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Boletín Usuarios SPMEe-boletín nº 7; año 2009. Editor Dr. Nour Kayali

2 Boletín Usuarios SPMEe-boletín nº 7, año 2009. Editor Dr. Nour Kayali. Patrocinador Sigma-Aldrich Química

SPME Multi Fiber Exchange

• El Cambiador de fibras, MFX, es un nuevo accesorio para la automatización de la Microextracción en Fase Sólida, SPME, ofreciendo una nueva estrategia para la optimización y determinación de compuestos orgánicos volátiles y/o semivolátiles en muestras de naturaleza sólida, líquida o gaseosa.

• Varios fabricantes presentaron un accesorio para el robot CombiPAL.Este accesorio está formado de dos partes principales, una corresponde al control de la sujeción y cambio de la fibra con su nuevo holder, y otra corresponde a un soporte con varios orificios para la colocación de varios holders.

• Existen soportes con diversas capacidades, uno para tres unidades de fibras y otro para veinticinco unidades, fabricados por Gerstel http://www.gerstel.com/en/multi-spme-fiber-exchange-mfx.htm

• También, existe otro accesorio de MFX de 25 unidades fabricado por Presearch

• http://www.presearch.co.uk/pages/products/show-product.asp?id=1612

•

Gerstel MFX 3 fibras Gerstel MFX 25 fibrasVideo: http://www.nurka.es


SPME Multi Fiber Exchange

•El objetivo de esta nueva modalidad ofrece varias ventajas. La primera, presenta una táctica interesante para la optimización de un nuevo método analítico, facilitando la selección adecuada de la fase de la fibra para la extracción de un amplio rango de analitos de diferentes polaridades.

•La segunda, ofrece la posibilidad de utilizar varias fibras de la misma naturaleza procedentes de las extracciones, tanto en modo on-line, evitando así el efecto memoria, como en modo off-line de un muestreo pasivo.

Presearch MFX 25 Fibras

NOTA: Las fibras ya están disponibles en Supelco


Carta a los Usuarios de SPME.

Estimados usuarios de SPME, ya tenemos ganadores de la 3 ª edición del premio “Club usuarios de SPME” dotado con 1000 € en productos de las marcas de Analítica de Sigma-Aldrich, Fluka y Supelco. En esta ocasión se a otorgado el premio al trabajo con título ��

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��. Trabajo realizado por Elena Serrano, Joaquín Beltrán y Félix Hernández del Instituto del agua y plaguicidas de la Universidad Jaume I en Castellón. El premio fue entregado en la sesión de clausura de la Reunión Científica de la SECyTA que tuvo lugar en San Sebastián los próximos 28, 29 y 30 de Octubre. Un resumen del trabajo nos ha sido cedido por sus autores y podrán leerlo en las páginas de este boletín.Dado el éxito de las tres ediciones de este premio es la intención de Sigma-Aldrich Química mantenerlo en los próximos años y abrirlo a todos los trabajos realizados en el año sobre SPME. En el próximo numero de 2010 se publicaran las bases del mismo por lo que os invito a ampliar la producción científica con el uso de esta interesante técnica de preparación de muestras.Sigma-Aldrich está realizando un gran esfuerzo en llevar a todos nuestros clientesunas sensacionales ofertas de muchas de sus líneas de productos. No dudéis en revisar mes a mes el siguiente vínculo en el que podéis encontrar las ofertas:

www.sigmaaldrich.com/europe/special-offers.html?tab=2

Los promotores del club de usuarios de SPME nos unimos a este esfuerzo con el envío bimensual de una oferta exclusiva para los miembros del club, que la hacemos llegar mediante e_mail. Si aún no eres miembro del club o no recibes estas ofertas no dudes en ponerte en contacto conmigo.

([email protected])

Reciba un cordial saludo

Pedro GutiérrezSales Development. AnalyticalSigma-Aldrich Química


Consejo Práctico

El empleo de una barra de agitación magnética, en el procedimiento de extracción en SPME, puede ser en la mayoría de los casos una fuente de contaminación, debido a la retención de los analitos en su superficie. En las sucesivas extracciones estos analitos contaminarían la muestra acuosa, dando lugar a análisis erróneos. El uso

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Artículo miembro del Club SPME.

DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS VOLÁTILES AROMÁTICOS EN MUESTRAS VEGETALES MEDIANTE

MHS-SPME-GC-MSSerrano, Elena *; Beltrán, Joaquim; Hernández, Félix

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE PLAGUICIDAS Y AGUAS, UNIVERSITAT JAUME IAvda/ Sos Baynat s/n, Campus Riu Sec, 12079-CASTELLÓN DE LA PLANA

1. IntroducciónEl perfil aromático de un alimento, junto a otras características como el

sabor, el color o la textura, es un componente característico de su calidad organoléptica. Esta propiedad, junto al valor nutritivo del alimento, estáconstantemente en estudio y mejora para obtener alimentos que sean aceptados por el consumidor. Debido a esto, es necesario el desarrollo de metodologías analíticas que permitan caracterizar estos perfiles, identificando y cuantificando los compuestos responsables de su aromaticidad, y determinando cuáles son realmente esenciales.

En este campo, la microextracción en fase sólida (SPME) presenta grandes ventajas debido principalmente a que es capaz de llevar a cabo la extracción de los volátiles, su concentración y su introducción en el sistema cromatográfico en una sola etapa. Además, la posibilidad de llevar a cabo análisis del headspace (HS) de la muestra aporta una gran selectividad en la determinación de compuestos volátiles.

En este trabajo se pretende estudiar la aplicación de la HS-SPME en modo múltiple a la determinación cuantitativa de volátiles aromáticos en matrices vegetales como melón, tomate o aceite.

Para introducir el concepto de microextracción en fase sólida en headspace en modo múltiple (MHS-SPME), es necesario recordar primero algunas aspectos teóricos de la SPME. El sistema de trabajo está formado por tres fases en equilibrio: la muestra (s), el headspace (hs) y la fibra (f). Durante el proceso de extracción, se da una relación lineal entre la cantidad de analito presente inicialmente en la muestra (no), y la cantidad de analito

que se extrae (n∞). Este proceso depende de las constantes de partición (K) yde los volúmenes (V) de las 3 fases implicadas (1):



El proceso de múltiple headspace es un proceso por etapas que permite calcular la cantidad teórica total de un analito en una muestra., realizando extracciones consecutivas sobre la misma y analizando cada extracción.

Según las ecuaciones que intervienen en el proceso, en cada extracción consecutiva (i) la cantidad de analito aislada está relacionada con la cantidad extraída inicialmente, y con un parámetro denominado beta (β) que es la clave en la aplicación de la técnica.

El parámetro β se define como la fracción de analito que queda en la muestra después de cada extracción (6), y depende de las características del analito, de la matriz de la muestra y de las condiciones de extracción seleccionadas.

Asumiendo que la cantidad de analito tiene una relación directa con el área de pico cromatográfico, la ecuación (2) se podría rescribir así:

Así, el área teórica total correspondiente a un compuesto vendría dada por la suma de áreas de cada extracción individual, es decir:

Este sumatorio correspondería a la suma de una progresión geométrica, y con el tratamiento matemático adecuado, se llega a una expresión que relaciona ésta respuesta total, con el área de la primera extracción y el parámetro beta:

Por su propia definición, β presentará valores acotados entre 0 y 1. En general, valores de beta menores a 0.4 indican que el analito se puede determinar de forma cuantitativa llevando a cabo las primeras 3 o 4 extracciones sucesivas. Por otra parte, valores mayores a 0.95 indican una saturación de este analito en el espacio de cabeza de la

n∞ = · no

Kfs·Vf

Kfs·Vf + Khs·Vh + Vs

(1)

ni = n1 · βi-1 (2)

β = 1 –Kfs·Vf

Kfs·Vf + Khs·Vh + Vs

(3)

Ai = A1 · βi-1 (4)

A T = A1 + A2 + … + An = ΣAi (5)

A T =1 – β

A1(6)



muestra, y no se observan diferencias significativas entre las distintas extracciones, por lo que no se puede utilizar la aproximación de la SPME en modo múltiple. Los compuestos que presentan valores intermedios de β, necesitarían numerosas extracciones consecutivas para ser extraídos de forma cuantitativa, por lo que no resultaría factible la aplicación experimental llevando a cabo las etapas de extracción de una en una.

