blast.ppt [modalità compatibilità] - unibo.it · 31/05/2007 2. identità di sequenza e identità...

31/05/2007

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Evoluzione Molecolare e omologiaEvoluzione Molecolare e omologia

Evoluzione: Mutabilità e Selezione Naturale

Le sequenze degli organismi attuali hanno avuto origine dall’evoluzione di sequenze ancestrali

Le sequenze genomiche cambiano continuamente in modo casuale

L’ambiente seleziona gli individui in base al loro fenotipo

Se il prodotto del gene modificato non è funzionale (perde struttura o funzione) l’individuo muore e la modifica non si trasmette

NB. Le mutazioni sono casuali? Almeno la loro velocità, non sempre: SOS polimerasi di Radman

Evoluzione Molecolare e omologiaEvoluzione Molecolare e omologia

Omologia

Due sequenze sono dette omologhe se hanno un ancestore comune

Ortologhe in due specie differenti Paraloghe all’interno della stessa specie (duplicazione genica)

Similarità

Due sequenze sono dette simili se condividono buona parte della sequenza (molti amminoacidi uguali o simili): concetto NON evolutivo, ma di confronto tra sequenze

Omologia e SimilaritàOmologia e Similarità

Sequenze omologhe sono sempre simili?

Dipende dal grado di divergenza

Sequenze simili sono sempre omologhe?

Sequenze differenti possono essere evolute convergentemente verso sequenze simili (es non su sequenze ali di uccelli e ali di verso sequenze simili (es., non su sequenze, ali di uccelli e ali di pipistrello sono evoluzioni convergenti, a partire da da rettili e da mammiferi)

Di principio similarità e omologia non coincidonoesattamente. Tuttavia se due sequenze sono molto similisono probabilmente omologhe.

Per ora misuriamo la similarità in termini di identità disequenza

Identità di sequenza e identità strutturaleIdentità di sequenza e identità strutturale

Quando la similarità di sequenza implica similiarità strutturale?


2.5

0 5

1.5

2.0

1.0

of b

ackb

one

atom

s in

cor

e

1.0

0.6

0.8

0.4

tion

of re

sidu

es in

cor

e w

ith

RM

SD <

0.1

nm

Fino a quanto due sequenze simili danno strutture uguali?

Chothia, C. & Lesk, A. M. (1986). The relation between the divergence of sequence and structure in proteins. EMBO J. 5, 823-826.

0.0

0.5

100 050

Rm

sd o

Percent identical residues in core

0.0

0.2

100 050Percent identical residues in core

Frac

t

•2 proteine sono sovrapposte e si esamina la percentuale di identità nel nucleo sovrapposto•Proteine con identità maggiore del 60% hanno il 90% dei residui sovrapposti a meno di 0.1 nm

.

60

80

100identity

di s

eque

nza

(%)

Identità di sequenza implica identità strutturale


0

20

40

0 50 100 150 200 250Numero di residui allineati

Iden

tità

d

Identitàdi sequenza NON implica identità strutturale

Rost B (1999). The twilight zone of protein alignments. Protein Engineering 12, 85-94.

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.


Quindi due sequenze più lunghe di 100 residui, checondividano il 30 % dei residui, hanno struttura simile

Per sequenze più corte la percentuale di identità deveessere più alta

N N l h d àQuesto NON implica che sequenze con identità minoreabbiano strutture differentiEsempio: Mioglobina di capodoglio e emoglobina batterica:

RMSD = 0.19 nm, Identità: 14%


Per sequenze più lunghe di 100 residui

Midnight zone:

contiene la maggior

Twilight zone:

alto numero di falsi iti i

Safe zone:

nessun falso positivot tt l contiene la maggior

parte delle proteine strutturalmente simili

positivi(sequenza simile

struttura diversa)

tutte le sequenze simili hanno la

stessa struttura

20% 30%Percentuale di identità

Identità di sequenza e funzioneIdentità di sequenza e funzione

Il limite di identità che determina la stessa funzione è piùdifficile da stabilire e dipende criticamente dalladefinizione di funzione.

Per enzimi, la classe funzionale maggiore (ossidoreduttasi,isomerasi, ligasi, liasi….) viene conervata per sequenze conpiù del 30% di identità. La funzione più specifica richiede il60% d d à60% di identità

Aspartase [1JSW]

CO2-

C

H

NH3+

HH

OO-

CO2-

H

H-O2C+ NH3

Histidase [1B8F]

N NH

CO2-

H

HH+NH3

HH CO2

-

NHN+ NH3

δ2-Crystallin [1AUW]

Avian eye lens protein

Dati: Torsten SchwedeUniversità di Basilea

Allineamento di sequenzeAllineamento di sequenze

Problema: date due sequenze, confrontarle in modo darilevare la loro similarità

•Definire una distanza tra le sequenze

•Cercare un algoritmo per trovare l’allineamento a minimadistanza

•Studiare metodi per validare la significativitàdell’allineamento

Distanza tra sequenzeDistanza tra sequenze

Quali eventi consideriamo?

