bq - frcftm.ru · 7 fhgblhjbg] ijhp_kkz lh _klv lj_[mxlky fzjd_ju dhlhju_ iha\hebeb [u gz^_`gh b...

$: bq - frcftm.ru · 7 fhgblhjbg] ijhp_kkZ Lh _klv lj_[mxlky fZjd_ju dhlhju_ iha\hebeb [u gZ^_`gh b h^ghagZqgh ^_l_dlbjh\Zlv himohe_\uc ijhp_kk gZ ^hdeb gbq_kdbo klZ^byo (ijb$
ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Лехнов Евгений Анатольевич

МикроРНК мочи как маркеры неинвазивной диагностики рака предстательной

железы

03.01.04 – биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

к.б.н. Лактионов П.П.

Новосибирск– 2019

2

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................ 5

ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................................... 6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................. 12

1.1. Рак предстательной железы, существующие методы диагностики и их характеристика

....................................................................................................................................................... 12

1.2. Современные методы диагностики РПЖ в клинической практике ................................ 14

1.3. Молекулярная диагностика РПЖ ....................................................................................... 17

1.4. Дополнительные тесты на основе ПСА ............................................................................. 20

1.5. Маркеры мочи ....................................................................................................................... 21

1.5.1. РНК-маркеры в диагностике РПЖ .................................................................................. 21

1.5.2. Определение паттернов метилирования ДНК у больных раком предстательной

железы ........................................................................................................................................... 23 1.5.3. Детекция онкоспецифических ферментов при РПЖ ..................................................... 25

1.5.4. Определение онкоспецифических метаболитов в моче ................................................ 26

1.6. МикроРНК мочи при раке предстательной железы .......................................................... 27

1.6.1. Использование осадка клеток мочи в качестве источника диагностических

микроРНК ..................................................................................................................................... 28 1.6.2. Использование бесклеточного супернатанта мочи в качестве источника

диагностических микроРНК ....................................................................................................... 30 1.6.3. Использование внеклеточных везикул мочи в качестве источника

диагностических микроРНК ....................................................................................................... 31

1.7 Технические затруднения, возникающие при стандартизации анализа внеклеточных

микроРНК ..................................................................................................................................... 33

1.8 Выделение микроРНК из биологических жидкостей ........................................................ 34

1.9 Внеклеточные везикулы ....................................................................................................... 36 1.9.1. Выделение внеклеточных везикул ................................................................................... 38 1.9.2. Методы, применяемые для выделения внеклеточных везикул из мочи ...................... 42 1.9.3. Проблема контаминации выделенных из мочи препаратов внеклеточных везикул .. 46

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................... 49

2.1. Материалы ............................................................................................................................. 49 2.1.1. Реактивы ............................................................................................................................. 49 2.1.2. Оборудование .................................................................................................................... 49

3

2.1.3. Клинические характеристики здоровых доноров, больных ДГПЖ и больных РПЖ . 50

2.2. Методы .................................................................................................................................. 52 2.2.1. Забор образцов крови ........................................................................................................ 52 2.2.2. Обработка образцов крови и мочи ................................................................................... 52 2.2.3. Ультрацентрифугирование ............................................................................................... 52 2.2.4. Протокол выделения внеклеточных везикул из мочи ................................................... 53

2.2.5. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) ..................................................... 53 2.2.6. Протокол выделения микроРНК из плазмы крови с октановой кислотой .................. 54 2.2.7. Протокол выделения микроРНК из мочи с октановой кислотой ................................. 55 2.2.8. Кислая экстракция фенол-хлороформом микроРНК из плазмы крови и мочи ........... 55 2.2.9. Выделение микроРНК из биологических жидкостей с помощью Exiqon miRCURY

biofluids kit (Exiqon, Дания) ........................................................................................................ 55

2.2.10. Протокол выделения микроРНК из внеклеточных везикул мочи с октановой

кислотой ....................................................................................................................................... 56

2.2.11. Осаждение микроРНК изопропанолом ......................................................................... 56 2.2.12. Анализ нуклеиновых кислот плазмы крови и мочи ..................................................... 56 2.2.13. Обратная транскрипция и количественная полимеразная цепная реакция ............... 57 2.2.14. Электрофорез в денатурирующих условиях по Леммли и Вестерн-блот .................. 57 2.2.15. Профилирование микроРНК во фракциях бесклеточного супернатанта мочи после

центрифугирования при 17 тыс. g и внеклеточных везикул мочи с использованием

платформы miRCURY LNA miRNA qPCR Panels Urine (Exiqon, Дания) .............................. 58 2.2.16. Статистический анализ профиля экспрессии микроРНК во фракциях бесклеточного

супернатанта мочи после центрифугирования при 17 тыс. g и ВВ мочи здоровых доноров,

пациентов с ДГПЖ и больных РПЖ .......................................................................................... 58

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .......................................................................... 60

3.1. Разработка метода выделения внеклеточных везикул из мочи ....................................... 60

3.2. Описание внеклеточных везикул мочи здоровых доноров и больных раком

предстательной железы ............................................................................................................... 62

3.3. Выбор оптимальных условий выделения микроРНК из плазмы крови и мочи здоровых

доноров ......................................................................................................................................... 64

3.4. Сравнение эффективности выделения микроРНК из биологических жидкостей при

помощи протокола с октановой кислотой, фенол-хлороформной экстракции и Exiqon

miRCURY biofluids kit (Exiqon, Дания) ..................................................................................... 71

3.5. Анализ белкового состава супернатантов плазмы крови после добавления реагентов

Gu / OcA и miRCURY biofluids kit методом SDS-PAGE ......................................................... 73

3.6. Сравнительный анализ профиля экспрессии микроРНК во фракции супернатанта мочи

и фракции внеклеточных везикул мочи здоровых доноров, пациентов с

доброкачественной гиперплазией предстательной железы и больных раком


3.7. Анализ представленности микроРНК различных фракций мочи больных раком


3.8. Биоинформационный анализ профиля экспрессии микроРНК обеих фракций мочи

больных РПЖ при помощи баз данных OncomiRDB и DIANA-TarBase ............................... 82

4

3.9. Определение диагностически значимых пар микроРНК.................................................. 84

3.10. Алгоритм анализа данных для разработки диагностических систем ............................ 88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................................ 97

ВЫВОДЫ ..................................................................................................................................... 99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................................... 100

5

Список сокращений

РПЖ - рак предстательной железы

ДГПЖ - доброкачественная гиперплазия предстательной железы

ПСА - простатспецифический антиген

ВВ - внеклеточные везикулы

ПЖ - предстательная железа

ЗД - здоровые доноры

ПРИ - пальцевое ректальное исследование

ТРУЗИ - трансректальное ультразвуковое исследование

КТ - компьютерная томография

МРТ - магнитно-резонансная томография

ПЭТ - позитронно-эмиссионная томография

мпМРТ - мультипараметрическая магнитно-резонансная томография

МВ - микровезикулы

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ОТ - обратная транскрипция

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

Gu - гуанидин изотиоцианат

OcA - октановая кислота

6

Введение

Актуальность

К середине 90-х годов в связи с увеличением средней продолжительности жизни и

снижением смертности населения от других конкурирующих причин, рак предстательной

железы (РПЖ) во многих странах мира стал выходить в лидеры по встречаемости

злокачественных новообразований у мужчин. Так, в России РПЖ в структуре

онкологических заболеваний в 2015 г. переместился с 4 на 2 место и составил уже 14% от

всех злокачественных новообразований, встречающихся у мужчин [1].

РПЖ, в целом, имеет тенденцию к росту заболеваемости во всем мире и находится на

втором месте среди всех онкологических заболеваний у мужчин. В развитых странах

(США), согласно American Cancer Society 2017, показатель 5-летней выживаемости

больных с локальными формами РПЖ составляет почти 100%, однако при

распространенных формах этот показатель снижается до 29% [2].

Причинами поздней диагностики РПЖ являются длительное бессимптомное течение

заболевания, несовершенство методов первичной диагностики РПЖ, в том числе

асимптомных микроскопических очагов, сложность дифференциальной диагностики

очагов РПЖ и очагов доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ),

несвоевременное оказание медицинской помощи (в том числе и по причине

недостаточного уровня образованности населения или по экономическим причинам),

недостаточное техническое оснащение медицинских учреждений, а также несовершенство

клинико-инструментальной базы. Эффективность диагностики РПЖ в развитых странах

выше, чем в развивающихся, в связи с этим, смертность от РПЖ в развитых странах ниже,

чем в развивающихся [3].

Несмотря на то, что на сегодняшний день разработаны различные тесты для

диагностики и прогноза РПЖ, широкое их внедрение в клиническую практику ограничено

в виду недостаточности их предикторной способности, инвазивности процедуры или

вследствие дороговизны теста. Кроме того, такие клинические параметры, как

простатспецифический антиген (ПСА), методы визуальной (лучевой) диагностики и

гистопатологичсеский индекс Глисона определяют риски РПЖ, но не позволяют оценить

прогноз на индивидуальном уровне у конкретного пациента, что в дальнейшем отражается

на качестве лечения [4]. Таким образом, в онкоурологии существует острая

необходимость в эффективных маркерах РПЖ для решения различных клинических задач,

включая эффективную диагностику ранних стадий РПЖ, оптимизацию терапии и

7

мониторинг процесса. То есть требуются маркеры, которые позволили бы надежно и

однозначно детектировать опухолевый процесс на доклинических стадиях (при

отсутствии клинических проявлений), достоверно дифференцировать очаги РПЖ от

других объемных образований предстательной железы (ПЖ), а также контролировать

эффективность процесса лечения.

Так называемая ―жидкая биопсия‖ является новым подходом, основанным на

исследовании внеклеточных нуклеиновых кислот, включая ДНК и РНК, в биологических

жидкостях человека, таких, как кровь или моча [5]. В крови и других биологических

жидкостях обнаружены ассоциированные с опухолями микроРНК, которые являются

наиболее представленным классом внеклеточных РНК биологических жидкостей. Эти

молекулы отличаются высокой стабильностью во внеклеточных средах, которая

обеспечивается их способностью формировать комплексы с белками, липопротеинами

или упаковываться во внеклеточные везикулы. Известно, что некодирующие РНК

(включая и микроРНК) составляют более половины транскриптома и более 80%

циркулирующих РНК [6], что позволяет уверенно детектировать эти молекулы

современными методами анализа и делает их удобными диагностическими мишенями.

Более того, микроРНК играют важную роль в регуляции процессов метаболизма,

эмбрионального развития, пролиферации, дифференцировки, старения, участвуют в

иммунном и стрессовом ответах, геномном импринтинге, а также непосредственно

участвуют в регуляции основных путей сигнальной трансдукции и могут выступать в

качестве драйверов развития онкологического процесса [6]. Известно, что

злокачественная трансформация клеток и прогрессия онкологического процесса связаны с

изменением профиля экспрессии микроРНК по сравнению с нормальными клетками.

Иначе говоря, уровень экспрессии отдельных микроРНК может либо повышаться, либо

снижаться. Поэтому анализ и выявление гипо- или гиперэкспрессированных микроРНК

является перспективным не только для ранней диагностики РПЖ, а также для

дифференциальной диагностики объемных образований предстательной железы и

выявлением злокачественных и агрессивных форм [4].

МикроРНК, ассоциированные с разными гистотипами опухолей или стадиями

заболевания, могут выступать в роли молекулярных биомаркеров и могут быть

использованы для диагностики и прогноза течения заболевания, а также являться

потенциальными терапевтическими мишенями [7].

Интерес к циркулирующим микроРНК как потенциальным биомаркерам для целей

ранней диагностики заболеваний человека постоянно растѐт. По данным базы данных

медицинских и биологических публикаций Национального центра биотехнологической

8

информации США (NCBI) Pub Med наблюдается стойкий рост числа публикаций по теме

внеклеточных микроРНК при РПЖ. При этом в последнее время стало очевидно, что

поиск одного-двух микроРНК-маркеров РПЖ не позволит решить хотя бы часть

диагностических задач в силу гетерогенности заболевания и сопутствующих процессов, и

такая задача может быть решена только при помощи использования панели микроРНК-

маркеров [8].

Кроме того, решение некоторых методологических проблем, в частности

эффективного и производительного выделения микроРНК из комплексов с

биополимерами внеклеточных сред, выявление оптимальных источников диагностических

микроРНК (упакованных в комплексы с биополимерами или в внеклеточные везикулы)

так же ждет своего решения.

В связи с этим поиск микроРНК, связанных с развитием РПЖ, анализ их

представленности у больных с разной клинической манифестацией РПЖ представляет

большой научный и практический интерес, поскольку не только позволит получить новые

данные о развитии процессов канцерогенеза и выявить ключевые регуляторные молекулы

этого процесса, но и обнаружить потенциальные маркеры злокачественных

новообразований ПЖ, которые могут быть использованы для улучшения диагностики и

лечения РПЖ.

Цель исследования

Изучить представленность и концентрации внеклеточных микроРНК в моче здоровых

доноров (ЗД), пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы

(ДГПЖ) и больных раком предстательной железы (РПЖ) для выявления микроРНК,

ассоциированных с развитием рака предстательной железы и разработки диагностических

систем.

Задачи исследования

1. Разработать простой и эффективный метод выделения микроРНК из мочи.

2. Разработать простой метод для выделения внеклеточных везикул мочи, пригодный для

последующего исследования микроРНК, находящихся в составе внеклеточных везикул

мочи.

3. Провести сравнительное исследование профиля экспрессии микроРНК во фракциях

внеклеточных везикул и бесклеточного супернатанта мочи здоровых доноров, пациентов с

9


предстательной железы.

4. Провести поиск микроРНК-предикторов рака предстательной железы при помощи

биоинформационного анализа данных массового исследования экспрессии микроРНК в

исследуемых группах здоровых доноров, пациентов с доброкачественной гиперплазией

предстательной железы и больных раком предстательной железы.

5. Предложить вариант алгоритма анализа данных, позволяющий осуществлять

рациональный отбор микроРНК-маркеров, оценивать диагностические диапазоны их

относительных концентраций и формировать панели маркеров для эффективной

диагностики рака предстательной железы.

Научная новизна работы

Разработан и оптимизирован оригинальный протокол выделения микроРНК из мочи

и плазмы ЗД – аналог miRCURY™ RNA Isolation Kit фирмы Exiqon A/S, Denmark.

Протокол отличается простотой, скоростью исполнения, высокой эффективностью

выделения микроРНК из различных биологических жидкостей организма (кровь, моча) и

отсутствием опасных реагентов по сравнению с традиционными методами выделения и

коммерческим аналогом.

Разработан и оптимизирован протокол выделения ВВ из мочи, не уступающий по

эффективности выделения ВВ золотому стандарту – ультрацентрифугированию, но не

требующий применения дорогостоящего оборудования и превосходящий его по простоте

и скорости выделения.

Во внеклеточных везикулах и бесклеточной фракции мочи исследуемых групп

пациентов одновременно оценены концентрации 84 микроРНК.

Предложены и охарактеризованы по нескольким критериям наилучшие комбинации

микроРНК обеих фракций мочи, позволяющие отличить группы ЗД, больных ДГПЖ и

больных РПЖ между собой, а также определена диагностическая ценность таких пар

микроРНК.

Предложен вариант алгоритма анализа данных, позволяющий осуществлять

рациональный отбор микроРНК-маркеров, оценивать диагностические диапазоны их

относительных концентраций и формировать панели маркеров для эффективной

диагностики РПЖ

10

Теоретическая и практическая значимость

Разработаны высокоэффективные протоколы выделения микроРНК и ВВ из мочи и

охарактеризованы микроРНК различных фракций мочи у ЗД, пациентов с ДГПЖ и

РПЖ. С помощью биоинформационного анализа обнаружены ассоциированные с

развитием РПЖ микроРНК различных фракций мочи, что позволяет расширить знания

о молекулярных осноавах развития РПЖ. Предложена диагностическая система,

основанная на измерении концентраций 24 микроРНК и позволяющая

идентифицировать пациентов с РПЖ, ДГПЖ и ЗД с чувствительностью не менее 90%

и специфичностью 100%, которая может быть использована в практической медицине

для улучшения диагностики РПЖ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Выявлены пары микроРНК во фракциях супернатанта мочи после центрифугирования

при 17 тыс. g и внеклеточных везикул мочи здоровых доноров, пациентов с


предстательной железы, позволяющие отличить три группы доноров между собой с

чувствительностью не менее 90% и специфичностью 100%.

2. Наибольшей диагностической информативностью обладают пары miR-107-miR-26b-5p,

miR-375-3p-miR-26b-5p в группе сравнения здоровые-больные раком предстательной

железы во фракции супернатанта мочи, а также miR-31-5p- miR-16-5p, miR-31-5p-miR-

200b, miR-31-5p-miR-30e-3p и miR-31-5p-miR-660-5p в группе здоровые доноры-

пациенты с доброкачественной гипреплазией предстатательной железы во фракции

внеклеточных везикул мочи.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 6 статей, 2 патента и 14 тезисов.

Результаты работы представлены на 9 конференциях.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и

методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы».

11

Работа изложена на 118 страницах машинописного текста (12 шрифт, интервал 1.5),

содержит 9 рисунков и 17 таблиц. Библиография включает 171 литературный источник.

12

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Рак предстательной железы, существующие методы диагностики и их

характеристика

Рак предстательной железы - по праву считается глобальной социальной проблемой в

виду своей распространенности [9] и социальной значимости во всем мире [10].

Глобально в мире уровень заболеваемости и смертности от РПЖ составил 30.8 и 8,6 на

100 тыс. мужчин соответственно [11]. По выявляемости РПЖ стоит на втором месте и на

пятом месте среди причин смерти после рака легкого, желудка, печени и колоректального

рака по данным 2012 года [12, 13, 14, 15]. В России заболеваемость РПЖ занимает второе

место после рака легкого [16] и составляет 14% от всех злокачественных

новообразований, встречающихся у мужчин. Как и во всем мире, выявляемость РПЖ в

России неуклонно растет, опережая темпы роста выявляемости таких заболеваний, как рак

легкого и рак желудка [17]. Так в структуре заболеваемости мужского населения России

злокачественными новообразованиями РПЖ в 2004 г. составлял 6,9 %, а в 2009 г. – 10.7 %

[16]. Среди больных раком простаты, выявленных в 2015г. На долю локализованного

РПЖ (I-II стадии) пришлось 55.1%, местно-распространенного РПЖ (III стадия) – 27.4%,

метастатического РПЖ (IV стадия) – 15.9%. Пятилетняя выживаемость для случаев с

местным и региональным течением заболевания близка к 100%, а для РПЖ с отдаленными

метастазами – только 34%. Эта статистика и объясняет относительно невысокую

смертность от РПЖ, которая составляет 8%. [18].

Согласно мировой статистике показатели заболеваемости и смертности от РПЖ в

развитых и развивающиеся странах значительно варьируют во всем мире [19].

В зависимости от региона заболеваемость может отличаться до 25 раз с самыми высокими

показателями в развитых регионах (Австралия, Новая Зеландия, Западная и Северная

Европа и Северная Америка) и самыми низкими - в Южной и Центральной Азии [11, 12,

15]. Если же сравнивать развитые и развивающиеся страны между собой, то в

экономически развитых странах заболеваемость РПЖ выше, а в менее развитых странах

отмечается выше смертность [14, 20].

Так, наибольшая заболеваемость и смертность для развитых стран по данным International

Agency for Research on Cancer (IARC) характерна для Соединенного Королевства – 111.1 и

22.8 на 100 тысяч человек соответственно. Наибольшая заболеваемость и смертность

среди развивающихся стран отмечена в Уганде 48.2 и 38.8 на 100 тыс. соответственно.

13

Причем показатели заболеваемости в Уганде приближаются к показателям смертности

[14].

Такие вариации в заболеваемости среди развитых и развивающихся стран в значительной

мере обусловлены различной степенью охвата скринингом с использованием теста на

ПСА [11, 12, 20]. Кроме того, это обусловлено генетическими факторами, диетой, образом

жизни, факторами окружающей среды, уровнем здравоохранения страны, а также уровнем

образования населения [21].

Стоит отметить, что использование теста на ПСА оказало большее влияние на процент

выявляемости РПЖ, чем смертности от этого заболевания [15].

В экономически развитых странах, где более эффективна система выявления РПЖ за счет

проведения скрининговых программ ежегодно диагностируется до 70% всех случаев РПЖ

в мире (1 млн. мужчин) [16], причем в 80% случаев - это локальные формы на ранних

стадиях с низким риском [9, 15, 20] и более хорошим прогнозом. Таким образом,

значительно снижается и число смертельных исходов от этого заболевания [22].

Однако одновременно с этим увеличивается и число чрезмерных (излишних) биопсий с

последующей гипердиагностикой и повышенными затратами на лечение [12]. В связи с

агрессивным скринингом лишь до 10% пациентов умирают от этого заболевания [14].

Для многих азиатских и африканских стран характерна более низкая выявляемость РПЖ,

когда чаще диагностируются распространенные формы, требующие более радикального

лечения и больших финансовых затрат [11, 14, 20].

Интересно, что частота случайных (асимптомптомных, с объемом опухоли менее 0.5

куб.см.) или аутопсийных случаев РПЖ в разных странах мира примерно одинакова, в

отличие от клинически значимых форм РПЖ, статистика которых широко варьирует

среди стран мира [23].

Такие экзогенные факторы, как диета, потребление алкоголя, воздействие

ультрафиолетового излучения, хроническое воспаление, оказывают влияние на риск

прогрессирования РПЖ и способствуют переходу от так называемого латентного

(асимптомного) РПЖ к клинически значимым формам. Следует отметить, что

наследственные факторы важны для определения риска развития клинического РПЖ, в то

время как экзогенные факторы также могут влиять на риск прогрессирования этого

заболевания [23].

14

1.2. Современные методы диагностики РПЖ в клинической практике

На сегодняшний день, современная диагностика РПЖ основывается на определении

содержания ПСА в плазме или сыворотке крови, в случае его повышения — выполнении

пальцевого ректального исследования (ПРИ) и трансректального ультразвукового

исследования предстательной железы (ТРУЗИ). Проведение этих основных

диагностических методов показано всем мужчинам после 50 лет в плановом порядке. При

подозрении на РПЖ, выполняют пункционную биопсию под контролем ультразвукового

исследования [24].

Окончательный диагноз РПЖ ставится на основании гистологического заключения с

определением индекса Глисона. Сумма Глисона является важным показателем, который

позволяет предсказать прогноз заболевания. Например, пациенты с индексом Глисона 8-

10 имеют плохой прогноз [23].

Такие дополнительные методы обследования, как компьютерная томография (КТ),

магнитно-резонансная томография (МРТ) и ее различные варианты, позитронно-

эмиссионная томография (ПЭТ), рентгенография и сцинтиграфия костей скелета

используют для оценки распространенности онкологического процесса и определения

стадии: оценки кровотока в предстательной железе и опухолевом узле, состояния

капсулы, парапростатической клетчатки, семенных пузырьков, выявления регионарных и

отдаленных метастазов, а также контроля проводимого лечения [24, 25, 26].

ПРИ является простой физикальной процедурой, которая позволяет быстро пальпаторно

оценить состояние предстательной железы: ее размеры, форму, четкость границ

консистенцию, эластичность, наличие узловых и кистозных образований в органе,

подвижность железы по отношению к прямой кишке.

Большинство РПЖ расположены в периферической зоне и могут быть обнаружены с

помощью ПРИ, когда объем составляет более 0.2 см. куб. [23]. Несмотря на все

преимущества данного метода, ПРИ обладает низкой чувствительностью. Так, например,

с помощью ПРИ только в 30% пальпируемых узлов выявляется РПЖ T1-T2 стадии [27].

Полученные в результате ПРИ данные непросто интерпретировать и постановка

правильного заключения зависит от опыта специалиста. При выполнении ПРИ возможны

как ложноположительные заключения при наличии у пациента сопутствующих

заболеваний предстательной железы (простатит, доброкачественная гиперплазия

предстательной железы), так и недооценка стадии, например, при локализации

опухолевых узлов в передней части предстательной железы.

15

ТРУЗИ сегодня применяется широко и является золотым стандартом диагностики РПЖ.

ТРУЗИ отличает высокая информативность, а возможность одновременного выполнения

биопсии предстательной железы [18] делает этот метод незаменимым для первичной

диагностики РПЖ [17].

Использование соноэластографии, основанной на фиксации изменений обратного

рассеивания ультразвукового сигнала в зависимости от плотности ткани, позволило еще

больше повысить точность ТРУЗИ при РПЖ. Соноэластография имеет высокую

информативность и по эффективности как минимум сопоставима с МРТ c использованием

эндоректальной катушки [17].

Несмотря на то, что ТРУЗИ является наиболее распространенным методом визуализации

предстательной железы, этот метод не позволяет определить размер опухоли с

достаточной точностью [10]. Стоит отметить, что ТРУЗИ как и ПРИ, обладает

недостаточной чувствительностью и не способно дифференцировать T2 и T3 стадии с

достаточной диагностической точностью. Так, на дооперационном этапе при ТРУЗИ не

диагностируется 60% опухолей стадии T3, кроме того, оценка УЗИ-картины также во

многом определяется квалификацией специалиста [23].

Тем не менее, сочетание ПРИ и ТРУЗИ позволяет обнаруживать T3a стадию РПЖ более

точно, чем любой из этих методов в отдельности [23].

МРТ является одним из перспективных методов первичной диагностики РПЖ, включая

диагностику рецидивов [18]. В отличие от КТ, МРТ лучше дифференцирует ткани

предстательной железы и окружающих органов и способствует лучшей визуализации

структур малого таза и их взаимоотношений [27].

На сегодняшний день для диагностики РПЖ применяются различные варианты МРТ,

включая эндоректальную МРТ и мультипараметрическую МРТ (мпМРТ).

Информативность МРТ повышается при дополнении общего исследования

использованием эндоректальной катушки. По сравнению с наружной МРТ,

эндоректальная МРТ значительно повышает качество изображения. Например, результаты

эндоректальной МРТ могут повлиять на решение о сохранении или резекции сосудисто-

нервного пучка при радикальной простатэктомии [10].

МпМРТ является новым методом в диагностике РПЖ и объединяет анатомические

изображения (Т2 и Т1) с функциональной оценкой, включающей диффузионно-

взвешенные изображения, динамическое контрастное усиление и, в ряде случаев,

протонную магнитно-резонансную спектроскопию in vivo [28].

У мпМРТ высокая чувствительность к очагам РПЖ с индексом Глисона более 7.

Результаты многих одноцентровых исследований приводят к выводу, что мпМРТ может

16

надежно обнаруживать агрессивные формы РПЖ у пациентов с показанием на биопсию

предстательной железы с отрицательным (NPV) и положительным прогностическим

значением (PPV) в диапазоне от 63 до 98% и от 34 до 68% соответственно. Таким образом,

некоторые авторы предлагают проведение мпМРТ перед биопсией с целью уменьшения

числа биопсий благодаря выявлению клинически незначимых очагов РПЖ [23]. МпМРТ

также может быть эффективным методом диагностики локального рецидива РПЖ в ложе

удаленной железы после радикальной простатэктомии даже при отрицательных

результатах комплексного ТРУЗИ [18].

В диагностике костных метастазов МРТ оказалась более чувствительной и специфичной,

чем остеоцинтиграфия, прицельная рентгенография и КТ. Согласно метаанализу МРТ

также более чувствительна, чем холин-ПЭТ/КТ, хотя последняя имеет более высокую

специфичность [23].

В том случае, если результаты обследования будут влиять на стратегию лечения РПЖ,

необходимо уточнение N стадии по классификации TNM [10]. Однако чувствительность

абдоминальной КТ и МРТ в обнаружении метастазов в регионарные лимфатические узлы

составляет менее 40%. Таким образом, визуализация микроскопических очагов РПЖ без

измерения размеров и формы лимфатических узлов с помощью данных методов

диагностики не представляется возможным. Поэтому в виду низкой чувствительности КТ

или МРТ не должны использоваться для нодального стадирования (определении N стадии

по TNM) у пациентов с низким риском, а золотым стандартом является открытая или

лапароскопическая лимфаденэктомия [23]. В целом, несмотря на ряд преимуществ, МРТ

не нашло широкого применения в скрининге и стадировании РПЖ в виду дороговизны

исследования [10, 17].

Кроме МРТ, для диагностики РПЖ может применяться и позитронно-эмиссионная

томография (ПЭТ), которая проводится c помощью C11

-или F18

-меченых

радиофармпрепаратов холина для выявления первичного или рецидивирующего РПЖ.

C11

-холин служит специфичным маркером для неинвазивной визуализации локусов РПЖ.

ПЭТ в последнее время применяется в комбинации c КТ (ПЭТ-КТ). ПЭТ позволяет

одновременно оценивать структурные и метаболические изменения в органах и тканях,

благодаря чему ПЭТ-КТ стала одним из ведущих методов диагностической визуализации,

используемых в клинической онкологии. Важным преимуществом этого метода является

возможность одномоментного обследования всего организма, что позволяет

диагностировать регионарные и отдаленные метастазы, а также их сочетание [16].

Стоит отметить, что C11

-или F18

-холин ПЭТ-КТв диагностике нодальных метастазов имеет

хорошую специфичность, но относительно низкую чувствительность [10-73%] и, таким

17

образом, не достигает клинически приемлемой диагностической эффективности [23]. В

диагностике костных метастазов при М - стадировании (определении М стадии по TNM)

F18

-фторид натрия (18

F-NaF) ПЭТ или ПЭТ/КТ показывает сходную специфичность и

большую чувствительность по сравнению с остеосцинтиграфией. Кроме того, метод имеет

самую высокую чувствительность к обнаружению костных метастазов, по сравнению с

другими методами визуализации [23].

ПЭТ имеет те же медико-социальные ограничения, что и МРТ, при этом стоимость как

самого исследования, так и необходимого оборудования еще выше [17].

Несмотря на преимущества МРТ, ПЭТ-КТ для диагностики распространенных форм РПЖ

и оценки костных метастазов при РПЖ при М-стадировании, наиболее распространенным

методом является остеосцинтиграфия с технецием-99 [23, 29]. Сцинтиграфия костей

скелета является наиболее точным методом выявления метастазов рака предстательной

железы в кости [26] и превосходит рентгенографию скелета. Хотя сцинтиграфия уступает

по точности холин ПЭТ/КТ и мпМРТ в диагностике костного поражения РПЖ [23]. Стоит

отметить, что на результат диагностики при помощи остеосцинтиграфии в значительной

мере влияют значения уровня ПСА, клиническая стадия и индекс Глисона у конкретного

пациента [23].

Характерные метастатические изменения в костях скелета также могут быть определены

при помощи рентгенографиии, имеющих вид характерных пятнистых, мраморных очагов

за счет чередования остеобластических и остеолитических участков [27]. Повышенная

активность щелочной фосфатазы в 70% случаев может указывать на наличие метастазов.

Одновременная оценка показателей активности щелочной фосфатазы и ПСА повышает

клиническуюэффективность почти до 98%, а содержание ПСА всыворотке крови более

100 нг/мл является единственным и важнейшим диагностическимкритерием

метастазирования с прогностической ценностью 100% [10].

