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Bolsas Universidade de Lisboa / Fundação Amadeu Dias
Edição 2010/2011
Relatório de Projecto
Estudo de extractos de uma esponja marinha com actividade neurobiológica
Bolseira: Clara Patrício
Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa
Curso: Bioquímica
Ano: 3º Ano
Tutor: Doutor Pedro Lima
Í N D I C E
Enquadramento
Objectivos do projecto
Metodologia aplicada
Resultados obtidos de acordo com os objectivos propostos
Execução financeira de acordo com o plano orçamental previsto
Conclusões
Bibliografia
1 | E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
Enquadramento
1. Relevância do estudo de produtos marinhos
A diversidade das florestas tropicais é uma miudeza quando comparada com a diversidade dos
ecossistemas marinhos. Todavia, os produtos naturais provenientes do mar são muito menos
estudados que os equivalentes terrestres [12]. Ainda assim, a enorme diversidade de metabolitos
secundários a serem sintetizados pela flora e fauna marinhas justifica o interesse científico crescente.
Desde que, em 1951, foram isolados dois nucleósidos (spongouridin e spongothymidin) da esponja
Cryptotethya crypta, os quais revelavam propriedades antivirais, mais de 20,000 compostos foram
descobertos em organismos marinhos [11] e mais de 21,000 artigos foram publicados.
O valor científico e comercial dos produtos marinhos na indústria biotecnológica, em vendas
globais, rondava 2.4 biliões de dólares em 2002. Para o período entre 1973 e 2007, o sector químico
detinha a maior fatia (53.5%) das patentes referentes aos recursos genéticos marinhos seguido do
sector farmacêutico (32.2%), alimentar (5.7%), agrícola (1.7%), cosmético (1.2%) e outros (5.7%) [17]. Apontam-se aqui apenas alguns exemplos ilustrativos de aplicações de produtos marinhos. Na
indústria química, os materiais base para plásticos biodegradáveis como o PHB são PHAs produzidos
por procariotas marinhos, e pigmentos como a melanina têm utilidade potencial na tinturaria e em
protectores solares. Proteínas anti-congelantes sintetizadas por peixes que vivem nos pólos são hoje
utilizadas no controlo da deterioração induzida pelo frio de alimentos, produtos médicos e
cosméticos. Igualmente, diversos produtos marinhos são também utilizados como suplementos
nutricionais (os óleos de krill, ricos em Omega-3, são suplementos benéficos na dieta humana). Já na
produção de etanol a partir de milho é usada um enzima (Fuelzyme) desenvolvido a partir de
amostras recolhidas do fundo do mar. Do uso de produtos marinhos na indústria cosmética são
exemplos a Pseudopterosin (Estée Lauder) e a alga Durvillea antárctica (Clarins) [17]. O oceano
fornece ainda recursos usados hoje nos laboratórios científicos de todo o mundo. Exemplos são a
proteína verde fluorescente (GFP) e enzimas como o Taq polimerase, o Vent polimerase ou o Pfu
DNA polimerase. O Prémio Nobel da Química de 2008 foi atribuído “pela descoberta e
desenvolvimento da GFP” [31] [24].
Há hoje 3 medicamentos em comercialização nos EUA e mais um na Europa cujo composto
activo é um produto marinho (cytarabine (Cytosar-U®, Depocyt®), vidarabine (Vira-A®), ziconotide
(Prialt ®) e Trabectedin (Yondelis ®)), e vários outros estão em ensaios clínicos para serem
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utilizados em diversas patologias. No tratamento do cancro, o Cytosar-U®, o Depocyt® e o
Yondelis® são três dos medicamentos actualmente em comercialização, mas outros dez compostos
de esponja estão já em fase de ensaios clínicos nos EUA [13]. Já exemplos de compostos com
actividade antiviral são o AZT, o Retrovir® e o Acyclovir (Zovirax®) utilizados no tratamento da
SIDA [17]. Também o vidarabine (Vira-A®) é utilizado como antiviral [13] e outros 150 produtos
naturais marinhos têm níveis promissores de actividade anti-HIV. Uma toxina extraída do búzio
conus (conotoxina) está na base do medicamento contra a dor [17]. Razões associadas à ecologia
marinha justificam a existência de compostos com actividade anti-bacteriana extraordinariamente
potentes [12]. Resultados indicam ainda produtos particularmente favoráveis para o tratamento da
tuberculose, enquanto outros parecem ter actividade anti-inflamatória, actividade anti-coagulante e
actividade anti-malária [17].
2. Esponjas
Como já foi referido, os produtos obtidos a partir de esponjas têm uma enorme relevância na
química dos produtos marinhos. As esponjas são animais invertebrados do filo Porifera que se
alimentam por filtração, o que justifica a morfologia com uma complexa rede canais condutores da
água e câmaras de coanócitos (células flageladas características do processo de nutrição das
esponjas), a qual permite o processamento de uma massa de água equivalente ao seu peso cada 5
segundos. As esponjas são consideradas fósseis vivos, já que se pensa representarem o filo
metazoário mais antigo existente nos dias de hoje. Considera-se que actualmente existam cerca de
9000 espécies de esponjas no planeta, em recifes de corais, altitudes mais elevadas ou mesmo em
lagos de água doce [14]. O seu esqueleto inorgânico é composto por estruturas denominadas espículas
maioritariamente de sílica (vasta maioria das esponjas) ou de carbonato de cálcio (minoritariamente)
[14], cuja análise é um factor determinante na identificação da espécie. Uma das características mais
peremptoriamente associada às esponjas é a sua estacionaridade. Esta particularidade não lhes
confere defesas físicas e, como tal, justifica a potência das suas defesas químicas.
É ainda de referir que o número de microrganismos, nomeadamente bactérias, que as esponjas
alojam suplanta em larga escala o número de células da própria esponja [14]. As bactérias são
activamente “aspiradas” para dentro da esponja através de correntes por esta geradas e retidas por
filtração. A distribuição das bactérias pela esponja segue então um padrão em que o mesmo tipo de
bactérias é encontrado nos mesmos tecidos de esponjas taxonomicamente e geograficamente
distantes. Muitas vezes as bactérias associadas às esponjas são referidas como simbiontes, no entanto,
em numerosos casos, essa relação é ainda controversa. Na verdade vários são os casos em que se
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verifica que os compostos com interesse biotecnológico isolados a partir de esponjas são na verdade
produtos dos microrganismos nela residentes [12] [14].