MutazioneVa definito un punteggio per la sostituzione dell’amminoacidoi con l’amminoacido j

Matrici di sostituzione s(i,j)

A: ALASVLIRLITRLYPA: ALASVLIRLITRLYPB: ASAVHLNRLITRLYP

∑= ),(),( ii BAsBAScore

La matrice di sostituzione riflette se una mutazione èmediamente compatibile col folding e col mantenimento dellafunzione

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Nucleotidi: identità

Amminoacidi: identità + somiglianzaVLSSADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFL

AGGCTGACCTGGGAAGGGAAACTCTCAAAACCATAGGATGAGCT-GGAAGGATA-CTCTCAAAAACAT*** *** ** ******* ** ******** ***

Identità e similaritàIdentità e similarità

VLSAADKANIKAAW-KVGGQAGDHGAEALERMPL***:*** *:**** ***: **: ******** *

Derivazione degli score da allineamenti di sequenze Derivazione degli score da allineamenti di sequenze omologheomologhe

Vogliamo misurare la probabilità di mutazione di ogni tipodi amminoacido in un insieme di sequenze omologhe

Date (molte) coppie di sequenze correlate, misuriamo lafrequenza della sostituzione iA->jB o iB->jA (indipendente dalladirezione): Pij

Es:A: ALASVLIRAILRLYPB: ALAVLLNRLILRALP

P(A,A)= N(AA,AB)/N = 2/15

P(A,L)= P(L,A)= [N(LA,AB)+N(AA,LB)]/N = 2/15

Qual è la probabilità che la sostituzione i->j sia casuale (e quindi non significativa)?

La sostituzione è significativa?La sostituzione è significativa?

Es: 1° insieme di sequenze omologhe

A: ALASVLIRAILRLYP B: ALAVLLNRLILRALP

2° insieme di sequenze omologhe

La probabilità che questa sostituzione sia casuale dipende dalle frequenze di occorrenza dei singoli amminoacidi Pi e Pj

2 insieme di sequenze omologheA: LLLLAALLLALLALL B: LALLAALLAALLALL

P(A,L)= 2/15 in entrambi i casi. Sono ugualmente significativi?

Per determinare il grado di “non casualità” della sostituzione bisogna confrontare Pij con il prodotto PiPj

Es: 1° insieme di sequenze omologheA: ALASVLIRAILRLYP

Sostituzione iA -> jB casuale significa che i 2 eventi:E1 = (i in A) e E2 = (j in B) sono INDIPENDENTI

Confronto con l’ipotesi di indipendenzaConfronto con l’ipotesi di indipendenza

B: ALAVLLNRLILRALPP(A)= 6/30, P(L) =10/30P(A,L) = 2/15 > 1/15 = P(A)P(L): sostituzione FAVORITA

2° insieme di sequenze omologheA: LLLLAALLLALLALL B: LALLAALLAALLALL

P(A)= 10/30, P(L) =20/30P(A,L) = 2/15 < 2/9 = P(A)P(L): sostituzione SFAVORITA

Score di sostituzioneScore di sostituzione

Il rapporto rij = Pij/PiPj determina se la sostituzione i -> j è più o meno frequente di quanto ci si aspetterebbe casualmente.

Dato un allineamento tra due sequenze:

A: SLDPIKHTYRALMNVDSLRTFPILB: SFGIKKHTKLAKLPVDTIKSWPIL

SCORE di SOSTITUZIONE: s(i,j) =int[K log(Pij/PiPj)]

Il logaritmo rende la quantità additiva sulla sequenza

Minima distanza = Massimo score (s)

la probabilità di sostituzione A->B sarà data dal prodotto degli rij : rSS rLF rDG rPI rIK … (indipendenza delle posizioni)

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ESERCIZIOESERCIZIO

Calcolare la matrice di sostituzione a partire dalle seguenti sequenze allineate

ACAGGTGGACCTACTGGTCGACTT

CTATATGGCTATATGGCCGGATCG

Matrici di sostituzione: PAMMatrici di sostituzione: PAM

In base a questo concetto, differenti matrici possonoessere derivate.La differenza fondamentale sta nell’insieme di allineamenticonsiderati per costruire le matrici.

PAMx: (Point Accepted Mutation). Numero di eventimutazionali pari a x%.Si costruisce la matrice:Si costruisce la matrice:

A1ij = P(j|i) = N(i,j)/N(i)

per sequenze con 1% di mutazioni.