Así, el primer objetivo para la aplicación de esta aproximación es la determinación de este parámetro para cada analito de interés en una matriz, para después poder realizar el análisis de muestras similares, pero llevando a cabo una sola extracción (como se realizaría en las aplicaciones de SPME en el modo tradicional).

En el caso de la caracterización del perfil aromático de un vegetal, un aceite o un vino, por ejemplo, casi siempre nos encontramos con la misma situación: los compuestos responsables de su aromaticidad son componentes de la matriz de la muestra, están presentes en un rango muy amplio de concentraciones, y suelen presentar distinto comportamiento fisicoquímico. Por otra parte, no se pueden obtener blancos de la matriz, es decir, una fruta sin su aromaticidad, por lo que no se pueden llevar a cabo ensayos de recuperación o calibrados en matriz, que facilitarían el trabajo de cuantificación. Además, en estos casos, el efecto matriz suele ser importante y casi siempre es necesario el uso de uno o varios patrones internos o surrogates para corregirlos, no obteniendo siempre resultados satisfactorios.

Es habitual recurrir a la metodología de adiciones estándar, pero requiere gran cantidad de trabajo por muestra, y suele presentar problemas con matrices complejas o sólidas. Así, la MHS-SPME se podría presentar como una interesante alternativa para la determinación cuantitativa de volátiles aromáticos en muestras vegetales.

2. Optimización del proceso de extracciónAntes de aplicar la aproximación de SPME en modo múltiple, el proceso

de extracción debe ser optimizado como en cualquier otra aplicación de la técnica.En primer lugar se ha estudiado la eficiencia de la extracción utilizando

distintos tipos de recubrimientos de fibras de SPME: CAR/PDMS (75 µm), DVB/CAR/PDMS (50/30 µm), PDMS/DVB (65 µm), PDMS (100 µm), siendo la más adecuada para la determinación de estos volátiles la fase DVB/CAR/PDM.

Con el fin de seleccionar las condiciones óptimas de extracción, en lugar de optimizar las siguientes variables en una aproximación invariante, se aplicó un diseño




factorial para el estudio el efecto de la temperatura de extracción, la adición de disolución acuosa de cloruro sódico, de la masa de muestra a tratar. De este modo, además de estudiar el efecto de varias variables de forma simultánea, se puede estudiar, el efecto de posibles interacciones entre variables, si estas se dan. La temperatura y la adición de cloruro sódico resultaron ser las variables más influyentes en la eficiencia de la extracción, pero de forma distinta según el tipo de compuestos (Fig 1). Finalmente, para poder estudiar las condiciones de aplicación de la MHS-SPME, las extracciones se llevaron a cabo bajo dos condiciones distintas, ya que no se consideró adecuada la selección de unos valores de compromiso generales para todos los aromas. En una última etapa se estudiaron los tiempos de equilibrio de los compuestos en las condiciones de extracción seleccionadas, y se fijaron los tiempos de extracción.

Figura 1. Estudio de los efectos de algunas de las variables optimizadas en el proceso de extracción

(temperatura, adición de NaCl y masa de muestra) para dos de los aromas seleccionados en el estudio de perfil aromático de melón.

3. Determinación de parámetros βPara la determinación de los parámetros beta correspondientes a cada volátil, se realizaron 5 extracciones consecutivas sobre la misma muestra real, realizando estas experiencias por duplicado.Una vez obtenidas las áreas de pico cromatográfico para cada compuesto en cada extracción, se calcularon los logaritmos de estas respuestas, y los valores obtenidos se representaron frente a i – 1, donde i representaba el número de extracciones realizadas. Con el ajuste por mínimos cuadrados de los resultados obtenidos, se obtiene una recta de pendiente negativa. A partir de este valor, se calcula el parámetro beta

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alcohol bencílico 2-metilbutirato de etilo

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Efectos positivos Efectos negativos


34 35 36 37 38 minutes

0.0

1.0

2.0

3.0

MCounts nonadienolXIC m/z 79

i = 1

i = 2i = 3

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Extracción Ai i – 1 Log Ai

i = 1 20080000 0 7,30i = 2 4528000 1 6,66i = 3 859568 2 5,93i = 4 123182 3 5,09i = 5 29754 4 4,47

i - 1

Log

A i

β = 0.19

( A )

( B )

( C )

correspondiente a cada aroma en estudio (Fig 2). De esta forma se determinaron también los parámetros β correspondientes a los aromas estudiados a partir de una disolución acuosa de los patrones.