A utilização de esponjas pelo seu poder absorvente é bastante conhecida. Não obstante, outros
exemplos de aplicações que exploram as características morfológicas das esponjas são: a utilização
da esponjina (proteína semelhante ao colagénio) [20], a aplicação de uma estrutura do tipo esponja
formada de agregados de titânio em painéis fotovoltaicos híbridos [20], a utilização de microesponjas
sintéticas como estratégia de drug delivery [4] e a exploração das propriedades de fibras ópticas das
espículas da base da esponja Euplectella [27].
Tal como foi atrás mencionado, as esponjas são animais quase sem mobilidade e parcas
defesas físicas. Como tal, desenvolveram defesas químicas tóxicas ou repelentes contra os predadores
e contra outros organismos sedentários com os quais têm de competir por espaço no substrato [17] [9]
[15]. Assim, as concentrações dos metabolitos são mais altas em ambientes de alta competitividade
como recifes de coral ou zonas em que as esponjas estejam mais expostas à predação por peixes [15],
variando ainda com outros factores ambientais (temperatura, localização geográfica e iluminação) e
de stress. Cerca de 400 compostos foram já isolados a partir de esponjas [17] e mais de 2,700 artigos
relativos a metabolitos de esponjas marinhas foram publicados [9]. Contudo, apenas um número
restrito de drogas derivadas desses compostos chegaram efectivamente ao mercado devido às
dificuldades de cultura de esponjas em larga escala e à morosidade e custos elevados associados à
síntese dos compostos em questão [17]. Ainda assim, há mais fármacos derivados de esponjas em
ensaios clínicos e pré-clínicos do que de qualquer outro filo marinho [16]. Os lucros anuais de
compostos de esponjas marinhas usados para tratar herpes eram, em 2005, da ordem dos 50 a 100
milhões de dólares [17], o que é representativo do verdadeiro potencial em questão.
Resultados revelam que várias moléculas produzidas por esponjas e/ou microrganismos
associados, nomeadamente nucleósidos invulgares, treptenos bioactivos, estróis, péptidos cíclicos,
policétidos, alcalóides, ácidos gordos, peróxidos e derivados de aminoácidos (halogenados ou não),
apresentam actividades farmacológicas relevantes. Destacam-se aqui algumas dessas actividades [9]
[16]:
− anti-tumoral (Halichondrin B – metabolito da esponja H. okadai é uma potencial droga em
ensaios clínicos no Canadá; Agelasphin – proveniente da Agela Mauritânia, está em fase I de
testes clínicos na Europa),
− anti-bacteriana (6-hydroxymanzamine E – alcalóide produzido pela Acanthostrongylophora
sp. com resultados promissores contra M. tuberculosis, o patogénio da tuberculose),
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− anti-fúngica (Manzamine A – produto da Acanthostrongylophora sp. que exibe actividade
anti-C. neoformans, fungo que infecta a garganta, encontra-se em testes pré-clínicos),
− antiviral (Ara-A – nucleósido da Cryptotethya crypta tem actividade contra o vírus da herpes
e da varicela; Avarol – produto da Dysidea avara inibe o HIV quase completamente e os seus
derivados são potentes inibidores da transcriptase reversa do HIV, enzima fundamental nas
primeiras fases de infecção pelo vírus da SIDA),
− anti-protozoário (Manzamine A- alcalóide isolado de várias esponjas parece muito promissor
no tratamento de malária, em testes pré-clínicos),
− anti-inflamatória (Contignaterol - isolado de Petrosia contignata, está neste momento em
estudo em ensaios clínicos) e
− imunossupressora (Discodermolide – metabolito da Discodermia dissoluta, é um agente
imunossupressivo e anti-canceroso, apresentando actividade semelhante ao Taxol; encontra-se
em testes clínicos para cancros resistentes ao Taxol).
Outros produtos de esponjas podem ser encontrados nos laboratórios de todo o mundo, como
ferramentas de investigação científica. São exemplos o ácido ocadaico e a caliculina [9].
3. Esponjas nas neurociências
O sistema nervoso, e os neurónios em particular, funcionam por sinais eléctricos. Estes
devem-se a fluxos de iões para dentro e fora dos neurónios, os quais são regulados por canais iónicos.
Os canais iónicos são proteínas transmembranares, formando poros na membrana, por onde fluem
iões controladamente. Pequenas alterações conformacionais num único canal podem provocar a sua
abertura (gate) e permitir que 10 milhões de iões entrem ou saiam da célula por segundo. Alguns pico
amperes (10-12A) de corrente são gerados pela translocação de iões específicos de cada vez que cada
canal abre [19]. Estes canais normalmente são classificados segundo o tipo de ião que conduzem –
sódio, potássio, cálcio, cloro, entre outros -, embora alguns sejam menos selectivos. O gating pode
ser induzido por ligandos extracelulares, segundos mensageiros intracelulares ou alterações na
voltagem transmembranar [1]. Estes últimos, os canais iónicos dependentes de voltagem que medeiam
a sinalização eléctrica têm funções distintas: os canais de sódio dependentes de voltagem (Nav)
iniciam potenciais de acção; os canais de cálcio dependentes de voltagem (Cav) estão envolvidos em
processos como a transmissão sináptica, a contracção muscular e a secreção hormonal; e os canais de
potássio dependentes de voltagem (Kv) terminam o potencial de acção e repõe o potencial de repouso
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da membrana controlando a neuroexcitabilidade [19]. Cada célula tem várias subpopulações de canais,
ou seja, vários canais com funções distintas.
A diversidade de canais de potássio (K+) é significativamente superior à dos demais canais [6].
De acordo com a sua topologia – nº de domínios transmembranares (DTMs) - podemos identificar
três grupos principais: aqueles com 6DMTs, que funcionalmente estão identificados como canais de
potássio dependentes de voltagem (Kv) e canais de potássio activados por ião cálcio; os com 4DMTs,
funcionalmente canais de potássio “leak”; e aqueles com apenas 2DMTs, os canais de potássio
inward rectifying (Kir). Estes grupos subdividem-se em famílias, de acordo com a semelhança da
respectiva sequência de aminoácido, e estas em subfamílias [6]. Cada população de canais de potássio
tem mecanismos de selectividade de iões, gating dependente de voltagem, de cálcio ou de outros
factores, subunidades auxiliares/proteínas associadas, mecanismos inactivação e bloqueio
característicos. A família de canais de potássio dependentes de voltagem (Kv) engloba 8 subfamílias [6]. Estes canais podem ser maioritariamente modulados por alteração da condutância, por influência
na dependência de voltagem ou por alteração dos perfis de activação ou inibição.