PAM 1 = Log(A1ij /Pi)

Anij=(A1

ij)n

Es: n=2 P(i|j) = Πl P(i|l) P(l|j)

Matrici di sostituzione: PAMMatrici di sostituzione: PAM

Per derivare gli score relativi a sequenze in cui siano avvenutin eventi mutazionali ogni 100 residui:

NOTA BENE: n % eventi mutazionali: numero di mutazioni, NON di residui mutati. Possono essere rimutati posizioni già mutate. 100 eventi mutazionali indipendenti ogni 100 residui lasciano alcune posizioni invariate

PAM n = Log(Anij /Pi)

Relazione tra PAM e identità tra due sequenzeRelazione tra PAM e identità tra due sequenze

Il numero di eventi mutazionali (PAM) è differente dal numero di residui differenti tra due sequenze, quando le mutazioni si accumulano.

PAM10PAM10

Matrice molto stringente: nessun valore positivo fuori diagonale

PAM160PAM160

Iniziano valori positivi fuori diagonale: residui con valori di sostituzione positivi sono detti SIMILI

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PAM250PAM250

Molto usata

PAM500PAM500

Matrici di sostituzioneMatrici di sostituzione

Le matrici PAM ricavano ipotesi sulle mutazioni in sequenzelontane a partire dalle mutazioni osservate in sequenze moltosimili. Ipotesi molto stretta.

BLOSUMx: Famiglia di matrici ricavate direttamente dablocchi di allineamenti di sequenze con identità maggiore alx%.

Per sequenze molto relate vanno usate PAM basse o BLOSUMalte. Per sequenze lontane, viceversa.

BLOSUM62BLOSUM62

Molto usata

BLOSUM90BLOSUM90 BLOSUM30BLOSUM30

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Distanza tra sequenzeDistanza tra sequenze

Quali eventi consideriamo?

MutazioneDelezione e InserzioneAlcuni amminoacidi possono essere stati deleti o inseriti nelcorso dell’evoluzione

A: ALASVLIRLIT--YPB: ASAVHL ITRLYPB: ASAVHL---ITRLYP

)2()3(),(),( σσ ++= ∑ ii BAsBAScoreIl punteggio (negativo) di un gap dipende solo dal numero diposizioniσ(n) = -nd lineareσ(n) = -d - (n-1)e affine (d: apertura, e: estensione)

N.B. Tutti i punteggi sono indipendenti dalla posizionelungo la sequenza

Allineamento tra sequenzeAllineamento tra sequenze

Date due sequenze, qual è l’allineamento a punteggiomassimo?

Soluzione naïf: provare tutti gli allineamenti possibili escegliere quello a punteggio maggiore!

Per ogni allineamento, possiamo infatti calcolare il punteggiotramite la formulatramite la formula

)(),(),( gapgapi

ii nBAsBAScore σ∑∑ +=

Quanti sono i possibili allineamenti di due sequenze?Quanti sono i possibili allineamenti di due sequenze?

Scrivere TUTTI i possibili allineamenti senza gap interni delle sequenze:

A: tcaB: ga

Scrivere TUTTI i possibili allineamenti con gap p g pdelle medesime sequenze

Scrivere i punteggi di allineamento per ognuno degli allineamenti secondo la seguente matrice con penalità di gap LINEARE (d=2) A C T G

A 2 -1 -1 0C 2 0 -1T 2 -1G 2


Caso senza Gap interni

--tca -tca tca tca tca- tca--ga--- ga-- ga- -ga --ga ---ga

Date due sequenze di lunghezza m e n, il numero dei possibili scorrimenti differenti è m +n

Uguale al primo

Caso con gap interni

--tca -tca -tca -tca t-caga--- ga-- g-a- g--a ga--gatca gtaca gtcaa gtcaa tgaca22111 21211 21121 21112 12211

tca tca tc-a tca tca-


ga- g-a -ga- -ga --gatgcaa tgcaa tcgaa tcgaa tcaga12121 12112 11221 11212 11122

I possibili allineamenti sono uguali ai possibili modi diintercalare le due sequenze, mantenendo l’ordineDate due sequenze di lunghezze n e m, i possibili allineamenti sono (m+n)!/n!m!

Per n=m=80 ho 9•1042 possibili allineamenti !!!!!!!

Il calcolo per intero di tutti gli allineamenti è sovrabbondante

ALSKLASPALSAKDLDSPALSALSKIADSLAPIKDLSPASLT

Algoritmi di programmazione dinamica: idea baseAlgoritmi di programmazione dinamica: idea base

ALSKLASPALSAKDLDSPAL-SALSKIADSLAPIKDLSPASLT-

I due allineamenti sono per la maggior parte uguali.Lo score è additivo lungo l’allineamento. Col metodo naïf laprima parte dell’allineamento viene ricalcolata!

