BMP21-1

ความหลากชนดของซลเอตในดนทปนเปอนเชอ Burkholderia pseudomallei ดวยเทคนค Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Diversity of Ciliates in Soil Contaminated with Burkholderia pseudomallei Using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

สธารทพย ศรทาบตร (Suthantip Srithabut)* พสฏฐ เจรญสดใจ (Pisit Chareonsudjai)**

บทคดยอ

ซล เอตเปนสงมชวตทควบคมแบคทเรยในธรรมชาต จงมศกยภาพในการควบคมเชอ Burkholderia pseudomallei ซงเปนสาเหตของการเกดโรคเมลออยโดสสทพบมากทางภาคตะวนออกเฉยงเหนอของประเทศไทย เดมการคดแยกและจ าแนกซลเอตใชวธซดเอมไอท าใหทราบจ านวนชนดของซลเอตเพยงไมกชนดท งยงใชระยะเวลาทยาวนานในการตรวจตดตาม ดงนนการศกษาครงนมวตถประสงคเพอเปรยบเทยบความหลากชนดของซลเอตทพบในดนโดยการใชเทคนคดจจอกบวธซดเอมไอ โดยเกบตวอยางดนทพบการปนเปอนของเชอ ในเดอนมถนายน ป พ.ศ.2558 ทงหมด 6 ตวอยาง ในอ าเภอน าพองและอ าเภอเมอง จงหวดขอนแกน จากการศกษาโดยวธซดเอมไอพบซลเอตทงหมด 4 ชนดไดแก Colpoda steinii, Colpoda inflate, Tetrahymena sp., Leptopharynx costatus และจากศกษาโดยใชเทคนคดจจอ นอกจากพบทง 4 ชนดเดมแลวยงพบซลเอตเพมขน 2 ชนดไดแก Colpoda lucida และ Oxitrichidae Sp. ดงนนกลาวไดวาเทคนคดจจอสามารถใชในการหาความหลากชนดของซลเอตในดนไดดกวาวธซดเอมไอซงใชอยเดม ทงยงสามารถแกปญหาทพบ เชน การไมสามารถเพาะเลยงและคดแยก จงเหมาะทจะใชตดตามการเปลยนแปลงในสงแวดลอมหรอใชซลเอตเปนตวบงชทางชวภาพตอไป

ABSTRACT

Ciliate is a natural biological control agent of bacteria including Burkholderia pseudomallei, which is the causative agent of Melioidosis. The objective of this research was to compare the number of species of ciliates in soil using the Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) with the Culture dependent and morphological identification method (CDMI). Six samples were collected from a known B.pseudomallei contamination in NamPhong and Muang Districts, Khon Kaen, Thailand in June 2015. Four species of ciliates were found by the culture dependent and morphological identification including Colpoda steinii, Colpoda inflate, Tetrahymena Sp., Leptopharynx costatus. Whereas two more ciliate species Colpoda lucida and Oxitrichidae Sp. were determined by DGGE. DGGE is therefore a useful technique for studying the diversity of ciliates in soil and can be applied for monitoring in the environment or monitoring ciliate as a biological indicator. ค าส าคญ: ซลเอต ดจจอ เบอรโคลเดอเรย ซโดมลลอาย Keywords: Ciliate, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), Burkholderia pseudomallei * นกศกษา หลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาวทยาศาสตรสงแวดลอม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน ** ผชวยศาสตราจารย สาขาวชาวทยาศาสตรสงแวดลอม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน

- 555 -

BMP21-2

บทน า โรคเมลออยโดสสเปนโรคตดเชอทส าคญช น ด ห น ง ซ ง เ ก ด จ าก แ บ ค ท เร ย Burkholderia pseudomallei ชนดแกรมลบทอาศยในดน (Soil-borned bacteria) ซงพบมากในภาคตะวนออกเฉยงเหนอของป ร ะ เท ศ ไ ท ย เ น อ ง จ า ก ด น บ ร เว ณ ภ า คตะวนออกเฉยงเหนอของประเทศไทยมปจจยทางกายภาพ -เคม ทแตกตางจากดนในภมภาคอน เชน ลกษณะเนอดน มเนอดนเปนดนทราย ท าใหมชองวางสง การระบายน าและอากาศด และบางสวนประมาณ 33% ข อ ง พ น ท ภ าค ม ค ว าม เค ม ส งกว าภ าค อ น (Palasatien et al., 2008) และยงมโอกาสพบเชอไดมากในสภาวะทมคาความเปนกรด-เบสของดนเฉลย 6.0 คาความสามารถในการอมน าต า ความเขมขนต าของธาตเหลก และความเขมขนสงของแมงกานสซงแสดงใหเหนวาเชอ B. pseudomallei สามารถอยรอดไดภายใตความหลากหลายของสภาพแวดลอม (Suebrasri et al., 2013) นอกจากนยงมรายงานวา ปจจยทางชวภาพของดนอาจจะเออตอการเจรญเตบโตของเชอน โดยพบวาโพรโทซวกลมอะมบาในดนอาจจะเปนเจาบานใหกบเชอ B. pseudomallei โดยตวอยางของ Acanthamoeba astronyxis กลนแบคทเรยเขาไปและแบคทเรยสามารถอาศยอยในแวคควโอลของอะมบาเพอหลกเลยงสภาวะทไมเหมาะสมในการด ารงชพ (Inglis et al., 2000) เปนส า เห ต ใ ห เ ช อ B. pseudomallei ส าม าร ถ อ ย ใ นสงแวดลอมในชวงทมความแหงแลงและขาดอาหารในชวงฤดแลงได ในทางตรงกนขามโพรโทซวเปนตวควบคมทางชวภาพโดยเฉพาะโพรโทซวในกลมซ ล เอต (Ciliates) กนแบคทเรยเปนอาหารโดยไมเลอกชนด ดวยวธการใช Ciliaโบกพดอาหารเขาสปาก (บพธ, 2546) ความสมพนธระหวางโพรโทซวและแบคทเรยสวนใหญเปนความสมพนธแบบผลา-เหยอ (predator - prey) จ งท าให เช อ B. pseudomallei ลดจ านวนลง (Purves, 2005) จงเปนการควบคมแบคทเรยไดทางหนง จากการศกษาโพรโทซวในโรงฆาสตวโดยใช

กลองจลทรรศนแบบใชแสงพบ โพรโทซว 61 ชนด แตเมอศกษาใชเทคนค DGGE พบโพรโทซวเพมอก 49 ชนดแสดงใหเหนวาเทคนค DGGE สามารถหาความหลากหลายไดมากกวาและรวดเรวกวาวธการคดแยกแล ะ จ าแน ก โพ รโท ซ ว ด ว ยก ล อ ง จ ล ท รรศ น (Vaerewijck, 2008) ด ง น น ก า ร ศ ก ษ า น ใ น ภ าพ ร ว ม จ ง มวตถประสงคตองการควบคมเชอ B. pseudomallei โดยเพ มจ านวนโพรโทซ วก ลม ซ ล เอต แต กอน อนจ าเปนตองหาชนดของโพรโทซวในดนทจะสามารถน ามาประยกตใชเพอควบคมเชอ B. pseudomallei แตเน องจากโพรโทซวจ านวนไมนอยไมสามารถเพาะเลยง (Viable but non culturable) หรอเพาะเลยงไดยาก และใชระยะเวลานาน (Vaerewijck, 2008) ซงวธการคดแยกและจ าแนกโพรโทซวทวไปท าไดโดยวธการคดแยกและจ าแนกดวยสณฐานวทยา ดงนนในการศกษาครงนจงใชเทคนค Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) เปรยบเทยบกบวธการคดแยกและจ าแนกดวยสณฐานวทยา (Culture dependent and morphological identification; CDMI) วตถประสงคการวจย เพอเปรยบเทยบจ านวนชนดของซลเอตในด น โด ยก าร ใช เท ค น ค Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) กบวธการคดแยกและจ าแนกด ว ย ส ณ ฐ า น ว ท ย า ( Culture dependent and morphological identification; CDMI) วธการวจย ตวอยางดนทศกษาเกบจากอ าเภอน าพองและอ าเภอเมอง จงหวดขอนแกน บรเวณทพบการปนเปอนของเชอ B. pseudomallei จ านวน 6 จด (ภาพท 1) ตามพกดดวยเครอง GPS ในเดอนมถนายน พ.ศ.2558 ซงเปนชวงฤดฝนและเปนเดอนทมรายงานการพบเชอ B. pseudomallei ส ง (Palasatien et al., 2008) เน อ งจ ากความชนของดนมผลตอการอยรอดของเชอโดยพบการ