A técnica mais usada para monitorizar o funcionamento dos canais iónico é o patch clamp [1],
técnica utilizada no presente trabalho.
Existem alguns estudos sobre efeitos de extractos de esponjas marinhas na actividade de
canais iónicos, nomeadamente em canais de cálcio: um extracto aquoso de Ectyoplasia ferox mostra
um efeito no batimento cardíaco relacionada com uma potenciação de canais de cálcio de tipo L
(Cav1.2) – o composto activo não foi todavia identificado [5]; a halichlorine, um alcalóide de fórmula
molecular C23H32O3NCl (MM=405.4g/mol) isolado de Halichondria okadai Kadota tem um efeito
vasodilatador coadunável com a inibição do mesmo tipo de canais; também alcalóides (pirrólicos),
vários compostos isolados de Agelas conífera reduzem a entrada de cálcio dependente de voltagem
em células PC12 [2] [3]. Outros compostos mostram efeitos a nível dos mecanismos de Ca2+
intracelular: as xestosponginas (A, B e C) são um conjunto de produtos inicialmente isolados da
esponja Xestospongia exígua e que bloqueiam selectivamente receptores inositol-1,4,5-trifosfato (IP3)
e de Ryanodina [25], [10] e [28]. Já ao nível dos canais de sódio, há que referir que os compostos
alcalóides dromosceptrin e clathrodin, purificados de esponjas do género Agelas, apresentam efeitos
nas correntes membranas neuronais [23]. Por fim, há que salientar que, segundo o que foi possível
identificar, não existem quaisquer efeitos relatados de produtos de esponjas marinhas em canais de
potássio [30].
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4. Caso particular: Erylus
De acordo com o registo mundial das espécies marinhas há 74 espécies do género Erylus [22].
No entanto, poucos estudos decorrem sobre os produtos secundários desta esponja. Assinalam-se
porém de seguida três exemplos. As erylosides constituem uma família de glicósidos isolada de
várias Erylus spp.: a erylosid A5 tem actividade anti-tumor e antifungica, a erysolide E7 é
antagonista da ligação ao receptor de C5a (molécula parte do sistema imunitário) e a erosylide F
apresenta uma potente actividade antagonista do receptor da trombina, uma molécula envolvida na
coagulação do sangue, inibindo a agregação de plaquetas in vitro [26]. A nobiloside, C47H72O19,
isolada de uma amostra de Erylus nobilis, revelou ter actividade anti-neuramidase, um enzima
envolvido na infecção pelo vírus da influenza [29]. A esponja Erylus discophorus apresentou ainda
níveis elevados de polissacáridos e actividade inibitória do HIV-1 (90 a 95%) [8], sendo
presumivelmente a molécula activa neste efeito um polissacárido sulfatado de elevado peso
molecular (> 2000 kDa) a funcionar como um inibidor de fusão.
Espécimes da mesma esponja - Erylus discophorus - foram utilizados no decurso deste
trabalho. Esta esponja marinha (Classificação (Biota): Animalia, Porifera, Demospongiae,
Astrophorida, Geodiidade, Erylus) foi inicialmente descrita por Schmidt em 1862 e está registada no
Atlântico e no mar mediterrânico [22].
Objectivos do projecto
Este trabalho teve por objectivo estudar a actividade neurofarmacológica do extracto de uma
esponja marinha, Erylus discophorus. Em particular, numa primeira fase, o objectivo do trabalho foi
extrair o conteúdo de várias (dezoito) amostras de esponja Erylus discophorus, recolhidas em pontos
distintos do Oceano Atlântico nordeste. A segunda fase almejou a (1) estudar o efeito de um desses
estratos (B05.09.99) ao nível das correntes de potássio de neurónios piramidais isolados da região
CA1 do hipocampo de ratos wistar; (2) indagar sobre o modo de acção do(s) princípio(s) activo(s); e
(3) identificar qual(ais) o(s) canal(ais) de K+ afectado(s).
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Metodologia aplicada
Preparação de extractos de Erylus discophorus
As amostras de esponja
localizações do Oceano Atlântico Nordeste
do Gorringe (fig. 1 e tabela 1)
congeladas a -20°C, levadas em recipientes isotérmicos para o laboratório, onde foram armazenadas a
essa temperatura. A todas as amostras (18 amostras)
1). Uma fracção representativa d
98% para identificação. As amostras foram cortadas em pedaços pequenos
-80°C e liofilizadas. Os resultantes pedaços secos de esponja foram reduzidos a pó. Um grama
de cada amostra foi submetido então a uma extracção não diferencial. Ao grama de amostra foram
adicionados 20mL de solução de diclorometano:metanol (1:1) e a mistura foi submetida à acção de
ultra-sons (10 min) (Elma, Transsonic 460)
procedimento mais duas vezes usando o resíduo sólido da decantação. Do filtrado final (60mL)
obteve-se um extracto sólido por evaporação dos solventes num rota
Heating Bath B-490 e Rotavapor R
pressão até o extracto estar seco). Este extracto sólido foi sucessivamente dissolvido em solução
diclorometano:metanol (1:1), decantado para um novo recipiente, dissolvido em metanol e decantado
para o mesmo recipiente e de novo dissolvido em metanol e transferido para o recipiente referido. De
novo os solventes foram evaporados no rota
pressão até 1 torr). Quando se refere
deste processo. Os códigos de identificação dos extractos correspondem aos códigos de identificação
das amostras.