Si possono memorizzare i punteggi degli allineamenti parziali

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Complessità computazionaleComplessità computazionale

Numero di operazioni necessario per ottenere un risultato seguendo un algoritmo

Algoritmo naïfDate due sequenze di lunghezza n dobbiamo calcolare (2n)!/(n !)2 punteggi di allineamento. Ognuno richiede dalle n alle 2n operazioni.

Poiché n ! ≈ n n (2π n)1/2 e-n

Complessità ≈ O(22n n 1/2)

Algoritmo Needleman-WunschVanno calcolati (n +1)2 valori della matrice. Ognuno richiede 4 operazioni:Complessità ≈ (n 2)

Allineamenti globali e localiAllineamenti globali e locali

Algoritmi differenti, ma sostanzialmente simili, cercano similarità GLOBALI confrontando intere sequenze o similarità LOCALI, cercando i segmenti che meglio si allineano all’interno di due sequenze

L’annotazione si basa spesso sulla ricerca di domini comuni e elementi funzionali conservati…

Significatività di un allineamentoSignificatività di un allineamento

Dato un allineamento (globale o locale) che abbia ottenuto un punteggio S, come valutare se è significativo?Come sono distribuiti i punteggi di allineamenti di sequenze casuali? Con 100,000 allineamenti di sequenze scorrelate e randomizzate:

Gli allinementi significativi sono qua!

Score

Occ

orre

nza

Z=(S-<S>)/σs

S=Punteggio di allineamento<S>=Media dei punteggi di allineamento su un insieme randomσs=Deviazione dei punteggi di allineamento su un insieme random

Accuratezza dell’allineamento

ZZ--scorescore

Accuratezza dell allineamento

Z<3 non significativo

Lo Z-score di questo allineamento locale è 7.5 su 54 residuiL’identità è 25.9%. Le sequenze sono completamente differenti in struttura secondaria

Quanto è affidabile lo ZQuanto è affidabile lo Z--score?score?

Citrate synthase (2cts) vs transthyritin (2paba)

EE--valuevalue

Numero atteso di allineamenti random con punteggiomaggiore o uguale a un punteggio dato (s)

E’ reso possibile dal calcoli statistici

E=Kmn e-λs

m, n: lunghezze delle due sequenzeg qK, λ: Costanti di “scaling”

Il numero di allineamenti random a punteggio maggiore di scresce col crescere delle lunghezze delle sequenze (o deidata base con cui confrontiamo una sequenza) e calaesponenziamente al crecere di s

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La probabilità P di trovare un allineamento con score maggiore o uguale ad un certo valore S è data da:

( ) Ee=xSP −−≥ 1( ) exSP ≥ 1

Accuratezza dell’allineamentoLa significatività dell’E-value dipende dalla lunghezza della banca dati considerata. Per un numero di sequenze pari a quello di SwissProt

E> 10-1 non significativoE 10 3 i ifi ti

EE--valuevalue

E < 10-3 significativo

Ricerca di similarità in Banche DatiRicerca di similarità in Banche Dati

Data una sequenza, cercare se esistono sequenze simili in una banca dati

Di principio si potrebbero fare allineamenti tra la sequenza target e TUTTE le sequenze

Le sequenze da allineare sono troppe, e il processo non è fattibile in tempi brevi nemmeno usando l’algoritmo di NWfattibile in tempi brevi nemmeno usando l algoritmo di NW

Si utilizzano algoritmi euristici, che non assicurano il raggiungimento dell’allineamento ottimo

FASTABLAST

FASTAFASTA

Data una sequenza (Query), viene divisa in “parole” lunghe k-tup (generalmente k-tup = 2 per proteine, 6 per DNA)

ADKLPTLPLRLDPTNMVFGHLRI

Parole (indicizzate per posizione):AD, DK, KL, LP, PT, TL, LP, PR, RL, …,…,1 2 3 4 5 6 7 8 9 ….

Lo stesso elenco di parole indicizzato è compilato per ogni sequenza (Subject) del data base in cui si cercano sequenze.

E’ molto rapida la ricerca di parole uguali tra Query e Subject. La differenza degli indici determina la diagonale

FASTAFASTA

Query

Identificazione delle identità di “parole”: identità consecutive danno origine a diagonali più lungheSi selezionano le sequenze candidate

FASTAFASTA

Query

I punteggi delle regioni più lunghe sono valutati con una matrice di score (PAM o BLOSUM)

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FASTAFASTA

Query

Vengono cercate regioni ad alta similarità su diagonali vicine

Query

FASTAFASTA

Si procede ad un allineamento esatto (Smith-Waterman) su una banda stretta attorno alla diagonale di maggior similarità (solitamente banda larga attorno ai 32 residui)

Sequence similarity with FASTA BLASTBLAST

Data un data base di sequenze, questo viene indicizzato:per ogni tripletta di residui consecutivi si memorizza in quali sequenze e in quali posizioni questa tripletta viene trovata.

AAAAACAADAADACA.........