1.3. Молекулярная диагностика РПЖ

Тест на ПСА на сегодняшний день является самым важным маркером для детекции,

последующего наблюдения и мониторинга лечения РПЖ и является первым маркером,

одобренным департаментом контроля качества пищевых продуктов, лекарственных

препаратов и других товаров в США (Food and Drug Administration, FDA). Использование

ПСА в качестве маркера произвело революцию в диагностике РПЖ [23]. ПСА-тест

18

является стандартизированным, быстрым и недорогим, несмотря на недостаточную его

специфичность [30].

Простатический специфический антиген является протеазой химотрипсинового типа и

вырабатывается как нормальными, так и опухолевыми клетками выводных протоков

желез предстательной железы и необходим для разжижения эякулята. В норме небольшое

количество ПСА поступает в эякулят и секрет простаты и очень незначительное

количество попадает в кровь. К экстрапростатическим источникам относят

парауретральные железы, молочную железу и амниотическую жидкость [27].

В диагностике РПЖ ПСА имеет высокую корреляцию со стадией заболевания и

концентрация ПСА в крови пропорциональна объему опухоли нелеченых больных в ткани

предстательной железы. Так, увеличение уровня ПСА до 20 нг/мл и выше является

высокоспецифичным для РПЖ, более 50 нг/мл - указывает на прорастание капсулы органа

в 80% случаев и поражение регионарных лимфатических узлов в 66% случаев, а

повышение ПСА более 100 нг/мл в 100% случаев - на регионарное или отдаленное

метастазирование [27].

Кроме первичной диагностики, ПСА также позволяет оценить чувствительность опухоли

к проводимому лечению и своевременно выявить рецидив после проведения радикальной

простатэктомии, лучевой терапии или гормонотерапии [27].

Несмотря на широкое использование ПСА для скринингового выявления больных РПЖ,

этот маркер обладает недостаточной специфичностью. Так, при своей чувствительности в

70-90%, ПСА обладает специфичностью только в 20-40% (AUC=0.55-0.70) [31].

Чувствительность метода недостаточна для определения латентного, фокального и

высокодифференцированного РПЖ. 20-40% всех злокачественных образований

предстательной железы сопровождаются нормальной концентрацией ПСА, а при стадии

Т3-Т4 ПСА повышен в 100% случаев [27]. Для пациентов с ПСА в серой зоне (4-10 нг/мл)

специфичность варьирует 25-40%. Это означает, что у 65-75% мужчин после проведения

биопсии РПЖ диагностирован не будет [3].

ПСА не позволяет отличать воспалительный процесс от доброкачественного роста ткани

или индолентное течение РПЖ от агрессивного [32]. Однако при этом, по сравнению с

ПРИ и ТРУЗИ, ПСА имеет наибольшую специфичность [23]. Использование этого

маркера в скрининге РПЖ с одной стороны позволило снизить долю пациентов с

запущенными формами [11], а с другой способствовало гипердиагностике, выявлению

латентных форм РПЖ, клинически незначимых доброкачественных опухолей и, как

следствие, гиперактивному лечению [33]. В связи со всем вышеперечисленным вопрос о

необходимости использования ПСА для диагностики РПЖ активно дискутируется [12,

19

33]. Действительно, ПСА не удовлетворяет современным диагностическим требованиям, и

в мировой онкодиагностике имеется потребность в его замене. В связи с этим, необходим

надежный, высокоспецифичный и чувствительный тест, основанный на использовании

нового маркера (или маркеров) для достоверной диагностики РПЖ. Наряду с этим

востребованы и тесты для определения групп риска, стадирования РПЖ, оценки ответа

опухоли на лечение, развития резистентных форм, своевременного выявления рецидивов,

и метастазирования [7]. Молекулярно-биологические подходы находят все большее

применение для диагностики рака в целом и РПЖ в частности [5, 31]. Одним из

современных подходов является поиск в составе циркулирующих/внеклеточных

нуклеиновых кислот крови или мочи онкомаркеров (например, гиперэкспрессированных

микроРНК крови или мочи), изменение статуса метилирования ДНК опухоль-

ассоциированных генов, мутаций, перестроек [5, 30].

Действительно, на сегодняшний день предложено несколько тест-систем для диагностики

РПЖ. Очевидно, что использование комбинации маркеров может позволить улучшить

аналитические характеристики тест-систем. Комбинирование нескольких маркеров в

составе одной диагностической системы является общепринятым подходом, а

использующие его диагностикумы одобрены такими организациями, как FDA (ПСА,

PCA3). Часть таких комбинированных тестов включает в себя анализ ПСА в крови (4K

score test, Prostate health index, Mi-Prostate score test), для других требуется проведение

биопсии или забора операционного материала (Oncotype DX test, ConfirmMDx test или

ProMark test) [13, 32, 34]. Однако, несмотря на большое количество разнообразных тестов,

эффективные маркеры для диагностики и прогнозирования РПЖ до сих отсутствуют [8].

На сегодняшний день был разработан целый ряд различных диагностических и

прогностических тестов, основанных главным образом на анализе образцов ткани

предстательной железы или крови.

Поскольку ПСА сегодня используется в клинической практике как ключевой маркер

РПЖ, дополнительно на его основе были разработаны такие тесты, как PHI и 4Kscore.

Не смотря на то, что разработаны эти маркеры для крови, необходимо упомянуть об этих

тестах, поскольку они основаны на ПСА, ключевом и главном маркере РПЖ в

клинической урологической практике.

Очевидно, что использование комбинации маркеров может позволить улучшить

аналитические характеристики тест-систем. Действительно, комбинирование нескольких

маркеров в составе одной диагностической системы является общепринятым подходом, а

использующие его диагностикумы одобрены такими организациями, как FDA. Часть

таких комбинированных тестов включает в себя анализ ПСА в крови (4K scoretest, Prostate

20

health index, Mi-Prostate score test), для других требуется проведение биопсии или забора

операционного материала (Oncotype DX test, ConfirmMDxtest или ProMarktest) [13, 32, 34].

1.4. Дополнительные тесты на основе ПСА

Индекс здоровья предстательной железы (prostate health index, PHI) является вторым FDA-

одобренным тестом. PHI включает в себя определение предшественника ПСА в крови

(p2PSA), свободного ПСА (fPSA) и общего ПСА (tPSA) для предсказания риска

обнаружения РПЖ с индексом Глисона ≥ 7 при проведении биопсии у мужчин старше 50

лет и предназначен для дифференцирования больных РПЖ и ДГПЖ с уровнями ПСА в

серой зоне (4-10 нг / мл) при отрицательных результатах ПРИ [3, 8, 34, 35]. Стоит

отметить, что PHI обладает значительно большей точностью по сравнению с ПСА (AUC

=0.71–0.75 и 0.53–0.58 соответственно) [35]. Кроме того, PHI оказался значимым

предиктором стадии T3 РПЖ при проведении радикальной простатэктомии [3].

4K score-тест score основан на измерении нескольких маркеров плазмы крови: общий

уровень ПСА, fPSA, интактный PSA и калликреин 2 человека (hK2). При анализе теста

учитывается также возраст, результаты ПРИ и биопсии при оценке клинически

незначимого и агрессивного РПЖ [3, 8]. 4K score-тест помогает предсказать риск

обнаружения РПЖ с индексом Глисона ≥ 7, что подтверждено многочисленными

исследованиями при AUC 0.82 [3]. Этот тест показан для больных РПЖ с повышенным

уровнем ПСА или положительным результатом ПРИ перед проведением первичной

биопсии, а также у больных с отрицательными результатами предшествующей биопсии

на фоне повышенного уровня ПСА [3]. Таким образом, 4K score-тест смог сократить

число биопсий на 49% - 57% среди мужчин, прошедших скрининговое обследование в

первый раз [3], при этом было пропущено только 1% агрессивных форм РПЖ. Кроме

того, 4K score-тест значительно улучшал предсказание метастазирования по сравнению с

ПСА крови [35]. 4K score-тест показал значительно более высокую точность прогноза

РПЖ, чем точность комбинированной панели, состоящей из ПСА, возраста больного РПЖ

и результатов ПРИ (AUC 0.71 и 0.58 соответственно) [35].

ПСА представляет собой гликопротеин с единственным сайтом N-гликозилирования

аспарагинового остатка 45-й аминокислоты с N-конца. У пациентов с РПЖ терминальная

N-гликановая структура ПСА богата сиаловой кислотой с α2,3-связанной галактозой,

тогда как терминальные N-гликановые структуры ПСА у здоровых пациентов содержат

преимущественно α2,6-связи [36]. Был разработан иммунотест с использованием

21

магнитных шариков, для детекции α2,3-связанного сиалилирования на свободном ПСА

(S2,3 PSA). При этом AUC S2,3 теста достигала 0.84, а чувствительность и специфичность

составила 95% и 72% соответственно, что значительно превосходило точность общего

ПСА крови или % fPSA. Таким образом, детекция нарушений гликозилирования ПСА

может повысить точность диагностики РПЖ [36].

1.5. Маркеры мочи

1.5.1. РНК-маркеры в диагностике РПЖ

Для того чтобы выявить пациентов с подозрением на РПЖ при отрицательных результах

ПРИ, первой биопсии и определении уровня ПСА крови, применяется PCA3 (FDA-

одобренный тест) [23], который основан на анализе длинной некодирующей РНК в осадке

мочи, известной как раковый антиген предстательной железы (prostate cancer antigen 3,

PCA3 или DD3) и используется как коммерчески доступный тест, известный как

PROGENSA® PCA3 [37].

Известно, что транскрипт PCA3 не определяется в нормальной ткани ПЖ, слабо

экспрессирован или отсутствует в простатических гиперпластических тканях ПЖ и

гиперэкспрессирован у больных РПЖ (в более чем 90% случаев) [3, 8, 38]. Кроме того,

уровень PCA3 не повышен при воспалительных процессах в ПЖ и не зависит от объема

этого органа [3]. Проведение теста показано пациентам в возрасте от 50 и более лет с

подозрением на РПЖ при отрицательных результатах первичной биопсии для решения

вопроса о проведении повторной биопсии.

Оценивают PCA3 в осадке мочи, как правило, после ПРИ, используя ПСА крови в

качестве нормализатора. Соотношение уровней этих двух маркеров позволяет

нивелировать негативный эффект увеличения ПСА в связи с наличием сопутствующего

ДГПЖ или возраста пациента [3].

В одних исследованиях уровень экспрессии PCA3 коррелировал с результатами биопсии и

агрессивностью опухоли. Согласно другим исследованиям значимой корреляции между

PCA3 и индексом Глисона найдено не было. Таким образом, вопрос о связи уровня PCA3

в осадке мочи с агрессивностью РПЖ и, следовательно, с прогнозом, остается открытым

[3].

Определение мРНК PCA3 в осадке мочи имеет несколько большую специфичность и

меньшую чувствительность, чем ПСА, при этом значение cut-off для PCA3 точно не

22

определено (the best discriminating value), что до сих пор является предметом дискуссии, и,

следовательно, может влиять на процент диагностированных случаев РПЖ с

использованием этого теста [34]. Несмотря на то, что тест одобрен для решения вопроса о

повторной биопсии у пациентов с повышенными уровнями ПСА, применение этого теста

в качестве первой линии или для обнаружения агресивных форм РПЖ остается

нерешенным [3, 39].

Слияние генов транскрипционных факторов семейства ETS (обычно ERG) с

андрогенрегулируемым геном TMPRSS2 известен как химерный транскрипт TMPRSS2-

ERG [32]. Известно, что TMPRSS2-ERG гиперэкспрессирован в эпителитальных клетках

опухолей ПЖ (около 50% опухолей) и может быть определен в осадке мочи в качестве

маркера РПЖ. Однако при высокой специфичности [93%] этот маркер имеет низкую

чувствительность (37%) [32]. Кроме того, на сегодняшний день не выявлено корреляций

между экспрессией TMPRSS2:ERG и индексом Глисона или стадией РПЖ [34], а

исследования о связи экспрессии TMPRSS2:ERG с агрессивностью РПЖ,

метастазированием и смертностью носят противоречивый характер [32].

Кроме того, TMPRSS2-ERG менее экспрессирован у мужчин африканского

происхождения при сравнении с европеоидной расой (27% и 54% соответственно) [3].

Известно, что комбинирование TMPRSS2-ERG и PCA3 значительно повышает

чувствительность теста с 68 до 76% по сравнению с чувствительностью PCA3 [32]. Тест,

сочетающий определение ПСА крови и транскриптов TMPRSS2:ERG и PCA3 в осадке

мочи известен как Mi-Prostate Score (MiPS) тест и используется для оценки риска РПЖ и

уменьшения числа биопсий [32].

Проведение теста показано для пациентов с повышенным уровнем ПСА, которым

планируется проведение первичной биопсии или для пациентов с отрицательными

результатами предыдущей биопсии, которым планируется проведение повторной биопсии

[3]. Сочетание TMPRSS2-ERG, PCA3 и ПСА крови увеличивают специфичность метода

до 90%, а чувствительность– до 80% для диагностики и прогнозирования выявления РПЖ

с помощью биопсии [32, 37]. В исследованиях MiPS превосходил ПСА в диагностике

РПЖ, включая распространенные формы заболевания [36].

Wei Zhang с соавторами [39] при помощи секвенирования длинных некодирующих РНК

(lncRNA) ткани ПЖ у больных РПЖ при сравнении участков РПЖ с неизмененными

участками ткани предстательной железы обнаружил гиперэкспрессию транскрипта

FR0348383. Этот транскрипт был обнаружен в 80% [39]. Увеличение экспрессии мРНК

FR0348383 коррелировало с возрастающей вероятностью положительной биопсии

(Р<0.001). РОК-анализ (receiver operating characteristic, ROC) показал, что диагностическая

23

эффективность этого теста превосходит общий ПСА, % свободного ПСА и плотность

ПСА (отношение концентрации ПСА к объему ПЖ) при определении больных РПЖ среди

пациентов с ПСА серой зоне (4-10нг/мл) (AUC=0.815, 0.562, 0.599 и 0.645 соответственно)

[39].

Известно, что транскрипционный фактор гена homeobox C6 (HOXC6) играет важную роль

в морфогенезе многоклеточных организмов, регулирует активность онкогенов,

опухолевых супрессоров и генов, связанных с морфогенезом предстательной железы и

метастазированием опухоли в кости скелета. Было показано, что HOXC6

гиперэкспрессирован у пациентов с РПЖ. Distal-less homeobox 1 (DLX1) является геном

ядерного транскрипционного регулятора цитокинов суперсемейства TGF-β и участвует в

нейроэндокринно-эпителиальной дифференцировке, а также может быть связан со

степенью агрессивности РПЖ [3]. Уровень экспрессии обоих генов HOXC6 и DLX1

позволяет использовать их в качестве независимых предикторов индекса Глисона при

проведении биопсии и в прогнозировании высокого риска РПЖ у пациентов с ПСА более

4 нг / мл. Чувствительность и специфичность HOXC6 и DLX1 составили по данным ранее

циторованных авторов 91% и 33% (AUC=0.73) и 83% и 16% (AUC=0.65) соответственно.

В комбинированной модели из двух генов чувствительность и специфичность составили

91% и 36% (AUC=0.76) соответственно [3]. Тест SelectMDx основан на измерении

уровней экспрессии мРНК DLX1 и HOXC6 в моче после проведения ПРИ в сочетании с

определением ПСА сыворотки, плотностью ПСА, с учетом возраста и семейной историей

РПЖ. Тест обеспечивает вероятность обнаружения РПЖ при проведении биопсии, а также

вероятность обнаружения агрессивных форм РПЖ и позволяет уменьшить число биопсий

на 53% [3].

Помимо определения РНК маркеров мочи для диагностики РПЖ, предпринимаются

попытки найти и другие оннкоспецифические молекулы – аберрантно метилированную

ДНК, ферменты, метаболиты. Примером этого служат несколько работ, посвященных

исследованию этих предикторов в моче.

1.5.2. Определение паттернов метилирования ДНК у больных раком

предстательной железы

Эпигенетические модификации являются наследственными и обратимыми

биохимическими изменениями, которые изменяют экспрессию гена без влияния на

24

первичную последовательность ДНК [40]. Известно, что фенотип РПЖ носит сложный и

гетерогенный характер, который обусловлен не только генетическими дефектами, но и

эпигенетическими изменениями [31]. Многочисленными работами доказана роль

метилирования ДНК в развитии и прогрессировании РПЖ [31].

Аберрантное метилирование может включать гиперметилирование, гипометилирование

или потерю импринтинга. Так гиперметилирование богатых CpG промоторных областей

генов приводит к потере функции генов и часто наблюдается в регуляторных участках

генов супрессоров опухолевых тканей [40]. Гиперметилирование промотора гена

глутатиона S-трансферазы 1 (glutathione S-transferase-1, GSTP1) является наиболее частой

эпигенетической модификацией как при интраэпителиальной простатической неоплазии

(в 70% случаев) так и при РПЖ (в 90% случаев) по сравнению с нормальными тканями

предстательной железы или при ДГПЖ [37]. Гиперметилированные фрагменты GSTP1

гена могут быть обнаружены в сыворотке крови или моче для диагностики РПЖ. Тест,

основанный на их детекции, обладает высокой специфичностью (86,8-100%), но низкой

чувствительностью в моче (18,8-38,9%) и крови (13,0-72,5%). В 50% случаев GSTP1

обнаруживается в эякуляте и в 77% в осадке мочи после ПРИ [41]. Кроме того, в

сравнении с РНК, ДНК относительно более стабильна в моче.

Было обнаружено, что гиперметилирование GSTP1 определяется в осадке мочи после

массажа ПЖ у 68% пациентов РПЖ на ранних стадиях, у 78% пациентов с локальными

формами РПЖ, у 29% пациентов с ПИН и у 2% пациентов с ДГПЖ (Hessels 2013). По

данным этих же авторов специфичность теста составляет 98% а чувствительность - 73%.

Отрицательная прогностическая ценность этого теста составляла 80%, что указывает на

то, что этот анализ может позволить уменьшить количество биопсий [41]. Одним из

недостатков этого теста является высокая частота метилирования GSTP1 у пациентов с

простатической интраэпителиальной неоплазией (ПИН) (high-grade). Поскольку

гиперметилирование GSTP1 имеет высокую специфичность для РПЖ, наличие

гиперметилирования GSTP1 в осадке мочи пациентов с отрицательной биопсией (33%) и

пациентов с атипией или высокой степенью ПИН (67%) предполагает, что у этих

пациентов не исключено течение скрытого, латентного РПЖ [41].

Применение комбинированного теста, состоящего из трех и более метилированных

маркеров, может повысить специфичность и чувствительность анализа.

Так, комбинация нескольких генов (p16, ARF, MGMT и GSTP1) смогли обнаружить рак

предстательной железы с 87% чувствительностью и 100% специфичностью [31].

Абберантное метилирование GSTP1, RASSF1A, рецептора ретиноевой кислоты b2

(RARB) и гена аденоматозного полипоза кишечника (adenomatous polyposis coli, APC) при

25

анализе осадка мочи, полученных после массажа ПЖ, позволяют отличить здоровых и

больных доноров с 86% чувствительностью и 89% специфичностью [41]. Отличие в

уровнях метилирования генов протокадгерина 17 (PCDH17) и транскрипционного фактора

21 (TCF21) обнаружено в ткани РПЖ по сравнению с контрольной группой ЗД с 83%

чувствительностью и 100% специфичностью. Однако при исследовании этих генов в моче

при 100% специфичности чувствительность составляла всего 26% [37]. Несмотря на

полученные данные, требуется проведение дальнейших исследований этих маркеров на

более крупных выборках.

1.5.3. Детекция онкоспецифических ферментов при РПЖ

Ядерная β-1,6-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза-1 (Core2 β-1,6-N-

acetylglucosaminyltransferase-1, GCNT1) является ферментом, который играет ключевую

роль в формировании ядерных 2-разветвленных O-гликанов. Экспрессия GCNT1

ассоциирована с прогрессией нескольких типов рака, а также с агрессивностью опухоли у

пациентов с РПЖ [36]. Было отмечено, что в 90% случаев в моче GCNT1-положительных

пациентов РПЖ с высокими показателями ПСА крови отмечалось экстракапсулярное

распространение опухоли. Кроме того, дальнейшая прогрессия опухоли быоа

ассоциирована с подъемом уровня этого фермента в моче больных РПЖ. Таким образом,

GCNT1 может быть использован как многообещающий маркер агрессивности РПЖ в

клинической практике [36].

Метилацил-кофермент А рацемаза (Methylacylcoenzyme A racemase, AMACR)

представляет собой изомеразу семейства ферментов, в основном расположенных в

митохондриях или пероксисомах [31]. Этот фермент играет критическую роль в

пероксисомальном β-окислении жирных кислот, содержащихся в молочных и мясных

продуктах [41]. мРНК AMACR часто гиперэкспрессирована в ткани предстательной

железы, крови и моче больных РПЖ.

Девятикратная гиперэкспрессия мРНК AMACR была обнаружена в злокачественных

опухолях ПЖ по сравнению с нормальной тканью ПЖ, что позволяет использовать

определение уровня экспрессии этого гена для диагностики РПЖ. Детекция мРНК

AMACR позволяет отличить РПЖ от ДГПЖ лучше, чем ПСА [31]. AMACR Western Blot-

анализ образцов мочи, полученных после массажа ПЖ больных РПЖ, чувствительностью

100% и специфичностью 58% с положительным прогностическим значением 72% и

отрицательном прогностическом значением 88%. И, таким образом, тест на основе

26

детекции мРНК AMACR при помощи ПЦР в реальном времени позволяет выявлять

пациентов с клинически незначимыми формами РПЖ при использовании нормализации

данных на уровень ПСА крови [41].

В случае детекции AMACR и PCA3 в осадке мочи, чувствительность и специфичность

детекции РПЖ может быть повышена до 81% и 84% соответственно [41].

Простатспецифический мембранный антиген (Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA))

представляет собой трансмембранный гликопротеин, который экспрессируется на

поверхности эпителиальных клеток предстательной железы, а также присутствует в

экзосомах мочи у пациентов с РПЖ [37]. PSMA впервые был предложен в качестве

прогностического маркера для РПЖ в 1999 году. Двойной моноклональный сэндвич-

анализ для PSMA был разработан для анализа тканей ПЖ, семенной жидкости и мочи

[37]. Отличия в экспрессии PSMA были обнаружены в группах сравнения ДГПЖ и РПЖ,

что указывает на то, что PSMA является перспективным диагностическим маркером [41].

Недавно было показано, что высокая экспрессия PSMA у больных РПЖ коррелирует со

стадией заболевания, степенью злокачественности и биохимическим рецидивом. Кроме

того, повышенная экспрессия мРНК PSMA в первичных очагах РПЖ и метастазах

коррелирует с избыточной экспрессией белка PSMA. У мужчин с уровнем ПСА в

сыворотке крови от 4 до 10 нг/мл, измерение мРНК PSMA в осадке мочи после ПРИ

позволяет предсказывать РПЖ более эффективно, чем тесты, основанные на измерении

уровней PCA3 [41]. Тем не менее, PSMA-тест до сих пор не используется в клинической

практике.

Фосфопротеин Гольджи 2 (Golgiphosphoprotein 2, GOLPH2, GP73) – представляет собой

белок комплекса Гольджи с молекулярной массой 73 kDa. GOLPH2 экспрессируется

различными эпителиальными клетками организма и гиперэкспрессирован при РПЖ,

гепатоцеллюлярной карциноме и аденокарциноме легких. Было паказано, что транскрипт

GOLPH2 детектируется в моче вместе транскриптами SPINK1, PCA3 и TMPRSS2-ERG и

может также является потенциальным предиктором РПЖ [31].

1.5.4. Определение онкоспецифических метаболитов в моче

Еще одним подходом в поиске маркеров для диагностики онкологических заболеваний

является исследование метаболитов нормальных и опухолевых клеток [35].

Так, аминокислота саркозин (N-метилглицин), которая содержится в мышцах и других

тканях организма, может быть использована как предиктор РПЖ. Было показана разница в

27

уровнях саркозина в моче у пациентов с ДГПЖ, клинически локализованным и

метастатическим РПЖ [31, 35]. Саркозин можно измерять как в моче, так и в сыворотке.

Сывороточный саркозин имел более высокую прогностическую ценность, чем общий

уровень ПСА и свободный ПСА при выявлении рака предстательной железы у пациентов

с общим уровнем ПСА <4 нг / мл в сыворотке [35].

Тест Prostarix основан на определении четырех метаболитов мочи, включая саркозин,

которые увеличиваются во время прогрессирования РПЖ. Этот метаболический тест

использует метод количественной жидкостной хроматографии-масс-спектроскопии (LC-

MS) для точного измерения концентраций четырех аминокислот в образцах мочи после

ПРИ. Показана его эффективность в определении показаний к проведению первичной или

повторной биопсии у мужчин с повышенным уровнем ПСА, но отрицательным ПРИ [42].

В клинических испытаниях тест Prostarix показал повышенную чувствительность и

специфичность по сравнению с ПСА крови и может быть полезен в диагностическом

плане, особенно у пациентов с отрицательным ПРИ или умеренно повышенным уровнем

ПСА [32].

Несмотря на появление разнообразных тестов для диагностики РПЖ, тесты на основе

ПСА по-прежнему остаются незаменимым иструментом в клинической урологической

практике. Тем не менее, начало компании по отмене этого теста и появление новых

биомаркеров рака предстательной железы предполагают разработку в ближайшее время

новых подходов для принятия решений по оценке риска и лечения РПЖ. Однако,

несмотря на большое количество разнообразных тестов, эффективные маркеры и

надежные, общепринятые тесты для диагностики и прогнозирования РПЖ до сих

отсутствуют [8].

1.6. МикроРНК мочи при раке предстательной железы

Использование биологических жидкостей (кровь, моча) в качестве источника маркеров

имеет определенные преимущества. Маркеры в составе биологических жидкостей могут

лучше отражать генетическую гетерогенность опухоли, чем фрагмент ткани опухоли из

определенной области, полученный при помощи биопсии [5, 9]. С другой стороны,

жидкая биопсия не позволяет дифференцировать первичные и метастатические очаги

опухоли, определить локализацию первичной опухоли и требует высокочувствительной и

специфичной детекции диагностических молекул [5].

28

В качестве перспективных маркеров РПЖ в настоящее время рассматриваются

внеклеточные микроРНК биологических жидкостей («жидкая биопсия»). Было

обнаружено, что эти молекулы участвуют в ключевых процессах канцерогенеза, их

экспрессия определяется статусом опухоли, т.е скоростью роста, склонностью опухоли к

метастазированию и т.д. [5, 43, 44, 45].

МикроРНК обладают относительно высокой стабильностью и могут длительно сохранятся

в биологических жидкостях организма [46], что обеспечивает их уверенную детекцию.

Для анализа экспрессии микроРНК требуется минимальное количество биологического

материала, минимум оборудования и рабочего персонала. Для определения набора и

концентрации микроРНК используются хорошо отработанные методы, такие как

микроэррэй, секвенирование или полимеразная цепная реакция (ПЦР) с обратной

транскрипцией (ОТ). Вышеперечисленные характеристики позволяют надеяться на

выявление набора диагностически значимых микроРНК и разработке на их основе панели

маркеров для диагностики РПЖ с высокой чувствительностью и специфичностью,

пригодной для внедрения в клиническую практику для рутинной диагностики.

Для исследования микроРНК в моче можно использовать различные фракции мочи,

каждая из которых содержит отличающиеся наборы микроРНК и представляет

определенный интерес для диагностики и прогнозирования течения РПЖ. К числу этих

фракций оносят осадок клеток, бесклеточный супернатант мочи (супернатант после

центрифугирования при 17 тыс.g) и фракцию внеклеточных везикул.

1.6.1. Использование осадка клеток мочи в качестве источника

диагностических микроРНК

Осадок мочи представляет собой клеточный осадок эпителиальных клеток органов

мочеполовой системы, включая предстательную железу, который может быть получен

путем низкоскоростного центрифугирования. Эта фракция мочи содержит не только

микроРНК, но и значительное количество мРНК, ДНК, белков, пептидов и других

макромолекул. Относительная концентрация онкоспецимфических микроРНК в этой

фракции может быть как ниже, так и выше, чем в остальных фракциях мочи, в

зависимости от состояния опухолевой ткани и размера опухоли. Концентрация

балластных микроРНК, как правило, достаточно высока. Одним из преимуществ

использования этой фракции в качестве источника диагностических молекул является то,

29

что в качестве потенциальных маркеров вместе с микроРНК можно использовать ДНК,

мРНК, некодирующие РНК и белок.

Stephan с соавторами обнаружили, что экспрессия miR-183 и miR-205 изменена не только

в ткани РПЖ, но и в моче больных РПЖ. Экспрессия этих микроРНК была оценена в

осадке мочи, однако предсказательные значения оказались невысокими (AUC=0.58 и 0.56

соответственно) [47].

Кроме того, была исследована экспрессия микроРНК в клеточном осадке мочи у больных

с локальными и распространенными формами РПЖ [48]. Было показано, что miR-107 и

miR-574-3p находятся в более высоких концентрациях в осадке мочи у больных РПЖ по

сравнению с контрольной группой. Детекция этих микроРНК позволяет более точно

диагностировать РПЖ, чем определение уровня PCA3, однако основанные на их

использовании диагностические системы отличались умеренной диагностической

эффективностью (AUC=0.74 и 0.66 для miR-107 и miR-574-3p соответственно) [48].

Отличить больных РПЖ и пациентов с ДГПЖ попытались Egidi с соавторами [49]. Они

оценили уровни экспрессии miR-19a-3p и miR-9-3p у 79 пациентов в осадке мочи.

Оказалось, что miR-19a-3p и miR-9-3p были гиперэкспрессированы в группе пациентов с

ДГПЖ. Специфичность и чувствительность miR-19a-3p и miR-9-3p составили 64,29% и

81,08% соответственно. Анализ при помощи логистической регрессии KLK11 с miR-9-3p

и miR-19a-3p оказался более точен, чем miR-19a-3p и miR-9-3p при которой

чувствительность и специфичность комбинированной панели составили 86,67% и 72.92%

соответственно [49].

Casanova-Salas проанализировали экспрессию miR-182 и miR-187 одновременно с

экспрессией мРНК генов PCA3, ERG, GOLPH2, SPINK1, в группе из больных РПЖ

(замороженная опухолевая ткань и парафиновые срезы (formalin-fixed and paraffin-

embedded, FFPE)), которым была проведена биопсия предстательной железы. Далее

авторы работы оценили уровень экспрессии указанных маркеров в осадке мочи после

массажа ПЖ. Было показано, что увеличение экспрессии PCA3 и miR-187 коррелирует с

положительными данными биопсии у больных с РПЖ [50]. Предсказательная модель,

состоящая из ПСА, PCA3 и miR-187 обладала чувствительностью 88.6% и

специфичностью более 50%. Достигнутая точность данной комбинированной модели

превысила диагностическую точность ПСА в качестве единичного маркера (AUC = 0.711

и AUC = 0.615 соответственно). Таким образом, miR-187 может быть использована в

качестве маркера ранней диагностики РПЖ [50].