- 556 -

BMP21-3

ระบาดเชอมากทสดในชวงฤดฝน (Chaowagul et al., 1989) เกบตวอยางดนแตละตวอยางทระดบความลกในแนวดง 30 เซนตเมตร ทงหมด 4 หลม โดยแตละหลมหางกนประมาณ 1 เมตร จากนนน าตวอยางดนทง 4 หลม หลมละ 1 กโลกรม มาลดปรมาตรโดยวธ quartering method ใหไดตวอยางดน 1 กโลกรม เกบตวอยางใสถงพลาสตก ปดปากถงใหมดชด เกบรกษาตวอยางดนในถงพลาสตกบรรจice packเพอใหเยนและปองกนแสงแดดและน าไปวเคราะหในวนเดยวกน (Suebrasri et al., 2013)

ภาพท 1 แผนทอ าเภอน าพองและอ าเภอเมอง จงหวด ขอนแกน (มาตราสวนแผนท 1: 50,000) แสดงจดเกบตวอยางดน 6 จด ในอ าเภอน า พอง 3 จดและอ าเภอเมอง 3 จด การแยกชนดและนบจ านวนเชอ B. pseudomallei ศ ก ษ าช น ด แ ล ะ จ า น ว น ข อ ง เ ช อ B. pseudomallei โดยปรบปรงวธจาก Trung (2011) และ Wuthiekanun (1990) ดงนน าตวอยางดนมาปรมาณ 100 กรม เตมสารละลาย PEG – DOG (polyethylene glycol sodium Deoxycholat ) (Trung et al., 2 0 1 1 ) ปรมาตร 100 มลลลตร จากนนน าไปเขยา ทความเรว 200 รอบ/นาท เปนเวลา 2 ชวโมง จากนนวางทงไวท

อณห ภ มห องให อน ภาค ดนตกตะกอน แลว ดดสารละลายปรมาตร 10, 100 และ 500 ไมโครลตรspread ลงบน Ashdown’s agar plates (Peacock et al., 2005; Wuthiekanun et al., 1 9 9 0 ) จ า ก น น บ ม ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง นบจ านวนเชอ B. pseudomallei โดยวธ Direct plate count technique (Trung et al., 2011) วธการคดแยก เพาะเลยงและจ าแนกซลเอตโดยวธทางสณฐานวทยา (Culture dependent and morphological identification; CDMI) ท าการคดแยก เพาะเลยงและจ าแนกซลเอตโ ด ย ใ ช ว ธ ป ร บ ป ร ง จ าก Ronn et al. (1 9 9 5) มรายละเอยดโดยสรปดงน เจาะชองสเหลยมบน1.7% agar ขนาด 1x1 เซนตเมตร บรเวณกงกลางจานเพาะเชอและโดยรอบท ง 8 ทศ และเจาะเนอ agar เปนทางเชอมจากชองกลางไปยงชองโดยรอบทง 8 ทศ จากนนเตมตวอยางดนปรมาณ 1 กรม ลงในชองกลาง และเตมอ าห าร เ ล ย ง เ ช อ 0.03% Tryptic Soy Broth (TSB) ปรมาตรประมาณ 3-5 มลลลตร ห รอจนเตมชองทงหมด น าไปบมอณหภม 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง เพอใหซลเอตออกจากสภาวะซสต (Cyst) จากนนคดแยกซลเอตในแตละหลมแตละชนดโดยใชปเปตปลยแหลมดดออกมาใสสไลดภายใตกลองจลทรรศน (Olympus รน CH20B1MF200 ประเทศญปน) ทก าลงขยาย 40 – 400 เทา โดยท าการตดตามทกวนเปนเวลา 30 วน ตรวจสอบลกษณะทางสณฐานวทยาและชนดของซลเอตตามการอางองจาก บพธ (2546), นนทพร (2545) จดเกบเปนฐานขอมลของซลเอตของดนแตละตวอยาง การวเคราะหโดยใชเทคนค Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) ประกอบดวย 2 ตอนคอ ตอนท1 การท าฐานขอมลของซลเอตและ ตอนท 2 การเปรยบเทยบกบฐานขอมลของซลเอต