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Metodologia aplicada
Preparação de extractos de Erylus discophorus
As amostras de esponja Erylus discophorus foram recolhidas por mergulho
localizações do Oceano Atlântico Nordeste - Reserva Natural das Berlengas, Açores, Ferrol e Banco
do Gorringe (fig. 1 e tabela 1) – em várias missões. Imediatamente após rec
em recipientes isotérmicos para o laboratório, onde foram armazenadas a
odas as amostras (18 amostras) foi atribuído um código de identificação
1). Uma fracção representativa de cada amostra foi armazenada à temperatura ambiente em etanol
As amostras foram cortadas em pedaços pequenos
0°C e liofilizadas. Os resultantes pedaços secos de esponja foram reduzidos a pó. Um grama
de cada amostra foi submetido então a uma extracção não diferencial. Ao grama de amostra foram
adicionados 20mL de solução de diclorometano:metanol (1:1) e a mistura foi submetida à acção de
, Transsonic 460); foi então decantada e filtrada. Repetiu
procedimento mais duas vezes usando o resíduo sólido da decantação. Do filtrado final (60mL)
se um extracto sólido por evaporação dos solventes num rota-vapor
490 e Rotavapor R-200) (a temperatura inferior a 37°C (aprox. 34°C), reduziu
pressão até o extracto estar seco). Este extracto sólido foi sucessivamente dissolvido em solução
diclorometano:metanol (1:1), decantado para um novo recipiente, dissolvido em metanol e decantado
ara o mesmo recipiente e de novo dissolvido em metanol e transferido para o recipiente referido. De
novo os solventes foram evaporados no rota-vapor (a temperatura inferior a 37°C, reduziu
refere a “extracto” doravante referimo-nos ao resíduo sólido decorrente
deste processo. Os códigos de identificação dos extractos correspondem aos códigos de identificação
.
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foram recolhidas por mergulho em várias
Reserva Natural das Berlengas, Açores, Ferrol e Banco
em várias missões. Imediatamente após recolha as amostras foram
em recipientes isotérmicos para o laboratório, onde foram armazenadas a
um código de identificação (tabela
e cada amostra foi armazenada à temperatura ambiente em etanol
As amostras foram cortadas em pedaços pequenos (≈2cm3), congeladas a
0°C e liofilizadas. Os resultantes pedaços secos de esponja foram reduzidos a pó. Um grama do pó
de cada amostra foi submetido então a uma extracção não diferencial. Ao grama de amostra foram
adicionados 20mL de solução de diclorometano:metanol (1:1) e a mistura foi submetida à acção de
tada e filtrada. Repetiu-se este
procedimento mais duas vezes usando o resíduo sólido da decantação. Do filtrado final (60mL)
vapor (Büchi: Vac V-500,
(a temperatura inferior a 37°C (aprox. 34°C), reduziu-se a
pressão até o extracto estar seco). Este extracto sólido foi sucessivamente dissolvido em solução
diclorometano:metanol (1:1), decantado para um novo recipiente, dissolvido em metanol e decantado
ara o mesmo recipiente e de novo dissolvido em metanol e transferido para o recipiente referido. De
vapor (a temperatura inferior a 37°C, reduziu-se a
nos ao resíduo sólido decorrente
deste processo. Os códigos de identificação dos extractos correspondem aos códigos de identificação
8 | E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
Preparação de neurónios piramidais isolados da região CA1 do hipocampo de rato
Neurónios piramidais foram isolados da região CA1 do hipocampo de ratos wistar do sexo
feminino com idades compreendidas entre os 21 e os 30 dias (P21-30) como descrito anteriormente[7].
Os processos de dissecação cerebral, remoção do hipocampo, dissociação enzimática e mecânica,
usados para a obtenção dos neurónios processaram-se como anteriormente descrito [32].
Registos electrofisiológicos
Os registos das correntes membranares foram realizados por whole-cell voltage-clamp
unicamente em células piramidais isoladas, à temperatura ambiente (20-24°C), usando um
electrómetro (Axon Instruments, Axopatch 200B), um conversor de sinal analógico/digital (Axon
Instruments, DigiData 1200) e devidamente registados utilizando o software Clampex 6.0.3 (Axon
Instruments). Os microelectrodos utilizados foram produzidos por um estirador de pipetas horizontal
(Science Products GmbH, GB150T-8P) a partir de tubos de vidro de borosilicato (Science Products
GMBH). Estes eram enchidos com solução interna (tabela 2), enquanto a solução de perfusão externa
(tabela 2) fluía, por acção da gravidade, a uma taxa de 2-3 mL/min.
O potencial de junção estimado foi de 9.2 mV (os dados apresentados não estão corrigidos
para este valor). Já a capacitância e a resistência em série foram compensadas em 80%, as correntes
foram filtradas a 2kHz e a estudado frequência de amostragem foi de 5 kHz.
Protocolos de voltagem
Aguardou-se o tempo necessário para o registo estabilizar antes de as experiências serem
realizadas (monitorizando-se a taxa de run-down e qualidade do selo – resistência em série e holding
current), sendo que o holding potential foi mantido a -60mV.
O efeito dos extractos e perfusão nas correntes foi com correntes evocadas por um pulso
despolarizante, de +40mV, com duração de 1,3 segundos. Este pulso era precedido de um
pré-pulso hiperpolarizante (-120mV, 100ms) que pretendia remover a inactivação de canais,
particularmente os subjacentes à componente da corrente rápida (tipo A-D, segundo algumas
publicações mais antigas). Este protocolo era repetido a cada 30s.
Para o estudo da dependência de voltagem da activação, uma série de pulsos na gama de -80 a
+40mV (em passos de 10mV), com duração 1040ms e em intervalos de 5s, foi aplicada. Esta série de
‘pulsos-comando’ era precedida por outra série, de -65 a -39mV em passos de 2mV (duração 160
ms). Estes pré-pulsos tinham por finalidade estimar a corrente de fuga presente [18].
9 | E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
Os extractos de esponja foram ressuspendidos numa solução de metanol, formando a solução
stock. A aplicação dos extractos passou por uma diluição desta solução stock em solução externa, e
foram consequentemente administrados em perfusão constante.
Tabela 2. Composição das soluções utilizadas na preparação de neurónios piramidais da região CA1 do hipocampo de
rato e durante os registos electrofisiológicos.
Análise de dados e tratamento estatístico
Utilizaram-se os softwares Clampfit 9.0.1.07 (Axon Instruments) e OriginPro 8.1.34.90
(OriginLab Corporation) para a análise dos dados.
Para cada experiencia, procedeu-se ao ajuste (fit) de uma ou mais funções exponenciais ao
registo da fase de inactivação da corrente de K+, de acordo com a seguinte equação:
�� = � ����/�� + ��
���
onde τi e ai são, respectivamente, a constante de tempo e o coeficiente de amplitude da exponencial
correspondente, c é uma constante (da componente constante e da corrente de fuga) e m é o número
de exponenciais que descrevem a queda da corrente de K+.