В другой работе сравнивали содержание микроРНК в осадке мочи у пациентов с РПЖ и

ДГПЖ. Было обнаружено, что уровень экспрессии miR-100 и miR-200b позволяет

30

отличить пациентов с ДГПЖ от больных РПЖ. При помощи мультивариантной

логистической регрессии было показано, что комбинированная модель, включающая

возраст, ПСА, ПРИ, miR-100 и miR-200b, значительно превосходит базовую панель без

микроРНК (AUC комбинированной модели = 0.866, AUC ПСА = 0.681) [51].

Sruopelyte и другие исследователи оценили уровень экспрессии микроРНК в ткани

больных РПЖ (опухолевая и неопухолевая ткань), а затем и в моче (ЗД-РПЖ, РПЖ-

ДГПЖ) [52]. Уровни miR-375 значимо различались в моче в двух независимых выборках

больных РПЖ, особенно у больных с T2 стадией, а miR-148а - у больных РПЖ с T2

стадией заболевания (как маркер ранней стадии). Было показано, что определение

экспрессии miR-148а в комбинации с miR-375 позволяет эффективно диагностировать

РПЖ AUC = 0.785 (РПЖ-ДГПЖ) и 0.835 (ЗД-РПЖ) соответственно. Использование

комбинации miR-148а и miR-375 с ПСА крови, по сранению с единичным ПСА тестом

позволило повысить диагностическую эффективность (AUC=0.845 и 0.513

соответственно) [52].

1.6.2. Использование бесклеточного супернатанта мочи в качестве

источника диагностических микроРНК

Бесклеточный супернатант мочи также представляет немалый интерес для

исследователей, поскольку эта фракция содержит микроРНК, которые находятся в

комплексе с белками и липидами, наряду с микроРНК, находящимися в составе

внеклеточных везикул [6]. Такую фракцию получают при помощи низкоскоростного

центрифугирования, причем ее получение не требует специального оборудования и

оптимизации методов, а в составе микроРНК этой фракции встречаются и

онкоспецифические микроРНК [6].

При исследовании бесклеточной фракции мочи в качестве источника диагностических

микроРНК было обнаружено, что miR-205 и miR-214 гипоэкспрессированы в моче

больных РПЖ и могут отличить больных от здоровых доноров с AUC 0.708 и 0.743

соответственно. Причем экспрессия miR-205 и miR-214 была значительно изменена не

только в моче, но и в опухолевой ткани больных РПЖ. Сочетание miR-205 и miR-214

обладает наибольшей чувствительностью и специфичностью, достигающие 89% и 80%

соответственно [53].

Korzeniewski и другие при исследовании микроРНК в бесклеточной фракции мочи при

РПЖ и обнаружили гиперэкспрессию miR-483-5p [54]. Гиперэкспрессия этой микроРНК

31

была обнаружена и в супернатанте клеточной культуры LNCaP. Определение уровня

экспрессии miR-483-5p позволяло выявлять больных РПЖ с AUC = 0.694, однако

диагностическая эффективность этого метода уступала таковой для ПСА [AUC =0.81],

даже в случае использования для диагностики комбинации определения уровня

микроРНК с уровнем ПСА (AUC =0.80) [54].

Для того, чтобы отличить агрессивные формы РПЖ от индолентных форм, в крови и мочи

больных РПЖ (16 больных с высоким риском и 17 больных с низким риском) до

выполнения радикальной простатэктомии была исследована экспрессия восьми

микроРНК. Интересно отметить, что в крови не наблюдалось дифференциальной

экспрессии ни одной из микроРНК в группах низкого и высокого риска (AUC=0.62), в то

время как гиперэкспрессия наилучших предикторов высокого риска РПЖ - miR-16, miR-

21 и miR-222 была обнаружена в моче пациентов (AUC=0.75). Однако экспрессия этих

микроРНК не зависела от объема опухоли и стадии заболевания [55].

Haj-Ahmad исследовал возможность использования микроРНК для дифференциальной

экспрессии РПЖ и ДГПЖ [56]. Была оценена экспрессия 894 микроРНК в цельной моче

больных РПЖ, пациентов с ДГПЖ и ЗД. Обнаружено, что miR-1826 была

гипреэкспрессирована у семи из восьми пациентов с РПЖ по сравнению с ЗД, а miR-484

гипоэкспрессирована у 6 из 8 пациентов с РПЖ. При сравнении больных ДГПЖ с ЗД было

обнаружено, что экспрессия микроРНК miR-1826 у этих больных нестабильна: у 4 из 12

она была гипреэкспрессирована, у 2 из 12 – гипоэкспрессирована, а у 6 из 12 – экспрессия

не различалась [56]. При этом miR-484 в моче больных ДГПЖ была гипоэкспрессирована

во всех образцах. Чувствительность и специфичность miR-1826 для детекции РПЖ среди

ДГПЖ составила 60% и 69% соответственно, в то время как чувствительность и

специфичность miR-484 - 80% и 19% соответственно. Чувствительность и специфичность

обеих пар в тандеме составила 45% и 75% соответственно [56].

1.6.3. Использование внеклеточных везикул мочи в качестве источника

диагностических микроРНК

Одной из проблем изучения микроРНК в моче является их низкая концентрация (как

минимум на порядок меньше, чем в крови). Кроме того, свой вклад в уменьшение

диагностической эффективности определения уровня микроРНК оказывает гетерогенный

состав микроРНК этой фракции и зависимость концентрации микроРНК в этой фракции

от физиологических факторов [57]. Кроме того, отдельной проблемой является выделение

32

микроРНК из суммарной мочи [8]. Одним из таких вариантов обогащения микроРНК и

уменьшения концентрации биополимеров, ингибирующих полимеразные реакции и

уменьшения гетерогенности исследуемой фракции микроРНК является использование для

выделения диагностических микроРНК фракции внеклеточных везикул мочи.

Bryzgunova и другие авторы исследовали микроРНК различных фракций мочи, а также

состав и содержание ВВ мочи у ЗД и больных РПЖ. Было показано, что микроРНК по-

разному распределены между различными фракциями ВВ. ROC-анализ экспрессии

микроРНК во всех фракциях показал, что диагностически значимым является только

уровень экспрессии miR-19b. Определение концентрации этой микроРНК позволяет

дифференцировать больных РПЖ от ЗД со 100% специфичностью и 93%

чувствительностью в случае суммарных ВВ и 95% специфичностью и 79%

чувствительностью для фракций экзосом. Таким образом, количественное определение

микроРНК (в частности, микроРНК-19b) ВВ мочи может быть использовано в качестве

основного или, по крайней мере, дополнительного критерия для диагностики рака

предстательной железы [57].

При помощи секвенирования следующего поколения Koppers-Lalic и другие

проанализировали экспрессию микроРНК и выполнили верификацию обнаруженных

маркеров при помощи ПЦР на независимой группе пациентов. Оказалось, что изоформы

miR-21, miR-375 и miR-204 внеклеточных везикул мочи с модификациями на 3-конце

были значительно гиперэкспрессированы и позволили отличить больных РПЖ от ЗД с

подтверждением на независимой группе пациентов [58]. ROC-анализ трех изоформ

микроРНК показал 72.9% чувствительность и 88% специфичность с AUC=0.866 (AUC

ПСА=0.707). Комбинированная панель изоформ микроРНК с ПСА показала наилучшую

диагностическую эффективность (AUC = 0.866) [58].

Foj и другие изучили экспрессию микроРНК клеточного осадка и экзосом супернатанта

мочи 60 больных РПЖ. Они обнаружили, что miR-21, miR-141 и miR-375

гиперэкспрессирваны, а miR-214 гипоэкспрессирована в клеточном осадке мочи больных

РПЖ [59]. В экзосомах мочи больных РПЖ была обнаружена гиперэкспрессия let-7c, miR-

21 и miR-375. Наилучшие показатели чувствительности и специфичности для диагностики

РПЖ были получены при помощи комбинированной панели, состоящей из двух miR-21 и

miR-375 (AUC=0.872). Кроме того, экспрессия miR-141 клеточного осадка коррелировала

с индексом Глисона, а let-7c экзосом мочи – со стадией заболевания. Определение

экспрессии miR-21, miR-141 и miR-214 в осадке мочи и miR-21, miR-375 и let-7c во

фракции экзосом мочи позволяло дифференцировать группы среднего/высокого риска и

низкого риска ЗД [59].

33

Marta Rodríguez при помощи масштабного секвенирования микроРНК ЗД и больных РПЖ

обнаружили, что miR-196a-5p, miR-34a-5p, miR-143-3p, miR-501-3p и miR-92a-1-5p

значительно гипоэкспрессированы в экзосомах больных РПЖ. Верификация экспрессии

микроРНК методом ОТ-ПЦР на независимой выборке была подтверждена гипоэкспрессия

miR-196a-5p и miR-501-3p у больных РПЖ, и продемонстрирована перспективность этих

микроРНК для диагностики РПЖ [60].

1.7 Технические затруднения, возникающие при стандартизации анализа

внеклеточных микроРНК

На сегодняшний день существует ряд известных и не до конца проработанных

технических сложностей анализа концентраций микроРНК в биологических жидкостях, в

том числе и в моче. Например, отсутствуют единые стандарты преаналитического,

аналитического и постаналитического этапов исследования микроРНК, такие как

протоколы сбора, обработки и хранения биологических образцов, процедуры выделения и

детекции микроРНК, анализ полученных данных и т.д. [7]. Все это приводит к сложности

сопоставления результатов разных исследований и снижает ценность метаанализа

полученных данных, оценки их корректности, реальной диагностической эффективности

[7].

К числу основных проблем исследования микроРНК в моче можно отнести нерешенный

вопрос о поведении массажа ПЖ перед забором мочи и связанной с этим гематурией и

гемолизом, отсутствие единого способа выделения микроРНК из фракций мочи, выбора

конкретной фракции мочи для изучения микроРНК (клеточный осадок, бесклеточная

фракция мочи или фракция ВВ), выбор объема мочи для получения конкретной фракции и

выделения микроРНК, использование аналитических платформ (ПЦР, микроэррэй или

секвенирование) для детекции микроРНК, отсутствие единых стандартных стратегий для

нормализации и верификации полученных результатов. Однако, несмотря на

существующие проблемы, моча остается перспективным источником биомаркеров РПЖ, в

виду неинвазивности процедуры получения образцов и циркуляции в моче

онкоспецифических микроРНК [40].

34

1.8 Выделение микроРНК из биологических жидкостей

Основным препятствием в выделении высококачественных микроРНК из

биологических жидкостей является высокое содержание в них биополимеров

ненуклеотидной природы (белки, липопротеины, липиды и их комплексы), в том числе

входящих в комплексы с микроРНК, присутствие в них ингибиторов ферментов,

используемых в последующем анализе (например, ПЦР), а также высокие концентрации

ферментов, гидролизующих нуклеиновые кислоты.

Таким образом, получение высокоочищенных препаратов недеградированных микроРНК,

пригодных для последующего анализа (ОТ-ПЦР, микрочиповый анализ, полногеномное

секвенирование) является актуальной проблемой в молекулярной биологии.

Показано, что микроРНК, характерные для разных тканей, в том числе и тканей опухолей,

присутствуют в биологических жидкостях организма, таких как кровь, моча,

спинномозговая жидкость, бронхоальвеолярные смывы и т.д. [61]. В составе этих

жидкостей микроРНК остаются стабильны в течение длительного времени благодаря

тому, что формируют прочные комплексы с белками [62], липопротеинами [63] и/или

находятся в составе окруженных мембранами частиц (экзосомы, апоптические тельца,

микрочастицы) [64]. Разрушение таких комплексов требует специальных условий и

осложняет процесс выделения микроРНК из биологических жидкостей.

На сегодняшний день фенол-хлороформная экстракция является наиболее часто

используемым методом выделения микроРНК из разных биологических источников.

Способы фенольной экстракции используются в ряде коммерческих наборов для

выделения микроРНК, таких как TRIZOL LS. В таких коммерческих наборах, как

miRVANA, miRNeasy и др. для обогащения по микроРНК используется дополнительная

стадия очистки на колонках со стекловолоконными сорбентами [65].

Наряду с преимуществами этот метод имеет некоторые существенные ограничения.

Процедура занимает много времени (40-60 минут), требует высококачественных

реагентов (фенол), результаты в значительной степени зависят от опыта исследователя.

Кроме того, фенол является высокотоксичным реагентом, который требует

дополнительного оборудования и систем удаления отходов. Это создает значительные

трудности для его рутинного использования [66].

Moret et al. сравнивали четыре разных протокола для экстракции РНК с использованием

TRIzol-LS, mirVana PARIS kit, miRNeasy Serum/Plasma kit и TRIzol-LS с mirVana kit из

образцов свежей и замороженной плазмы. Они показали, что методы на основе колонок

35

более эффективны, чем TRIzol, из-за присутствия органических загрязнителей в

препаратах РНК, полученных выделением TRIzol [67]. Кроме того, было показано, что

микроРНК с низким содержанием GC и вторичной структурой (например, miR-141 и miR-

21) выделяются наименее эффективно, а выделение микроРНК от биологических

жидкостей также затруднено [68].

MiRCURY biofluids Kit (Exiqon, Denmark) был разработан сравнительно недавно как

альтернатива настоящим коммерческим методам, основанным на феноле. Метод основан

на денатурации комплексов биополимеров с микроРНК с последующим осаждением

нецелевых биополимеров и очисткой на микроколонках. Его преимуществом является

отсутствие фенола и трудоемкого этапа разделения фаз, что сокращает время,

необходимое для выделения и упрощает его использование [66]. Согласно

опубликованным данным, miRCURY biofluids превосходит другие коммерческие наборы

по выделению микроРНК из плазмы крови, включая Trizol LS, и позволяет получить

высокий выход микроРНК [65, 69] MiRCURY biofluids дал самый высокий выход

микроРНК как из экзосом, так и из культивируемых клеток. Это указывает на

эффективное разрушение комплексов с микроРНК, эффективную адсорбцию микроРНК

на колонках и высокую эффективность элюирования [65].

Cheng et al. сравнили шесть коммерческих наборов для выделения РНК, включая

miRCURY biofluids kit, используя экзосомы, полученные из мочи [70]. Авторы показали,

что miRCURY biofluids kit менее эффективен, чем miRNeasy kit с колонками RNeasy

MinElute (с обогащением микроРНК), miRNeasy kit (без обогащения микроРНК) и Urine

Exosome RNA Isolation kit (Norgen, Biotek). Тем не менее, эффективность выделения

miRCURY biofluids kit была сопоставима с mirVana PARIS (Ambion), а также реагентом

Trizol LS (Life Technologies) и mirVana (Ambion).

Наряду с известными мировыми брэндами в области выделения микроРНК были

предложены инновационные решения, не уступающие и даже превосходящие по

эффективности, качеству и скорости выделения микроРНК, отличающиеся простототой и

удобством использования [71, 72].

Тем не менее, на сегодняшний день не существует консенсуса в выборе оптимального и

единого метода для выделения микроРНК из биологических жидкостей, таких как кровь

или моча. При этом использование различных протоколов и коммерческих наборов

приводит к появлению противоречивых результатов. Таким образом, выбор оптимального

метода выделения микроРНК является важнейшей задачей в области исследования

микроРНК (раздел ―Технические затруднения, возникающие при стандартизации анализа

внеклеточных микроРНК‖).

36

1.9 Внеклеточные везикулы

Внеклеточные везикулы – гетерогенная группа покрытых мембраной микрочастиц,

различных размеров и формы, которые продуцируются про- и эукариотическими

клетками. Мембраны ВВ, образованные липидным бислоем с интегрированными в него

белками, защищают содержимое ВВ от протеаз и нуклеаз. В составе ВВ обнаружены

поверхностные рецепторы, мембранные и растворимые белки, липиды, рибонуклеиновые

кислоты (мРНК, микроРНК, тРНК, рРНК, малые ядрышковые РНК, малые кольцевые

ядрышковые РНК, piРНК, scaРНК, viral RNAs, Y-RNAs, длинные некодирующие РНК)

[57, 73, 74, 75], а также, по данным некоторых авторов, геномная и митохондриальная

ДНК [75, 76]. Особый интерес вызывает участие ВВ в межклеточной коммуникации за

счет горизонтального переноса белков, нуклеиновых кислот и других биологически

активных молекул [77].

ВВ были обнаружены во всех биологических жидкостях организма: крови, моче,

слюне, семенной жидкости, бронхоальвеолярном лаваже, желчи, асците, грудном молоке,

спинномозговой жидкости и т.д. [78]. Поскольку они секретируются клетками

практически всех тканей и органов, как в норме, так и при развитии патологических

процессов [79, 80], анализ содержимого ВВ позволяет получить информацию о

дифференцировочном/функциональном статусе родительских клеток. Очевидно, что в

зависимости от типа и представленности, клетки вносят разный вклад в пул экзосом ткани

или биологической жидкости, например, в генерацию пула микровезикул (МВ) крови

основной вклад вносят тромбоциты (до 70-90% от всего количества ВВ крови) [79],

другие гемопоэтические клетки, такие как ретикулоциты, B лимфоциты и T клетки,

тромбоциты, нейтрофилы, тучные клетки, дендритные клетки, макрофаги, а также клетки

других тканей организма, например, эпителиальные [81, 82]. Моча в основном содержит

ВВ из различных типов клеток сегментов нефрона, которые вступают в контакт с

первичной/вторичной мочой, в том числе ВВ клубочковых подоцитов, клеток почечных

канальцев [83], других эпителиальных клеток урогенитального тракта: мочевого пузыря,

предстательной железы.

Несмотря на большой интерес современных исследователей к изучению

внеклеточных везикул, связанный с участием этих частиц в межклеточной коммуникации

и транспорте потенциальных диагностически значимых молекул, исследователи до сих

пор используют большое количество терминов, зачастую описывающих одни и те же

37

везикулы. Например, применяют такие термины как экзосомы, эктосомы, микрочастицы,

микровезикулы, мембранные частицы, микровезикулы, отделяемые микровезикулы,

экзосомо-подобные частицы, апоптические пузырьки, промининосомы, простосомы,

дексосомы, тексосомы, эпидидимосомы, миграсомы, онкосомы и т.д. [78, 84, 85]. Однако,

большинство авторов, в качестве основных видов ВВ, выделяют экзосомы,

микровезикулы и апоптические тельца [83, 86, 87].

Различные виды ВВ отличаются по размеру, форме, набору переносимых

макромолекул, способу и источнику образования. Экзосомы - мембранные полостные

структуры однородной, сферической формы (согласно криоэлектронной микроскопии и

трекового анализа NTA) [88], с плотностью в сахарозе 1.13-1.19 g/ml, имеющие размеры

от 30 до 100-150 нм [79, 80, 87] и осаждающиеся центрифугированием в течение не менее

чем 1 часа при 100.000g. Экзосомы образуются в процессе формирования

мультивезикулярных тел и секретируются во внеклеточное пространство в результате

слияния мультивезикулярных тел с плазматической мембраной [79, 83]. На своей

поверхности экзосомы экспрессируют специфические маркеры, такие как белки семейства

тетраспанинов (CD63, CD9, CD81, CD82), flotillin, Tsg101, Alix, белки теплового шока

(HSP60. HSP70, HSPA5, CCT2 and HSP90) (77, 80, 81, 87, 89). Мембраны экзосом

содержат холестерол, сфингомиелин, фосфатидилинозит и церамид, липидные рафты,

связанные с рядом белков (тирозинкиназы Src, гликозилфосфатидилинозит-содержащие

белки и пр.), фосфотидилэтаноламин, фосфатидилсерин [76, 80, 81]. Теоретически в

состав каждой экзосомы наряду с вышеперечисленными липидами может входить ≤100

белков и ≤10000 нуклеотидов ДНК и РНК [66].

Микровезикулы представляют собой мембранные пузырьки различной формы от 50 до

1000 нм и более в диаметре [86], образуются путем выпячивания плазматической

мембраны из клетки наружу с последующим отделением образовавшегося пузырька от

мембраны клетки [83, 90]. Основными белковыми маркерами МВ являются интегрины,

селектины, CD 40, а также недавно предложенные ARF6 и VCAMP3 [81, 85]. Мембраны

микровезикул содержат холестерол, диацилглицерол, фосфатидилсерин в больших

количествах по сравнению с экзосомами [88].

Апоптические тельца отличаются от везикул другого типа достаточно крупными

размерами (500–4,000 nm) [91, 92]. Они образуются при апоптозе клеток различных типов

[80], характеризуются гетерогенной формой и отличаются плотностью в сахарозе 1.16-

1.28 g/ml. Осаждаются при центрифугировании с ускорением 10000-100000g. Как и МВ,

апоптические тельца экспонируют на поверхности мембраны фосфотидилсерин.

Основным белковым маркером апоптических телец являются гистоны [81], TSP and C3b

38

[85]. Апоптические тельца содержат фрагментированную геномную ДНК и клеточные

огранеллы, что отличает их от других типов ВВ [83, 85, 90].

Как уже упоминалось ранее, содержимое ВВ отражает тип и функциональное состояние

родительских клеток, и, в зависимости от состава, могут оказывать разное влияние на

клетки-мишени [93]. Созревание эритроцитов, адгезия тромбоцитов, лизис клеток,

презентация антигенов - вот далеко не полный список процессов, в которых ВВ играют

роль посредников [94]. Большое значение имеют ВВ при прогрессии опухолевого

процесса, перенося онкогенный материал, а также участвуют в патогенезе множества

заболеваний: нейродегенеративных и аутоиммунных, кардиоваскулярных нарушениях,

вирусных инфекциях, прионных болезнях и многих других [75, 94]. Благодаря этому и

своим биохимическим свойствам, ВВ являются перспективным источником биомаркеров

различных заболеваний [90] и могут представлять собой интерес с точки зрения

неинвазивной/малоинвазивной диагностики, оценки эффективности противоопухолевой

терапии и прогноза заболевания. Кроме того, удаление опухолевых циркулирующих ВВ

предлагается использовать для того, чтобы ингибировать развитие заболевания [95].

Особый интерес представляет использование ВВ для диагностики рака предстательной

железы [5].

ВВ естественным образом выделяются клетками, отличаются стабильностью в различных

средах организма, селективно распределяются по органам и тканям, иммунологически

инертны, и, в силу небольшого размера, способны проходить через биологические

барьеры. Таким образом, ВВ могут быть использованы для ткане- и органо-специфичной

доставки лекарств (DDS), повысить ее эффективность и уменьшить побочные эффекты

[96]. ВВ можно использовать для доставки хемотерапевтических препаратов, таких как

доксорубицин или куркумин, терапевтических микроРНК, белков и нуклеиновых кислот

[83, 97]. Следует упомянуть, что экзосомы, продуцируемые стволовыми клетками,

способны индуцировать процессы регенерации тканей, поэтому могут быть использованы

для лечения таких заболеваний, как инфаркт миокарда, и травм спинного, головного мозга

и многих других [75, 97].

1.9.1. Выделение внеклеточных везикул

Как следует из предыдущего раздела, получение и использование ВВ для

диагностики и терапии различных заболеваний, в том числе онкологических,

кардиологических, нейродегенеративных становится приоритетной задачей. При

39

планировании эксперимента, направленного на исследование и использование ВВ,

необходимо учитывать набор требований к получаемому материалу, которые и

определяют метод выделения ВВ. Очевидно, что если ВВ планируется использовать в

качестве источника диагностического материала, то необходимо получить максимальное

количество таких ВВ, а сохранение их структуры в этом случае не обязательно. Выделять

ВВ в этом случае лучше методами, обеспечивающими максимальный выход

диагностического материала при минимальной контаминации балластными

биополимерами. Такие ВВ будут более представлены в биологической жидкости,

непосредственно контактирующей с родительскими клетками. Например, при поиске

биомаркеров рака легкого наиболее подходящим для выделения микрочастиц будет

бронхоальвеолярный лаваж, а при изучении рака почки, предстательной железы или

мочевого пузыря – моча [93]. В случае, когда ВВ планируется использовать в качестве

средств для доставки лекарств, нужно применять методы, не нарушающие структуру ВВ,

и выбрать такой источник микровезикул, который позволяет получать ВВ с требуемой

ткане/органоспецифичностью. Например, для терапии иммунологических и

онкологических заболеваний ВВ выделяют из дендритных клеток [98, 99, 100, 101].

Традиционные способы выделения ВВ основаны на использовании таких свойств ВВ как

размер и плавучая плотность (ультацентрифугирование) [81, 102], микрофильтрация [103,

104], гель-фильтрация [104]. Несколько позднее появились методы выделения ВВ,

основанные на том, что ВВ в зависимости от состава раствора изменяют растворимость

и/или агрегируют (например, осаждение полиэтиленгликолем) [105, 106], протамином

[107], ацетатом натрия [108]. Кроме того, в последние годы было разработано большое

количество методов выделения популяций ВВ, основанных на высокоспецифичных

взаимодействиях с экспонированными на поверхности ВВ молекулами или применении

микрофлюидных технологий [104, 109, 110, 111]. Каждый из этих методов наряду с

преимуществами обладает и недостатками, которые важно учитывать при планировании

эксперимента [112], таблица 1.

Таблица 1. Длительность, основные преимущества и недостатки различных методов

выделения ВВ [112].

Метод Время,

мин преимущества недостатки

1.1Ультрацентрифугирование,

дифференциальное

центрифугирование:

140-600

Стоимость (если есть

ультрацентрифугирование),

изоляция из больших V,нет

Оборудование, сложность, неэкзосомальные

загрязнения, низкая воспроизводимость, мало РНК,

повреждение экзосом, на эффективность влияют разные

40

300g,10000g, 100000-200000g

(1,5 часа)

добавления хим в-в хар-ки роторов, силы g, вязкость образца, только 6

образцов одновременно на 1 ультрацентрифуге

1.2Ультрацентрифугирование

в градинте плотности

градиент плотности sucrose или

иодиксанола,

дифференциальное

центрифугирование

250- 2 дня

Чистота, при

ультрацентрифугировании в

иодиксаноле нет загрязнений

вирусными частицами. Нет

добавления хим в-в

Сложность, потери образца, ультрацентрифугирование,

Не отделяет крупные везикулы с аналогичными

скоростями седиментации, при

ультрацентрифугировании в сахарозе остаются

вирусные загрязнения

2.1 Ультрафильтрация

наномембрана или фильтры с

размером пор 0.8-0.1 мкм

130

Простота процедуры, много

образцов за раз, чистота, Нет

добавления хим в-в, нет

ограничений по объему

образца

Засорение фильтра, потеря образца, загрязнения (белки),

деформация везикул, небольшое кол-во экзосомальных

белков

2.2 Гидростатический диализ

мембранное разделение при

градиенте концентрации

30+ 1час-

75 ml

Подходит для анализа

высокоразбавленных

образцов (моча), стоимость,

нет добавления хим в-в;

стандартизует концентрацию,

объем и электролитный

состав образца

Необходимость дополнительной очистки образца мочи

от бактерий

2.3 Гель-фильтрационная

хроматография (SEC)

колонки, заполненные

полимерами с гетерогенными

порами

1мл/мин

+промывка

колонки

Воспроизводимость, чистота,

сохраняется целостность

везикул, использование

буферов с высокой ионной

силой позволяет убрать

неспецифические

загрязнения,

чувствительность, нет

потерь, масштабируемость,

большое количество

экзосомальных белков, нет

агрегации микровезикул,

высокая вязкость образцов не

ухудшает анализ, нет

добавления хим в-в

Ограничение по v, по кол-ву разделяемых пиков

(различие компонентов по мол. массе ≥ 10%),

оборудование, сложность, коизоляция крупных

белковых агрегатов и липопротеинов, только 1 образец

за раз, стоимость

3.1.1Полимерное осаждение

полиэтиленгликоль вызывает

осаждение везикул

65

Стоимость, простота

процедуры, нет деформации

везикул, не нужно доп.

оборудование, выделение

при pH, близких к

физиологическим, и высоких

ионных концентрациях

Загрязнения, присутствие полимера

3.1.2 Коммерческие киты для

полимерного осаждения:

Exoquik, TEI, Norgen. полимер

45-65

(иногда на

ночь)

Простота процедуры, нет

деформации везикул, не

нужно доп. оборудование,

Стоимость (особенно для разбавленных образцов, таких

как моча), воспроизводимость, загрязнения, присутствие

полимера, небольшое количество экзосомальных белков

41

вызывает осаждение везикул выделение при pH, близких к

физиологическим, и высоких

ионных концентрациях

3.2. Осаждение протамином 55+инкуба

ция (ночь)


процедуры, сохраняется

целостность и биологическая

активность везикул, чистота,

эффективность

Необходима очистка выделенной фракции от протамина,

липопротеинов (гепарин+гель-фильтрация),

длительность

3.3. Осаждение ацетатом

натрия pH ~4.75, 0.1M

acetate

130


процедуры, возможна работа

с большим объемом образцов

Загрязнение невезикулярными белками

3.4. Осаждение органическим

растворителем PROSPR,

охлажденный ацетон

105 Стоимость, простота, Агрегация в мультивезикулы

4. Двузфазное выделение

инкубация в смеси полиэтиен

гликоль и декстран

75-195


процедуры, нет деформации

везикул, чистота,

эффективность

Повторяющиеся замены PEG фазы, присутствие

полимера

Высокая селективность, стоимость, доступность

анитител, сложно отсоединить мол-лы и анализир

интактные везикулы (элюирующие буферы могут

нарушить функц активность микрочастиц), возможность

неспецифического связывания

5.1 Использование антител к

рецепторам ВВ. тетраспанинам

(CD 9,63,81), TSG101, EpCam,

флюоресцину

240 Чистота, высокая

селективность

5.2 Выделение при помощи

фосфатидилсерин-

связывающих белков

(анексин, TIM4).

12 ч

инкубация

Связывание легкообратимо,

простота Стоимость

5.3 Выделение при помощи

модифицированных

гепарином сорбентов

12 ч

инкубация

Х2

Стоимость, сохранение

функциональной

целостности экзосом

Необходима первичная очистка и концентрирование

(ультрацентрифугирование)

5.4 Выделение ВВ при помощи

связывания белков теплового

шока

< 1 часа сохранение функциональной

целостности экзосом Стоимость

5.5 Выделение ВВ при

помощи лектинов

12 ч

инкубация Стоимость, просота, чистота

Необходима первичная очистка и концентрирование (UC

или 20000g)

6. Микрожидкостные

устройства 14мкл/мин

Скорость, чистота,

эффективность выделения

Сложность конструкций, необходимость в

дополнительном оборудовании, стоимость

7. KeepEX, протокол

разведения мочи < 2 часов

Увеличенный выход ВВ по

сравнению с

ультрацентрифугированием

Оборудование, трудоемкость, ограничение числа

одновременно обрабатываемых образцов (до 6), и т.д.

42

1.9.2. Методы, применяемые для выделения внеклеточных везикул из мочи

Для выделения ВВ из мочи может быть использован ряд методов, таких как

ультрацентрифугирование, ультрафильтрация, гидростатический диализ, методы

полимерного осаждения, осажение ВВ при помощи лектинов.

Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки (таблица 1).

Ультрацентрифугирование является классическим методом выделения микровезикул и

основано на разделении частиц по их плавучей плотности.

Было показано, что ультрацентрифугирование позволяет выделить фракцию

микровезикул размером от 20 до 250 нм. В различных исследованиях выделенные

фракции демонстрировали присутствие следующих ВВ маркеров: CD9, CD63, CD81,

TSG101, Alix, Flotillin-1, AQP2 и FLT1. Полученная фракция ВВ позволяет выделять и

анализировать РНК и микроРНК в частности. Данные относительно контаминации

выделенных ВВ невезикулярными белками, такими как альбумин и уромодуллин или

белок Тамма-Хорсвалла (THP, Tamm-Horsfall protein) представлены в таблице 1.

Кроме наличия загрязнений в выделенных препаратах ВВ, существенным

недостатком метода дифференциального центрифугирования является длительность

процедуры, использование дорогостоящего оборудования, что ограничивает

производительность метода и возможность его использования в клинических

исследованиях и клинической диагностике (таблица 1). Более того, как правило, роторы

ультрацентрифуг способны вмещать не более 6-ти образцов. В то же время,

ультрацентрифугирование характеризуется рядом преимуществ: подходит для выделения

ВВ из больших объемов биологических жидкостей, использует очень ограниченное число

реактивов и расходных материалов, выделяемые микрочастицы находятся исключительно

под воздействием гравитационных сил и пипетирования; химические вещества, которые

могут затруднять дальнейший анализ ВВ и их содержимого не используются. Благодаря

перечисленным плюсам и хорошей воспроизводимости, ультрацентрифугирование

является наиболее часто используемым методом выделения.

Анализ статей, опубликованных в течение последних трех лет, демонстрирует, что

второе место по популярности после ультрацентрифугирования занимает метод,

основанный на осаждении микрочастиц в растворах полиэтиленгликоля (26,3% работ)

[112]. Действительно, полиэтиленгликоли (ПЭГ) разной молекулярной массы, давно

используются для осаждения белков, нуклеиновых кислот, вирусов и других мелких

43

частиц [113]. Этот метод основан на снижении растворимости соединений в растворах

супергидрофильных полимеров - полиэтиленгликолей. Вся процедура сводится к

смешиванию образца и раствора полимера, инкубации и последующему осаждению ВВ

при помощи низкоскоростного центрифугирования (1500хg). Осадок микровезикул

ресуспензируют в PBS для дальнейшего анализа. Неоспоримыми преимуществами

осаждения ВВ ПЭГ являются простота и скорость выделения, возможность работы при

физиологических pH растворов, слабая зависимость от концентрации ионов [112].

В отличие от таких методов как, например, ультрацентрифугирование или гель-

хроматография, осаждение ПЭГ-ом позволяет одновременно работать с большим

количеством образцов. Простота и скорость процедуры, масштабируемость, отсутствие

деформации везикул и необходимости в дополнительном оборудовании для выделения

ВВ делает этот метод привлекательным с точки зрения внедрения в клинические

исследования, однако ряд недостатков осложняет дальнейший анализ образца. Основной

недостаток метода осаждения ПЭГом – загрязнение полученного образца белками,

белковыми комплексами, липопротеинами, нуклеопротеинами, вирусными и другими

частицами [114, 115]. Кроме того, помимо крупных везикул и труднорастворимых

белковых агрегатов полученная фракция содержит еще и молекулы полимера, что

осложняет дальнейший анализ образца (масс спектрометрия, протеомный анализ, анализ

РНК). Удаление из образца контаминирующих примесей при помощи

центрифугирования, фильтрации или гель-фильтрации может быть использовано для

повышения чистоты препаратов ВВ [104].

Для выделения ВВ из мочи был предложен протокол, основанный на

концентрировании образца при помощи ультрафильтрации [116]. Авторы использовали

ультрафильтрационные ячейки с ультрамембранами, задерживающие белки с мол. массой

более 100 кДа и центрифугирование при 3000g. Протокол не использует

ультрацентрифугирование и пригоден для анализа образцов небольшого объема

(например, 0.5 мл мочи, что очень удобно при работе с клиническими архивами). Было

показано, что часть микровезикул может прочно связываться с мембраной, поэтому,

чтобы уменьшить потерю образца, необходима дополнительная промывка мембраны

[116]. В полученной фракции микровезикул выявляются экзосомальные маркеры, которые

не регистрируются в фильтрате, что свидетельствует об удержании ВВ нанопористой

мембраной. Морфология выделенных везикул соответствует таковым, выделенным при

помощи ультрацентрифугирования. Более поздние исследования показали, что препараты

ВВ, выделенные ультрафильрацией, характеризуются низким содержанием

микровезикулярных белков, таких как аквапорин и нефролизин, и достаточно высоким

44

содержанием невезикулярных белков, таких как альбумин и a-1-антитрипсин [117, 118].

Это факт связан с тем, что заявленные пределы отсечения молекул определенной мол.

массы ультрафильтрами, как правило, существенно ниже реальных и этим методом не

удается эффективно освободить микровезикулярную фракцию от невезикулярных белков

[97], а загрязнение балластными белками биологических жидкостей существенно

осложняет анализ белкового содержимого ВВ. Для того чтобы уменьшить потери за счет

необратимого связывания микровезикул с мембранами используют ультрафильтрацию

через гидрофилизованные мембраны с низким сродством к белку или гель-фильтрацию

[117, 119]. Однако, даже при использовании материалов с низким сродством к белку,

часть ВВ прочно связывается с мембраной [104, 119]. Для «продавливания» образца через

мембрану применяют центрифугирование, давление или вакуум, и, по мере

концентрирования образца, белковые молекулы и вновь формирующиеся агрегаты

биополимеров, блокируют поры мембраны [104], уменьшая скорость процесса,

увеличивая концентрацию балластных молекул и потери искомого материала [120]. Кроме

того, вопрос о деформации ВВ под действием давления, вакуума, контакта с мембраной

остается открытым и требует дополнительного изучения.

Тем не менее, данные ряда работ демонстрируют, что фильтрация позволяет

получить ВВ по морфологии, количеству частиц, контаминации невезикулярными

белками и представленности экзосомальных маркеров практически аналогичную таковой

при выделении ВВ ультрацентрифугированием [112].

В 2014 г. Musante с соавторами предложили протокол выделения микровезикул из

образцов мочи, основанный на гидростатическом диализе ‗‗hydrostatic filtration dialysis‘‘

(HFD) [121]. Основными преимуществами этого метода являются: отсутствие стадии

ультрацентрифугирования и возможность выделения ВВ из сильно разбавленных

растворов. Кроме того, в отличие от ультрацентрифугирования, выделение ВВ методом

гидростатического диализа, по заверениям авторов, не сопровождается потерей образца.

Для удаления клеток, бактерий, дебриса и, частично, агрегатов белка THP образцы мочи

центрифугируют с ускорением 2000 g. Полученный супернатант переносят в

разделительную воронку, соединенную с диализной мембраной, проницаемой для частиц

с молекулярным весом до 1000 kDa. За счет гидростатического давления мочи в воронке

жидкость с частицами с молекулярным весом до 1000 kDa проходит через мембрану при

этом из образца удаляются нежелательные компоненты и уменьшается объем образца.

Далее везикулы осаждают центрифугированием на 40.000 g. В результате авторы

получали везикулы размером 50–90 nm [121], содержащие экзосомальный маркер TSG101.

Было показано, что препараты ВВ, полученные по этому протоколу содержат

45

преимущественно РНК длиной менее 1000 nt с явным пиком РНК размером 10–40 nt; в

составе РНК отсутствуют рибосомные РНК. Позже, в работе Tataruch-Weinert с

соавторами была подтверждена эффективность этого метода и показано, что для

увеличения точности последующего РНК-анализа необходимо дополнительно очищать

образец мочи от бактерий [122]. Таким образом, гидростатический диализ позволяет

выделять микровезикулы более эффективно, быстрее и с меньшими потерями по

сравнению с ультрацентрифугированием [121], и представляет особый интерес при работе

с образцами большого объема, такими как моча.

Еще одним способом выделения ВВ из мочи – является использование лектинов.

Лектины - белки, связывающие обратимо, нековалентно и с высокой

специфичностью углеводные мотивы гликопротеинов, протеогликанов, гликолипидов.

Лектины обнаружены у растений, животных, микроорганизмов и отличаются по

аффинности к различным углеводам [123]. Известно, что на поверхности ВВ

экспонированы гликозилированные белки, участвующие в важных процессах в организме,

например, в транспорте белка [124]. При этом паттерны гликозилирования в норме и при

патологии могут отличаться [124].

Echevarria с соавторами изучили профиль гликозилирования ВВ мочи,

сконструировав микрочип, состоящий из 62 различных лектинов растений и грибов.

Сначала авторы сравнили эффективность связывания различных лектинов с

углеводными эпитопами экзосом мочи. Наибольшей аффинностью обладали лектины,

взаимодействующие с N-ацетил глюкозаминовыми и лактозоминовыми олигомерами -

Wheat germ agglutinin (WGA), Lycopersicon esculentum lectin (LEL), Solanum tuberosum

lectin (STL), причем лектин STL обладал максимальной аффинностью и специфичностью

к ВВ мочи [124].

Кроме того, было показано, что для выделения экзосом мочи могут также быть

использованы Concanavalin A (Con А), Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin (PHA-E),

Ricinus communis agglutinin (RCA), wheat germ agglutinin (WGA) и Sambucus nigra

agglutinin (SNA). Такие лектины, как Vicia villosa lectin (VVL), peanut agglutinin (PNA) и

Dolichos biflorus (DBL), Maackia amurensis (MAA), Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin

(PHA-L) и Lens culinaris agglutinin (LCA) мало перспективны для выделения ВВ [125]

Предложенный способ отличается простотой исполнения, позволяет выделять ВВ,

экспонирующие определенные маркеры, и может быть использован в рутинной

иммунодиагностической процедуре, однако не обеспечивает эффективного выделения ВВ,

переносящих РНК.

46

1.9.3. Проблема контаминации выделенных из мочи препаратов

внеклеточных везикул

ВВ мочи представляют собой удобный источник диагностического материала для

диагностики заболеваний мочеполовой системы. Количество и концентрация

невезикулярных белков мочи составляет в норме 0.033мг/мл [57], существенно меньше,

чем в плазме крови, что позволяет надеяться на меньшую контаминацию препаратов ВВ

мочи белками и другими биополимерами при выделении ВВ из мочи. К числу основных

белков мочи можно отнести человеческий сывороточный альбумин, Tamm-Horsfall Protein

(THP) или уромодуллин, Aquaporin-1, Aquaporin-2, uroplakin, а также аполипопротеины и

т.д [121].

Белок Тамма-Хорсфалла - гликопротеин с молекулярной массой 85 кДа, является

основным белком мочи [126, 127], который мешает выделению ВВ. Суточная экскреция

этого белка достигает 50-100 мг [128]. При кислом pH в присутствие ионов кальция и

калия [129]. ТНР-белок способен формировать трехмерную полимерную сеть. В

организме формируемая уромодулином гелеобразная структура задерживает бактерии и

препятствует распространению инфекции [130]. Кроме того, ТНР способен связывать

ионы кальция [131]. Тот факт, что уромодулин может формировать комплексы с

отрицательно заряженными мембранами через мостики из ионов кальция и формирование

гелеобразной сети приводят к удержанию ВВ, что в конечном итоге снижает выход

микровезикул [132].

Для высвобождения ВВ из комплексов с уромодулином было предложено несколько

способов: обработка дитиотреитолом (DTT), детергентом CHAPS, высаливание, [125, 133,

134, 135, 136, 137].

Наиболее распространенный метод – это обработка образца дитиотреитолом (ДTT),

который способен восстанавливать ZP-домен THP-белка, отвечающего за полимеризацию

филаментов [135]. Деполимеризация THP-белка в присутствие ДTT приводит к

высвобождению связанных с полимерной сетью везикул [103, 132, 138, 139, 140, 141, 142].

Несмотря на широкое распространение, использование ДТТ обладает существенным

недостатком - мономеры и часть полимеров THP остаются во фракции выделенных ВВ и

затрудняют дальнейший анализ компонентов ВВ. Кроме того, ДTT оказался эффективен

не во всех случаях [136].

CHAPS (d 3-((3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propanesulfonic) – является

цвиттерионным детергентом, который нарушает белок-белковые взаимодействия и

растворяет комплексы THP, сохраняя при этом функциональную и морфологическую

47

целостность везикул. Обработка мочи этим детергентом позволяет успешно удалить

основную часть ТНР и альбумина из ВВ препарата [103, 133]. Известно, что высаливание

при помощи 0.58 М NaCl осаждает мукопротеины мочи и в том числе THP белок. Метод

является простым и быстрым и позволяет уменьшить содержание THP белка во фракции

ВВ без изменения их свойств [125].

В 2016 г. Puhka и соавт. предложили разрушить арегаты уромодулина при помощи

изменения pH мочи до щелочных значений и уменьшением концентрации двухвалентных

ионов металлов при помощи этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) [143].

После центрифугирования с целью удаления клеток из мочи, супернатант

разбавляли холодным 20 mM Tris-HCl буфером , pH 8.6 или 20 mM Tris-HCl, 20 mM

EDTA буфером, pH 8.6/9.0 и инкубировали при +4°C в течение 1.5 минут. Образцы

центрифугировали, супернатант фильтровали через фильтры с диаметром пор 1.2 мкм и

осаждали ВВ ультрацентрифугированием. Полученные ВВ характеризовали при помощи

трансмиссионной электронной микроскопии, трекового анализа, вестерн болттинга.

РНК из ВВ выделяли с помощью miRNEasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany).

Образцы РНК анализировали, используя 2100 BioAnalyzer, (Agilent Technologies,

Santa USA) и Qubit (ThermoFischer Scientific). По размеру и морфологии опытные и

контрольные образцы были схожи, кроме того содержание РНК в прапаратах ВВ,

полученных опытными и контрольным образцами не отличалось. Однако в препаратах

ВВ, полученных по вышеописанной методике по данным вестерн-блота и NTA было

обнаружено в 2-7 раз больше ВВ белков [143].

Таким образом, в настоящее время предложено несколько способов высвобождения

ВВ из комплексов с уромодулином, однако на сегодняшний день эффективного способа

для решения данной проблемы не существует.

Современные методы инструментального анализа, такие как рентгеновская или

магнитно-резонансная томография, эндоскопические и ультразвуковые исследования и

т.д. не позволяют эффективно выявлять ранние стадии заболевания, в ряде случаев дают

избыточное количество ложноположительных результатов и ограничены по возможности

охвата больших групп населения, поскольку ориентированы на использование

дорогостоящего оборудования с невысокой производительностью, а интерпретация

полученных данных во многом зависит от опыта и квалификации специалиста. Исходя из

вышесказанного, использование для диагностики маркеров, присутствующих в таких

легкодоступных биологических жидкостях как периферическая кровь, моча и т.д.,

является очень перспективным, однако этот подход все еще недостаточно реализован в

современной клинической практике. Иммунохимический анализ внеклеточных

48

онкомаркеров в настоящее время широко используется, но не обладает необходимой

специфичностью и чувствительностью, в силу гетерогенности опухолей и в связи с тем,

что достаточное для измерения количество белкового антигена может быть секретировано

в кровь или мочу только после достижения опухолью определенного размера.

Несомненно, что на сегодняшний день в клинической практике требуется эффективный

скрининговый тест на РПЖ. Одними из потенциальных маркеров РПЖ могут являться

микроРНК, которые могут быть определены как в клеточном осадке мочи, так и в

бесклеточном супернатанте мочи после 17 тыс. g и фракции ВВ. Показано, что ВВ

различных биологических жидкостей, в том числе и мочи, являются перспективными

кандидатами для разработки современной малоинвазивной диагностики различных

заболеваний человека, включая рак предстательной железы. На сегодняшний день

существует ряд технических сложностей, связанных с отсутствием единых стандартов

выделения и анализа микроРНК мочи. Таким образом, разработка простых, эффективных,

экономичных и производительных методов выделения микроРНК и ВВ, пригодных для

последующего анализа (ОТ-ПЦР, микрочиповый анализ, полногеномное секвенирование,

масспектрометрия и протеомные исследования), а также диагностических и

прогностических систем рака предстательной железы на основе микроРНК является

актуальными задачами современной молекулярной биологии и диагностической

медицины.

49

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы

В работе были использованы следующие материалы: гуанидин изотиоцианат (Sigma,

США), ацетат натрия (Sigma, США), ацетат натрия (Sigma, США), октановая кислота

(Sigma, США), соляная кислота, спирт этиловый 96% перегнанный, 2-меркаптоэтанол

(Sigma, США), Трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) (Sigma, США), NaCl (Applichem,

Германия), полиэтиленгликоль 6000 (Sigma, США), полиэтиленгликоль 20000 (Sigma,

США), декстран синий 2000 кДа (Ferrak Berlin, Германия), полиакриламид (Sigma, США),

бисакриламид (Sigma, США), TEMED (Sigma, США), персульфат аммония (Fluka,

Швейцария), SDS (Sigma, США), бромфеноловый синий, натрий лимоннокислый, железо

сернокислое, нитрат серебра, ЭДТА (Fluka, Швейцария), PBS (ICN, США), хлороформ,

фенол, гликоген (Sigma, США), спирт изопропиловый перегнанный.

Реактивы без указания производителя являются препаратами отечественного

производства с квалификацией ОСЧ или ХЧ.

Праймеры, dNTPs были синтезированы в лаборатории органического синтеза,

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения

Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) с помощью стандартного фосфитамидного

метода и выделены с помощью ионообменной и обращеннофазовой ВЭЖХ. Для

проведения ПЦР использовался набор БиоМастер HS-qPCR (2×) (Биолабмикс, Россия).

Для выдления микроРНКиз плазмы крови и мочи использовался набор miRCURY biofluids

kit (Exiqon, Дания, #300112).

Для приготовления всех буферных растворов использовали воду, очищенную на

установке MilliQ фирмы Millipore (США), а затем подвергали стерилизации

фильтрованием через нитроцеллюлозный фильтр (0.22 мкм) фирмы Millipore (США).

2.1.2. Оборудование

В работе использовали центрифуги «Pico-Heraeus» и «K26-MLW Janetzki»

(Германия), рН-метр «Sartorius», центрифуги «Eppendorf 5415» (Германия) и «Optima L-

90K» (Beckman Coulter, США), шейкер «vortex-genie2» производства фирмы «Scientific

Industries», камера для вертикального электрофореза (BioRad, США), iCycler iQ5 (BioRad,

США), Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, США), cтекловолокнистые фильтры для сорбции

50

микроРНК (БиоСилика, Россия), электронный микроскоп JEM 1400 (80 кВ, Jeol, Japan) с

цифровой камерой Veleta (Olympus SIS, Германия), Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent

Technologies, США).

2.1.3. Клинические характеристики здоровых доноров, больных ДГПЖ и

больных РПЖ

Материалом для изучения микроРНК послужила моча ЗД, больных ДГПЖ и

больных РПЖ. Клинико-патологическая и демографическая характеристики доноров,

принимавших участие в исследовании, представлены в таблице 2А, 2Б.

В исследование были включены 10 первично обратившихся больных РПЖ в возрасте 56-

82 лет (средний возраст 70.7 лет), 10 мужчин с ДГПЖ в возрасте 52-80 лет (средний возраст

68.1 лет) и 10 ЗД в возрасте 48-65 лет (средний возраст 57.4 лет). Группы для исследования

формировали после подтверждения диагноза на основании клинического, морфологического,

рентгенологического обследования и по результатам оперативного вмешательства. Образцы

крови и мочи ЗД, больных РПЖ и ДГПЖ были получены из Федерального сибирского

биомедицинского исследовательского центра им. Е.Н. Мешалкина (Новосибирск, Россия) и

Центра новых медицинских технологий ИХБФМ СО РАН (Новосибирск, Россия) после

одобрения исследования этическими комитетами обеих организаций. Письменное

информированное согласие было предоставлено всеми участниками. Группы пациентов с

ДГПЖ и РПЖ формирвали на основании жалоб пациентов, уровню ПСА крови,

гистологическому заключению биопсийного или послеоперационного материала. Критериями

вхождения для больных РПЖ являлись: стадия Т2-3N0M0. уровень ПСА крови выше

10 нг/мл. Критериями вхождения для больных ДГПЖ было клиническое подтверждение

диагноза и отсутствие иных онкологических заболеваний предстательной железы или других

локализаций в анамнезе. Группу ЗД формировали по уровню ПСА крови (не выше 2.8 нг/мл

плазмы), отсутствию жалоб со стороны мочеполовой системы, отсутствию любых

заболеваний мочеполовой системы (включая онкологические).

51

Таблица 2А. Клинико-патологическая и демографические характеристики ЗД, пациентов

с ДГПЖ и больных РПЖ: общие данные.

Здоровые ДГПЖ РПЖ

n=10 n=10 n=10

Возраст

среднее 57,5 68 70.5

медиана [1;3

квартиль] 57 [52; 64] 66 [61; 78] 74 [65; 76]

диапазон 48-66 53-81 56-82

Общий ПСА, нг/мл

среднее 0.817 11,6 16,3

медиана [1;3

квартиль] 0.91 [0.4; 1.1] 8.5 [5; 10.9] 14 [11.2; 21.3]

диапазон 0.13-1.54 1.97-41.5 9.24-26.4

Стадия РПЖ T2-3NxMx

T2 5[50%]

T3 5[50%]

Nx 10[100%]

Mx 10[100%]

Индекс Глисона 6 5[50%]

Индекс Глисона 7 5[50%]

Таблица 2Б. Клинико-патологическая и демографические характеристики ЗД, пациентов

с ДГПЖ и больных РПЖ. Приведены данные по каждому донору.

Здоровые ДГПЖ РПЖ

№

донора

Возраст,

лет

Общий

ПСА

нг/мл

№

донора

Возрас

т, лет

Общий

ПСА

нг/мл

№

донора

Возраст,

лет

Общий

ПСА

нг/мл

Стадия

по TNM

Индекс

Глисона

1 61 0,33 1 60 1,97 1 60 14,2 T2bNxMx 7

2 66 0,81 2 79 5,45 2 66 15 T3bNxMx 7

3 48 1,01 3 81 33 3 64 476 T2cNxMx 6

4 64 1,54 4 53 4,7 4 76 23,7 T3aNxMx 6

5 51 0,39 5 78 41,5 5 56 10,3 T2bNxMx 6

6 62 0,42 6 65 10,9 6 73 30 T3bNxMx 7

7 53 0,13 7 78 17,2 7 82 13,88 T3bNxMx 6

8 51 1,39 8 66 9,4 8 78 9,24 T2bNxMx 6

9 53 1 9 58 8,48 9 75 23 T2bNxMx 7

10 66 1,15 10 62 5 10 75 26,4 T3aNxMx 7

52

2.2. Методы

2.2.1. Забор образцов крови

Кровь от ЗД и больных пациентов собирали путем венепункции иглой № G18 ½

(самотеком) в пробирки, содержащие 2 мл раствора (10 мМ Трис-HCl, 0.15 М NaCl,

50 мМ ЭДТА рН 7.5), до объема 10 мл либо с использованием вакутейнеров. Сразу после

взятия образца крови содержимое пробирок перемешивали аккуратным переворачиванием

5 раз в течение 10-15 секунд и хранили до обработки не более 4 часов при 4°С.

2.2.2 Обработка образцов крови и мочи

Венозную кровь собирали в вакутейнеры с нанесенным распылением EDTA (BD, №

368589) и фракционировали плазму и клетки крови в течение 4 часов после взятия крови.

Кровь центрифугировали при 400 × g в течение 20 мин, переносили в новые пробирки.

Супернатант отбирали в новую пробирку и центрифугировали при 800g в течение

20 минут. Мочу собирали у участников и сразу фракционировали двумя

последовательными центрифугированиями при 400 × g и 17 000 × g, при 20 ° C в течение

20 мин. Супернатанты образцов плазмы и мочи у 10 доноров хранили замороженными в

аликвотах при -20 ºC. Перед выделением микроРНК образцы плазмы крови или мочи

размораживали, осторожно перемешивали и центрифугировали при 3000g в течение 5

мин. Аликвоты были разморожены один раз.

2.2.3. Ультрацентрифугирование

Объем 500 мкл человеческой плазмы или 5 мл человеческой мочи после

центрифугирования при 17 тыс.g. разбавляли до 12 мл в забуференном фосфатом

физиологическом растворе (PBS) и переносили в пробирку на 14 мл для центрифуги Ultra-

ClearTM (Beckman Coulter, Brea, CA) и центрифугировали в течение 1,5 ч при 100000g при

18°С в центрифуге Beckman Coulter Optima TM L-90k (ротор Sw 40Ti, Beckman Coulter).

Осадок ресуспендировали в 10 мл PBS на стадии промывки и снова центрифугировали

при тех же условиях. Наконец, осадок ресуспендировали в PBS (500 мкл), замораживали в

жидком азоте и хранили при -80°С для последующей экстракции РНК или анализа ВВ.

53

2.2.4. Протокол выделения внеклеточных везикул из мочи

Для уменьшения загрязнения препарата невезикулярными частицами (клетки,

клеточный дебрис, апоптические тельца) на первом этапе образец биологической

жидкости подвергают низкоскоростному центрифугированию сначала при 300-400g в

течение 20 минут и 800g в течение 20 минут, затем центрифугированию при 16.000-

18.000g в течение 20 минут для крови или 300-400g в течение 20 минут и 16.000-18.000g в

течение 20 минут для мочи. Отбирают супернатант и переносят в новую емкость. Затем к

полученному супернатанту последовательно добавляют раствор NaCl до концентрации

0.154-0.3М для выделения из мочи или 0.48-0.6М для выделения из плазмы крови, далее

добавляют раствор, содержащий 1M TrisHCl рН 7.0 до конечной концентрации 50 мМ,

затем раствор декстрана синего (Dextran Blue) c мол. массой 2000 кДа до конечной

концентрации 4-8 мкг/мл и полиэтиленгликоль (ПЭГ) с мол. массой 20 кДа до

концентрации 1,5-5%. Смесь перемешивают после добавления каждого компонента,

инкубируют в течение 20 минут при 4°С и центрифугируют при 16.000 -18.000g в течение

20 минут. Полученный супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в PBS и используют

для определения концентрации (количественного анализа) требуемых биомаркеров,

например, микроРНК.

2.2.5. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ)

Свежие образцы ВВ / экзосом (20 мкл) адсорбировались в течение 1 минуты на медных

сетках, покрытых формирующей пленкой и стабилизированных углеродом. Решетки

экспонировали в течение 5-10 секунд на капле 0.5% уранилацетата, затем избыток

жидкости удаляли с использованием фильтровальной бумаги, сетки сушили на воздухе.

Количество ВВ, оценивали с использованием 36 изображений ТЭМ от трех ЗД и трех

пациентов с РПЖ (шесть изображений на пациента, среднее число частиц на изображение

39, не менее 200 частиц на пациента).

Счет частиц был выполнен вручную с шагом 10 нм; например, группа 31-40 нм содержит

частицы размером ≥30.01 нм, но ≤40 нм. Для оценки экспрессии экзосомальных

рецепторов 10 мкл суспензии экзосом размораживали и инкубировали в течение 18 ч на

орбитальном шейкере с 10 мкл 0.5% бычьего сывороточного альбумина (БСА)/ФБ

(фосфатный буфер) и 3 мкл мышиных моноклональных антител против CD63, CD24 и

CD9 (Abcam, 100 мкг / мл). После инкубации экзосомы адсорбировали в течение 1 минуты

54

на медных сетках, покрытых формовочной пленкой, и стабилизировали углеродом,

дважды промывали PBS и инкубировали с конъюгатом белка А-коллоидного золота в

течение 2 ч во влажной камере на шейкере при комнатной температуре с двумя

промывками с PBS, затем окрашивали фосфорвольфрамовой кислотой, как описано ранее

[144, 145].

Сетки анализировали с использованием просвечивающего электронного микроскопа JEM

1400 (80 кВ, Jeol, Japan) с цифровой камерой Veleta (Olympus SIS, Германия). Измерения

проводились непосредственно на экране с использованием программного обеспечения

iTEM (Olympus SIS, Германия).

2.2.6. Протокол выделения микроРНК из плазмы крови с октановой кислотой

Образец 150 мкл плазмы крови смешивали с 4,5 мкл 2-меркаптоэтанола, 100 мкл

денатурирующего буфера (0.6 М гуанидин изотиоцианата (Gu) в конечной

концентрации), 150 мкл буфера для осаждения, содержащего 0.8 М ацетата натрия, рН 4,0

и 0.5% октановой кислоты (OcA), в конечных концентрациях. Смесь встряхивали в

течение 5 секунд и инкубировали в течение 3 минут при комнатной температуре. Перед

нанесением на колонки образец центрифугировали на настольной центрифуге с

максимальной скоростью (около 10 000 × g) в течение 3 минут. Супернатант наносили на

колонку с фильтром (например, BioSilica Ltd, Россия) на вакуумном коллекторе или с

помощью настольной центрифуги, не более 500 мкл за одно нанесение. Проскок удаляли.

Колонку дважды промывали 300 мкл промывочного буфера, содержащего 5 М

гуанидиизотиоцианата, 10 мМ Трис-ацетата, рН 6,5, 50% этанола и 1% 2-

меркаптоэтанола. После второй промывки колонку сушили центрифугированием при

10000 × g в течение 1 мин. Проскок удаляли. Колонку дважды промывали 300 мкл

промывочного буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0.1 М NaCl, 75% этанола). После второй

промывки колонку сушили центрифугированием при 10000 × g в течение 1 мин. Проскок

удаляли. Для элюирования РНК 120 мкл раствора для элюции BioSilica с 10 мМ

этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) рН 9,5 наносили на центр фильтра и

центрифугировали при 400 × g в течение 15 минут, а затем сушили при 10000 g в течение

1 мин. Проскок содержит очищенную микроРНК.

55

2.2.7. Протокол выделения микроРНК из мочи с октановой кислотой

Образец 400 мкл мочи смешивали с 10 мкл 2-меркаптоэтанола, 200 мкл денатурирующего

буфера, содержащего 0.3-1,35 М Gu, 400 мкл осаждающего буфера, состоящего из 0.8 М

ацетата натрия, рН 4,0 и 0.5-2,5% OcA (оптимальные условия - 1,35 M Gu, 1,5% OcA (pH

4.0) см. Результаты и обсуждение). Последующие этапы выделения выполнялись в

соответствии с ранее описанной процедурой для плазмы крови.

2.2.8. Кислая экстракция фенол-хлороформом микроРНК из плазмы крови и

мочи

РНК выделяли из 150 мкл плазмы крови или 400 мкл осветленной мочи. Кислую фенол-

хлороформную экстракцию проводили, как описано в Chomczynski, Sacchi [15]. 150 мкл

плазмы смешивали с 4,5 мкл 2-меркаптоэтанола и 300 мкл денатурирующего буфера (6,75

М Gu) в Eppendorf пробирке объемом 2 мл. Смесь перемешивали в течение 5 секунд.

