analizinden önce aynıplazma numunesini radyoaktif işaretli ilaç ile dengeleyerekbağlı yüzdesini belirlemek olabilir.

15

Plazma ve Serum

İlaçlar plazma proteinlerine kuvvetlicebağlanabilmesine karşın bağlanma tersinirdir. Bundandolayı uygun pH da numune organik bir çözücüyleekstre edilebilir.

İyonize olmayan formdaki ilacın organik çözücüyepartisyonu yeterince yüksekse, bağlanma dengesiorganik çözücüye verimli ekstraksiyonu sağlayacakşekilde kaydırılabilir. Bu strateji tamponun en az miktarıile gerekli pH ya ayarlamak ve çözücünün bağıl olarakbüyük hacmiyle ekstre etmektir.

Bu prosedürün avantajı çok sayıda numune için bir rutinişlem olan filtrasyon veya aktarma gibi işlemlerdenkaçınmaktır. Toksikoloji ve klinik farmakoloji çalışmalarınıdestekleyen laboratuarlar için bu işlemler gerçek birproblemdir.

16

Plazma ve Serum

Çok sayıda numunenin analizinde gerekli zamanı

azaltmak için ekstraksiyon işlemleri ile ilgili basamağı

basitleştirmek amacıyla

çözeltideki analitin katı bir matrikse adsorpsiyonu ve

ardından çözücünün daha küçük bir hacmi ile elüsyonu

işlemleri uygulanabilir.

Bu amaçla aktif kömür, modifiye silika veya iyon

değiştirici reçine gibi bir materyal içeren bir kolona

işlem görmemiş numune çözeltisinin eklenir. (katı faz

ekstraksiyonu)

17

Plazma ve Serum

Ayrıca, numune sağlandıktan sonra plazma veya

serum bileşeni olarak bulunan enzimlerin ilaç

degredasyonunu sürdürmesi ihtimali mevcuttur.

Nonspesifik esterazlar özellikle önemlidir ve esterleri

serbest alkol ve asitlere parçalar. Bu esterazların

doğası ve aktivitesi kişiye göre değişir.

18

Plazma ve Serum

Plazma ve serum büyük miktarda protein içerdiği için ilaçlar kendi fizikokimyasal özelliklerine göre çeşitli derecelerde proteinlere bağlanacaktır.

Genelde asit ve nötral yapıdaki laçlar başlıca albümine, bazik ilaçlar ise asit glikoproteinlere bağlanır. Ekstravasküler dağılım ve eliminasyon için sadece serbest ilaç mevcuttur ve hücre membranlarını geçebilecek ve ilaç reseptörleri ile etkileşecek kısım serbest ilaç fraksiyonudur.

Amaç toplam ilaç derişiminin ölçülmesi olduğunda proteinsiz serum veya plazmada ilacın doğrudan analizi toplam ilaç derişimini yansıtmayacaktır. Bu yüzden protein, bir organik çözücü ile ekstraksiyon işleminden önce denature edilir. Alternatif olarak proteine kuvvetlice bağlanan ilaçlar pH ninuygun şekilde ayarlanması ile serbest hale geçirilebilir.

19

Numune Hazırlama

1. Osmotik parçalama

2. Protein çöktürme

3. Asit muamelesi

4. İnorganik tuzlar

5. Sonikasyon

20

Numune Hazırlama

1. Osmotik parçalama

1 ml, kan, serum veya plazmaya 4 ml distile su

eklenir.

Vortex ile karıştırılır veya 5 dk bekletilir.

670 g de 10 dk santrifüj edilir ve pellet atılır.

Tampon çözelti ilave edilerek süpernatan pH değeri

ayarlanır.

21

Numune Hazırlama

2. Protein çöktürme

1 kısım plazma veya serum için 2 kısım organik çözücü kullanılır.

Karıştırılır ve 5-10 dk bekletilir.

Numune vortexlenir ve santrifüj edilir.

Süpernatan elde edilir ve ekstraksiyon öncesinde tamponlanır.

Organik çözücüler içinde protein bağını tahrip etmek için en kuvvetli olanı asetonitrildir.

Organik çözücünün daha düşük miktarları % 10-30 da etkili olabilir.

22

Numune Hazırlama

3. Asit muamelesi

Kuvvetli asitler (formik, perklorik, trikloroasetik asit)

proteinleri ve yapılarını tahrip eder.

50 mkro litre 0.1-1.0 M perklorik veya formik asit 1 ml

serum veya plazmaya eklenir.

Triklorasetik ast %10 derişimde kullanılır.

Numune karıştırılır ve 5-10 dk bekletilir.

Vortex ve santrifüj yapılır pellet atılır.

Supernatan analiz edilir.

23

Numune Hazırlama

4. İnorganik tuzlar

Amonyum sülfat ve çinko sülfat (% 10-20) 1:1

oranında dilüsyon ile proteinleri çöktürmek için

kullanılabilir.

24

Numune Hazırlama

5. Sonikasyon

(kimyasal, biyolojik, farmakolojik ve fizyolojik

çalışmalarda materyallerin parçalanarak homojenize

edilmesi )

Biyolojik sıvı 15 dk oda sıcaklığında sonike edilir.

Uygun pH değerindeki tampon eklenir ve karıştırılır.

Santrifüj (670 g) 15 dk yapılır.

Pellet atılır ve supernatan analiz edilir.

25

İlginiz için teşekkür ederim.

26