BLASTBLAST

Data una sequenza (Query), viene divisa in “parole” lunghe W (generalmente W = 3 per proteine)

LSHLPTLPLRLDPTNMVFGHLRI

LSH, SHL, HLP, LPT, PTL, TLR, …,…,

Per ognuna vengono generate le parole affini secondo la BLOSUM62 l t i T (T 11 13)BLOSUM62: parole con punteggio > T (T = 11--13)

LSH 16 ISH 14MSH 14VSH 13LAH 13LTH 13LNH 13

The BLAST Algorithm:Seeding (W and T)

Sequence 1

RGD 17

KGD 14

QGD 13

RGE 13

EGD 12

HGD 12

NGD 12

BLOSUM62 neighborhood

of RGD

• Speed gained by minimizing search space• Alignments require word hits• Neighborhood words• W and T modulate speed and sensitivity

Sequence 1

word hits

NGD 12

RGN 12

AGD 11

MGD 11

RAD 11

RGQ 11

RGS 11

RND 11

RSD 11

SGD 11

TGD 11

T=12

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The BLAST Algorithm:2-hit Seeding

• Alignments tend to have multiple word hits.

• Isolated word hits are frequently false

word clustersisolated words

frequently false leads.

• Most alignments have large ungapped regions.

• Requiring 2 word hits on the same diagonal (of 40 aa for example), greatly increases speed at a slight cost in sensitivity.

BLASTBLAST

Per ognuna delle parole affini vengono recuperate le sequenze del data base che la contengono (secondo l’indicizzazione)

La corrispondenza viene estesa (senza gap) a destra e a sinistra fino a che lo score rimane superiore a una soglia S. Durante l’estensione vengono tollerate perdite di score fino a una tolleranza X

Query:83 LMVAISNVGTDTLSHLEAQNKIKSASHNLSLTLQKSK+++AIS GT+++SH +AQ++IK+AS+ L L + ++

Subject:48 VILAISGFGTESMSHADAQDRIKAASYQLCLKIDRAE

HSP

The BLAST Algorithm: Extension

extension

alignment

• Alignments are extended from seeds in each direction.

• Extension is terminated when the maximum score drops below X.

The quick brown fox jumps over the lazy dog.The quiet brown cat purrs when she sees him.

X =

length of extension

trim to max

Text examplematch +1mismatch -1no gaps

>gi|23098447|ref|NP_691913.1| (NC_004193) 3-oxoacyl-(acyl carrier

protein) reductase [Oceanobacillus iheyensis]Length = 253

Score = 38.9 bits (89), Expect = 3e-05Identities = 17/40 (42%), Positives = 26/40 (64%)Frame = -1

Query: 4146 VTGAGHGLGRAISLELAKKGCHIAVVDINVSGAEDTVKQI 4027VTGA G+G+AI+ A +G + V D+N GA+ V++I

Sbjct: 10 VTGAASGMGKAIATLYASEGAKVIVADLNEEGAQSVVEEI 49

Sequence similarity with BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

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BLAST: i 4 parametri fondamentali

W: word size, maggiore è il numero, minore è il numero di parole generate, minore è il tempo di esecuzione. Ma la sensibilità decresce sensibilmente.

T: threshold, minore è il numero, maggiore è il numero di w-mers inclusi nella lista, maggiore è il tempo di esecuzione Si ha però un incremento di sensibilitàesecuzione. Si ha però un incremento di sensibilità.

S: score, minore è il numero, maggiore sarà la lunghezza degli HSP

X: maggiore è il numero, più estesamente sarà osservato l’intorno di una HSP, aumentando il tempo di esecuzione.

Le versioni di BLAST

blastp: cerca similarità in banche dati proteiche a partire da una query di amino acidi.

blastn: cerca similarità in banche dati di nucleotidi a partire da una query di nucleotidi.

blastx: cerca similarità in banche dati proteiche a partire d un qu r di nucl tidi ch vi n tr d tt in tutti i da una query di nucleotidi che viene tradotta in tutti i frame.

tblastn: cerca similarità in banche dati di nucleotidi a partire da una query di amino acidi, traducendo in amino acidi tutti i subject della banca dati, in tutti frame.

tblastx: cerca similarità in banche dati di nucleotidi a partire da una query di nucleotidi, traducendo in amino acidi tutti i subject della banca dati

The 5 Standard BLAST ProgramsProgram Database Query Typical Uses

BLASTN Nucleotide Nucleotide Mapping oligonucleotides, amplimers, ESTs, and repeats to a genome. Identifying related transcripts.

BLASTP Protein Protein Identifying common regions between proteins. Collecting related proteins for phylogenetic analysis.

BLASTX Protein Nucleotide Finding protein-coding genes in genomic DNA.

TBLASTN Nucleotide Protein Identifying transcripts similar to a known protein (finding proteins not yet in GenBank). Mapping a protein to genomic DNA.