O caso foi mais comum foi aquele em que m=2, sendo o decaimento da corrente descrito por
duas componentes, uma rápida (Ifast) e uma lenta (Islow) (fig. 2).
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Figura 2. Componentes da corrente de K+ dependente de voltagem em neurónios pirâmidais da região CA1 do hipocampo
de rato. A cinzento estão assinaladas as duas funções exponencias que descrevem a corrente, sendo bastante notória a sua
divergência e portanto a diferença entre as duas componentes da corrente. O protocolo de voltagem utilizado para evocar
a corrente encontra-se ilustrado no canto superior direito. Figura adaptada de Vicente, et al., 2010 [32].
As amplitudes das duas componentes foram medidas no pico (Ifast) e a 5xτfast (Islow), e a esses
valores foi subtraída a corrente de fuga (leak current), extrapolada a partir de uma regressão linear
ajustada aos valores de corrente obtidos por incrementemos de 1mV ao holding potential (sem que o
potencial de acção seja accionado).
Os valores de corrente resultantes foram convertidos em condutâncias através de:
� = � (�� − ��)⁄
onde Vm é a voltagem do pulso, EK o potencial de equilíbrio de K+ calculado pela equação de Nernst
(EK=-82mV). Posteriormente os valores de condutância foram normalizados para a sua resposta
máxima (G/Gmáx), o que nos permitiu construir o gráfico de G/Gmáx em função do potencial do pulso
(V) e descrever o comportamento por uma função de Boltzman:
� ��á�⁄ = �� − ��1 + �( ! "⁄ #) $⁄ + ��
onde Vm é o potencial do pulso, V1/2 é o potencial de meia-activação, VS é a constante de declive e A1
e A2 são as amplitudes mínima e máxima da curva, respectivamente.
A comparação dos resultados antes e depois da adição do extracto de esponja foi conseguida
por subtracção das correntes registadas nessas condições, considerando-se a corrente antes da adição
do produto o controlo.
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Resultados obtidos de acordo com os objectivos propostos
1. Obtenção de extractos de Erylus discophorus
Numa primeira fase deste trabalho procedeu-se à extracção não diferencial do conteúdo de 18
amostras de esponja Erylus discophorus, de acordo com o procedimento apresentado em
“Metodologia Aplicada”. Os resultados obtidos estão apresentados na tabela 2.
Tabela 2. Massas e rendimentos decorrentes da extracção não diferencial do conteúdo de amostras de Erylus discophorus.
“n.d.” significa não determinado.
Código de identificação
Massa esponja
fresca (g)
Massa esponja
liofilizada (g)
Rendimento liofilização
Massa pesada para
extracção (g)
Massa extracto final (g)
Rendimento extracção
AZ12/06/02 n.d. 78.02 n.d. 1.00 0.15 15% B05.09.99 52.33 12.03 23% 1.00 0.23 23%
B133 n.d. 8.87 n.d. 1.00 0.14 14% B135 n.d. 6.91 n.d. 1.00 0.18 18% B170 180.43 32.50 18% 1.01 0.13 13% B172 n.d. 64.30 n.d. 0.99 0.14 14% B206 158.72 36.02 23% 0.99 0.08 8% B24 120.92 n.d. n.d. 1.00 0.11 11%
B282 88.41 18.23 21% 1.01 0.10 10% B309 n.d. 10.33 n.d. 1.00 0.1119 11% B311 90.50 16.67 18% 1.00 0.16 16% B320 n.d. 33.93 n.d. 1.01 0.15 15% B329 n.d. 54.68 n.d. 1.02 0.09 9% B348 264.71 55.95 21% 1.00 0.12 12% B351 n.d. 51.04 n.d. 1.01 0.11 11% B437 141.86 32.17 23% 0.99 0.13 13% Fe06 n.d. 4.52 n.d. 1.01 0.1885 19%
G06.01 n.d. 42.14 n.d. 1.01 0.13 13%
Apesar dos rendimentos de extracção obtidos não serem ideais, são comparáveis aos valores
obtidos anteriormente [8]. A amostra para a qual o método de extracção foi mais rentável foi a
B05.09.99. Não foi possível fazer uma comparação do conteúdo extraído face à localização
geográfica de origem das amostras devido ao número reduzido de amostras dos Açores, Ferrol e
Banco do Gorringe.
Justifica-se assim a escolha do extracto B05.09.99 para a segunda fase do trabalho.
12 | E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
2. Estudo da actividade neurofarmacológica do
2.1. Estudo do efeito do extracto
A segunda fase do trabalho compreende os estudos electrofisiológicos do efeito do
B05.09.99.
As correntes obtidas caracterizaram
seguida de um decaimento em
tempo (τfast)~70ms), seguida de uma outra mais lenta (
destas correntes é semelhante à descrita
A aplicação do extracto
(fig. 3). No entanto, a inibição referida mostrou ser dependente da concentração usada. A uma baixa
concentração (0,001%), o efeito é mais notório na fase de decaimento de
presente na componente de Islow
subsequente, a qual, apesar de ser descrita pela soma de duas
componente cuja constante de tempo é 57,4
observa-se que, não só é afectada
Finalmente, a uma concentração elevada (0,1%) as duas componentes de corrente são inibidas de
forma equiparável (fig. 3c). Todavia, não se observaram diferenças significativas nas constantes de
tempo de Ifast e Islow das correntes sensíveis às três concentrações usada, aplicadas em 14
células/registos. A cinética das correntes sensíveis a
às componentes Ifast e Islow de 60,2±7,5
Figura 3. Efeito de concentrações crescente de extrato de
de neurónios piramidais isolados da região CA1 do hipocampo de ratos
pulso despolarizante de +40mV com duração 1040ms, precedido de um pré
O protocolo de voltagem está respresentado no canto
E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
Estudo da actividade neurofarmacológica do extracto de Erylus B05.09.99
extracto ao nível das correntes de potássio (K+) em neurónios do hipocampo
A segunda fase do trabalho compreende os estudos electrofisiológicos do efeito do
As correntes obtidas caracterizaram-se por uma activação rápida da corrente de potássio (K
seguida de um decaimento em duas fases claramente observáveis: uma rápida (
)~70ms), seguida de uma outra mais lenta (Islow – τslow~ 1015ms) (fig. 3). A natureza
destas correntes é semelhante à descrita anteriormente [32] [18].
o de Erylus traduziu-se numa redução da corrente total
(fig. 3). No entanto, a inibição referida mostrou ser dependente da concentração usada. A uma baixa
concentração (0,001%), o efeito é mais notório na fase de decaimento de I
slow; esta observação é corroborada pela análise da c
a qual, apesar de ser descrita pela soma de duas exponenciais
cuja constante de tempo é 57,4 ms (fig. 3a). A uma concentração intermédia (0,01%),
é afectada a componente rápida, como também a componente lenta (fig. 3b).