Затем добавляли 45 мкл 2 М ацетата натрия (рН 4,0), 450 мкл насыщенного водой фенола

и 90 мкл хлороформа / изоамилового спирта (49: 1). Смесь встряхивали в течение 5

секунд, инкубировали в течение 15 мин на льду и центрифугировали при 10000 × g в

течение 20 мин при 4 ° С.

После разделения фаз собирали водную фазу, смешивали с равным объемом этанола и

наносили на колонку с фильтром (BioSilica Ltd., Россия). Последующие этапы выделения

выполнялись в соответствии с ранее описанной процедурой для плазмы крови и мочи.

2.2.9. Выделение микроРНК из биологических жидкостей с помощью Exiqon

miRCURY biofluids kit (Exiqon, Дания)

Выделение из плазмы крови и мочи проводили с использованием Exiqon miRCURY

biofluids kit [#300112] согласно протоколам производителя. Дополнительную стадию

осаждения РНК, как описано ниже, проводили для обеспечения чистоты препаратов

микроРНК.

56

2.2.10. Протокол выделения микроРНК из внеклеточных везикул мочи с

октановой кислотой

Для выделения микроРНК из ВВ мочи использовали метод, описанный выше.

К 200 мкл ВВ мочи последовательно добавляли 100 мкл денатурирующего раствора

(0.6 М гуанидин изотиоцианат, 1% 2-меркаптоэтанол, 20 мМ Трис-ацетат, рН 4,0) и 200

мкл буфера для осаждения (0.5% октановая кислота, 0.8 М ацетат натрия, pH 4,0).

Смесь перемешивали, инкубировали в течение 3 минут при комнатной температуре.

К супернатанту добавляли равный объем 96% этанола, наносили на микроколонку

BioSilica (BioSilica Ltd, Россия) и выделяли микроРНК, как описано выше.

2.2.11. Осаждение микроРНК изопропанолом

Для осаждения микроРНК к 120 мкл элюата добавляли 1,5 мкл гликогена (20 мг/мл)

и 12 мкл 3М ацетата натрия (pH 7.4), затем перемешивали и добавляли 140 мкл

изопропанола. Полученную смесь перемешивали, инкубировали при -20ºС в течение 30

минут и центрифугировали при 13000g при 4ºС в течение 15 мин. Супернатант удаляли

декантацией, осадок последовательно промывали 500 мкл 75% этанола и 500 мкл 96%

этанола. Осадок сушили на воздухе и растворяли в 15 мкл воды. Полученные образцы

микроРНК хранили при -80ºС.

2.2.12. Анализ нуклеиновых кислот плазмы крови и мочи

Распределение по размеру РНК, выделенной из плазмы крови и мочи протоколом Gu /

OcA, анализировали с использованием капиллярного электрофореза (Agilent 2100

Bioanalyzer, Agilent Technologies, США). Образцы РНК (2 мкл) анализировали с помощью

Agilent Small RNA Analysis Kits в соответствии с протоколом производителя.

Электрофореграммы анализировали с использованием программного обеспечения Agilent

2100 Expert B.02.07.

57

2.2.13. Обратная транскрипция и количественная полимеразная цепная

реакция

Обратную транскрипцию (ОТ) микроРНК выполняли, как описано Chen et al. [146].

Праймеры и зонды для обратной транскрипции и TaqMan были синтезированы в

Лаборатории медицинской химии (ИХБФМ СО РАН, Новосибирск). Каждая ОТ-реакция

проводилась в общем объеме 20 мкл и содержала 5 мкл РНК, 50 нМ каждого из РНК-

специфических праймеров, 1 единицы RiboLock RNAse inhibitor (Fermentas, Vilnius,

Lithuania], 100 единиц обратной транскриптазы MMLV (Fermentas, Vilnius, Lithuania),

4 мкл реакционного буфера 5 × MMLV (250 мМ Трис-HCl (рН 8,3 при 25 ° C), 250 мМ

KCl, 20 мМ MgCl2, 50 мМ DTT) и 250 мкМ каждого dNTP. Условия реакции были

следующими: 16°С в течение 30 мин, 42 ° С в течение 30 мин и 70 ° С в течение 10 мин.

Отрицательный контроль не включал образцы РНК.

ПЦР в режиме реального времени проводилась на iCycler iQ5 Real-Time PCR Detection

System (Bio-Rad, США). Все реакции проводили в дубле в общем объеме 30 мкл. Каждая

реакция содержала 5 мкл продукта ОТ-реакции, 1,25 ед. ДНК-полимеразы Taq

(BiolabMix, Россия), 3 мкл 10 × ПЦР-буфера (750 мМ Трис-HCl (pH 8,8 при 25oC], 200

мМ (NH4)2SO4, 0.1% (об./об.) Tween 20, 4 мМ MgCl2, 250 мкМ каждого dNTP, 600 нМ

прямого праймера, 800 нМ универсального обратного праймера и 300 нМ

специфического зонда TaqMan. После начальной денатурации при 95°С в течение 3 мин

реакции проводили в течение 50 циклов при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 45 с.

2.2.14. Электрофорез в денатурирующих условиях по Леммли и Вестерн-блот

Образцы супернатантов мочи разделяли в 10-20% полиакриламидном геле (соотношение

полиакриламидного геля 30:1), как описано ранее, с помощью SDS PAGE с

использованием буферов Леммли и 4,5% концентрирующего геля [147]. Перед

нанесением на гель образцы инкубировали при 95°С в течение 5 мин в буфере (62,5 мМ

Трис-HCl (рН 6,8), 10% глицерин, 0.5% SDS, 2,5% 2-меркаптоэтанол), содержащем

бромфенол синий, а затем центрифугировали в течение 5 мин при 17000 × g. Белки

переносили из геля на нитроцеллюлозные мембраны в Вестерн-блот-буфере (217 мМ

58

Трис-глицин (рН 8,6), 9,5% этанола), мембрану окрашивали коллоидным серебром, как

описано ранее [148].

2.2.15. Профилирование микроРНК во фракциях бесклеточного супернатанта

мочи после центрифугирования при 17 тыс. g и внеклеточных везикул мочи с

использованием платформы miRCURY LNA miRNA qPCR Panels Urine (Exiqon,

Дания)

Сравнительный анализ профиля экспрессии микроРНК во фракциях бесклеточного

супернатанта мочи после центрифугирования при 17000g и ВВ мочи проводили с

использованием платформы miRCURY LNA miRNA qPCR Panels Urine (Exiqon, Дания) с

аналитической маркерной панелью из 84 микроРНК, выбранных нами на основе анализа

доступной литературы и баз данных.

2.2.16. Статистический анализ профиля экспрессии микроРНК во фракциях

бесклеточного супернатанта мочи после центрифугирования при 17 тыс. g и ВВ мочи

здоровых доноров, пациентов с ДГПЖ и больных РПЖ

Статистический анализ выполнен в среде R (R Core Team (2017). R: A language and

environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.

URL https://www.R-project.org/.) (пакеты RandomForrest, Boruta, pROC). Пороговые

значения всех микроРНК (значения Ct) были нормализованы при помощи метода парных

отношений [149, 150]. Значимые комбинации пар микроРНК отбирали с помощью feature

selection algorithm Boruta на базе метода классификации RandomForest. Всего было

составлено 3403 комбинации. Поскольку часть микроРНК не была детектирована в

образцах от некоторых доноров, чтобы не выпускать из рассмотрения выпавшие

микроРНК, использовали следующий подход: на первом этапе случайным образом (выбор

без возвращений) для каждой группы выбирали 9 значений для каждой комбинации пар

микроРНК. Далее, на основе алгоритма Boruta, оценивали значимость этих комбинаций

как предикторов РПЖ, ЗД или ДГПЖ. Такая процедура проводилась 1000 раз. На каждой

итерации фиксировали значимые предикторы. Затем оценивали разность медиан

отобранных пар микроРНК между группами и строили 95% доверительный интервал с

помощью bootstrap подхода [151]. Из дальнейшего рассмотрения исключали те

комбинации, для которых доверительный интервал включал нулевое значение. Для

59

оставшихся комбинаций микроРНК проводили сравнение групп с помощью

перестановочного теста Манна-Уитни (Asymptotic Wilcoxon-Mann-Whitney Test).

Достоверными считались отличия между группами с p<0.05.

Для корректировки уровня статистической значимости при проведении множественных

сравнений применялся алгоритм Бенджамини-Хохберга (padj). Для исследования

диагностической значимости комбинаций микроРНК проводили расчет площади под

ROC-кривой (AUC), оценивали чувствительность и специфичность разделения

исследуемых групп.

60

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Разработка метода выделения внеклеточных везикул из мочи

Идеальный метод должен не только эффективно выделять ВВ, но и обладать такими

качествами как воспроизводимость, низкая стоимость, возможность адаптации для

анализа различных биологических жидкостей, параллельная обработка большого

количества образцов, быстрота и легкость анализа и т.д. До сих пор метода, сочетающего

в себе все эти качества и подходящего для всестороннего анализа состава ВВ, разработано

не было.

Одной из задач этой работы являлась разработка простого и эффективного метода

выделения ВВ из биологических жидкостей, подходящего для научных и клинических

исследований содержимого ВВ, а именно, переносимых ими микроРНК. В качестве

контрольного метода выделения был выбран метод ультрацентрифугирования, как

наиболее распространенный и изученный, своеобразный ―золотой стандарт‖ среди

различных способов выделения ВВ. Для разработки и оценки эффективности нового

метода были использованы образцы крови и мочи ЗД и больных РПЖ.

Для того, чтобы получить чистые препараты микроРНК из везикул, которые не содержали

бы примесей ингибиторов ферментативных реакций, нами был разработан метод

выделения микровезикул из мочи. Метод основан на использовании преципитирующего

реагента – полиэтиленгликоля в присутствие дополнительного мембранотропного

реагента, позволяюшего дополнительно агрегировать микрочастицы – голубого декстрана.

Нами были оптимизированы концентрации всех реагентов (таблица 3), Было

обнаружено, что наиболее оптимально удаление ингибиторов ПЦР и выделение ВВ из

мочи происходит при следующем составе осаждающего раствора: 0.154М NaCl, 50 мM

TrisHCl, 4мкг/мл Dextran Blue (2000 кДа), 1,5% ПЭГ(20 кДа) и 0.3 М NaCl, 50 мM TrisHCl,

8 мкг/мл Dextran Blue (2000 кДа), 5,0% ПЭГ(20 кДа).

Предлагаемый способ позволяет выделять ВВ из мочи с большей эффективностью

по сравнению с прототипом (выделение ВВ с помощью 10% ПЭГ(6000)) и

ультрацентрифугированием, а также позволяет сократить время выделения ВВ на 16.67%

по сравнению с прототипом и на 65% по сравнению с ультрацентрифугированием.

61

Таблица 3. Сравнительный анализ эффективности выделения микроРНК из фракции ВВ

мочи, разработанным протоколом ПЭГ+Dextran Blue, способом-прототипом (10%

ПЭГ(6000)), а также с различными растворами для осаждения ВВ, представлен в таблице

1, где Ct – значение порогового цикла, ∆Ct –разница значений пороговых циклов, SD –

стандартное отклонение, * - номер донора. Чем меньше разница значений пороговых

циклов, тем больше микроРНК содержится в образце и соответственно выше выход.

Данные представлены по miR-19b.

Наличие ВВ в препаратах, полученных протоколом ПЭГ+Dextran Blue, подтверждается

результатами ТЭМ при сравнении со стандартным ультрацентрифугированием,

рисунок 1 А, Б. Анализ ВВ выполнен в Институте цитологии и генетики СО РАН (ИЦиГ

СО РАН, сектор структурной биологии клетки). На полученных изображениях видно, что

оба препарата содержат ВВ. В образцах мочи, полученных при помощи протокола

ПЭГ+Dextran Blue отмечается формирование агрегатов ВВ, рисунок 1 А.

Метод выделения

∆Ct = Ct (метода выделения)- Ct

ультрацентрифугирования

Среднее

∆Ct SD

1* 2* 3* 4* 5* 6* 7* 8*

10% ПЭГ(6000) 4,43 4 3,73 3,9 4,26 3,96 3,66 4,81 4,09 0.39

5% ПЭГ (20000) 2,2 2,24 2,7 2,01 2,28 2,55 2,63 2,31 2,37 0.24

1,5% ПЭГ (20000) 2,29 2,95 2,77 1,69 1,92 2,22 2,47 1,89 2,28 0.44

4мкг/мл Dextran Blue

(2000 кДа),, 1,5% ПЭГ

(20000)

1,78 1,7 1,3 1,84 2,12 1,52 0.93 1,55 1,59 0.36

50mM TrisHCl, 4мкг/мл

Dextran Blue(2000 кДа),

1,5%ПЭГ (20000)

0.61 1,2 0.79 0.96 0.66 0.61 1,3 0.77 0.86 0.27

0.154 M NaCl, 50mM

TrisHCl, 4мкг/мл Dextran

Blue (2000 кДа),, 1% ПЭГ

(20000)

-0.8 -0.23 -0.63 -0.6 -0.4 -0.5 -0.8 -0.69 -0.57 0.20

0.3M NaCl, 50 мM

TrisHCl, 8 мкг/мл Dextran

Blue (2000 кДа), 5% ПЭГ

(20000)

-0.7 -0.34 -0.67 -0.7 -0.5 -0.5 -0.8 -0.44 -0.58 0.15

62

А Б

Рисунок 1: А. Трансмиссионная электронная микроскопия препаратов внеклеточных

везикул мочи, полученных при помочи протокола ПЭГ+Dextran Blue.

Б. Трансмиссионная электронная микроскопия препаратов внеклеточных везикул мочи,

полученных при помощи ультрацентрифугирования.

Таким образом, разработанный протокол ПЭГ+Dextran Blue не уступает

ультрацентрифугированию по эффективности выделения ВВ, а также время выделения

ВВ после пробоподготовки, включающей осаждение клеток и клеточного дебриса,

составляет 50 минут, этот метод может быть использован для серийного выделения ВВ из

клинических образцов. Однако в виду необходимости проведения дополнительных

сравнительных исследований препаратов ВВ (полученных при помощи протокола

ПЭГ+Dextran Blue) на большей выборке доноров, в последующей работе все препараты

ВВ выделяли методом ультрацентрифугирования.

3.2. Описание внеклеточных везикул мочи здоровых доноров и больных раком

предстательной железы

Анализ ВВ был выполнен в Группе микроскопических исследований ИХБФМ СО РАН.

По данным ТЭМ образцы мочи здоровых доноров и больных пациентов содержат

многочисленные микровезикулы размер основной части которых варьирует от 20 до

230 нм (рисунок 2). Среди этих частиц были идентифицированы экзосомы, имеющие вид

сферических пузырьков, либо «чашек». Доля экзосомо-подобных частиц размером 30-

100 нм в моче составляла около 95% у здоровых доноров и 90% у больных РПЖ, а

крупных частиц (100-230 нм) – 5 и 10% от всех микрочастиц, соответственно. Методика

63

замера микрочастиц описана выше. Подсчет проводили с препаратов микрочастиц,

полученных от 3-х здоровых доноров и 3-х больных РПЖ. На каждого пациента делалось

не менее 6 фотографий различных полей, в каждом поле было от 5 до 72 частиц

различного размера. Подсчет частиц проводили вручную, объединяли их в группы с

шагом в 10 нм, например, группа «31-40 нм» содержит частицы размером >30 нм (т.е. от

30.01 нм), но ≤40 нм. По критерию Манна-Уитни эти отличия не достоверны.

Рисунок 2. Распределение внеклеточных везикул мочи по размеру.

По данным ТЭМ, антитела к CD63, CD9 и CD24 связывались с поверхностью экзосом,

выделенных из мочи здоровых доноров и больных раком простаты, частицы коллоидного

золота (коньюгат золота с белком А) наблюдались на поверхности экзосом (таблица 4).

Таблица 4. Экзосомы мочи здоровых доноров и больных раком предстательной

железы, выделенные путем ультрафильтрации и двукратного ультрацентрифугирования и

их идентификация с помощью специфических антител и конъюгата белка А с коллоидным

золотом.

64

СД63 СД24 СД9

Здоровый

донор

№21

Здоровый

донор

№29

Больной

РПЖ

№49

Больной

РПЖ

№58

Эти результаты демонстрируют, что (1) в моче здоровых доноров и больных РПЖ

присутствуют микрочастицы размером преимущественно 20-200 нм; (2) не менее, чем

90% этих частиц имеет размер 30-100 нм и экспрессируют рецепторы СД63, СД24 и СД9

и, поэтому, по-видимому, являются экзосомами.

3.3. Выбор оптимальных условий выделения микроРНК из плазмы крови и

мочи здоровых доноров

Более 50 лет назад было показано, что в низких (0.04 М) концентрациях октановая кислота

(ОсА) (и некоторые другие жирные кислоты) формирует нерастворимые комплексы с

большинством белков плазмы крови, включая α- и β-глобулины, а в более высоких

65

концентрациях - с альбуминами и глобулинами [152]. Позднее OcA была успешно

использована для выделения иммуноглобулинов из плазмы крови [153, 154].

Так как хаотропные эффекты только одного Gu неспособны в полной мере разрушить

комплексы микроРНК с белками и другими биополимерами [155], необходимы реагенты,

нарушающие гидрофобные взаимодействия, микроРНК с биополимерами и

способствующие их высвобождению из таких комплексов [71]. Из-за сродства OcA к

гидрофобным остаткам (способность образовывать/разрушать гидрофобные

взаимодействия) она способна эффективно связывать/разрушать биологические мембраны

и комплексы липопротеинов. Таким образом, мы предположили, что комбинация двух

денатурирующих / осаждающих агентов - Gu и OcA позволит разрушить комплексы

микроРНК с биополимерами биологических жидкостей и частично осадить белки.

Поскольку осаждение белков или разрушение циркулирующих комплексов микроРНК, в

том числе и микроРНК в составе микрочастиц, покрытых оболочкой, в присутствии OcA и

Gu трудно прогнозировать, исходя из доступных данных, нами был протестирован

широкий диапазон условий, который позволил бы подобрать оптимальные концентрации

реагентов и условия их инкубации с мочей и плазмой крови.

Чтобы оценить эффективность протокола, различные концентрации Gu и OcA добавляли к

200 мкл плазмы крови или 400 мкл мочи, полученных от ЗД. Остаточное количество белка

в супернатанте определяли с использованием спектрофотометра Genesys 10 UV (Thermo

Scientific, США) на 260 и 280 нм. Перед проведением измерений на спектрофотометре

образцы разбавляли в 10 раз 0.02 М Tris/HCl и 0.15 М NaCl, pH 7,5 (TBS). Испытывалась

зависимость эффективности осаждения белка от рН OcA и пропорций обоих химических

агентов, а также выход микроРНК при разных значениях pH и концентрациях Gu и OcA.

Концентрации miR-16 и miR-126 в супернатантах измеряли с помощью количественной

RT-PCR. Значения Ct микроРНК и значения поглощения учитывались для оптимальных

условий выделения микроРНК из плазмы крови и мочи.

66

Рисунок 3. Зависимость выхода микроРНК от концентрации Gu и рН.

Образцы плазмы крови 10 ЗД объединяли и использовали для всех выделений. На

графике показано среднее Ct и стандартное отклонение (Ct SD) для конечной

концентрации OcA на 0.5%. Звездочка (*) указывает на оптимальные условия

выделения микроРНК.

Рисунок 4. Эффективность выделения микроРНК в зависимости от концентрации

Gu и pH. Образцы мочи 10 ЗД объединяли и использовали для всех выделений. На

графике показано среднее Ct и стандартное отклонение (Ct SD) при использовании

1,5% OcA. Звездочка (*) указывает на оптимальные условия выделения микроРНК.

67

Данные, представленные на рисунке 3, ясно показывают, что выделение микроРНК из

плазмы крови наиболее эффективно при рН 4,0 и в присутствии 0.6 М Gu и 0.5% OcA.

Когда 0.3 М Gu использовался при том же pH и концентрации OcA, супернатант содержал

меньше белка (таблица 5), причем значительная часть микроРНК предположительно

соосаждалась с биополимерами. Напротив, при более высоких концентрациях Gu белки

осаждались OcA менее эффективно и, таким образом, выход микроРНК снижался. Стоит

отметить, что в присутствии 0.6 М Gu и 0.5% OcA при рН 4,0 остаточное количество

белка, обнаруженное в супернатантах плазмы крови, было минимальным (таблица 5).

Таблица 5. Эффективность выделения микроРНК при различных концентрациях OcA, Gu

и рН. Все выделения были выполнены из того же объема образца плазмы крови здорового

донора. В таблице показано среднее Ct и стандартное отклонение (CtSD), полученные в

трех повторах.

68

Оптимальные условия были определены как 1,35 М Gu и 1,5% OcA при рН 4,0 (рисунок 4). В

этих условиях в супернатанте мочи оставалось наименьшее количество белка (таблица 6).

miR-16 miR-126 Оптическая

плотность, нм

Номер

образца

Гуанидин,

M

Октановая

кислота,% pH Ct Ct SD Ct Ct SD 260 280

1 0.3

0.5

4 25.71 0.22 30.33 0.1 0.664 0.267

2 0.6 4 22.58 0.54 28.72 0.13 0.807 0.29

3 0.9 4 22.95 0.69 29.05 0.12 0.96 0.351

4 1.35 4 23.34 0.515 29.11 0.27 1.464 0.67

5 0.3 5 29.57 1.8895 45.78 1.73 1.105 0.758

6 0.6 5 24.1 0.512 28.77 0.14 0.826 0.284

7 0.9 5 22.98 0.676 28.45 0.25 0.953 0.313

8 1.35 5 23.35 0.238 28.64 0.18 1.343 0.543

9 0.3 6 31.8 1.9945 37.84 0.39 1.597 1.398

10 0.6 6 24.63 0.514 30.27 0.16 0.906 0.362

11 0.9 6 23.71 0.2515 29.51 0.19 1.006 0.436

12 1.35 6 23.6 0.442 29.66 0.25 1.617 0.8

1 0.3

1.5

4 25.37 0.31 28.63 0.3 0.67 0.27

2 0.6 4 25.28 0.86 29.01 0.1 0.791 0.282

3 0.9 4 25.33 0.28 28.17 0.39 0.909 0.301

4 1.35 4 32.6 1.45 27.87 0.51 1.125 0.422

5 0.3 5 30.19 0.45 35.36 0.15 0.679 0.26

6 0.6 5 26.01 0.67 28.26 0.31 0.76 0.249

7 0.9 5 25.96 0.05 28.21 0.62 0.863 0.263

8 1.35 5 25.98 0.24 28.44 0.24 1.12 0.349

9 0.3 6 25.87 0.08 37.46 0.52 0.987 0.743

10 0.6 6 26.09 0.2 28.41 0.25 0.816 0.274

11 0.9 6 26.17 0.27 28.04 0.32 0.944 0.333

12 1.35 6 25.39 0.07 28.52 0.46 1.312 0.563

1 0.3

2.5

4 26.66 0.02 30.08 0.24 0.647 0.271

2 0.6 4 24.32 0.45 28.78 0.12 0.745 0.271

3 0.9 4 24.48 0.14 28.14 0.11 0.888 0.298

4 1.35 4 24.05 0.38 28.3 0.36 1.374 0.6

5 0.3 5 36.64 0.64 36.45 0.37 0.669 0.275

6 0.6 5 24.63 0.71 28.62 0.23 0.746 0.25

7 0.9 5 24.33 0.57 28.37 0.33 0.871 0.27

8 1.35 5 24.17 0.27 28.75 0.1 0.981 0.284

9 0.3 6 46.22 N/A 39.78 0.93 0.891 0.614

10 0.6 6 27.05 0.16 30.78 0.14 0.825 0.316

11 0.9 6 25.62 0.21 29.29 0.25 0.888 0.269

12 1.35 6 24.78 0.43 28.66 0.21 1.134 0.407

69

Таблица 6. Эффективность выделения микроРНК при различных концентрациях OcA, Gu

и рН раствора. Все выделения были сделаны из того же объема мочи образцов ЗД. В

таблице показано среднее Ct и стандартное отклонение (CtSD), полученные в трех

повторах.

miR-16 miR-126 Оптическая плотность, нм

Номер

образца Гуанидин, M

Октановая

кислота,% pH Ct Ct SD Ct Ct SD 260 280

1 0.3

0.5

4 29.28 0.13 33.5 0.73 0.578 0.47

2 0.6 4 27.13 0.16 32.5 0.03 0.748 0.504

3 0.9 4 27.29 0.02 33.5 0.16 0.799 0.456

4 1.35 4 27.62 0.31 34.5 0.62 0.96 0.457

5 0.3 5 35.59 0.08 34.5 0.25 0.536 0.418

6 0.6 5 28.38 0.09 35.1 0.4 0.649 0.416

7 0.9 5 28.32 0.22 34.8 1.01 0.763 0.411

8 1.35 5 28.01 0.55 35 2.158 0.941 0.441

9 0.3 6 35.75 0.98 41.1 0.75 0.588 0.445

10 0.6 6 29.67 0.77 33.8 0.57 0.632 0.395

11 0.9 6 27.41 0.05 34.5 0.28 0.759 0.418

12 1.35 6 27.11 0.06 33.6 0.721 0.969 0.436

1 0.3

1.5

4 28.31 0.46 33.2 0.94 0.564 0.468

2 0.6 4 27.75 0.35 33.2 0.65 0.657 0.436

3 0.9 4 27.95 0.43 33.3 0.4 0.721 0.412

4 1.35 4 26.82 0.29 32.2 0.35 0.911 0.438

5 0.3 5 28.31 0.46 33.4 0.66 0.577 0.448

6 0.6 5 29.33 0.35 33.8 1.04 0.632 0.407

7 0.9 5 30.2 0.023 33.5 1.13 0.72 0.405

8 1.35 5 31.99 0.16 33.9 0.46 0.908 0.432

9 0.3 6 32.44 0.83 34.66 1.79 0.557 0.42

10 0.6 6 33.18 0.5 36.2 0.29 0.668 0.422

11 0.9 6 28.86 0.15 33.3 1.24 0.727 0.407

12 1.35 6 28.02 0.29 34.4 0.02 0.896 0.411

1 0.3

2.5

4 34.16 0.49 34.4 2.5 0.569 0.454

2 0.6 4 34.86 0.34 38.3 0.67 0.648 0.433

3 0.9 4 41.73 1.38 35.2 0.4 0.764 0.448

4 1.35 4 24.95 0.42 32.3 0.54 0.906 0.434

5 0.3 5 42.89 2.3 33.1 0.81 0.485 0.383

70

Эти экспериментальные данные демонстрируют, что комбинация OcA и Gu может

эффективно высвобождать микроРНК из комплексов, присутствующих в крови и моче, и

обеспечивать эффективное осаждение избыточных биополимеров.

Ранее было показано, что способность OcA осаждать белки зависит от разбавления

образца, значений рН, концентрации OcA и температуры [156]. Основная часть

неиммуноглобулиновой белковой фракции осаждается октановой кислотой при рН 4,2 и

4,5 [152, 153]. Повышение pH до 5.1 приводит к значительному уменьшению

эффективности осаждения белков. Альбумин, альфа и бета-глобулины полностью

осаждаются при концентрации OcA 20-30 мкл / мл (2-3%) и 22 ° C [156]. Было показано,

что силы Ван-дер-Ваальса участвуют во взаимодействии белков с OcA и в этом процессе

решающую роль играют тирозиновые остатки в белках [157, 158].

Для оценки размера и качества микроРНК, полученных с помощью протокола OcA,

препараты РНК, выделенные из плазмы крови и мочи, анализировали с использованием

Bioanalyzer Agilent 2100 (Small RNA Analysis Kits). Анализ был выполнен в ЦКП

―Геномика‖ ИХБФМ СО РАН. Small RNA Analysis Kit позволяет детектировать малые

РНК в интервале 6-150 нуклеотидов, включая область микроРНК (18-25 нуклеотидов).

Данные о составе препаратов РНК, полученные при помощи биоаналайзера, показали

присутствие коротких молекул РНК в образцах, полученных из плазмы крови и мочи

(рисунок 5). Протокол Gu / OcA позволяет выделять, прежде всего, короткие РНК (10-50

нт) из плазмы крови и мочи.

6 0.6 5 32.97 0.79 35.2 0.44 0.651 0.431

7 0.9 5 40.57 1.34 36 1.23 0.704 0.387

8 1.35 5 43.53 0.98 34 1.87 0.868 0.393

9 0.3 6 44.81 1.4 42.6 0.43 0.547 0.423

10 0.6 6 36.13 0.72 35.1 0.55 0.662 0.419

11 0.9 6 38.46 0.36 34.3 1.6 0.733 0.422

12 1.35 6 42.64 0.22 37.9 0.04 0.929 0.433

71

Рисунок 5. Анализ образцов микроРНК при помощи Bioanalyzer Agilent 2100.

полученных из плазмы крови (A) и мочи (Б). Электрофореграммы показывают

интенсивность флуоресценции и распределение по размеру нуклеотидов (nt)

микроРНК. Пик 4 nt является внутренним стандартом.

Таким образом, экспериментальные результаты показывают, что протокол Gu / OcA

позволяет эффективно выделять микроРНК из биологических жидкостей.

Тем не менее, эффективность выделения микроРНК должна быть исследована в

сравнительном исследовании. Для этого мы оценили эффективность экстракции

микроРНК из крови и мочи с использованием трех протоколов: фенол-хлороформной

экстракции [155], miRCURY RNA Isolation Kit -Biofluids (Exiqon) [65, 69] и протокол Gu /

OcA.

3.4. Сравнение эффективности выделения микроРНК из биологических

жидкостей при помощи протокола с октановой кислотой, фенол-хлороформной

экстракции и Exiqon miRCURY biofluids kit (Exiqon, Дания)

МикроРНК была выделена 10 образцов плазмы крови и 10 образцов мочи, полученных от

разных ЗД по протоколам, описанным в Материалах и методах. Все манипуляции с

miRCURY™ RNA Isolation Kit – Biofluids проводились в соответствии с рекомендациями

производителя. В каждом случае выделенные микроРНК соосаждались гликогеном. Для

72

оценки эффективности протоколов мы измеряли уровни экспрессии двух микроРНК (miR-

16 и miR-126) в качестве наиболее распространенных в плазме крови микроРНК.

Таблица 7. Сравнение эффективности выделения микроРНК из плазмы крови и мочи

различными протоколами.

Gu/OcA

miRCURY Biofluids

Kit

экстракция кислым

фенол-хлороформом

Ct Ct SD Ct Ct SD Ct Ct SD

Плазма

крови

miR- 16 21.92 1.66 22.64 1.48 22.77 1.53

miR- 126 30.66 0.64 32.17 1.43 31.18 0.27

Моча

miR- 16 29.8 1.93 36.95 1.03 31 1.03

miR- 126 34.16 1.94 ND1 ND 34.72 1.14

1 Не детектировано.