- 557 -

BMP21-4

ตอนท 1 การท าฐานขอมลของซลเอต น าซ ล เอต ทคดแยกไดจากวธ CDMI มาเพาะเลยงใหไดปรมาณ 10 5 cell/mL แลวน าไปท าตามขนตอนดงน

1. การสกด DNA โดยใชชด QIAamp DNA Mini Kit QIAamp®

สก ด DNA ข อ ง ซ ล เอ ต โด ย ใช ช ด QIAamp DNA Mini Kit QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook จากนนน าตวอยาง DNA ของซลเอตทสกดไดมาวดปรมาณของ DNA โดยวธ gel electrophoresis 0.8% (wt/vol) บ น agarose gel ท ค าค ว า ม ต า ง ศ ก ย ไ ฟ ฟ า 100 V ด ว ย เค ร อ ง Gel Electrophoresis System (ยหอ Advance รน 1ADV – EXU – 1 ประเทศญปน) และน าไปยอมสใน ethidium bromide เปนเวลา 3 นาท ปรมาณของ DNA อยใน agarose gel จากนนเกบตวอยาง DNA ของซลเอตทไวในตแชอณหภม -20 องศาเซลเซยส

2. การเพมจ านวน DNA ดวยวธ Polymerase Chain Reaction (PCR)

เพมจ านวน DNA ของซลเอตจาก DNA ทสกดเกบเอาไว ดวยวธ Polymerase Chain Reaction (PCR) โดยใช primer CS322F และ EU581RGC ตามตารางท 1 โดยในสารผสมปรมาตร 25 ไมโครลตร ประกอบดวย DNA Template ของซลเอตปรมาตร 3 ไ ม โ ค ร ล ต ร 1×Reaction Buffer ป ร ม า ต ร 2.5 ไมโครลตร 10mMdNTP ปรมาตร 0.5 ไมโครลตร DMSO (dimethyl sulfoxide) ปรมาตร 2.5 ไมโครลตร1.25 UTaq Polymerase ป รม าตร 0.25 ไมโครลตร จากน นน าไป เพมป รมาณ DNA ดวยเค รอง PCR Machines Cycler (รน Veriti 96-Well Thermal Cycler

ยหอ Applied Biosystems ประเทศสหรฐอเมรกา) ตงคาเรมตนท 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท , 95

องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 วนาท, 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 วนาท, 72 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท,

72 องศาเซลเซ ยส เปน เวลา 1 นาท และ 4 องศาเซลเซยส, จ านวน 35 รอบ (Shimano et al., 2012) ตารางท 1 Primer ส า ห ร บ เ พ ม จ า น ว น DNA

ของซลเอตในการศกษาน

3. การแยก DNA ดวยเทคนค Denaturing

Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) น าPCR product ทไดจากข นตอน PCR

amplification ตวอยางละ 150 นาโนกรม มาโหลดในเจล 8% polyacrylamide gel (acrylamide:bisacrylamide ratio 37.5:1) ทความเขมขน 30% - 60% (100% denaturant defined as 7 M urea and 40% deionised formamide) ทมความหนา 0.75 mm. (Green et al., 2010) ในสารละลาย 1×TAE buffer ต งคาระบบเครอง DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) ( ย ห อ Cleaver ร น VS20 ประเทศองกฤษ) ซงเปนแบบ D-code ระยะเวลา 16 ชวโมง ทอณหภม 58 องศาเซลเซยส คาความตางศกยไฟ ฟ า 80V ห ลงจากน น การยอม ส เจลดวย ethidium bromide เปนเวลา 30 นาท และวเคราะหผลดวยเครองวเคราะหเจล Gel Documentation (ยหอ BIO – RAD ประเทศ สวตเซอรแลนด) และจดเกบรปภาพการเคลอนทของแถบ DNA เปนฐานขอมลของซลเอต

4. การตรวจสอบแถบ DNA จากขนตอน DGGE ดวยการ Sequencing

ตดแถบ DNA ทบน polyacrylamide gel ทไดจากขนตอน DGGE แตละชนใสลงในหลอด PCR tube เตมน ากลนปรมาตร 10 ไมโครลตรใหทวมชนเจลทงไวเปนเวลา 16-18 ชวโมงทอณหภมหอง หลงจากน นน าสวนใสมาปรมาตร 2 ไมโครลตรมาเขาส