TBLASTX Nucleotide Nucleotide Cross-species gene prediction. Searching for genes missed by traditional methods.

gapped-blast: porta avanti la fase di estensione delle HSP considerando la possibilità di inserzione dei gap.

PSI-BLAST: effettua una ricerca iterativa utilizzando le HSP per generare dei profili caratteristici della query.

PHI-BLAST: estensione di PSI-BLAST per la ricerca in banca dati di pattern proteici più che di query esattebanca dati di pattern proteici più che di query esatte.

BL2SEQ: adattamento di blast per l’allineamento a coppie

MegaBLAST: può concatenare molte queries tra loro per minimizzare il tempo di esecuzione dovuto a sequenze query troppo lunghe (è adatto a sequenze nucleotidiche molto simili tra loro)

FASTA vs BLAST

simili in strategia, molto diversi nei contenuti

Cerca parole “esatte”: può perdere similarità significative

supera il problema grazie all’introduzione dei w-mersN.B. i w-mers sono basati su una matrice quindi può

d h h i accadere che match esatti score S inferiori rispetto a match non esatti

Esempio, con Blosum62 - il match perfetto AIS-AIS dà score 12 - lo score inesatto LSH-MSH dà score 14

il mismatch è premiato più del match

FASTA vs BLAST

più tollerante per sequenze che presentano gaps, il loro inserimento è previsto già nelle prime fasi

inserisce i gaps solo in fase di allungamento

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La presenza nelle sequenze di regioni molto ripetitive (polyQ, stratch idrofobici,…) può falsare i risultati della ricerca: si ritrovano altre regioni simili in proteine non imparentate:

Sequenze “Low complexity”

Di default viene utilizzato il filtro per le regioni low complexity: nell’allineamento queste regioni vengono indicate come XXXXXX

60

Query: 61 XXXXGVNHLHGISSELVNXXXXXXXXXXXXXXXXXRRKIERDPNAPKKPLTVFFAYSAYV 120GVNHLHGISSELVN RRKIERDPNAPKKPLTVFFAYSAYV

Sbjct: 61 TLTSGVNHLHGISSELVNPIDDDKDAIIAAPVKAVRRKIERDPNAPKKPLTVFFAYSAYV 120

The best scores are: opt bits E(787946)gi|6320379|ref|NP_010459.1| High mobility group (HMG)-like protein; ( 246) 1581 320 2.7e-86 gi|65265|emb|CAA42523.1| (X59863) a xenopus upstream binding factor ( 701) 196 48 0.00053 gi|104205|pir||S17196 transcription factor UBF2 - African clawed fro ( 701) 196 48 0.00053 gi|136657|sp|P25980|UBF2_XENLA NUCLEOLAR TRANSCRIPTION FACTOR 2 (UPS ( 701) 196 48 0.00053 gi|729731|sp|P40626|HMGB_TETTH HIGH-MOBILITY-GROUP PROTEIN B gi|1023 ( 143) 180 44 0.0013 gi|7492240|pir||T38936 non-histone chromosomal protein high mobility ( 108) 176 43 0.0018 gi|1079088|pir||S47596 HMG1-like protein - fruit fly (Drosophila mel ( 216) 180 44 0.0018 gi|1174454|sp|P41848|SSRP_CAEEL PROBABLE STRUCTURE-SPECIFIC RECOGNIT ( 697) 186 46 0.002 gi|15218011|ref|NP_173492.1| high mobility group protein (HMG1), put ( 502) 184 45 0.0021

gi|2137073|pir||JC5112 ribosomal transcription factor UBF1 - Chinese ( 764) 176 44 0.0086 gi|1045008|gb|AAB38418.1| (L42570) putative [Cricetulus griseus] ( 764) 176 44 0.0086 i|85591| i ||A24019 hi t h l t i HMG T t t (f ( 172) 167 42 0 0089

score significativitàscoreLista

Ricerca FASTA

gi|85591|pir||A24019 nonhistone chromosomal protein HMG-T - trout (f ( 172) 167 42 0.0089 gi|12836542|dbj|BAB23701.1| (AK004961) putative [Mus musculus] ( 752) 175 44 0.0097 gi|112465|pir||B40439 UBF transcription factor, short form - rat ( 727) 174 44 0.011 gi|14772527|ref|XP_008365.2| hypothetical protein XP_008365 [Homo sa ( 727) 174 44 0.011 gi|14754719|ref|XP_047946.1| high-mobility group 20A [Homo sapiens] ( 313) 167 42 0.014 gi|730842|sp|Q04931|SSRP_RAT STRUCTURE-SPECIFIC RECOGNITION PROTEIN ( 561) 170 43 0.015 gi|15022805|ref|NP_080088.1| high mobility group 20A [Mus musculus] ( 346) 167 42 0.016