Значения порогового цикла (Ct) miR-16 и miR-126 сравнивали в образцах, выделенных

различными протоколами из биологических жидкостей, полученных от одних и тех же

доноров. Было показано, что протокол Gu / OcA превосходит все другие методы

выделения микроРНК из плазмы крови. Протокол Gu / OcA был в 7,2 раз был более

эффективным, чем экстракция фенол-хлороформом, и в 1,65 раза эффективнее, чем

miRURY Biofluids при выделении miR-16. Эффективность выделения miR-126 методом

Gu / OcA также превосходила экстракцию фенол-хлороформом и miRURY Biofluids (в

1,43- и 2,85 раз соответственно).

Протокол Gu / OcA также превосходил другие методы выделения микроРНК из

образцов мочи. Он оказался было в 2,29 раз более эффективным, чем экстракция фенол-

хлороформомпо miR-16 и в 147 раз по miR-126. Протокол Gu / OcA также значительно

превзошел miRCURY biofluids kit при выделении микроРНК из мочи. Выход MiR-16 при

выделении Gu / OcA был в 142 раза выше, чем miRCURY biofluids kit, тогда как уровень

экспрессии miR-126 не был обнаружен (таблица 6). Таким образом, наши результаты

показывают, что Gu / OcA превосходит другие методы выделения микроРНК и

обеспечивает высокий выход микроРНК из плазмы и мочи (таблица 7).

Метод miRURY Biofluids так же как и предложенные протокол использует реагенты для

осаждения биополимеров биологиечских жидкостей. По сравнению с экстракцией кислым

фенол-хлороформом, этот метод не обеспечивает более эффективного выделения miR-16

73

из плазмы крови, однако существенно менее эффективен при выделении miR-16 из мочи.

Т.е. метод не отличается универсальностью, что, по-видимому, связано с разной

эффективностью выделения микроРНК, упакованных в состав разных комплексов. Метод,

основанный на использовании Gu / OcA более универсален и, поскольку, он позволяет

выделять микроРНК сушественно более эффективно по сравнению с другими методами,

представляется более перспективным для выделения микроРНК из биологических

жидкостей.

3.5. Анализ белкового состава супернатантов плазмы крови после добавления

реагентов Gu / OcA и miRCURY biofluids kit методом SDS-PAGE

Оба протокола Gu / OcA и miRCURY biofluids используют реагенты для осаждения

биополимеров (преимущественно белковой природы) крови. Чтобы сравнить

эффективность удаления белка с помощью miRCURY biofluids kit и протокола Gu / OcA,

мы измерили значения поглощения супернатантов, полученных обоими методами при 260

и 280 нм, и исследовали оставшиеся белки с помощью SDS PAGE.

Химические вещества, используемые в miRCURY biofluids kit, удаляют белки из крови с

более высокой эффективностью, чем протокол Gu / OcA (A260 / A280 0.45 / 0.16 против

0.54 / 0.27). Напротив, Gu / OcA более эффективен в удалении биополимеров мочи (A260 /

A280 для Gu / OcA составляет 0.88 / 0.73 против 1,12 / 0.88). SDS PAGE в супернатанте

плазмы крови обработанной miRCURY biofluids kit выявил минорный белок 52 кДа,

(предположительно антитромбин III, каталитическая цепь карбоксипептидазы N или

предшественник изоформы 1 витамина D-связывающего белка) и не менее 10 белков,

включая альбумин и IgG в супернатантах после осаждения Gu / OcA. Эти данные

показывают, что более полное осаждение белков miRCURY biofluids kit может привести к

соосаждению части микроРНК, рисунок 6.

Очевидно, что белки, остающиеся в супернатанте после осаждения Gu / OcA, не мешают

выдлению микроРНК, по крайней мере, в присутствии 0.6 M Gu, и сильно отличаются от

белков, оставшихся в образце после стадии осаждения miRCURY biofluids kit. Состав

осаждающего раствора в miRCURY biofluids kit неизвестен, однако наши данные

(рисунок 6) демонстрируют, что осадитель из коммерческого набора отличается от

используемой в нашем методе октановой кислоты, поскольку отличается набор

недоосажденных белков.

74

Рисунок 6. SDS-PAGE супернатанта плазмы крови, после осаждения

miRCURY Biofluids kit и Gu / OcA. 1 – плазма крови; 2 – супернатант плазмы крови,

обработанный Gu / OcA; 3-супернатант плазмы крови, обработанный miRCURY

biofluids kit.

Таким образом, метод Gu / OcA позволяет быстро и эффективно выделить микроРНК из

плазмы крови и особенно из мочи. Полученные в результате препараты РНК высоко

обогащены микроРНК, согласно количественному анализу ОТ-ПЦР (рисунок 5, таблица

5, 6). Предложенный способ отличается простотой, низкой трудоемкостью, может быть

легко адаптирован для выделения микроРНК из различных биологических жидкостей.

3.6. Сравнительный анализ профиля экспрессии микроРНК во фракции

супернатанта мочи и фракции внеклеточных везикул мочи здоровых доноров,

пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы и

больных раком предстательной железы

Для изучения распределения и представленности микроРНК в микровезикулах мочи при

заболеваниях предстательной железы был проведен сравнительный анализ экспрессии 84

микроРНК в парных образцах микровезикул и бесклеточного супернатанта мочи у здоровых

доноров, пациентов с ДГПЖ и больных РПЖ с использованием платформы miRCURY LNA

miRNA qPCR Panels (Exiqon Ltd, Дания). Всего в анализ было включено 84 микроРНК-

75

маркеров, таблица 8. Панель была сформирована на основе анализа доступной литературы и

баз данных и включала микроРНК, представленные в моче, в том числе и

онкоспецифические. 69 микроРНК в составе miRCURY LNA PCR Exosome Panel совпали

результатами нашего поиска, а 16 микроРНК были добавлены дополнительно.

Таблица 8. Состав панели для определения экспрессии микроРНК мочи.

Набор микроРНК для профилирования на платформе miRCURY LNA PCR

(Exiqon, Дания)

miRNA в составе стандартной панели Exiqon (n=69) дополнительные miRNA, (n=16)

let-7a-5p, let-7b-5p, let-7d-3p, let-7d-5p, let-7e-5p,

let-7f-5p, let-7g-5p, let-7i-5p, miR-101-3p, 103a-3p,

106a-5p, 106b-5p, 107, 125b-5p, 126-3p, 141-3p, 145-5p,

148a-3p, 149-5p, 16-5p, 17-5p, 187-3p, 191-5p, 193b-3p,

195-5p, 200a-3p, 200b-3p, 200c-3p, 20a-5p, 210, 21-5p,

221-3p, 222-3p, 23b-3p, 24-3p, 25-3p, 26b-5p, 27b-3p,

29a-3p, 29b-3p, 29c-3p, 30a-5p, 30b-5p, 30c-5p, 30d-5p,

30e-3p, 30e-5p, 34a-5p, 375, 429, 574-3p, 92a-3p, 93-5p,

99b-5p, 133a, 151a-5p, 22-3p, 22-5p, 378a-3p, 423-5p,

425-5p, 582-5p, 660-5p, 10b-5p, 15a-5p, 15b-5p,

31-3p, 31-5p

miR-346, 451a, 483-5p, 214, 331-3р,

130а-3р, 33а-5р, 19b, 205, 1285, 100,

183, 146а-5р, 484, 143, let-7c

Использование бесклеточного супернатанта мочи после центрифугирования при 17000g

позволяет стандартизовать препараты, удалив балластные рибонуклеиновые кислоты в

составе клеточного дебриса и апоптотических телец.

В среднем в каждом образце было обнаружено не менее 70 из 84 отдельных микроРНК,

при этом 72 микроРНК были экспрессированы более чем в 70% образцов. Для подавляющего

числа микроРНК различие их представленности во фракции микрочастиц и свободном от

микрочастиц виде было качественным, однако часть микроРНК были представлены

преимущественно в одной из фракций. Наиболее яркими примерами являются miR-143-3p и

miR-451a, которые присутствуют в бесклеточном супернатанте мочи, но отсутствуют почти

во всех образцах микровезикул. Перепредставленность miR-451a в свободном от микрочастиц

виде может быть связана с ее секрецией в виде белковых и/или липопротеиновых комплексов

из клеток крови, где она высоко экспрессирована, с последующей инфильтрацией в мочу

[159, 160]. Необходимо отметить, что в процессе получения препаратов везикул методом

ультрацентрифугирования концентрация свободных комплексов микроРНК мочи

уменьшается не менее, чем в 20 раз.

76

3.7. Анализ представленности микроРНК различных фракций мочи больных

раком предстательной железы

В процессе обработки данных были получены нормализованные значения (dCt) микроРНК

при помощи метода парных отношений, в котором экспрессия одной микроРНК нормируется

на каждую из оставшихся микроРНК. Затем выбираются характеристические пары микроРНК

[149, 150]. Сравнения проводили между группами: ЗД – больные РПЖ (h-c), ЗД – пациенты с

ДГПЖ (h-b) и пациенты с ДГПЖ - больные РПЖ (b-c) во фракции супернатанта мочи после

центрифугирования 17000g, а также между названными группами внутри фракции ВВ (hm-

cm, hm-bm и bm-cm, соответственно).

Далее при помощи Random Forests with Boruta feature selection method были получены

данные относительно встречаемости отдельных значимых пар микроРНК относительно

общего числа сравнений (запусков), разность медиан, доверительный интервал и

значимость (p) как было описано в ―Материалах и методах‖.

В таблице 9 приведены лучшие комбинации микроРНК, отобранные по следующим

критериям: 3 пары с наибольшей встречаемостью, 3 пары с наибольшим расстоянием

между медианами ΔCt между группами доноров (Cutoff для разницы ΔCt был принят за 1),

3 пары с наибольшей удаленностью 95% доверительного интервал (CI) для разности

медиан от 0 (но не менее 0.1) и 3 пары с наименьшим значением padj. Такие критерии

позволяют отразить некоторые отличия в подходах к сопоставлению групп. Критерий

наибольшей встречаемости комбинации микроРНК в 1000 итерациях, как значимого

фактора алгоритма Boruta, на наш взгляд, позволяет отобрать те комбинации, которые

наименее чувствительны к выбросам отдельных значений, а также в дальнейшем будут

эффективно комбинироваться с другими парами. Критерий наибольшего расстояния

между медианами ΔCt групп доноров, как и критерий наибольшей удаленности 95%

доверительного интервала (CI) разности медиан от 0 ориентирован на практическую

применимость Он отражает «разнесенность» значений в различных группах. Так как при

сильной близости данных небольшие погрешности измерений экспрессии микроРНК

(техническая и выборочная вариация) могут сильно повлиять на идентификацию группы

на практике (качество аналитической системы). Пары с наименьшем значением padj были

отобраны, как наиболее отличающиеся с точки зрения статистического критерия. В целом,

так как эти критерии направлены на разделение групп, то пары достаточно часто

пересекались. Если какая-либо пара была лучшей по нескольким критериям, то в

итоговую выборку она включалась однократно. Для каждой отобранной пары микроРНК

был проведен ROC анализ и определена площадь под кривой (AUC).

77

Таблица 9. Значимые предикторы групп сравнения. Указана частота встречаемости

комбинации за 1000 запусков алгоритма Boruta, разность дельта Ct и доверительный

интервал, AUC, значения статистической значимости P и скорректированные P (padj).

№ микроРНК пары

Частота

встречаемости

пары

микроРНК ,%

Доверительный

интервал

(95% CI)

AUC p padj

h-c сравнение, 1770 пар

1 miR-107-miR-26b-5p 74.8 -0.74 (-1.94;-0.33) 0.93 0.0012 0.0237

2 miR-93-5p-miR-29b-3p 36.3 -0.54 (-1.31;-0.26) 0.92 0.0019 0.0212

3 miR-22-3p-miR-30e-5p 36.0 -0.76 (-1.95;-0.23) 0.86 0.0065 0.0256

4 miR-375-miR-26b-5p 6.2 -1.71 (-3.92;-0.17) 0.83 0.0143 0.0249

5 miR-29b-3p-miR-205-5p 4.6 1.92 (0.25;2.81) 0.88 0.0041 0.0202

6 miR-331-3p-miR-205-5p 0.3 1.72 (0.24;3.06) 0.79 0.0018 0.0373

7 miR-205-5p-miR-26b-5p 15.2 -1.4 (-3.17;-0.55) 0.88 0.0041 0.0237

8 miR-29a-3p-miR-205-5p 10.3 1.69 (0.57;2.74) 0.83 0.0126 0.0252

9 miR-151a-5p-miR-205-5p 6.3 1.18 (0.43;3.29) 0.84 0.0102 0.0252

10 let-7e-5p-miR-23b-3p 15.8 0.88 (0.27;1.35) 0.92 0.0019 0.0237

h-b сравнение, 254 пар

1 miR-30a-5p-let-7g-5p 98.5 0.57 (0.28;1.09) 0.83 0.0143 0.0429

2 miR-200a-3p-let-7a-5p 3.9 0.53 (0.03;1.34) 0.7 0.0054 0.1416

3 miR-205-5p-let-7a-5p 0.2 0.86 (0.06;2.71) 0.78 0.0412 0.0618

b-c сравнение, 254 пар

1 miR-103a-3p-miR-30c-5p 28.6 1.03 (0.03;1.45) 0.79 0.0338 0.0495

2 hsa-miR-30c-5p-miR-30e-5p 21.8 -0.43 (-1.13;-0.17) 0.83 0.0143 0.0429

3 miR-100-5p-miR-30e-3p 18.9 0.73 (0.02;1.02) 0.77 0.05 0.05

4 miR-30c-5p-miR-16-5p 15.2 -0.74 (-1.36;-0.01) 0.84 0.0114 0.0429

5 miR-23b-3p-miR-103a-3p 8.8 -0.41 (-0.99;-0.03) 0.78 0.0412 0.0495

6 miR-100-5p-miR-30a-5p 7.2 0.52 (0.09;1.39) 0.79 0.0338 0.0495

hm-cm сравнение, 849 пар

1 miR-20a-5p-miR-16-5p 50.3 0.39 (0.17;0.8) 0.89 0.0032 0.0245

2 miR-24-3p-miR-200b-3p 12.0 0.47 (0.13;1.08) 0.88 0.0055 0.0245

3 miR-101-3p-miR-30e-5p 11.8 -0.28 (-0.46;-0.09) 0.82 0.0179 0.0268

4 miR-24-3p-miR-16-5p 5.3 0.45 (0.09;0.95) 0.85 0.0082 0.0245

5 miR-99b-5p-miR-24-3p 3.5 -0.25 (-0.86;-0.06) 0.76 0.0102 0.0494

6 miR-30b-5p-miR-125b-5p 3.3 0.32 (0.06;0.91) 0.8 0.0233 0.03

7 miR-31-5p-miR-16-5p 1.7 0.77 (0.08;1.23) 0.85 0.0118 0.0267

78

8 miR-30c-5p-miR-16-5p 0.3 0.42 (0;0.9) 0.82 0.0156 0.0268

9 miR-30b-5p-miR-16-5p 0.1 0.85 (0.08;1.5) 0.79 0.0284 0.0319

hm-bm сравнение, 849 пар

1 miR-107-miR-31-5p 95.3 -0.73 (-1.95;-0.27) 0.87 0.0071 0.0141

2 miR-31-5p-miR-16-5p 61.5 0.79 (0.31;1.25) 0.89 0.0043 0.0141

3 miR-31-5p-miR-30e-3p 43.8 0.69 (0.15;1.5) 0.88 0.0055 0.0141

4 miR-31-5p-miR-200b-3p 23.9 0.58 (0.18;1.3) 0.88 0.0055 0.0141

5 miR-31-5p-miR-660-5p 22.1 0.74 (0.08;1.79) 0.84 0.0023 0.0142

6 miR-29a-3p-miR-660-5p660-5p 20.4 0.65 (0.38;1.06) 0.86 0.009 0.0142

7 miR-31-5p-miR-200c-3p 17.3 0.63 (0.25;1.24) 0.83 0.0143 0.0159

8 miR-107-miR-141-3p 5.6 -0.79 (-1.95;-0.09) 0.78 0.0412 0.0412

9 miR-29a-3p-miR-30e-3p 1.6 0.82 (0.04;1.16) 0.84 0.0114 0.0142

10 miR-660-5p660-5p-miR-24-3p 0.8 -0.58 (-1.16;-0.05) 0.87 0.0071 0.0141

bm-cm сравнение, 254 пар

1 miR-191-5p-miR-31-5p 22.7 0.41 (0.16;1.09) 0.91 0.0025 0.0143

2 miR-100-5p-miR-30d-5p 11.1 0.32 (0.15;1.27) 0.84 0.0114 0.0177

3 miR-106b-5p-miR-191-5p 7.4 -0.71 (-1.34;-0.29) 0.88 0.0041 0.0143

4 miR-93-5p-miR-22-3p 2.9 -0.4 (-0.75;-0.02) 0.78 0.0034 0.0412

5 miR-191-5p-miR-200b-3p 0.3 0.54 (0.02;1.21) 0.83 0.0126 0.0177

6 miR-22-3p-miR-92a-3p 0.1 0.44 (0.12;0.89) 0.78 0.0412 0.0412

7 miR-191-5p-miR-200a-3p 0.1 0.69 (0.17;1.13) 0.83 0.0126 0.0177

При первичном анализе обращает на себя внимание большое число значимых микроРНК,

например, в группе сравнения h-c, а также уникальные наборы пар микроРНК для каждой

группы сравнения, таблица 9.

Примечательно, что отдельные пары предикторов по частоте встречаемости резко

выделяются среди других комбинаций микроРНК: miR-107-miR-26b-5p (74.8%, h-c), miR-

30a-5p- let-7g-5p (98.5%, h-b), miR-20a-5p- miR-16-5p (50.3%, hm-cm) и miR-107- miR-31-

5p (95.3%, hm-bm). AUC для представленных пар микроРНК составил от 0.70 до 0.93.

Для супернатанта мочи в группе сравнения h-c наилучшими являлись следующие

комбинации: miR-375- miR-26b-5p, miR-29a-3p-hsa-miR-205-5p, miR-331-3p- miR-205-5p,

miR-205-5p- miR-26b-5p, miR-29b-3p miR-205-5p и miR-151a-5p- miR-205-5p. Пара miR-

29b-3p-miR-205-5p имела наибольшую разность медиан, а комбинация miR-29a-3p-miR-

205-5p – наибольшее отдаление доверительного интервала разности медиан от нуля.

Комбинацию miR-107-miR-26b-5p отличал высокий процент встречаемости в группе

сравнения, но с разницей ΔCt менее 1, таблица 9.

79

В группах h-b и b-с было выявлено по 3 и 6, соответственно, комбинаций микроРНК с

пограничной значимостью, что связано, в том числе и с тем, что сигнал от некоторых

микроРНК у отдельных доноров этих групп был ниже уровня детекции микрочипового

метода в нашем исследовании. Единственной значимой (по границе значимости) парой,

отличающей ЗД от пациентов с ДГПЖ, является miR-30a-5p-let-7g-5p с высоким

процентом выявляемости в 98.5%, а пара miR-103a-3p-miR-30c-5p отличалась наибольшей

выявляемостью (28.6%) и разницей медиан (больше 1) в группе b-с.

Во фракции ВВ ЗД и больных РПЖ (hm-cm) наиболее часто (50.3%) встречается пара

miR-20a-5p-miR-16-5p, но разница медиан группы сравнения не превышала 0.39.

Наибольшая разница медиан характерна для пар miR-31-5p-miR-16.5p и miR-30b-5p-

miR-16-5p и составляет 0.77 и 0.85, соответственно. Пара miR-29a-3p-miR-30e-3p

обладает наибольшей разницей медиан (0.82) в группе сравнения hm-bm (фракция ВВ), но

доверительный интервал для этой пары мало отличается от 0. Наиболее часто в этой

группе сравнения встречается пара miR-107-miR-31-5p (95.3%).

Комбинация miR-191-5p-miR-31-5p наиболее часто встречается в группе bm-cm, а пара

miR-106b-5p-miR-191-5p отличается максимальной разницей ΔCt (0.71), таблица 9.

Стоит отметить, что, несмотря на уникальность пар предикторов, характерных для каждой

из 6 групп, одни и те же микроРНК обнаруживаются одновременно в нескольких группах

сравнения, таблица 8. Интересно, что некоторые микроРНК были выявлены только во

фракции супернатанта мочи ( miR-23b-3p, miR-30a-5p, miR-205-5p), другие – только во

фракции ВВ ( miR-24-3p, miR-31-5p и miR-200b-3p), таблица 10.

Таблица 10. Встречаемость отдельных микроРНК в парах среди групп сравнений

фракций бесклеточного супернатанта мочи после центрифугирования при 17000g и ВВ

мочи.

микроРНК h-c h-b b-c hm-cm hm-bm bm-cm

miR-16-5p ● ● ●

miR.22-3p ● ●

miR-24-3p ● ●

miR-23b-3p ● ●

miR-29a-3p ● ●

miR-30a-5p ● ●

miR-30c-5p ● ●

miR-30e-5p ● ● ● ●

miR-31-5p ● ● ●

80

miR-93-5 p ● ●

miR-100-5p ● ●

miR-107 ● ●

miR-200a-3p ● ●

miR-200b-3p ● ● ●

miR-205-5p ● ●

Стоит подчеркнуть, что в каждой группе сравнения есть микроРНК, которые многократно

встречаются в различных комбинациях внутри каждой группы сравнения, таблица 10.

Так, в группе h-c микроРНК miR-205-5p и miR-26b-5p входит в состав 50% и 40%

комбинаций, соответственно. miR-30c-5p в группе h-b встречается во всех трех парах

микроРНК, а miR-31-5p в группе hm-bm встречается в 6 комбинациях из 10, таблица 11.

Таблица 11. Встречаемость отдельных микроРНК внутри групп сравнений двух фракций

бесклеточного супернатанта мочи после центрифугирования при 17000g и ВВ мочи.

Группы

сравнения микроРНК

Встречаемость микроРНК

в группе сравнения, %

Общее число пар

микроРНК в группе

сравнения

h-c

miR-205-5p 50

10 miR-26b-5p 40

miR-29b-3p 20

h-b miR-30c-5p 100 3

b-c

miR-30c-5p 50

6 miR-30e-5p 33.34

miR-100-5p 33.34

miR-103a-3p 33.34

hm-cm

miR-16-5p 55.56

9 miR-24-3p 33.34

miR-30b-5p 22.23

hm-bm

miR-31-5p 60

10

miR-660-5p 30

miR-107 20

miR-30e-3p 20

miR-29a-3p 20

bm-cm miR-191-5p 57.15

7 miR-22-3p 28.58

81

Несмотря на то, что при анализе экспрессии микроРНК в биологических жидкостях, в

частности в моче, для нормализации используются различные подходы [161], метод

парных отношений позволяет обнаружить наибольшее количество возможных

комбинаций пар микроРНК, которые могут участвовать в патологических процессах и

может быть применим к нашему исследованию при РПЖ. При использовании данного

подхода определенные микроРНК встречаются чаще (таблица 11) и, вероятно, являются

опухольспецифическими, тогда как другие микроРНК внутри каждой индивидуальной

пары (парные) являются нормализаторами к последним. Таким образом, данный подход

позволяет подобрать необходимую панель онкоспецифичных микроРНК.

Хотелось бы обратить внимание на то, что в нашем исследовании в парах микроРНК

групп h-b и hm-bm были обнаружены онкомикроРНК (таблица 10), а также на то, что

группы b и c супернанта мочи слабо отличались по значимости друг от друга (таблица 9).

Это может быть связано с возможностью присутствия в предстательной железе

недиагностированных очагов с признаками малигнизации у пациентов с ДГПЖ, равно как

и очагов гиперплазии при РПЖ. Кроме того, на фоне доброкачественных

гиперпластических процессов в предстательной железе возможно появление значительной

части дерегулированных микроРНК, которые при своей тканеспецифичности не являются

опухольспецифичными.

Известно, что доброкачественная гиперплазия предстательной железы может иметь

атипичные формы течения вариантов заболевания: помимо гиперпластических процессов

могут возникать и очаги дисплазии с нарушением структурообразования. Хотя такие

атипичные варианты гиперплазии предстательной железы не имеют признаков

злокачественной трансформации, однако могут считаться факультативным предраком

[162]. Кроме того, согласно [20] до 25% случаев у пациентов с ДГПЖ обнаруживаются и

очаги РПЖ. По другим данным, латентная карцинома предстательной железы встречается

в 15.1% среди всех случаев ДГПЖ [163, 164] и примерно третья часть всех раков

переходной зоны предстательной железы обнаруживалась вместе с ДГПЖ.

Однако, несмотря на то, что для роста очагов РПЖ и ДГПЖ нужны андрогены, для этих

заболеваний существуют общие патофизиологические факторы [165, 166] и оба

заболевания встречаются преимущественно в пожилом возрасте, на сегодняшний день до

сих пор нет однозначных доказательств связи этих двух патологий [162].

82

3.8. Биоинформационный анализ профиля экспрессии микроРНК обеих

фракций мочи больных РПЖ при помощи баз данных OncomiRDB и DIANA-

TarBase

С целью оценки возможного участия микроРНК в патогенезе РПЖ, при помощи баз

данных OncomiRDB и DIANA-TarBase, содержащих экспериментально

верифицированные онкогенные и онкосупрессорные микроРНК, были проанализированы

микроРНК из всех комбинаций таблицы 9 (за исключением пар miR- let-7a, hsa-miR- let-

7g h-b, так как значения p этих пар были больше 0.05). Большинство этих микроРНК были

идентифицированы обеими базами данных. Согласно OncomiRDB и DIANA-TarBase,

52.8% и 65% из этих микроРНК являются простатспецифическими и принимают участие в

процессах развития РПЖ. В качестве наглядного примера в таблице 10 приведены

результаты поиска микроРНК с помощью OncomiRDB. Кроме того, большинство

наиболее часто встречающихся микроРНК в каждой группе сравнения также могут быть

связаны с развитием РПЖ (таблица 12), что может быть учтено при разработке

аналитических диагностических систем.

Участие этих и других микроРНК в важнейших процессах патогенеза/развития РПЖ,

таких как нарушение регуляции экспрессии андрогенового рецептора (АР), развития

устойчивости к апоптозу (apoptosis resistance), нарушения регуляции клеточного цикла,

адгезии клеток и эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) хорошо известны [43, 44,

45, 167, 168). Результатом таких нарушений является приобретение клетками инвазивных

свойств, способности к пролиферации, клеточного выживания, подвижности и

способности распространяться на другие органы и ткани.

Таким образом, детекция таких онкомикроРНК, участвующих в различных путях

патогенеза РПЖ может быть использована для диагностики и лечения различных

типов/вариантов течения этого заболевания. Например, экспрессия miR-205 и miR-214

может быть оценена на предмет прогрессирования РПЖ [53] или miR-16, miR-21 и miR-

222 могут быть использованы как предикторы, отличающие летальный и индолентный

РПЖ [55].

Таблица 12. Участие найденных предикторов в развитии и прогрессии РПЖ, согласно

базе OncomiRDB.

микроРНК Функия микроРНК Суммирующий

эффект Прямые цели

miR-16-5p снижает клеточную пролиферацию опухолевая супрессия FGF2

83

ингибирует опухолевый рост FGFR1

miR-20a-5p Увеличивает клеточную пролиферацию

онкогенный эффект CX43

увеличивает образование колоний

miR-23b-3p

ингибирует клеточную пролиферацию

опухолевая супрессия

ингибирует образование колоний

ингибирует миграцию клеток

ингибирует клеточную инвазию SRC

индуцирует остановку клеточного цикла в

G0/G1 AKT1

индуцирует апоптоз

ингибировать эпителиально-

мезенхимальный переход

miR-26b-5p ингибирует клеточную пролиферацию опухолевая супрессия

miR-29a-3p ингибирует рост клеток

TRIM68

ингибирует клеточную инвазию

miR-29b-3p

ингибирует заживление ран

опухолевая супрессия ингибирует клеточную инвазию

ингибирует образование колоний

miR-30d-5p способствует клеточной пролиферации

онкогенный эффект SOCS1

способствует клеточной инвазии

miR-101-3p ингибирует рост клеток

опухолевая супрессия COX2

ингибирует опухолевый рост

miR-106b-5p

увеличивают клеточную адгезию онкогенный эффект

CASP7

способствует клеточному росту

miR-125b-5p MUC1

miR-141-3p повышает клеточный рост онкогенный эффект

miR-200a-3p ингибирует клеточную инвазию

опухолевая супрессия GNA13

miR-200b-3p



уменьшает клеточную адгезию

уменьшает отрыв клеток

miR-200c-3p

увеличивает адгезию клеток

опухолевая супрессия уменьшить клеточную инвазию

уменьшает миграцию клеток

miR-205-5p

увеличивает адгезию

опухолевая супрессия ZEB1 уменьшает инвазию клеток

уменьшает миграцию клеток

ингибировать эпителиально- VIM

84

мезенхимальный переход


miR-31-5p

ингибирует клеточную пролиферацию



miR-99b-5p


SMARCA5

ингибирует рост клеток SMARCD1

MTOR

miR-100-5p


SMARCA5

ингибирует рост клеток SMARCD1

MTOR

miR-331-3p ингибирует клеточную пролиферацию опухолевая супрессия

DOHH

3.9. Определение диагностически значимых пар микроРНК

фракций мочи, позволяющих отличить группы здоровых доноров, пациентов с

ДГПЖ и больных РПЖ

Для лучших комбинаций пар микроРНК был выполнен сравнительный анализ

чувствительности и специфичности, который показал, что наибольшей диагностической

эффективностью обладают пары miR-107- miR-26b-5p (AUC=0.93, 80% чувствительность

и 100% специфичность), miR-375-3p-miR-26b-5p (AUC=0.83, 70% чувствительность и

100% специфичность) в группе сравнения h-c, а также miR-31-5p-miR-16-5p (AUC=0.89,

80% чувствительность и 100% специфичность), miR-31-5p-miR-200b (AUC=0.88, 70%

чувствительность и 100% специфичность), miR-31-5p-miR-30e-3p (AUC=0.88, 80%

чувствительность и 100% специфичность) и miR-31-5p-miR-660-5p (AUC=0.84, 70%

чувствительность и 100% специфичность) в группе hm-bm, таблица 13.

Таблица 13. Диагностическая значимость наилучших предикторов микроРНК

во фракции бесклеточного супернатанта мочи после центрифугирования 17000g и

фракции ВВ мочи при сравнении различных групп доноров между собой.