Primer Sequence (5’-3’) Position

CS322F GATGGTAGTGTATTGGAC 313–330

EU581RGC GCclamp-ATTACCGCGGCTGCTGGC

557–574

- 558 -

BMP21-5

ข นตอนการเพมจ านวน DNA ดวยวธ Polymerase Chain Reaction (PCR) น า PCR product ทไดมาสกด DNA โ ด ย ใ ช ช ด HiYield ™ Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 9 หลงจากนนน า DNA ทไดไปสงไป Sequencing เมอไดขอมลมาใหน ามา BLAST เปรยบเทยบกบฐานขอมลใน GenBank (Jousset et al.,2010) แลวจดเกบรปภาพและผลวเคราะหจากการ Sequencing เปนฐานขอลมของซลเอตแตละชนด ตอนท 2 การเปรยบเทยบกบฐานขอมลของซลเอต น าตวอยางดนทงหมด 6 จด มาเขาสขนตอน การสกด DNA โดยใชชด QIAamp DNA Mini Kit QIAamp® แลวเพมจ านวน DNA ดวยวธ Polymerase Chain Reaction (PCR) แ ล วน าไป แ ยก DNA ด ว ยเท ค น ค Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) และตวจสอบแถบ DNA จากขนตอน DGGE ดวยการวเคราะห Sequencing แลวน าขอมลมาจ าแนกชนดของซลเอตโดยเปรยบเทยบกบฐานขอมลทจดท าไวจาก ตอนท 1 การท าฐานขอมลของซลเอต รวมถงการเปรยบเทยบกบฐานขอมล GenBank ผลการวจย

1. ชนดของซลเอตในดนโดยวธการคดแยกและจ าแนกจากสณฐานวทยา (Culture dependent and morphological identification; CDMI)

จากการศกษาความหลากชนดของซลเอตทพบในดนทมเชอ B. pseudomallei จากตวอยางดน 6 ตวอยางดวยวธ CDMI พบซลเอตท งหมด 3 Class 4 ชนดไดแก 1) Class Colpodea ไดแกColpoda steinii, Colpoda inflate 2) Class Oligohymenophorea ได แ ก Tetrahymena Sp. แ ล ะ 3) Class Ciliophora ไ ด แ ก Leptopharynx costatus

โดยพบวา St-28 และ St-39 พบจ านวนชนดของซล เอตมากท สด 3 ชนด ดง น St-28 พบ Colpoda steinii, Colpoda inflate แ ล ะ Leptopharynx costatus St-39 พ บ Colpoda steinii, Colpoda inflate และ Tetrahymena Sp. ซงสอดคลองกบจ านวนเชอ B.

pseudomallei พบวา St-28 และ St-39 ตรวจพบเชอ B. pseudomallei ม าก ท ส ด 2 อน ดบ แรก ต าม ล าดบ ในขณะทบรเวณอนๆพบซลเอต 2 ชนด ตามรายละเอนดในตารางท 2 ซลเอตชนดทพบบอยทสดคอ Colpoda steinii ซงสอดคลองกบ Keller (2014) มการรายงานวาซ ล เอตชนด น เปน สวนห น งของสายววฒนาการของเชอ B. pseudomallei นอกจากนซลเอตยงสงผลตอเซลแบคทเรยยงเซลลโดยซลเอตจะไปยบย งกจกรรมทมผลตอการเจรญเตบโตของแบคทเรยในระบบนเวศท าใหพบ Colpoda steinii ในจดทพบ เชอ B. Pseudomallei ทกจด ตารางท 2 ชนดซลเอตทพบตามสถานเกบตวอยางดน

+ คอ พบซลเอต (วาง ) = ไมพบ

จากการศกษ าพบ Leptopharynx costatus เพ ยงจด เดยวจากพน ท ท ศกษาท งหมดคอ St-28 เนองจากเปนบรเวณนาขาว ตดคลองชลประทานซงแตกตางจากจดเกบตวอยางอนๆ (ตารางท 3) จงท าพบซลเอตชนดจดเดยว ซงสอดคลองกบรายงานของ Omar (2012) ท มการรายงานวาพบ Leptopharynx costatus ในบรเวณ ท เปนผวน า เขตกลางน า ห รอบรเวณทเปนน าไหล รวมถงบรเวณบนบกใกลแหลงน า และบรเวณทมการปลกขาวสาล