Finalmente, a uma concentração elevada (0,1%) as duas componentes de corrente são inibidas de
3c). Todavia, não se observaram diferenças significativas nas constantes de
das correntes sensíveis às três concentrações usada, aplicadas em 14
células/registos. A cinética das correntes sensíveis a Erylus exibiu constantes
de 60,2±7,5 ms e 1204,0±146,3 ms, respectivamente.
Figura 3. Efeito de concentrações crescente de extrato de Erylus na corrente de K+: registos de whole
dos da região CA1 do hipocampo de ratos wistar (P21-30). As correntes foram evocas por um
pulso despolarizante de +40mV com duração 1040ms, precedido de um pré-pulso a -120mV (
O protocolo de voltagem está respresentado no canto superior direito. São apresentadas as correntes obtidas antes e
E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
) em neurónios do hipocampo
A segunda fase do trabalho compreende os estudos electrofisiológicos do efeito do extracto
se por uma activação rápida da corrente de potássio (K+),
duas fases claramente observáveis: uma rápida (Ifast – constante de
~ 1015ms) (fig. 3). A natureza
se numa redução da corrente total whole-cell.
(fig. 3). No entanto, a inibição referida mostrou ser dependente da concentração usada. A uma baixa
Ifast e está pouco ou nada
; esta observação é corroborada pela análise da corrente subtraída
exponenciais, é dominada pela
(fig. 3a). A uma concentração intermédia (0,01%),
a componente rápida, como também a componente lenta (fig. 3b).
Finalmente, a uma concentração elevada (0,1%) as duas componentes de corrente são inibidas de
3c). Todavia, não se observaram diferenças significativas nas constantes de
das correntes sensíveis às três concentrações usada, aplicadas em 14
exibiu constantes de tempo (τ) relativas
e 1204,0±146,3 ms, respectivamente.
: registos de whole-cell voltage-clamp
). As correntes foram evocas por um
120mV (holding potential: -60mV).
superior direito. São apresentadas as correntes obtidas antes e
13 | E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
depois da adição de extrato de Erylus
(b) extrato de Erylus 0,001%, (c) extrato de
exponenciais.
Numa análise generalista, o efeito da inibição é tanto maior quanto maior a concentração do
extrato usada. No entanto, o efeito da concentração torna
onde se agrupam resultados provenientes de experiências identicas às apresentadas na figura 3
efeito das três concentrações de
Observa-se que para ambas (
relevante é notar que, à menor concentração usada (0,001%), apenas um efeito robusto é observável
em Ifast (a percentagem de inibição de
uma concentração moderada (0,0
componentes. Finalmente, à concentração mais elevada (0,1%), a tendência é inclusivamente inversa,
na medida em que ao efeito em
Estes resultados (fig. 3,
com especificidade díspar para uma e outra componente da corrente. De facto, a componente rápida é
bastante mais sensível ao extrato que a componente lenta.
Uma vez que é conhecido o efeito neurotóxico do metanol, solvente do composto usado,
investigou-se se algum dos efeitos observados seria a si atribuível. Assim, adicionou
neurónios sob registo, a concentração dez vezes mais elevada que aquela usada aquando d
concentração máxima de extracto
whole-cell para ambas as componentes (n=3).
E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
Erylus e a respectiva subtracção a três concentrações: (a) extrato de
0,001%, (c) extrato de Erylus 0,01%. A encarnado representa-
Numa análise generalista, o efeito da inibição é tanto maior quanto maior a concentração do
extrato usada. No entanto, o efeito da concentração torna-se mais evidente pela análise da figura 4,
agrupam resultados provenientes de experiências identicas às apresentadas na figura 3
efeito das três concentrações de Erylus é dissecado na decorrente inibição de cada componente.
se que para ambas (Ifast e Islow), a inibição aumenta com a co
relevante é notar que, à menor concentração usada (0,001%), apenas um efeito robusto é observável
(a percentagem de inibição de Islow é quase vestigial, sendo inferior a 5%). Tal não acontece a
uma concentração moderada (0,01%), em que, em termos relativos, o efeito é idêntico para as duas
componentes. Finalmente, à concentração mais elevada (0,1%), a tendência é inclusivamente inversa,
na medida em que ao efeito em Islow ganha expressão.
Figura 4. Relação dose-
do extrato de Erylus
corrente de K+ (Ifast
expresso em % de inbição (ver
aplicada”). “n” é o tamanho da amostra e as barras de
desvio, o erro padrão.
fig. 4) sugerem a existência de, pelo menos, dois principios activos,
com especificidade díspar para uma e outra componente da corrente. De facto, a componente rápida é
bastante mais sensível ao extrato que a componente lenta.
onhecido o efeito neurotóxico do metanol, solvente do composto usado,
se se algum dos efeitos observados seria a si atribuível. Assim, adicionou
neurónios sob registo, a concentração dez vezes mais elevada que aquela usada aquando d
extracto de Erylus. A figura ‘5’ demonstra a ausência de efeito na corrente
para ambas as componentes (n=3).
E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
respectiva subtracção a três concentrações: (a) extrato de Erylus 0,001% (m/v),
-se o ajuste de duas funções
Numa análise generalista, o efeito da inibição é tanto maior quanto maior a concentração do
se mais evidente pela análise da figura 4,
agrupam resultados provenientes de experiências identicas às apresentadas na figura 3 – o
é dissecado na decorrente inibição de cada componente.