>>gi|6320379|ref|NP_010459.1| High mobility group (HMG)-like protein; Hmo1p (246 aa)

10 20 30 40 50 60 70 80

QUERY MTTDPSVKLKSAKDSLVSSLFELSKAANQTASSIVDFYNAIGDDEEEKIEAFTTLTESLQTLTSGVNHLHGISSELVNPI

::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::

gi|632 MTTDPSVKLKSAKDSLVSSLFELSKAANQTASSIVDFYNAIGDDEEEKIEAFTTLTESLQTLTSGVNHLHGISSELVNPI

10 20 30 40 50 60 70 80

Allineamenti

Score ESequences producing significant alignments: (bits) Valuegi|6320379|ref|NP_010459.1| High mobility group (HMG)-like ... 332 3e-90gi|7446209|pir||T12113 transcription factor - fava bean >gi... 50 1e-05gi|1731110|sp|Q09390|YR44_CAEEL HYPOTHETICAL 23.8 KD PROTEI... 48 8e-05gi|14550383|gb|AAK67237.1|U22831_8 (U22831) Hypothetical pr... 48 1e-04gi|4507241|ref|NP_003137.1| structure specific recognition ... 48 1e-04gi|11359753|pir||T43009 HMG protein 1.2 - Caenorhabditis el... 47 1e-04gi|14550384|gb|AAK67238.1|U22831_9 (U22831) Hypothetical pr... 47 1e-04gi|12857100|dbj|BAB30892.1| (AK017716) putative [Mus musculus] 46 2e-04gi|15022805|ref|NP_080088.1| high mobility group 20A [Mus m... 46 3e-04gi|8922633|ref|NP_060670.1| high-mobility group 20A [Homo s... 46 3e-04

Ricerca BLAST

gi|7446219|pir||JC6179 dorsal switch protein 1 - fruit fly ... 46 3e-04gi|1079089|pir||S50068 nonhistone chromosomal protein HMG1-... 46 3e-04gi|136657|sp|P25980|UBF2_XENLA NUCLEOLAR TRANSCRIPTION FACT... 45 4e-04gi|65265|emb|CAA42523.1| (X59863) a xenopus upstream bindi... 45 4e-04gi|587104|emb|CAA57212.1| (X81456) unnamed protein product ... 45 4e-04gi|3915056|sp|Q91731|SX11_XENLA TRANSCRIPTION FACTOR SOX-11... 37 0.11gi|14786454|ref|XP_030626.1| hypothetical protein XP_030626... 37 0.11gi|1431689|pdb|1AAB| Nmr Structure Of Rat Hmg1 Hmga Frag... 37 0.12gi|12836358|dbj|BAB23621.1| (AK004857) putative [Mus musculus] 37 0.13gi|576153|pdb|1HME| High Mobility Group Protein Fragment... 37 0.13gi|7446228|pir||T03375 high mobility group protein HMGd1 - ... 37 0.17gi|13559761|gb|AAK29965.1| (AC024859) Hypothetical protein ... 37 0.18

Allineamenti>gi|6320379|ref|NP_010459.1| High mobility group (HMG)-like protein; Hmo1p [SaccharomycesLength = 246

Score = 332 bits (850), Expect = 3e-90Identities = 191/220 (86%), Positives = 191/220 (86%)

Query: 1 MTTDPSVKLKSAKDSLVSSLFELSKAANQTASSIVDFYNAIGDDEEEKIEAFXXXXXXXX 60MTTDPSVKLKSAKDSLVSSLFELSKAANQTASSIVDFYNAIGDDEEEKIEAF

Sbjct: 1 MTTDPSVKLKSAKDSLVSSLFELSKAANQTASSIVDFYNAIGDDEEEKIEAFTTLTESLQ 60

Query: 61 XXXXGVNHLHGISSELVNXXXXXXXXXXXXXXXXXRRKIERDPNAPKKPLTVFFAYSAYV 120GVNHLHGISSELVN RRKIERDPNAPKKPLTVFFAYSAYV

Sbjct: 61 TLTSGVNHLHGISSELVNPIDDDKDAIIAAPVKAVRRKIERDPNAPKKPLTVFFAYSAYV 120......

Lambda K H

0.308 0.127 0.355

Gapped

Lambda K H

0.267 0.0410 0.140

Matrix: BLOSUM62

Gap Penalties: Existence: 11, Extension: 1

Statistiche basate su valori di λ e k precacolati per determinate matrici, composizione in residui e penalità per gap

E(DNA) vs E(Proteine)Valori attesi con la sequenza di DNA [Score, E(DNA)] e la sequenza proteica [E(prot)] per una ricerca in bancadati effettuata con la glutatione transferasi (GST) di drosofila(GST) di drosofila.