สถานเกบตวอยาง

Ciliates

St-09

St-28

St-36

St-39

St-46

St-47

Colpoda steinii +

+ + + + +

Colpoda inflate + + + +

Tetrahymena sp. + + +

Leptopharynx costatus

+

- 559 -

BMP21-6

ตารางท 3 ลกษณะทางกายภาพและเคมตามสถานเกบตวอยางดน

สถานเกบตวอยาง

การใชประโยชนทดน

pH WHC (%)

St-09 พนทวางเปลาตดถนน มตนไมปกคลม

5.72 22.03

St-28 นาขาว ตดคลองชลประทาน

5.03 53.18

St-36 สวนยางพารา 6.05 17.75 St-39 สวนมะมวง 5.48 22.49

St-46 พนทวางเปลา 7.36 29.56

St-47 พนทวางเปลา 5.58 27.44

ภาพท 2 ชนดของซลเอตทพบในดนทมเชอ B. pseudomallei a=Colpoda steinii b= Colpoda inflate c=Tetrahymena sp., d=Leptopharynx costatus

2. ชนดของซลเอตในดนโดยการใชเทคนค

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) จากการศกษาความหลากชนดของซลเอต

ในต าแหนงเดยวกนโดยการใชเทคนค Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) พบซลเอตเพมจากเดม 2 ชนดคอ Colpoda Lucida, Oxitrichidae Sp.

โดยพบ Colpoda Lucid จากจดเกบตวอยางดน St-28, St-36, St-39 และ Oxitrichidae Sp. ภาพท (3) จากจดเกบตวอยางดน St- 39 เพยงจดเดยว จงเปนไปไดวาซลเอตสองชนดนไมสามารถเพาะเลยงได จงไมสามารถหาชนดของซลเอตท งสองชนดดวยวธ CDMI ได เนองจากอาจมสภาวะทไมเหมาะสมทจะท าใหซลเอตทง 2 ชนดเจรญเตบโตไดตามปกต นอกจากนยงไดน าแถบ DNA ท งหมดไปวเคราะห Sequencing จงท าใหไดขอมลชนดของซลเอตทมความเชอมนมากกวา 95 % จากการศกษาจงไดจดเกบฐานของมลของซลเอตทงหมด 6 ชนดนไวในรปแบบของภาพแสดงแถบของDNAของซลเอตแตละชนดทมลกษณะการเคลอนททแตกตางกน เพอประโยชนในการน าไปใชเปรยบเทยบชนดของซลเอตในการตรวจตดตามตอไป (ภาพท 2)

ภาพท 2 แผน เจล polyacrylamide gels แสดงแถบ DNA ของซลเอตแตละชนดทมเคลอนทในต าแหนงทแตกตางกนจากการวเคราะหดวยเทคนค DGGE บน 8%polyacrylamide gels ไ ด แ ก a. Colpoda steinii, b. Colpoda inflate, c. Colpoda lucida, d. Leptopharynx costatus, e. Tetrahymena Sp., f. Oxitrichidae Sp.

- 560 -

BMP21-7

ภาพท 2 แผน เจลแสดงแถบ DNA ของซ ล เอต ทต าแหนงตางกน ตามชนดของซลเอตในจดเกบตวอยางดนทง 6 จด เมอเทยบฐานขอมลแถบ DNA ของซลเอตแตละชนด ดงน St-09 พบ 1 ชนดคอ Colpoda steinii St-28 พบ 3 ช น ด ค อ Colpoda steinii, Colpoda lucida และ Leptopharynx costatus St-36 พบ 4 ชนดคอ Colpoda steinii, Colpoda inflate, Colpoda Lucida แ ล ะ Leptopharynx costatus St-39 พบทกชนดทงหมด 6 ชนด St-46 พบ 2 ชนดค อ Colpoda inflate แ ล ะ Oxitrichidae Sp. และ St-47 พบ 2 ชนด คอ Colpoda steinii และ Leptopharynx costatus X=marker