), a inibição aumenta com a concentração. Igualmente
relevante é notar que, à menor concentração usada (0,001%), apenas um efeito robusto é observável
é quase vestigial, sendo inferior a 5%). Tal não acontece a
1%), em que, em termos relativos, o efeito é idêntico para as duas
componentes. Finalmente, à concentração mais elevada (0,1%), a tendência é inclusivamente inversa,
-resposta dos efeitos inbitórios
nas duas componentes da
e Islow). O efito inbitório é
expresso em % de inbição (ver “Metodologia
). “n” é o tamanho da amostra e as barras de
fig. 4) sugerem a existência de, pelo menos, dois principios activos,
com especificidade díspar para uma e outra componente da corrente. De facto, a componente rápida é
onhecido o efeito neurotóxico do metanol, solvente do composto usado,
se se algum dos efeitos observados seria a si atribuível. Assim, adicionou-se metanol a
neurónios sob registo, a concentração dez vezes mais elevada que aquela usada aquando da adição da
. A figura ‘5’ demonstra a ausência de efeito na corrente
14 | E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
2.2. Estudo do efeito do extracto
Por fim, pretendeu-se indagar o modo de acção inerente à referida inibição. Assim, aplicaram
-se protocolos de voltagem que visam determinar a de
(fig. 6). A figura 6a mostra as correntes evocadas por pulsos despolarizantes de amplitude
incremental (ver “Metodologia aplicada”
0.01%. Os perfis de voltagem obtidos, tanto para
Para ambas componentes, observou
correspondentes. Concretamente, para
Uma vez que existe uma tendência para um
ao longo de registos similares, artefacto inerente ao método aplicado
provocado pelo extracto de esponja esteja aqui a se
demonstram que, pelo menos em parte, o efeito inibitório do
voltagem. Isto é, na presença do
corrente de igual amplitude.
Na figura ‘1c’, os sinais resultantes da subtracção das correntes em ‘a’ mostram, tal como
anteriormente, que Erylus, à concentração de 0,01% inibe ambas componentes da corrente total de
potássio. Os perfis de voltagem correspondentes a
-17,6 mV e -20,5 mV, respectivamente.
Finalmente, visitando a relevância biológica destes resultados, é coerente prever que o(s)
composto(s) activo(s) actue(m) na estrutura do canal alvo através de
de aminoácidos relativa ao sensor de voltagem do canal.
E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
Figura 5. Efeito do solvente da solução stock do
extrato de Erylus na corrente de K
foram evocas por um pulso despolarizante de
+40mV com duração 1040ms, precedido de um
pré-pulso a -120mV (
protocolo de voltagem está respresentado no canto
superior direito. O efeito não é relevante
pode observar pela subtracção das correntes.
extracto de Erylus na dependência da corrente à voltagem
se indagar o modo de acção inerente à referida inibição. Assim, aplicaram
se protocolos de voltagem que visam determinar a dependência de Ifast e Islow
(fig. 6). A figura 6a mostra as correntes evocadas por pulsos despolarizantes de amplitude
“Metodologia aplicada”) antes e depois do tratamento com
tagem obtidos, tanto para Ifast como para Islow são apresentados na figura 6b.
Para ambas componentes, observou-se um shift despolarizante nos perfis de voltagem
correspondentes. Concretamente, para Ifast obteve-se um shift de +9,7 mV e para
Uma vez que existe uma tendência para um shift gradual hiperpolarizante destes perfis de voltagem
ao longo de registos similares, artefacto inerente ao método aplicado [32], é de esperar que o desvio
de esponja esteja aqui a ser subestimado. Os resultados presentes em ‘6a
demonstram que, pelo menos em parte, o efeito inibitório do extracto é resultado do desvio de
voltagem. Isto é, na presença do extracto, uma despolarização maior é necessária para se induzir uma
Na figura ‘1c’, os sinais resultantes da subtracção das correntes em ‘a’ mostram, tal como
, à concentração de 0,01% inibe ambas componentes da corrente total de
potássio. Os perfis de voltagem correspondentes a Ifast e Islow (fig. 1d) mostram de valores de V
20,5 mV, respectivamente.
Finalmente, visitando a relevância biológica destes resultados, é coerente prever que o(s)
composto(s) activo(s) actue(m) na estrutura do canal alvo através de uma modificação da sequência
de aminoácidos relativa ao sensor de voltagem do canal.
E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
Figura 5. Efeito do solvente da solução stock do
na corrente de K+. As correntes
foram evocas por um pulso despolarizante de
+40mV com duração 1040ms, precedido de um
120mV (holding potential: -60mV). O
protocolo de voltagem está respresentado no canto
reito. O efeito não é relevante, como se
subtracção das correntes.
de Erylus na dependência da corrente à voltagem
se indagar o modo de acção inerente à referida inibição. Assim, aplicaram-
slow em relação à voltagem
(fig. 6). A figura 6a mostra as correntes evocadas por pulsos despolarizantes de amplitude
) antes e depois do tratamento com extracto de Erylus
são apresentados na figura 6b.
despolarizante nos perfis de voltagem
de +9,7 mV e para Islow de +23,3 mV.
gradual hiperpolarizante destes perfis de voltagem
, é de esperar que o desvio
r subestimado. Os resultados presentes em ‘6a-b’
é resultado do desvio de
, uma despolarização maior é necessária para se induzir uma
Na figura ‘1c’, os sinais resultantes da subtracção das correntes em ‘a’ mostram, tal como
, à concentração de 0,01% inibe ambas componentes da corrente total de
(fig. 1d) mostram de valores de V1/2 de
Finalmente, visitando a relevância biológica destes resultados, é coerente prever que o(s)
uma modificação da sequência
15 | E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
Figura 6. Efeito do extrato de Erylus
em passos de 10m, com duração 1040ms
de voltagem ilustrado no topo de ‘a’. (a) Correntes correspondentes antes e depois da adição de extrato de
(0.01%). (b) Relações condutância normalizada(G/Gmax)
‘a’, para antes e depois da adição do extrato de
uma função de Boltzman cujos valores de V
depois da aplicação do estrato. Observam
e Islow. (c) Subtracção das correntes revelando as correntes sensiveis ao extrato. (d) Dependência de voltage
das componentes Ifast e Islow das correntes subtraídas representadas em ‘c’.