Группа

сравнения Пары микроРНК AUC

Пороговое

значение 95% CI Чувствительность% Специфичность%

h-c miR-205-5p-miR-26b-5p 0.88 < -3.365 0.7212 - 1.039 30 100

miR-107-miR-26b-5p 0.93 < -0.4896 0.8074 - 1.053 80 100

85

miR-375-miR-26b-5p 0.83 < -0.6851 0.6293 - 1.037 70 100

miR-151a-5p-miR-205-5p 0.84 > 3.152 0.6506 - 1.029 30 100

miR-29b-3p-miR-205-5p 0.88 > 2.034 0.7278 - 1.032 50 100

miR-29a-3p-miR-205-5p 0.83 > 3.344 0.6368 - 1.023 20 100

miR-331-3p-miR-205-5p 0.79 > 5.651 0.5624 - 1.015 10 100

h-b miR-30a-5p-let-7g.5p 0.83 < -2.323 0.6107 - 1.056 33 100

b-c miR-30c-5p-miR-30e-5p 0.83 > -0.7914 0.6351 - 1.032 20 100

miR-103a-3p-miR-30c.5p 0.79 < 1.153 0.5727 - 1.005 60 100

hm-cm

miR-20a-5p-miR-16-5p 0.85 < 0.7185 0.6502 - 1.047 56 100

miR-30b-5p-miR-16-5p 0.83 < -2.959 0.6355 - 1.021 22 100

miR-31-5p-miR-16-5p 0.79 < 1.833 0.5630 - 1.012 37.5 100

miR-24-3p-miR-200b-3p 0.93 < 1.307 0.8231 - 1.044 67 100

hm-bm

miR-31-5p-miR-200c-3p 0.83 < 3.063 0.6356 - 1.031 60 100

miR-31-5p-miR-16-5p 0.89 < 2.256 0.7312 - 1.047 80 100

miR-107-miR-141-3p 0.78 > 5.213 0.5454 - 1.010 10 100

miR-31-5p-miR-200b-3p 0.88 < 3.104 0.7168 - 1.039 70 100

miR-31-5p-miR-30e-3p 0.88 < 1.252 0.7067 - 1.049 80 100

miR-29a-3p-miR-30e-3p 0.84 < -0.1366 0.6625 - 1.026 40 100

miR-31-5p-miR-660-5p 0.84 < 0.5698 0.6630 - 1.026 70 100

miR-29a-3p-miR-660-5p 0.86 < -0.7334 0.6679 - 1.043 20 100

miR-20a-5p-miR-16-5p 0.73 < 0.8182 0.4669 –

0.9931 70 100

miR-107-miR-31-5p 0.87 > 1.324 0.6716 - 1.062 10 100

bm-cm

miR-191-5p-miR-200a-3p 0.83 < 2.595 0.6479 - 1.012 40 100

miR-191-5p-miR-31-5p 0.91 < 0.07563 0.7707 - 1.052 33 100

let-7i-5p-let-7a-5p 0.83 < 4.612 0.6117-1.039 57.14 100

miR-100-5p-miR-200b-3p 0.81 < 3.867 0.6002-1.022 55.56 100

miR-106b-5p-miR-191-5p 0.88 > 0.3940 0.7234 –

1.037 30 100

Для оценки степени разделения значений наиболее диагностически значимых пар

микроРНК в группах сравнения были построены диаграммы распределения

нормализованных значений пар мироРНК, рисунок 7 А, Б.

Из рисунка 7 видно, что значения пары miR-107- miR-26b-5p больных и ЗД прилежат

достаточно плотно друг к другу, что может затруднить их разделение из-за ошибки

измерения. В то же время шансы отличить ЗД от больных РПЖ с использованием

предиктора miR-375-3p-miR-26b-5p представляются более высокими, рисунок 7 А.

86

Рисунок 7.

А. Диаграмма распределения нормализованных значенийЗД и больных РПЖ, пары miR-

375-3p- miR-26b-5p и miR-107-miR-26b-5p. Б. Диаграмма распределения

нормализованных значений ЗД и пациентов с доброкачественной гиперплазией

предстательной железы на примере комбинаций следующих микроРНК: miR-31-5p-miR-

660-5p, miR-31-5p- miR-16-5p, miR-31-5p- miR-30e-3p и miR-31-5p-miR-200b.

Аналогичная картина складывается и в группе сравнения hm-bm, где значения в парах

miR-31-5p- miR-660-5p достаточно хорошо разнесены. Однако в парах miR-31-5p-miR-16-

5p и miR-31-5p-miR-200b нормализованные значения группы больных ДГПЖ лежат

близко или внутри распределения значений группы ЗД, снижая вероятность разделения

этих групп между собой, рисунок 7Б.

Таким образом, были сравнены группы здоровых доноров, пациентов с ДГПЖ и больных

РПЖ при помощи различных статистических критериев для выявления наилучших

предикторов, которые смогли бы отличить все три группы между собой.

В целом наибольшее число таких пар микроРНК было найдено в группе здоровых-РПЖ

как во фракции супернатанта мочи ( 6 пар микроРНК), так и во фракции ВВ (3 пары

микроРНК). Причем супернатанте таких пар гораздо больше, чем во фракции ВВ,

которые достоверно отличают здоровых и больных РПЖ с ΔCt от 1 до 2, таблица 9.

Однако наиболее диагностически значимыми оказались пары miR-107-miR-26b-5p и miR-

87

375-3p-miR-26b-5p в группе здоровые-больные РПЖ во фракции супернатанта мочи,

таблица 13.

При сравнении групп здоровые-ДГПЖ или ДГПЖ-РПЖ не удалось выбрать пары

микроРНК во фракции ВВ, а во фракции супернатанта мочи достоверность отличия в

экспрессии пар микроРНК в этих группах проходила по границе значимости, таблица 9.

Тем не менее, при оценки диагностической значимости предикторов в группе здоровые-

больные ДГПЖ, наибольшее число диагностически значимых пар было найдено во

фракции ВВ (miR-31-5p-miR-16-5p, miR-31-5p-miR-200b, miR-31-5p-miR-30e-3p и miR-31-

5p-miR-660-5p), таблица 13.

С одной стороны, данные находки говорят о целесообразности использования фракции

супернатанта мочи для того, чтобы отличить здоровых доноров от больных РПЖ, с другой

стороны, данная фракция содержит микроРНК со всего мочевого мочевого тракта и

только часть из них имеют (простатическое) происхождение из предстательной железы

или являются онкоспецифическими.

Стоит отметить, что в настоящем исследовании диагностически значимые микроРНК

выявлялись как во фракции ВВ, так и в бесклеточном супернатанте мочи, таблица 13. А

ранее опубликованная работа показывает, что изменения представленности микроРНК во

фракциях мочи являются отражением различных патологических процессов,

протекающих в предстательной железе [6]. Таким образом, параллельное исследование

нескольких фракций может представлять наибольший научный и практический интерес.

В результате профилирования экспрессии микроРНК во всех трех группах доноров нам не

удалось обнаружить пары из двух микроРНК, позволяющие отличить со 100%

чувствительностью и специфичностью все три группы между собой, тем не менее, этого

можно достичь использованием различных комбинаций микроРНК. Например

(таблица 13), при разделении групп ЗД и больных РПЖ каждая по отдельности пара

микроРНК miR-107-miR-26b-5p и miR-375-miR-26b-5p при 100% специфичности

обладает 80% и 70% чувствительностью, соответственно, однако при рассмотрении этих

пар одновременно чувствительность системы возрастает до 100%. Такую же картину

можно наблюдать и при попытке разделить между собой группы ЗД и ДГПЖ

(таблица 13): при одновременном анализе пар miR-31-5p-miR-16-5p и miR-20a-5p-miR-16-

5p в группе сравнения hm-bm фракции внеклеточных везикул мочи. Чувствительность

анализа в этом случае также возрастает до 100%, вместо 80% и 70%, соответственно.

Поскольку, как уже описывалось выше, при развитии РПЖ зачастую наблюдаются в

предстательной железе и очаги доброкачественной гиперплазии [162], то для разделения

групп пациентов с РПЖ и ДГПЖ со 100% чувствительностью при 100% специфичности

88

требуется проанализировать уровень экспрессии большего количества микроРНК в обеих

фракциях, например (таблица 13): miR-103a-3p- miR-30c-5p (b-c, 60% чувствительность),

miR-100-5p- miR-200b-3p (bm-cm, 50% чувствительность) и let-7i-5p-let-7a-5p (bm-cm, 40%

чувствительность).

Одной из отличительных особенностей экспрессии микроРНК в биологических жидкостях

онкологических больных и ЗД является небольшая разница в уровне экспрессии

маркерных микроРНК в разных группах. Этот факт требует очень тщательного отношения

к дизайну диагностической системы, а именно к набору spike-in контролей, количеству

анализируемых повторов, разработке критериев включения и исключения образцов

микроРНК, полученных из донорской крови или мочи. Только после формулирования

таких требований и разработки аналитических систем можно приступать к верификации

микроРНК-маркеров на независимых выборках больных и ЗД, определять объем выборки

и реальную диагностическую эффективность системы.

3.10. Алгоритм анализа данных для разработки диагностических систем

Исследования последнего десятилетия показали, что определение концентрации одной

или нескольких микроРНК недостаточно для надежной диагностики онкологических

заболеваний [58, 59]. Из представленных в литературе данных следует, что для разработки

эффективных диагностических тестов необходим комплексный анализ панели из нескольких

маркеров [169, 170, 171]. При выборе микроРНК, которые входили бы в такие панели, в

настоящее время используются исключительно данные относительно их экспрессии в

больных и ЗД. При этом ошибки определения их концентраций в силу ошибок дозирования,

ПЦР и естественный разброс данных между здоровыми и больными донорами не

учитываются. Это осложняет как рациональный выбор микроРНК-маркеров так и

определение уровня cut-off, т.е. концентраций микроРНК, превышение (или напротив

понижение) которых является диагностическим критерием.

Для того, чтобы выбрать пары микроРНК, которые должны войти в состав

диагностической системы мы предложили алгоритм анализа данных, состоящий из четырѐх

блоков. Отбор пар микроРНК осуществляется, исходя из диагностической эффективности

маркеров (наивысшие показатели чувствительности при 100% специфичности) и учитывает

диагностический диапазон измеряемых маркеров. Для того, чтобы скомпоновать такую

диагностическую систему необходимо выполнить последовательность нижеперечисленных

действий (Рисунок 6, на примере блока для постановки диагноза «точно РПЖ»):

89

1. Проанализировать данные отношений экспрессии выбранных пар микроРНК в

любой из исследуемых фракций мочи у составной группы доноров «ЗД+ДГПЖ»

(используется в качестве контрольной группы), если распределение является

нормальным, то рассчитать среднее и стандартное отклонение (SD), если

распределение не является нормальным, то рассчитать медиану (med), квартили (Q)

(5%, 95%) и SD, т.е. определить диапазон, в котором значения dCt соответствуют

пациентам группы «ЗД+ДГПЖ», а вне этого диапазона – пациентам с РПЖ. В нашей

работе, в связи с нормальностью распределения полученных значений,

рассчитывались средние и стандартные отклонения.

2. Проанализировать данные по экспрессии микроРНК в образцах больных РПЖ. Все

пациенты этой группы, у которых значения dCt/ddCt конкретной пары микроРНК в

этой же фракции исследуемой биологической жидкости, лежат за пределами cut off

(mean+2SD или mean-2SD, полученные из анализа экспрессии микроРНК у группы

доноров «ЗД+ДГПЖ») считаются больными РПЖ. Если в эксперименте основная

часть значений dCt/ddCt у больных пациентов была меньше, чем у ЗД, то

используется «-2SD», в противном случае используется «+2SD» (рисунок 8).

3. У оставшихся пациентов из группы больных анализируют экспрессию либо этой же

пары микроРНК в другой фракции мочи, либо следующую пару микроРНК в этой

же/другой фракции мочи. Как и на предыдущем шаге, идентификация

онкологического больного производится путем сравнения полученных dCt/ddCt

значений экспрессий микроРНК со значениями mean±2SD (полученными из анализа

экспрессий этих же микроРНК в этой же фракции биологической жидкости у группы

доноров «ЗД+ДГПЖ»). То есть, если полученные значения dCt/ddCt выходят за

пределы mean+2SD или mean-2SD, то пациент считается больным РПЖ.

4. С образцами пациентов, не попавших за предыдущие шаги в группу «больных

РПЖ», проделывают те же действия, что и раньше, но с использованием следующих

пар микроРНК, анализируя их экспрессию или распределение в различных фракциях

мочи.

90

Рисунок 8. Схема анализа данных для выявления и мониторинга больных РПЖ. (А)

Выбор диапазонов для каждой пары маркерных микроРНК; (Б) Общая схема

алгоритма анализа данных для постановки диагноза «точно РПЖ».

Для увеличения достоверности анализа и статистической мощности исследования

необходимо проделать те же самые шаги, поменяв в анализе группы пациентов местами или

«изменив» состав групп. Тогда, если в одном из блоков ставился диагноз «точно РПЖ», то в

трѐх других блоках ставятся диагнозы «точно болен» (ЗД (как контроль) и ДГПЖ+РПЖ),

«точно не РПЖ» (РПЖ (как контроль) и ЗД+ ДГПЖ), «точно здоров» (ДГПЖ + РПЖ (как

контроль) и ЗД), рисунок 8.

Предложенный алгоритм действий по постановке диагноза позволяет: 1) на основании

данных об экспрессии 7-ми микроРНК в моче пациентов, полученных с использованием 4

аналитических систем, выявлять пациентов с диагностическим статусом «точно болен» с

чувствительностью и специфичностью 100% (Рисунок 9А; Таблица 14); 2) на основании

данных об экспрессии 9-ти микроРНК в моче пациентов, полученных с использованием 5

аналитических систем, выявлять пациентов с диагнозом РПЖ со специфичностью 100% и

чувствительностью 90% (Рисунок 9Б; Таблица15); 3) на основании данных об экспрессии 9-

ти микроРНК в моче пациентов, полученных с использованием 5 аналитических систем,

выявлять пациентов с диагностическим статусом «точно не РПЖ» со специфичностью и

чувствительностью 100% (Рисунок 9В, Таблица 16); 4) на основании данных об экспрессии

5-ти микроРНК в моче пациентов, полученных с использованием 3 аналитических систем,

91

выявлять пациентов с диагностическим статусом «точно здоров» со специфичностью и

чувствительностью 100% (Рисунок 9Г, Таблица 17).

К сожалению, нам не удалось поставить диагноз («РПЖ») только одному пациенту

(Таблица 15), но нам удалось отнести его к группе пациентов с диагностическим статусом

«точно болен» (Таблица 14).

А. «Точно болен»

ЗД (контрольная группа) и ДГПЖ+РПЖ

92

Б. «Точно РПЖ»

ЗД+ДГПЖ (как контрольная группа) и РПЖ

В. «Точно не РПЖ»

РПЖ (как контрольная группа) и ЗД+ДГПЖ

93

Г. «Точно здоров»

ДГПЖ+РПЖ (как контрольная группа) и ЗД

Рисунок 9. Схема алгоритма анализа данных с указанием значений Р и

чувствительности для каждой аналитической системы (A) для выявления больных

пациентов (ДГПЖ или РПЖ) (ЗД (как контрольная группа) и ДГПЖ+РПЖ); (Б) для

выявления больных РПЖ (ЗД+ДГПЖ (как контрольная группа) и РПЖ); (В) для

выявления пациентов с диагнозом «точно не РПЖ» (РПЖ (как контрольная группа) и

ЗД+ДГПЖ); (Г) для выявления ЗД (ДГПЖ+РПЖ (как контрольная группа) и ЗД).

Часть из выбранных систем перекрываются в диагностическом плане, т.е. некоторые

пациенты могут быть отнесены к группе «РПЖ» (Таблица 15) или «точно не РПЖ»

(Таблица 16) на основании данных экспрессии одной, двух или трех пар микроРНК.

Однако, диагностическая система, базирующаяся на анализе экспрессии 3-5 пар

микроРНК обладает большей устойчивостью и позволяет надежно классифицировать

не менее 90% пациентов. Кроме того, по меньшей мере на текущем этапе,

представленные диагностические системы не дают

ложноположительных/ложноотрицательных результатов, а использование отдельных

фракций мочи с последующим объединением полученных результатов повышает

диагностическую эффективность систем, что особенно важно на ранних стадиях

94

развития онкопатологии, когда опухоль нельзя выявить инструментальными и

иммунохимическими методами.

Таблица 14. Пример использования диагностической системы для выявления

больных пациентов (ЗД (как контрольная группа) и ДГПЖ+РПЖ).

№

Образеца

Шаг 1

miR-331-

miR-92a

(моча)

Шаг 2

miR-23b-

let-7g

(моча)

Шаг 3

miR-148a- miR-

24 (ВВ)

Шаг 4

miR-148a:

miR-29b

(моча-ВВ)

Количество

систем, давших

положительный

результат

Пациенты с ДГПЖ

1 1

2 1

3 3

4 1

5 1

6 1

7 3

8 1

9 1

10 1

Пациенты с РПЖ

1 1

2 1

3 2

4 1

5 3

6 4

7 1

8 2

9 1

10 2

95

Таблица 15. Пример использования диагностической системы для постановки

диагноза РПЖ (ЗД+ДГПЖ (как контрольная группа) и РПЖ).

№

Образеца

РПЖ

Шаг 1

miR-30a-

miR-

125b

(моча)

Шаг 2

miR-425-

miR-331

(моча)

Шаг 3

miR-29b-

miR-21

(моча- ВВ)

Шаг 4

miR-191-

miR-200a

(моча)

Шаг 5

miR-331-

miR-106b

(моча-ВВ)

Количеств

о систем,

выдавших

положител

ьный

результат

1 1

2 0

3 3

4 1

5 1

6 4

7 1

8 5

9 1

10 1

Таблица 16. Пример использования диагностической системы для выявления

пациентов, у которых РПЖ точно отсутствует (РПЖ (как контрольная группа) и

ЗД+ДГПЖ).

№

Образеца

Шаг 1

miR-

106b-

miR-191

(ВВ)

Шаг 2

miR-100-

miR-30c

(моча)

Шаг 3

miR-31-

miR-29b

(моча: ВВ)

Шаг 4

miR-22-

miR-103a

(ВВ)

Шаг 5

miR-106-

miR-34a

(ВВ)

Количеств

о систем,

давших

положител

ьный

результат

ЗД

1 2

2 1

3 1

4 1

5 1

6 1

96

7 1

8 4

9 1

10 1

Пациенты с ДГПЖ

1 2

2 3

3 4

4 1

5 1

6 1

7 1

8 2

9 2

10 1

Таблица 17. Пример использования диагностической системы для выявления ЗД

(ДГПЖ+РПЖ (в качесвтве контрольной группы) и ЗД).

№ Образеца

РПЖ

Шаг 1

miR-29a-

miR-200b

(моча-ВВ)

Шаг 2

let-7f-

miR-205 (моча)

Шаг 3

miR-200a- mir-

200b (ВВ)

Количество

систем,

выдавших

положительный

результат

1 1

2 1

3 2

4 1

5 1

6 1

7 1

8 1

9 1

10 1

97

Вполне вероятно, что при увеличении выборки пациентов и уточнения диапазонов cut off

сверху и снизу от среднего для повышения эффективности диагностической системы

можно будет использовать и такие отношения пар микроРНК, в которых для постановки

диагноза могут быть использованы значения dCt/ddCt, находящиеся как выше, так и ниже

значений mean±2SD контрольной группы.

Диагностическая система на основе этого алгоритма позволяет: 1) выявлять пациентов с

диагностическим статусом «заболевание ПЖ» за 4 аналитических шага с использованием

данных об экспрессии 7 микроРНК мочи с абсолютной чувствительностью и

специфичностью, 2) выявлять пациентов больных РПЖ (в группе больных ДГПЖ и

здоровых) за 5 аналитических шагов с использованием данных об экспрессии 9

микроРНК мочи с чувствительностью 90% и специфичностью 100%, 3) используя 5

аналитических шагов с использованием данных об экспрессии 9 микроРНК, выявлять

пациентов с диагностическим статусом «не болен РПЖ» с абсолютной чувствительностью

и специфичностью, 4) выявлять пациентов с диагностическим статусом «здоров» за 3

аналитических шага с использованием данных об экспрессии 5 микроРНК мочи с

абсолютной чувствительностью и специфичностью.

Заключение

В результате выполненной работы разработан метод выделения микроРНК из крови

и мочи. Показано, что метод существенно лучше аналогов подходит для выделения

микроРНК мочи. Разработан эффективный, быстрый и простой метод выделения ВВ из

биологических жидкостей, который в комбинации с методом выделения микроРНК

позволяет получать микроРНК из фракции микровезикул, свободные от ингибиторов ОТ-

ПЦР. С использованием платформы miRCURY LNA miRNA qPCR Panels Urine (Exiqon,

Дания) получены данные о концентрации 84 микроРНК во фракциях бесклеточного

супернатанта мочи и во фракции ВВ мочи ЗД, пациентов с ДГПЖ и больных РПЖ.

Выполнен анализ данных о экспрессии 84 микроРНК с целью поиска потенциальных

маркеров РПЖ. Для анализа микрочиповых данных микроРНК трех различных групп

доноров применен feature selection algorithm Boruta на базе метода классификации

RandomForest с последующей корректировкой данных методом Бенджамина-Хохберга.

Пары микроРНК охарактеризованы по нескольким критериям, выбраны наилучшие

98

комбинации пар микроРНК и определен их диагностический потенциал. Предложен

алгоритм анализа данных, который позволяет подбирать диагностические пары

микроРНК, определять диагностические диапазоны их концентраций и формировать

панели микроРНК для диагностических систем. Предложен вариант диагностической

системы, основанной на анализе 24 микроРНК и позволяющей не только выявлять

больных раком предстательной железы с чувствительностью не менее 90% и

специфичностью 100%, но и классифицировать ЗД и больных ДГПЖ.

99

Выводы

1. Разработан протокол выделения микроРНК из мочи, основанный на использовании

гуанидина изотиоцианата и октановой кислоты. Подобраны оптимальные концентрации

реагентов для разрушения нуклеопротеиновых комплексов и осаждения балластных

биополимеров. Показано, что предложенный метод превосходит аналоги по

эффективности выделения микроРНК, скорости и простоте выполнения процедуры.

2. Разработан быстрый, простой и эффективный метод выделения внеклеточных

везикул из мочи, основанный на использовании агрегации и осаждения внеклеточных

везикул, не уступающий ультрацентрифугированию.

3. Выполнен анализ экспрессии 84 микроРНК в бесклеточной фракции и фракции ВВ

мочи ЗД, больных ДГПЖ и РПХ. Выполнен статистический и биоинформационный

анализ этих данных при помощи баз данных OncomiRDB и DIANA-TarBase. Обнаружено,

что только 52.8% микроРНК согласно OncomiRDB и 65% микроРНК согласно DIANA-

TarBase фракции ВВ и бесклеточного супернатанта мочи ассоциированы по нашим

данным с развитием РПЖ, являются простатспецифическими и принимают участие в

процессах развития РПЖ.

4. В результате проведенного исследования и статистического анализа данных

установлено 6 пар микроРНК, обладающих наибольшей диагностической

эффективностью: miR-107-miR-26b-5p (AUC 0.93, 80% чувствительность и 100%

специфичность), miR-375-3p-miR-26b-5p (AUC 0.83, 70% чувствительность и 100%

специфичность) в группе сравнения здоровые - больные РПЖ во фракции супернатанта

мочи, а так же miR-31-5p-miR-16-5p (AUC 0.89, 80% чувствительность и 100%

специфичность), miR-31-5p-miR-200b (AUC 0.88, 70% чувствительность и 100%

специфичность), miR-31-5p-miR-30e-3p (AUC 0.88, 80% чувствительность и 100%

специфичность) и miR-31-5p-miR-660-5p (AUC 0.84, 70% чувствительность и 100%

специфичность) в группе ЗД – пациенты с ДГПЖ во фракции внеклеточных везикул мочи.

5. Разработан вариант алгоритма анализа данных, позволяющий выбирать пары

микроРНК для построения диагностической системы максимально классифицирующей

пациентов, уровни cut-off, учитывающие разброс данных и систематические ошибки. На

основании полученных данных выбрана панель из 24 диагностически значимых

микроРНК и разработана диагностическая система, которая на основании данных об

экспрессии микроРНК в моче, полученных с использованием 17 аналитических систем,

позволяет выявлять ЗД, пациентов с ДГПЖ и больных РПЖ с специфичностью 100% и

чувствительностью не менее 90%.

100

Список литературы

1. Каприн А. Д. Злокачественные новообразования в России в 2015 году/ Москва. 2017. –

250 с.

2. URL:https://www.cancer.org/content/cancer/en/cancer/prostate-cancer/detection-diagnosis-

staging/survival-rates.html

3. Alford A.V. The Use of Biomarkers in Prostate Cancer Screening and Treatment / Alford

A.V., Brito J.M., Yadav K.K., Yadav S.S., Tewari A.K., Renzulli J. // Reviews in Urology –

2017. – Т. 19 – № 4 – С.221–234.

4. Kretschmer A. Biomarkers in prostate cancer – Current clinical utility and future perspectives

/ Kretschmer A., Tilki D. // Critical Reviews in Oncology/Hematology – 2017. – Т. 120 –

С.180–193.

5. Di Meo A. Liquid biopsy: a step forward towards precision medicine in urologic malignancies

/ Di Meo A., Bartlett J., Cheng Y., Pasic M.D., Yousef G.M. // Molecular Cancer – 2017. – Т. 16

– № 1.

6. Zaporozhchenko I.A. Representation Analysis of miRNA in Urine Microvesicles and Cell-

Free Urine in Prostate Diseases / Zaporozhchenko I.A., Bryzgunova O.E., Lekchnov E.A.,

Osipov I.D., Zaripov M.M., Yurchenko Y.B., Yarmoschuk S.V., Pashkovskaya O.A., Rykova

E.Y., Zheravin A.A., Laktionov P.P. // Biochemistry (Moscow), Supplement Series B:

Biomedical Chemistry – 2018. – Т. 12 – № 2 – С.156–163.

7. Fendler A. The translational potential of microRNAs as biofluid markers of urological

tumours / Fendler A., Stephan C., Yousef G.M., Kristiansen G., Jung K. // Nature Reviews

Urology – 2016. – Т. 13 – № 12 – С.734–752.

8. Balacescu O. Urinary microRNAs for prostate cancer diagnosis, prognosis, and treatment

response: are we there yet? / Balacescu O., Petrut B., Tudoran O., Feflea D., Balacescu L.,

Anghel A., Sirbu I.O., Seclaman E., Marian C. // Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA – 2017.

– Т. 8 – № 6 – С.e1438.

9. Endzeliņš E. Diagnostic, prognostic and predictive value of cell-free miRNAs in prostate

cancer: a systematic review / Endzeliņš E., Melne V., Kalniņa Z., Lietuvietis V., Riekstiņa U.,

Llorente A., Linē A. // Molecular Cancer – 2016. – Т. 15 – № 1.

101

10. Глыбочко П.В. Практическая урология. Москва. –2012. –352 с.

11. Chen S.-L. Prostate Cancer Mortality-To-Incidence Ratios Are Associated with Cancer Care

Disparities in 35 Countries / Chen S.-L., Wang S.-C., Ho C.-J., Kao Y.-L., Hsieh T.-Y., Chen

W.-J., Chen C.-J., Wu P.-R., Ko J.-L., Lee H., Sung W.-W. // Scientific Reports – 2017. – Т. 7 –

№ 1.

12. Zhang K. Prostate cancer screening in Europe and Asia / Zhang K., Bangma C.H., Roobol

M.J. // Asian Journal of Urology – 2017. – Т. 4 – № 2 – С.86–95.

13. Hendriks R.J. Comparative analysis of prostate cancer specific biomarkers PCA3 and ERG

in whole urine, urinary sediments and exosomes / Hendriks R.J., Dijkstra S., Jannink S.A.,

Steffens M.G., Oort I.M. van, Mulders P.F.A., Schalken J.A. // Clinical Chemistry and

Laboratory Medicine (CCLM) – 2016. – Т. 54 – № 3.

14. Banerjee S. Worldwide Prostate Cancer Epidemiology: Differences Between Regions, Races,

and Awareness Programs / Banerjee S. // International Journal of Clinical and Experimental

Medical Sciences – 2016. – Т. 2 – № 1 – С.1.

15. Filippou P. Epidemiology of Prostate and Testicular Cancer / Filippou P., Ferguson J.,

Nielsen M. // Seminars in Interventional Radiology – 2016. – Т. 33 – № 03 – С.182–185.

16. Aslanidis I.P. 11C-Choline Pet/Ct in the Detection of Prostate Cancer Relapse in Patients

After Radical Treatment With Psa Level < 10 Ng/Ml / Aslanidis I.P., Pursanova D.M., Ekaeva

I.V., Trifonova T.A., Mukhortova O.V., Kotljarov A.А., Korniletskiy I.D., Shirokorad V.I.,

Roshchin D.A. // KnE Energy – 2018. – Т. 3 – № 2 – С.32.

17. Мухомор А.И. Комплексное трансректальное ультразвуковое исследование с

цветовым допплеровским кодированием, допплерографией и соноэластграфией в

выявлении рака предстательной железы. / А.И. Мухомор, Г.И. Ахвердиева, Э.Б. Санай и

др. // Онкоурология – 2013. – № 2. – С.42-52.

18. Ахвердиева Г.И. Панов В.О. Тюрин ИЕ, Долгушин БИ, Матвеев ВБ, Камолов БШ, и

др. Мультипараметрическая магнитно-резонансная томография в диагностике локального

рецидива рака предстательной железы после радикальной простатэктомии. /

Ахвердиева Г.И., Панов В.О., Тюрин И.Е., Долгушин Б.И., Матвеев В.Б., Камолов Б.Ш., и

др. // Онкоурология – 2015. – № 4. – С.72-79.

102

19. Daniyal M. Epidemiology, Etiology, Diagnosis and Treatment of Prostate Cancer / Daniyal

M., Siddiqui Z.A., Akram M., Asif H.M., Sultana S., Khan A. // Asian Pacific Journal of Cancer

Prevention – 2014. – Т. 15 – № 22 – С.9575–9578.

20. Khazaei S. Global prostate cancer incidence and mortality rates according to the human

development index / Khazaei S., Rezaeian S., Ayubi E., Gholamaliee B., Pishkuhi M.A.,

Mansori K., Nematollahi S., Sani M., Hanis S.M. // Asian Pacific Journal of Cancer Prevention –

2016. – Т. 17 – № 8 – С.3791–3794.

21. Cooperberg M.R. Epidemiology of prostate cancer / Cooperberg M.R., Chan J.M. // World

Journal of Urology – 2017. – Т. 35 – № 6 – С.849–849.

22. Wu D. Urinary biomarkers in prostate cancer detection and monitoring progression / Wu D.,

Ni J., Beretov J., Cozzi P., Willcox M., Wasinger V., Walsh B., Graham P., Li Y. // Critical

Reviews in Oncology/Hematology – 2017. – Т. 118 – С.15–26.

23. URL:http://uroweb.org/guideline/prostate-cancer/#5.

24. Глыбочко П.В. Урология /Москва, 2014. –250 с.

25. Чиссов В.И. Онкология/ – Москва, Гэотар-Медиа, 2007. – 544 с.

26. Аль-Шукри С.Х. Урология/ С.Х. Аль-Шукри и В.Н. Ткачук, Москва, 2012. - 480 с.

27. Матвеев Б. Клиническая онкоурология /Москва, 2003. –717 с.