นอกจากนจากจดเกบตวอยางทง 6 จด พบวา

St-39 เปนจดทพบชนดของซลเอตเพมขนจากเดม 3 ชนด รวมทงหมดเปน 6 ชนด ซงเปนบรเวณทพบมากทสดเมอเทยบกบบรเวณอน จากการตรวจสอบเชอ B. pseudomallei บรเวณนเปนจดทพบเชอมากทสดจงมผลท าใหพบชนดของซลเอตมากกวาบรเวณอนๆ

บรเวณทพบชนดซลเอตนอยท สดคอ St-09 ทพบ Colpoda steinii เพยงชนดเดยวโดยจากการตรวจสอบเชอ B. pseudomallei พบวาตรวจพบเชอนอยทสดจาก 6 จดจากการศกษาของ Purves (2005) เมอแบคทเรยมจ านวนมากโพรโทซวจะคอยๆเพมจ านวนขนเรอยๆและมจ านวนเพมมากขน มการกนทมากขน สงผลใหแบคทเรยมจ านวนลดลง เมอมอาหารนอยลงโพรโทซวจะเรมตายและลดจ านวนลง สงผลใหแบคทเรยสามารถทจะเพมจ านวนขน และเมอมอาหารเพมมากขนโพรโทซวกจะเพมจ านวนขนตามไปดวย (Purves, 2005) จงมความเปนไปไดทบรเวณนจะพบชนดของ ซลเอตนอยเนองจากแบคทเรยมจ านวนไมมากพอทจะเปนอาหารของซลเอต อภปรายและสรปผลการวจย จากการศกษาการเปรยบเทยบชนดของซลเอตในดนทมเชอ B. pseudomallei โดยการใชเทคนค Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) กบวธการคดแยกและจ าแนกดวยสณฐานวทยา (Culture dependent and morphological identification; CDMI) จากจดเกบตวอยางทง 6 จด พบวา วธ CDMI พบซลเอตทงหมด 4 ชนดไดแก Colpoda steinii, Colpoda inflate, Tetrahymena Sp., Leptopharynx costatus ใน ขณ ะ ทเทคนค DGGE นอกจากพบท ง 4 ชนดเดมแลวยงพบ ซ ล เอต เพม ขน 2 ชนดไดแก Colpoda lucida และ Oxitrichidae Sp. ซงสรปไดวาเทคนค DGGE สามารถทราบชนดของซลเอตไดมากกวา วธ CDMI ซงใชอยเดม และรวดเรวกวาโดย DGGE สามารถทราบชนดของซลเอตภายใน 2 วน ขณะท CDMI ใชเวลา 1 เดอน นอกจากนยงสามารถลดคาใชจายในการด าเนนการทดลองได (Anupama et al., 2015) รวมถงยงสามารถแกปญหาทพบ เชน การไมสามารถเพาะเลยงและคดแยก จงเหมาะทจะใชตดตามการเปลยนแปลงในสงแวดลอมหรอใชเปนตวบงชทางชวภาพตอไป (Altenburger et al., 2010)

- 561 -

BMP21-8

ซลเอตทพบในดนทมเชอ B. pseudomallei สวนใหญคอ Class Colpodea แสดงวาลกษณะทางกายภาพเคมของดนทม pH อยในชวงประมาณ 5-7, WHC ประมาณ 20%-55% รวมถงพนทสวนใหญปนพนทเกษตรกรรมเพาะปลกและนาขาวจงเหมาะแกการทเชอ B. pseudomallei และซลเอต Class Colpodea จะเจรญเตบโตไดดวยกน นอกจากนการพบซลเอต Colpoda lucida รวมกบเชอ B. pseudomallei แทบทกจดเกบตวอยางท าใหมศกยภาพในการน ามาใชเพอเปนตวควบคมทางชวภาพของเชอ B. pseudomallei และสามารถน าตรวจตดตามชนดของซลเอต ในแหลงทอยอาศยอนได (Jousset et al., 2010) เอกสารอางอง บพ ธ จ า รพน ธ . โพ รโท ซ ว วท ย า . ก ร ง เท พ ฯ :

ส านกพมพมหาวทยาลยเกษตรศาสตร; 2546. บพธ จารพนธ, นนทพร จารพนธ. สตวไมมกระดกสน

หลงโพรโทซว ถง ทารดกราดา. กรงเทพฯ: ส านกพมพมหาวทยาลยเกษตรศาสตร; 2545.