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em correntes de K+ evocas por uma série de pulsos despolarizantes (
, com duração 1040ms), precedidos por um pré-pulso a -120mV (holding potential
de voltagem ilustrado no topo de ‘a’. (a) Correntes correspondentes antes e depois da adição de extrato de
(0.01%). (b) Relações condutância normalizada(G/Gmax) vs voltagem das componentes Ifast
‘a’, para antes e depois da adição do extrato de Erylus 0.01%. A dispersão dos valores foi ajustada adequadamente por
uma função de Boltzman cujos valores de V1/2 (ver métodos), referentes a Ifast e I slow são
depois da aplicação do estrato. Observam-se desvios despolarizantes dos respectivos perfis
(c) Subtracção das correntes revelando as correntes sensiveis ao extrato. (d) Dependência de voltage
das correntes subtraídas representadas em ‘c’.
E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
despolarizantes (-80 a +50mV,
holding potential: -60mV)- protocolo
de voltagem ilustrado no topo de ‘a’. (a) Correntes correspondentes antes e depois da adição de extrato de Erylus
fast e Islow calculadas apartir de
0.01%. A dispersão dos valores foi ajustada adequadamente por
e I slow são apresentados para antes e
de voltagem para ambas, Ifast
(c) Subtracção das correntes revelando as correntes sensiveis ao extrato. (d) Dependência de voltagem de activação
16 | E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
2.3. Identificação das subunidades do(s) canal(ais) de potássio adjacente(s) à componente mais
sensível ao extracto
Na tentativa de identificar candidatos para o correlato molecular das subunidades no canal
associado a Ifast (componente mais sensível ao extracto) recorre-se aqui a uma avaliação comparativa
dos resultados. Por um lado, a taxa de decaimento de Ifast (τfast = 60,2±7,5 ms) enquadra-se na ordem
de grandeza dos valores publicados para Kv1.4, Kv4.1 e Kv4.3 [6]. Por outro lado, as curvas de
activação dependentes da voltagem da corrente sensível ao extracto de Erylus (V1/2~ -25 mV, valor
corrigido com o potencial de junção, ver “Metodologia aplicada”) sugerem o envolvimento de canais
do tipo Kv1.1, Kv1.3, Kv 1.4, Kv1.6, Kv1.7 e Kv2.2 [6]. Assim, e confrontando estas duas
abordagens, sugere-se aqui que a componente mais sensível ao extracto de Erylus (Ifast) é mediada
por um canal que contém subunidades α do tipo Kv1.4.
Este resultado é particularmente relevante dado que não existe conhecimento de qualquer
agente farmacológico cujo alvo seja especificamente o canal Kv1.4. Acrescenta-se o facto de o canal
referido ser o único Kv detectável nos “neurónios da dor”, os neurónios de menor diâmetro do
gânglio da raiz dorsal [21]. Concluindo, trata-se de um canal de importância reconhecida no estudo da
fisiologia da dor e constitui um alvo primordial na indústria associada.
Execução financeira de acordo com o plano orçamental
previsto
O projecto executou-se dentro do orçamento programado. Detalhando, as despesas
repartiram-se em reagentes (€420), eléctrodos e acessórios de electrofisiologia (€330), material
diverso de laboratório (€340), material de papelaria (€23) e outros (€150), totalizando €1263.
17 | E s t u d o d e e x t r a c t o s d e u m a e s p o n j a m a r i n h a c o m a c t i v i d a d e n e u r o b i o l ó g i c a | C l a r a C u n h a M a t o s P a t r í c i o | B o l s a U L / F A D
Conclusões
De acordo com os resultados apresentados no presente relatório, conclui-se que:
• O método de extracção não diferencial aplicado às dezoito amostras de esponja Erylus mostrou
rendimentos adequados em relação ao anteriormente publicado;
• O extracto de Erylus eleito induz uma diminuição da corrente total whole-cell dependente da
concentração usada;
• A corrente de potássio sensível ao extracto caracterizava-se por um decaimento em duas fases:
uma rápida (Ifast: τfast=60,2±7,5 ms) e outra mais lenta (Islow: τfast=1204,0±146,3 ms);
• A diminuição de Ifast, assim como a de Islow, é tanto maior quanto maior a concentração de
extracto. No entanto, Ifast é claramente mais sensível;
• Sugere-se a existência de dois princípios activos com acção em correntes de potássio, o que
sublinha a relevância de, numa perspectiva futura, fraccionar e caracterizar quimicamente o
extracto bruto;
• Ao evocar um shift despolarizante nos perfis de voltagem (correntes sensíveis ao extracto: Ifast -
V1/2=-17,6 mV e Islow - V1/2=-20,5 mV), o extracto está provavelmente a alterar a conformação
do sensor de voltagem do canal alvo;
• Por fim, integrando os resultados, pode-se apontar o canal Kv1.4 como aquele sensível ao
extracto de Erylus. Este canal tem uma grande relevância para a patologia da dor, não havendo
agente farmacológico específico conhecido. Abrem-se assim perspectivas para investigações
futuras no intuito de se identificarem os compostos activos e estes serem potencialmente usados na
indústria farmacológica.
Como bolseira da Universidade de Lisboa/Fundação Amadeu Dias, esta oportunidade
permitiu integrar-me no meio de investigação científica, ao mesmo tempo que me desafiava a
estender os meus conhecimentos a várias áreas da bioquímica e neurociências. O apoio do tutor, Dr.
Pedro Lima, tal como da Dra. Madalena Humanes, e de distintos professores e colegas foi fulcral ao
longo do trabalho.
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Agradecimentos
Agradeço ao tutor, Doutor Pedro Lima, pelo incansável esforço de me dar a conhecer uma
realidade em tudo nova para mim, o mundo das neurociências, e de me dar as ferramentas necessárias
para aí me mover. À Doutora Madalena Humanes, pela disponibilidade, apoio e simpatia que desde o
início teve para comigo – devo-lhe a oportunidade de me lançar neste projecto. À Doutora Helena
Gaspar, pelo suporte que me deu na “fase química” do projecto e por me ensinar a estar num
laboratório de química. Ao Miguel Mondragão, pela constante presença e ajuda ao longo da “fase de
electrofisiologia” do projecto e pela franqueza com que sempre me transmitiu os conhecimentos por
ele adquiridos. E por fim, aos restantes professores que me ajudaram pontualmente, aos colegas de
laboratório que me puseram à vontade neste meio e à família e amigos que fizeram os mais sinceros
esforços para entender porque é que eu achava tão entusiasmante misturar esponjas com neurónios.
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