Figura 2. (A) Cromatogramas (XIC) superpuestos correspondientes a extracciones consecutivas

realizadas sobre la misma muestra (melón), a 50 ºC. (B) Cálculo de los logaritmos de las respuestas

de pico cromatográfico. (C) Representación gráfica de la expresión “Log (Ai) = b + log(β) · (i – 1)”, ajuste lineal de los resultados y determinación del parámetro beta.

4. Análisis por GC-MSPara llevar a cabo este estudio se utilizó un cromatógrafo de gases

(Varian CP-3800) acoplado a una espectrómetro de masas con analizador de trampa iónica (Varian 4000MS), adquiriendo en modo Full Scan (50-200 m/z).

La separación y cuantificación de los compuestos se llevó a cabo usando una columna de fase polietilenglicol (60m x 0.32mm ID x 0.25µm ft), aplicando una rampa de temperaturas de 3 ºC/min para la conseguir la mayor separación posible entre los diferentes analitos. El tiempo de análisis cromatográfico resultante permitía el adecuado solapamiento entre la fase de extracción por SPME, y la posterior determinación por GC-MS, con el fin de maximizar la productividad.



Artículo miembro del Club SPME.5. Resultados

Los parámetros beta correspondientes a los aromas obtenidos a partir de una disolución acuosa y de una muestra real presentaron diferencias significativas en la mayoría de casos, lo que evidencia el efecto matriz que afecta a la extracción de estos aromas (Tabla 1).Tabla 1. Ejemplos de valores beta determinados sobre muestras de melón y sobre disoluciones acuosas del patrón en las condiciones de extracción optimizadas.

En este tipo de muestras, donde los aromas son componentes de la muestra, la precisión se puede evaluar en términos de repetibilidad, analizando varias réplicas de una muestra real.

El estudio de la etapa de cuantificación se puede abordar desde distintos puntos de vista. Para la preparación de la curva de calibrado, una primera aproximación, aunque posiblemente la menos atractiva, sería la realización de sucesivas extracciones sobre las disoluciones patrón, hasta la completa extracción de los analitos, y calcular la respuesta total como suma de las extracciones individuales. También se puede llevar a cabo la preparación de una curva de calibrado aplicando los parámetros beta obtenidos a partir de los estándar en disolución a las respuestas obtenidas con la primera extracción, determinando así el área teórica total de los estándares. Por otra parte, puesto que las áreas totales son teóricas, aunque calculadas a partir de un parámetro beta empírico, se puede plantear la posibilidad de cuantificar las muestras mediante un calibrado en solvente, si los resultados son satisfactorios al compararlos con otro tipo de cuantificación.

Con la aplicación de la SPME en modo múltiple, se pueden caracterizar perfiles aromáticos con la identificación y cuantificación del mayor número de compuestos posible, y esta aplicación se puede extender a otro tipo de matrices para las que el estudio de su aromaticidad sea de interés, no solo a frutas o verduras, sino que también a vinos, quesos aceites o vinagres, por ejemplo.

Aroma β (melón) β (patrón)

2-metilbutirato de etilo 0,34 0,14

Sorbato de etilo 0,58 0,60

E,E-2,4-nonadienal 0,58 0,15

Alcohol bencílico 0,89 0,93


Próximos Congresos

6º Encontro Nacional de CromatografiaFunchal, 14-16 de DEZEMBRO de 2009

El profesor Pawliszyn hablará el primer día sobre “IN-VIVO APPLICATIONS OF SOLID PHASE MICROEXTRACTION”

http://www.spq.pt/eventos/cromatografia09/

Eleventh International Symposium on Hyphenated

Techniques in Chromatography and Hyphenated

Chromatographic AnalyzersBruges, Belgium

January 27th - 29th, 2010

International Symposium on Hyphenated Techniques for

Sample PreparationBruges , Belgium

January 26th – 27th, 2010Symposia organized by the Royal Flemish Chemical Society (KVCV),

Catholic University College Bruges - Ostend in Bruges

25 - 29 January 2010http://www.ordibo.be/htc/index.html

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