Altenburger A, Ekelund F, Jacobsen CS.Protozoa and their bacterial prey colonize sterile soil fast. Soil Biology and Biochemistry 2010; 42 (9), 1636-1639.

Green SJ, Leigh MB, Neufeld JD. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) for Microbial Community Analysis. In K. Timmis (Ed.), Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology 2010; 4137-4158.

Inglis J, Rigby P, Robertson TA, Dutton NS, Henderson M, Chang BJ. Interaction between Burkholderia pseudomallei and Acanthamoeba species results in coiling phagocytosis, endamebic bacterial survival, and escape. Infection and Immunity 2000; 68(3): 1681-1686.

Inglis J, Sagripanti JL. Environmental factors that affect the survival and persistence of Burkholderia pseudomallei. Applied and Environmental Microbiology 2006; 72(11): 6865-6875.

Jousset A, Lara E, Nikolausz M, Harms H, Chatzinotas A. Application of the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) technique as an efficient diagnostic tool for ciliate communities in soil. Science of The Total Environment 2010; 408(5): 1221-1225.

Keller T, Jousset A, Overbeek L, Elsas JD, Costa R. The Freshwater Sponge Ephydatia fluviatilis Harbours Diverse Pseudomonas Species (Gammaproteobacteria, Pseudomonadales) with Broad-Spectrum Antimicrobial Activity. PLOS ONE 2014; 9(2).

Omar A, Foissner W. Description of Leptopharynx brasiliensis nov. spec. and Leptopharynx costatus gonohymen nov. subspec. (Ciliophora, Microthoracida). European Journal of Protistology 201; 48(1): 30-47.

Palasatien S, Lertsirivorakul R, Royros P., Wongratanacheewin S, Sermswan RW. (Soil physicochemical properties related to the presence of Burkholderia pseudomallei. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, Supplement 2008; 1(0): S5-S9.

- 562 -

BMP21-9

Peacock SJ, Chieng G, Cheng AC, Dance AB, Amornchai P, Wongsuvan G, Wuthiekanun V. Comparison of Ashdown's Medium, Burkholderia cepacia Medium, and Burkholderia pseudomallei Selective Agar for Clinical Isolation of Burkholderia pseudomallei. Journal of Clinical Microbiology 2005; 43(10): 5359-5361.

Purves WK, Orians GH, Heller HC (2005). Life: The Science of Biology. Avialable from http://www.globalchange.umich.edu/globalhange1/current/lectures/predation/predation.html

Ronn R., Ekalund F, Christensen S. Optimizing soil extract and broth medis for MPN enumeration of naked amoebae and heterotrophic flagellates in soil. Pedobiologia 1995; 39: 10-19.

Shimano S, Sambe M, Kasahara Y. Application of nested PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) for the analysis of ciliate communities in soils Microbes Environ 2012; 27: 136-141.

Suebrasri T, Wang-Ngarm S, Chareonsudjai P, Sermswan RW, Chareonsudjai S. Seasonal variation of soil environmental characteristics affect the presence of burkholderia pseudomallei in khon kaen, Thailand. African J Microbiol Res 2013; 7: 1940-1945.

Trung TT, Hetzer A, Topfstedt E, Gohler A, Limmathurotsakul D, Wuthiekanun V. Improved culture-based detection and quantification of Burkholderia pseudomallei from soil. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 2011; 105(6): 346-351.

Vaerewijck MJ, Sabbe K, Bar J, Houf K. Microscopic and Molecular Studies of the Diversity of Free-Living Protozoa in Meat-Cutting Plants. Applied and Environmental Microbiology 2008; 74: 5741-5749.

Wadowsky RM, Wilson TM, Kapp NJ, West AJ, Kuchta JM, States SJ, Yee RB. Multiplication of Legionella spp. in tap water containing Hartmannella vermiformis. Applied and environmental microbiology 1991; 57(7): 1950-1955.

Wuthiekanun V, Dance DA, Wattanagoon Y, Supputtamongkol Y, Chaowagul W, White NJ. The use of selective media for the isolation of Pseudomonas pseudomallei In clinical practice. J Med Microbiology 1990; 33(2): 121-126.

- 563 -