La ricerca che utilizza la sequenza proteica fornisce risultati più significativi ed è in grado di individuare omologhi della GST al di fuori del gruppo degli insetti

Allineamento di tutte le sequenze Allineamento di tutte le sequenze

ATTENZIONE: Non è allineamento multiplo ottimale

31/05/2007

13

1 Y K D Y H S - D K K K G E L - -2 Y R D Y Q T - D Q K K G D L - -3 Y R D Y Q S - D H K K G E L - -4 Y R D Y V S - D H K K G E L - -5 Y R D Y Q F - D Q K K G S L - -6 Y K D Y N T - H Q K K N E S - -7 Y R D Y Q T - D H K K A D L - -8 G Y G F G - - L I K N T E T T K 9 T K G Y G F G L I K N T E T T K10 T K G Y G F G L I K N T E T T K

A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0D 0 0 70 0 0 0 0 60 0 0 0 0 20 0 0 0E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 70 0 0 0F 0 0 0 10 0 33 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Position

Profilo di sequenzaProfilo di sequenza

F 0 0 0 10 0 33 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0G 10 0 30 0 30 0 100 0 0 0 0 50 0 0 0 0H 0 0 0 0 10 0 0 10 30 0 0 0 0 0 0 0K 0 40 0 0 0 0 0 0 10 100 70 0 0 0 0 100I 0 0 0 0 0 0 0 0 30 0 0 0 0 0 0 0L 0 0 0 0 0 0 0 30 0 0 0 0 0 0 0 0M 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0N 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 30 10 0 0 0 0P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0Q 0 0 0 0 40 0 0 0 30 0 0 0 0 0 0 0R 0 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0S 0 0 0 0 0 33 0 0 0 0 0 0 10 10 0 0T 20 0 0 0 0 33 0 0 0 0 0 30 0 30 100 0V 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0W 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0Y 70 0 0 90 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Utilità del profilo di sequenzaUtilità del profilo di sequenza

Il profilo di sequenza dà una descrizione complessiva di tutte le sequenze:

evidenzia le zone più conservate o le mutazioni più frequentiposizione per posizione

Allineare una sequenza contro un profilo

I parametri di un allineamento sono generalmente identiciper tutte le posizioni. Allineare contro un profilo pesadifferentemente le mutazioni nelle differenti posizioni

Dal profilo di sequenza possiamo ricavare una matrice di Dal profilo di sequenza possiamo ricavare una matrice di score dipendente dalla posizionescore dipendente dalla posizione

A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D 0 0 70 0 0 0 0 60 0 0 0 0 20 0 0 0 E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 70 0 0 0 F 0 0 0 10 0 33 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G 10 0 30 0 30 0 100 0 0 0 0 50 0 0 0 0 H 0 0 0 0 10 0 0 10 30 0 0 0 0 0 0 0 K 0 40 0 0 0 0 0 0 10 100 70 0 0 0 0 100 I 0 0 0 0 0 0 0 0 30 0 0 0 0 0 0 0 L 0 0 0 0 0 0 0 30 0 0 0 0 0 0 0 0 M 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 0 0 N 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 30 10 0 0 0 0 P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Q 0 0 0 0 40 0 0 0 30 0 0 0 0 0 0 0 R 0 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Stimo se ogni residuo in ogni posizione è più o meno presente di quanto ci si aspetterebbe random: confronto la probabilità desunta dal profilo con la probabilità a priori di avere l’amminoacido in questione

SAA (pos) = int [K log (ProfAA(pos)/PAA) ]

R 0 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S 0 0 0 0 0 33 0 0 0 0 0 0 10 10 0 0 T 20 0 0 0 0 33 0 0 0 0 0 30 0 30 100 0 V 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 W 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Y 70 0 0 90 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

PSIPSI--BLASTBLASThttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

Sequenza

D B

BLASTProfilo delle

sequenze Data Base

qrintracciate

PSI-BLAST

Fino a convergenza

(1) PSI-BLAST takes as an input a single protein sequence and compares it to a protein database, using the gapped BLAST program

(2) The program constructs a multiple alignment, and then a profile, from any significant local alignments found. The original query sequence serves as a template for the multiple alignment and profile, whose lengths are identical to that of the query. Different numbers of sequences can be aligned in different template positions

(3) The profile is compared to the protein database, again seeking local

The design of PSI-BLAST

( ) p f p p , g galignments. After a few minor modifications, the BLAST algorithm can be used for this directly.

(4) PSI-BLAST estimates the statistical significance of the local alignments found. Because profile substitution scores are constructed to a fixed scale, and gap scores remain independent of position, the statistical theory and parameters for gapped BLAST alignments remain applicable to profile alignments.

(5) Finally, PSI-BLAST iterates, by returning to step (2), an arbitrary number of times or until convergence.

blast.ppt [modalità compatibilità] - unibo.it · 31/05/2007 2. identità di sequenza e identità...

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