28. А.В. Мищенко и др.Система унифицированного подхода к интерпретации магнитно-

резонансной томографии предстательной железы согласно руководству PI-RADSv2 //

Онкоурология – 2016 Т. 12 – №1 – С.81-89.

29. Демешко П. Д. и др. Роль остеосцинграфии в диагностике метастатического

поражения костей скелета у пациентов с биохимическим рецидивом после радикальной

простатэктомии по поводу рака предстательной железы // Онкоурология – 2012. – №4 –

С.70-77.

30. Martignano F. Urinary RNA-based biomarkers for prostate cancer detection / Martignano F.,

Rossi L., Maugeri A., Gallà V., Conteduca V., De Giorgi U., Casadio V., Schepisi G. // Clinica

Chimica Acta – 2017. – Т. 473 – С.96–105.

31. Batra J.S. A Quest to Identify Prostate Cancer Circulating Biomarkers with a Bench-to-

Bedside Potential / Batra J.S., Girdhani S., Hlatky L. // Journal of Biomarkers – 2014. – Т. 2014

– С.1–12.

103

32. Saini S. PSA and beyond: alternative prostate cancer biomarkers / Saini S. // Cellular

Oncology – 2016. – Т. 39 – № 2 – С.97–106.

33. Mottet N. EAU-ESTRO-SIOG Guidelines on Prostate Cancer. Part 1: Screening, Diagnosis,

and Local Treatment with Curative Intent / Mottet N., Bellmunt J., Bolla M., Briers E.,

Cumberbatch M.G., De Santis M., Fossati N., Gross T., Henry A.M., Joniau S., Lam T.B.,

Mason M.D., Matveev V.B., Moldovan P.C., Bergh R.C.N. van den, Van den Broeck T., Poel

H.G. van der, Kwast T.H. van der, Rouvière O., Schoots I.G., Wiegel T., Cornford P. //

European Urology – 2017. – Т. 71 – № 4 – С.618–629.

34. Filella X. Prostate Cancer Detection and Prognosis: From Prostate Specific Antigen (PSA) to

Exosomal Biomarkers / Filella X., Foj L. // International Journal of Molecular Sciences – 2016. –

Т. 17 – № 11 – С.1784.

35. Ferro M. Biomarkers in localized prostate cancer / Ferro M., Buonerba C., Terracciano D.,

Lucarelli G., Cosimato V., Bottero D., Deliu V.M., Ditonno P., Perdonà S., Autorino R., Coman

I., De Placido S., Di Lorenzo G., De Cobelli O. // Future Oncology – 2016. – Т. 12 – № 3 –

С.399–411.

36. Hatakeyama S. Recent progress and perspectives on prostate cancer biomarkers /

Hatakeyama S., Yoneyama T., Tobisawa Y., Ohyama C. // International Journal of Clinical

Oncology – 2017. – Т. 22 – № 2 – С.214–221.

37. Rigau M. The Present and Future of Prostate Cancer Urine Biomarkers / Rigau M., Olivan

M., Garcia M., Sequeiros T., Montes M., Colás E., Llauradó M., Planas J., Torres I. de, Morote

J., Cooper C., Reventós J., Clark J., Doll A. // International Journal of Molecular Sciences –

2013. – Т. 14 – № 6 – С.12620–12649.

38. Trock B.J. Circulating biomarkers for discriminating indolent from aggressive disease in

prostate cancer active surveillance: / Trock B.J. // Current Opinion in Urology – 2014. – Т. 24 –

№ 3 – С.293–302.

39. Zhang W. A novel urinary long non-coding RNA transcript improves diagnostic accuracy in

patients undergoing prostate biopsy: Novel Urinary LncRNA for Detection of Prostate Cancer /

Zhang W., Ren S.-C., Shi X.-L., Liu Y., Zhu Y.-S., Jing T.-L., Wang F.-B., Chen R., Xu C.-L.,

Wang H.-Q., Wang H.-F., Wang Y., Liu B., Li Y.-M., Fang Z.-Y., Guo F., Lu X., Shen D., Gao

X., Hou J.-G., Sun Y.-H. // The Prostate – 2015. – Т. 75 – № 6 – С.653–661.

104

40. Tosoian J.J. Urinary Biomarkers for Prostate Cancer / Tosoian J.J., Ross A.E., Sokoll L.J.,

Partin A.W., Pavlovich C.P. // Urologic Clinics of North America – 2016. – Т. 43 – № 1 – С.17–

38.

41. Hessels D. Urinary biomarkers for prostate cancer: a review / Hessels D., Schalken J.A. //

Asian Journal of Andrology – 2013. – Т. 15 – № 3 – С.333–339.

42. Locke J.A. Next generation biomarkers in prostate cancer / Locke J.A., Black P.C. //

Frontiers in Bioscience (Landmark Edition) – 2016. – Т. 21 – С.328–342.

43. Massillo C. Implications of microRNA dysregulation in the development of prostate cancer /

Massillo C., Dalton G.N., Farré P.L., De Luca P., De Siervi A. // Reproduction – 2017. – Т. 154

– № 4 – С.R81–R97.

44. Kanwal R. MicroRNAs in prostate cancer: Functional role as biomarkers / Kanwal R., Plaga

A.R., Liu X., Shukla G.C., Gupta S. // Cancer Letters – 2017. – Т. 407 – С.9–20.

45. Vanacore D. Micrornas in prostate cancer: an overview / Vanacore D., Boccellino M.,

Rossetti S., Cavaliere C., D‘Aniello C., Di Franco R., Romano F.J., Montanari M., La Mantia E.,

Piscitelli R. // Oncotarget – 2017. – Т. 8 – № 30 – С.50240.

46. Zhou H. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for

biomarker discovery / Zhou H., Yuen P.S.T., Pisitkun T., Gonzales P.A., Yasuda H., Dear J.W.,

Gross P., Knepper M.A., Star R.A. // Kidney International – 2006. – Т. 69 – № 8 – С.1471–

1476.

47. Stephan C. Prostate-specific antigen and other serum and urine markers in prostate cancer /

Stephan C., Ralla B., Jung K. // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer –

2014. – Т. 1846 – № 1 – С.99–112.

48. Bryant R.J. Changes in circulating microRNA levels associated with prostate cancer / Bryant

R.J., Pawlowski T., Catto J.W.F., Marsden G., Vessella R.L., Rhees B., Kuslich C., Visakorpi T.,

Hamdy F.C. // British Journal of Cancer – 2012. – Т. 106 – № 4 – С.768–774.

49. Egidi M.G. Stability Assessment of Candidate Reference Genes in Urine Sediment of

Prostate Cancer Patients for miRNA Applications / Egidi M.G., Cochetti G., Guelfi G., Zampini

D., Diverio S., Poli G., Mearini E. // Disease Markers – 2015. – Т. 2015 – С.1–6.

105

50. Casanova-Salas I. Identification of miR-187 and miR-182 as Biomarkers of Early Diagnosis

and Prognosis in Patients with Prostate Cancer Treated with Radical Prostatectomy / Casanova-

Salas I., Rubio-Briones J., Calatrava A., Mancarella C., Masiá E., Casanova J., Fernández-Serra

A., Rubio L., Ramírez-Backhaus M., Armiñán A., Domínguez-Escrig J., Martínez F., García-

Casado Z., Scotlandi K., Vicent M.J., López-Guerrero J.A. // The Journal of Urology – 2014. –

Т. 192 – № 1 – С.252–259.

51. Salido-Guadarrama A.I. Urinary microRNA-based signature improves accuracy of detection

of clinically relevant prostate cancer within the prostate-specific antigen grey zone / Salido-

Guadarrama A.I., Morales-Montor J.G., Rangel-EscareñO C., Langley E., Peralta-Zaragoza O.,

Colin J.L.C., Rodriguez-Dorantes M. // Molecular Medicine Reports – 2016. – Т. 13 – № 6 –

С.4549–4560.

52. Stuopelyte K. The utility of urine-circulating miRNAs for detection of prostate cancer /

Stuopelyte K., Daniunaite K., Bakavicius A., Lazutka J.R., Jankevicius F., Jarmalaite S. // British

Journal of Cancer – 2016. – Т. 115 – № 6 – С.707–715.

53. Srivastava A. MicroRNA Profiling in Prostate Cancer - The Diagnostic Potential of Urinary

miR-205 and miR-214 / Srivastava A., Goldberger H., Dimtchev A., Ramalinga M., Chijioke J.,

Marian C., Oermann E.K., Uhm S., Kim J.S., Chen L.N., Li X., Berry D.L., Kallakury B.V.S.,

Chauhan S.C., Collins S.P., Suy S., Kumar D. // PLoS ONE – 2013. – Т. 8 – № 10 – С.e76994.

54. Korzeniewski N. Identification of cell-free microRNAs in the urine of patients with prostate

cancer / Korzeniewski N., Tosev G., Pahernik S., Hadaschik B., Hohenfellner M., Duensing S. //

Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations – 2015. – Т. 33 – № 1 – С.16.e17-

16.e22.

55. Sapre N. Curated MicroRNAs in Urine and Blood Fail to Validate as Predictive Biomarkers

for High-Risk Prostate Cancer / Sapre N., Hong M.K.H., Macintyre G., Lewis H., Kowalczyk

A., Costello A.J., Corcoran N.M., Hovens C.M. // PLoS ONE – 2014. – Т. 9 – № 4 – С.e91729.

56. Haj-Ahmad T.A. Potential Urinary miRNA Biomarker Candidates for the Accurate

Detection of Prostate Cancer among Benign Prostatic Hyperplasia Patients / Haj-Ahmad T.A.,

Abdalla M.A., Haj-Ahmad Y. // Journal of Cancer – 2014. – Т. 5 – № 3 – С.182–191.

106

57. Bryzgunova O.E. Comparative Study of Extracellular Vesicles from the Urine of Healthy

Individuals and Prostate Cancer Patients / Bryzgunova O.E., Zaripov M.M., Skvortsova T.E.,

Lekchnov E.A., Grigor‘eva A.E., Zaporozhchenko I.A., Morozkin E.S., Ryabchikova E.I.,

Yurchenko Y.B., Voitsitskiy V.E., Laktionov P.P. // PLOS ONE – 2016. – Т. 11 – № 6 –

С.e0157566.

58. Koppers-Lalic D. Non-invasive prostate cancer detection by measuring miRNA variants

(isomiRs) in urine extracellular vesicles / Koppers-Lalic D., Hackenberg M., Menezes R. de,

Misovic B., Wachalska M., Geldof A., Zini N., Reijke T. de, Wurdinger T., Vis A., Moorselaar

J. van, Pegtel M., Bijnsdorp I. // Oncotarget – 2016. – Т. 7 – № 16.

59. Foj L. Exosomal and Non-Exosomal Urinary miRNAs in Prostate Cancer Detection and

Prognosis: Urinary miRNAs in Prostate Cancer / Foj L., Ferrer F., Serra M., Arévalo A.,

Gavagnach M., Giménez N., Filella X. // The Prostate – 2017. – Т. 77 – № 6 – С.573–583.

60. Rodríguez M. Identification of non-invasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep

sequencing analysis of urinary exosomes / Rodríguez M., Bajo-Santos C., Hessvik N.P., Lorenz

S., Fromm B., Berge V., Sandvig K., Linē A., Llorente A. // Molecular Cancer – 2017. – Т. 16 –

№ 1.

61. Hanson E.K. Identification of forensically relevant body fluids using a panel of differentially

expressed microRNAs / Hanson E.K., Lubenow H., Ballantyne J. // Analytical Biochemistry –

2009. – Т. 387 – № 2 – С.303–314.

62. Arroyo J.D. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs

independent of vesicles in human plasma / Arroyo J.D., Chevillet J.R., Kroh E.M., Ruf I.K.,

Pritchard C.C., Gibson D.F., Mitchell P.S., Bennett C.F., Pogosova-Agadjanyan E.L., Stirewalt

D.L., Tait J.F., Tewari M. // Proceedings of the National Academy of Sciences – 2011. – Т. 108

– № 12 – С.5003–5008.

63. Vickers K.C. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-

density lipoproteins / Vickers K.C., Palmisano B.T., Shoucri B.M., Shamburek R.D., Remaley

A.T. // Nature Cell Biology – 2011. – Т. 13 – № 4 – С.423–433.

64. Raposo G. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends / Raposo G.,

Stoorvogel W. // The Journal of Cell Biology – 2013. – Т. 200 – № 4 – С.373–383.

107

65. Eldh M. Importance of RNA isolation methods for analysis of exosomal RNA: Evaluation of

different methods / Eldh M., Lötvall J., Malmhäll C., Ekström K. // Molecular Immunology –

2012. – Т. 50 – № 4 – С.278–286.

66. Vlassov V.V. Circulating microRNAs in lung cancer: Prospects for diagnosis, prognosis, and

prediction of antitumor treatment efficacy / Vlassov V.V., Rykova E.Y., Ponomaryova A.A.,

Zaporozhchenko I.A., Morozkin E.S., Cherdyntseva N.V., Laktionov P.P. // Molecular Biology –

2015. – Т. 49 – № 1 – С.48–57.

67. Moret I. Assessing an Improved Protocol for Plasma microRNA Extraction / Moret I.,

Sánchez-Izquierdo D., Iborra M., Tortosa L., Navarro-Puche A., Nos P., Cervera J., Beltrán B. //

PLoS ONE – 2013. – Т. 8 – № 12 – С.e82753.

68. Kim Y.-K. Short Structured RNAs with Low GC Content Are Selectively Lost during

Extraction from a Small Number of Cells / Kim Y.-K., Yeo J., Kim B., Ha M., Kim V.N. //

Molecular Cell – 2012. – Т. 46 – № 6 – С.893–895.

69. McAlexander M.A. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and

Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid / McAlexander M.A., Phillips M.J.,

Witwer K.W. // Frontiers in Genetics – 2013. – Т. 4.

70. Cheng L. Characterization and deep sequencing analysis of exosomal and non-exosomal

miRNA in human urine / Cheng L., Sun X., Scicluna B.J., Coleman B.M., Hill A.F. // Kidney

International – 2014. – Т. 86 – № 2 – С.433–444..

71. Zaporozhchenko I.A. A phenol-free method for isolation of microRNA from biological fluids

/ Zaporozhchenko I.A., Morozkin E.S., Skvortsova T.E., Bryzgunova O.E., Bondar A.A., Loseva

E.M., Vlassov V.V., Laktionov P.P. // Analytical Biochemistry – 2015. – Т. 479 – С.43–47.

72. Lekchnov E.A. Protocol for miRNA isolation from biofluids / Lekchnov E.A.,

Zaporozhchenko I.A., Morozkin E.S., Bryzgunova O.E., Vlassov V.V., Laktionov P.P. //

Analytical Biochemistry – 2016. – Т. 499 – С.78–84.

73. Camussi G. Exosome/microvesicle-mediated epigenetic reprogramming of cells / Camussi

G., Deregibus M.-C., Bruno S., Grange C., Fonsato V., Tetta C. // American Journal of Cancer

Research – 2011. – Т. 1 – № 1 – С.98–110.

108

74. Abels E.R. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection,

Content, Release, and Uptake / Abels E.R., Breakefield X.O. // Cellular and Molecular

Neurobiology – 2016. – Т. 36 – № 3 – С.301–312.

75. Iraci N. Focus on Extracellular Vesicles: Physiological Role and Signalling Properties of

Extracellular Membrane Vesicles / Iraci N., Leonardi T., Gessler F., Vega B., Pluchino S. //

International Journal of Molecular Sciences – 2016. – Т. 17 – № 2 – С.171.

76. Tamkovich S.N. Exosomes: Generation, structure, transport, biological activity, and

diagnostic application / Tamkovich S.N., Tutanov O.S., Laktionov P.P. // Biochemistry

(Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology – 2016. – Т. 10 – № 3 – С.163–

173.

77. Borges F.T. TGF- 1-Containing Exosomes from Injured Epithelial Cells Activate Fibroblasts

to Initiate Tissue Regenerative Responses and Fibrosis / Borges F.T., Melo S.A., Ozdemir B.C.,

Kato N., Revuelta I., Miller C.A., Gattone V.H., LeBleu V.S., Kalluri R. // Journal of the

American Society of Nephrology – 2013. – Т. 24 – № 3 – С.385–392.

78. Gonda D.D. Neuro-oncologic Applications of Exosomes, Microvesicles, and Other Nano-

Sized Extracellular Particles: / Gonda D.D., Akers J.C., Kim R., Kalkanis S.N., Hochberg F.H.,

Chen C.C., Carter B.S. // Neurosurgery – 2013. – Т. 72 – № 4 – С.501–510.

79. Żmigrodzka M. The biology of extracellular vesicles with focus on platelet microparticles

and their role in cancer development and progression / Żmigrodzka M., Guzera M., Miśkiewicz

A., Jagielski D., Winnicka A. // Tumor Biology – 2016. – Т. 37 – № 11 – С.14391–14401.

80. Ciardiello C. Focus on Extracellular Vesicles: New Frontiers of Cell-to-Cell Communication

in Cancer / Ciardiello C., Cavallini L., Spinelli C., Yang J., Reis-Sobreiro M., Candia P. de,

Minciacchi V., Di Vizio D. // International Journal of Molecular Sciences – 2016. – Т. 17 – № 2

– С.175.

81. Théry C. Membrane vesicles as conveyors of immune responses / Théry C., Ostrowski M.,

Segura E. // Nature Reviews Immunology – 2009. – Т. 9 – № 8 – С.581–593.

82. Frydrychowicz M. Exosomes - Structure, Biogenesis and Biological Role in Non-Small-Cell

Lung Cancer / Frydrychowicz M., Kolecka-Bednarczyk A., Madejczyk M., Yasar S., Dworacki

G. // Scandinavian Journal of Immunology – 2015. – Т. 81 – № 1 – С.2–10.

109

83. Mathivanan S. Exosomes: Extracellular organelles important in intercellular communication

/ Mathivanan S., Ji H., Simpson R.J. // Journal of Proteomics – 2010. – Т. 73 – № 10 – С.1907–

1920.

84. Al-Nedawi K. Microvesicles: Messengers and mediators of tumor progression / Al-Nedawi

K., Meehan B., Rak J. // Cell Cycle – 2009. – Т. 8 – № 13 – С.2014–2018.

85. Akers J.C. Biogenesis of extracellular vesicles (EV): exosomes, microvesicles, retrovirus-

like vesicles, and apoptotic bodies / Akers J.C., Gonda D., Kim R., Carter B.S., Chen C.C. //

Journal of Neuro-Oncology – 2013. – Т. 113 – № 1 – С.1–11.

86. Willms E. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological

properties / Willms E., Johansson H.J., Mäger I., Lee Y., Blomberg K.E.M., Sadik M., Alaarg

A., Smith C.I.E., Lehtiö J., EL Andaloussi S., Wood M.J.A., Vader P. // Scientific Reports –

2016. – Т. 6 – № 1.

87. Ha D. Exosomes as therapeutic drug carriers and delivery vehicles across biological

membranes: current perspectives and future challenges / Ha D., Yang N., Nadithe V. // Acta

Pharmaceutica Sinica B – 2016. – Т. 6 – № 4 – С.287–296.

88. Colombo M. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other

Extracellular Vesicles / Colombo M., Raposo G., Théry C. // Annual Review of Cell and

Developmental Biology – 2014. – Т. 30 – № 1 – С.255–289.

89. Yokoi A. Towards the realization of clinical extracellular vesicle diagnostics: challenges and

opportunities / Yokoi A., Yoshioka Y., Ochiya T. // Expert Review of Molecular Diagnostics –

2015. – Т. 15 – № 12 – С.1555–1566.

90. Boukouris S. Exosomes in bodily fluids are a highly stable resource of disease biomarkers /

Boukouris S., Mathivanan S. // PROTEOMICS - Clinical Applications – 2015. – Т. 9 – № 3–4 –

С.358–367.

91. Ihara T. The process of ultrastructural changes from nuclei to apoptotic body / Ihara T.,

Yamamoto T., Sugamata M., Okumura H., Ueno Y. // Virchows Archiv: An International

Journal of Pathology – 1998. – Т. 433 – № 5 – С.443–447.

92. Hristov M. Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the

differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro / Hristov M. // Blood – 2004. – Т.

104 – № 9 – С.2761–2766.

110

93. Yáñez-Mó M. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions

/ Yáñez-Mó M., Siljander P.R.-M., Andreu Z., De Wever O. // Journal of Extracellular Vesicles

– 2015. – Т. 4 – № 1 – С.27066.

94. Kaur A. Role of Exosomes in Pathology / Kaur A., Leishangthem G.D., Bhat P, Mahajan V.,

Dev Singh N., Banga H.S. // Journal of Environmental Pathology, Toxicology and Oncology. –

2014. – Т. 1 – С.7–11.

95. Marleau A.M. Exosome removal as a therapeutic adjuvant in cancer / Marleau A.M., Chen

C.-S., Joyce J.A., Tullis R.H. // Journal of Translational Medicine – 2012. – Т. 10 – № 1.

96. Tominaga N. Micromanaging of tumor metastasis by extracellular vesicles / Tominaga N.,

Katsuda T., Ochiya T. // Seminars in Cell & Developmental Biology – 2015. – Т. 40 – С.52–59.

97. Junker K. Extracellular Vesicles and Their Role in Urologic Malignancies / Junker K.,

Heinzelmann J., Beckham C., Ochiya T., Jenster G. // European Urology – 2016. – Т. 70 – № 2 –

С.323–331.

98. Escudier B. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DC)

derived-exosomes: results of thefirst phase I clinical trial / Escudier B., Dorval T., Chaput N.,

André F., Caby M.-P., Novault S., Flament C., Leboulaire C., Borg C., Amigorena S., Boccaccio

C., Bonnerot C., Dhellin O., Movassagh M., Piperno S., Robert C., Serra V., Valente N., Le Pecq

J.-B., Spatz A., Lantz O., Tursz T., Angevin E., Zitvogel L. // Journal of Translational Medicine

– 2005. – Т. 3 – № 1 – С.10.

99. Viaud S. Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and

Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15Rα / Viaud S., Terme M., Flament C., Taieb

J., André F., Novault S., Escudier B., Robert C., Caillat-Zucman S., Tursz T., Zitvogel L.,

Chaput N. // PLoS ONE – 2009. – Т. 4 – № 3 – С.e4942.

100. Pitt J.M. Dendritic Cell-Derived Exosomes as Immunotherapies in the Fight against Cancer

/ Pitt J.M., Charrier M., Viaud S., Andre F., Besse B., Chaput N., Zitvogel L. // The Journal of

Immunology – 2014. – Т. 193 – № 3 – С.1006–1011.

101. Lo Cicero A. Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad /

Lo Cicero A., Stahl P.D., Raposo G. // Current Opinion in Cell Biology – 2015. – Т. 35 – С.69–

77.

111

102. Tauro B.J. Comparison of ultracentrifugation, density gradient separation, and

immunoaffinity capture methods for isolating human colon cancer cell line LIM1863-derived

exosomes / Tauro B.J., Greening D.W., Mathias R.A., Ji H., Mathivanan S., Scott A.M.,

Simpson R.J. // Methods – 2012. – Т. 56 – № 2 – С.293–304.

103. Salih M. Urinary extracellular vesicles and the kidney: biomarkers and beyond / Salih M.,

Zietse R., Hoorn E.J. // American Journal of Physiology-Renal Physiology – 2014. – Т. 306 – №

11 – С.F1251–F1259.

104. Taylor D.D. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of

their cargoes / Taylor D.D., Shah S. // Methods – 2015. – Т. 87 – С.3–10.

105. Colombet J. Virioplankton ‗pegylation‘: Use of PEG (polyethylene glycol) to concentrate

and purify viruses in pelagic ecosystems / Colombet J., Robin A., Lavie L., Bettarel Y., Cauchie

H.M., Sime-Ngando T. // Journal of Microbiological Methods – 2007. – Т. 71 – № 3 – С.212–

219.

106. Gámez-Valero A. Size-Exclusion Chromatography-based isolation minimally alters

Extracellular Vesicles‘ characteristics compared to precipitating agents / Gámez-Valero A.,

Monguió-Tortajada M., Carreras-Planella L., Franquesa M., Beyer K., Borràs F.E. // Scientific

Reports – 2016. – Т. 6 – № 1.

107. Deregibus M.C. Charge-based precipitation of extracellular vesicles / Deregibus M.C.,

Figliolini F., D‘antico S., Manzini P.M., Pasquino C., De Lena M., Tetta C., Brizzi M.F.,

Camussi G. // International Journal of Molecular Medicine – 2016. – Т. 38 – № 5 – С.1359–

1366.

108. Brownlee Z. A novel ―salting-out‖ procedure for the isolation of tumor-derived exosomes /

Brownlee Z., Lynn K.D., Thorpe P.E., Schroit A.J. // Journal of Immunological Methods – 2014.

– Т. 407 – С.120–126.

109. Kreimer S. Mass-Spectrometry-Based Molecular Characterization of Extracellular Vesicles:

Lipidomics and Proteomics / Kreimer S., Belov A.M., Ghiran I., Murthy S.K., Frank D.A.,

Ivanov A.R. // Journal of Proteome Research – 2015. – Т. 14 – № 6 – С.2367–2384.

110. Kanwar S.S. Microfluidic device (ExoChip) for on-chip isolation, quantification and

characterization of circulating exosomes / Kanwar S.S., Dunlay C.J., Simeone D.M., Nagrath S.

// Lab Chip – 2014. – Т. 14 – № 11 – С.1891–1900.

112

111. Santana S.M. Microfluidic isolation of cancer-cell-derived microvesicles from hetergeneous

extracellular shed vesicle populations / Santana S.M., Antonyak M.A., Cerione R.A., Kirby B.J.

// Biomedical Microdevices – 2014. – Т. 16 – № 6 – С.869–877.

112. Konoshenko M.Y. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest

Trends / Konoshenko M.Y., Lekchnov E.A., Vlassov A.V., Laktionov P.P. // BioMed Research

International – 2018. – Т. 2018 – С.1–27.

113. Yamamoto K.R. Rapid bacteriophage sedimentation in the presence of polyethylene glycol

and its application to large-scale virus purification / Yamamoto K.R., Alberts B.M., Benzinger

R., Lawhorne L., Treiber G. // Virology – 1970. – Т. 40 – № 3 – С.734–744.

114. Lobb R.J. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human

plasma / Lobb R.J., Becker M., Wen Wen S., Wong C.S.F., Wiegmans A.P., Leimgruber A.,

Möller A. // Journal of Extracellular Vesicles – 2015. – Т. 4 – № 1 – С.27031.

115. Van Deun J. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on

downstream RNA profiling / Van Deun J., Mestdagh P., Sormunen R., Cocquyt V., Vermaelen

K., Vandesompele J., Bracke M., De Wever O., Hendrix A. // Journal of Extracellular Vesicles –

2014. – Т. 3 – № 1 – С.24858.

116. Cheruvanky A. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane

ultrafiltration concentrator / Cheruvanky A., Zhou H., Pisitkun T., Kopp J.B., Knepper M.A.,

Yuen P.S.T., Star R.A. // American Journal of Physiology-Renal Physiology – 2007. – Т. 292 –

№ 5 – С.F1657–F1661.

117. Rood I.M. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify

biomarkers of nephrotic syndrome / Rood I.M., Deegens J.K.J., Merchant M.L., Tamboer

W.P.M., Wilkey D.W., Wetzels J.F.M., Klein J.B. // Kidney International – 2010. – Т. 78 – № 8

– С.810–816.

118. Gonzales P. Urinary exosomes: is there a future? / Gonzales P., Pisitkun T., Knepper M.A.

// Nephrology Dialysis Transplantation – 2008. – Т. 23 – № 6 – С.1799–1801.

119. Merchant M.L. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by

MS / Merchant M.L., Powell D.W., Wilkey D.W., Cummins T.D., Deegens J.K., Rood I.M.,

McAfee K.J., Fleischer C., Klein E., Klein J.B. // PROTEOMICS - CLINICAL

APPLICATIONS – 2010. – Т. 4 – № 1 – С.84–96.

113

120. Cvjetkovic A. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of

extracellular vesicles / Cvjetkovic A., Lötvall J., Lässer C. // Journal of Extracellular Vesicles –

2014. – Т. 3 – № 1 – С.23111.

121. Musante L. Recovery of urinary nanovesicles from ultracentrifugation supernatants /

Musante L., Saraswat M., Ravidà A., Byrne B., Holthofer H. // Nephrology Dialysis

Transplantation – 2013. – Т. 28 – № 6 – С.1425–1433.

122. Tataruch-Weinert D. Urinary extracellular vesicles for RNA extraction: optimization of a

protocol devoid of prokaryote contamination / Tataruch-Weinert D., Musante L., Kretz O.,

Holthofer H. // Journal of Extracellular Vesicles – 2016. – Т. 5 – № 1 – С.30281.

123. Sharon N. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules /

Sharon N., Lis H. // Glycobiology – 2004. – Т. 14 – № 11 – С.53R-62R.

124. Echevarria J. Microarray-Based Identification of Lectins for the Purification of Human

Urinary Extracellular Vesicles Directly from Urine Samples / Echevarria J., Royo F., Pazos R.,

Salazar L., Falcon-Perez J.M., Reichardt N.-C. // ChemBioChem – 2014. – Т. 15 – № 11 –

С.1621–1626.

125. Kosanović M. Isolation of urinary extracellular vesicles from Tamm- Horsfall protein–

depleted urine and their application in the development of a lectin-exosome-binding assay /

Kosanović M., Janković M. // BioTechniques – 2014. – Т. 57 – № 3.

126. Iorember F.M. Uromodulin: old friend with new roles in health and disease / Iorember

F.M., Vehaskari V.M. // Pediatric Nephrology – 2014. – Т. 29 – № 7 – С.1151–1158.

127. Youhanna S. Determination of uromodulin in human urine: influence of storage and

processing / Youhanna S., Weber J., Beaujean V., Glaudemans B., Sobek J., Devuyst O. //

Nephrology Dialysis Transplantation – 2014. – Т. 29 – № 1 – С.136–145.

128. Serafini-Cessi F. Tamm-Horsfall glycoprotein: biology and clinical relevance / Serafini-

Cessi F., Malagolini N., Cavallone D. // American Journal of Kidney Diseases: The Official

Journal of the National Kidney Foundation – 2003. – Т. 42 – № 4 – С.658–676.

129. Kobayashi K. Conditions for Solubilization of Tamm–Horsfall Protein/Uromodulin in

Human Urine and Establishment of a Sensitive and Accurate Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay (ELISA) Method / Kobayashi K., Fukuoka S. // Archives of Biochemistry and Biophysics

– 2001. – Т. 388 – № 1 – С.113–120.

114

130. Akiyama A. Urothelial cytoprotective activity of Tamm-Horsfall protein isolated from the

urine of healthy subjects and patients with interstitial cystitis / Akiyama A., Stein P.C., Houshiar

A., Parsons C.L. // International Journal of Urology: Official Journal of the Japanese Urological

Association – 2000. – Т. 7 – № 5 – С.176–183.

131. Argade S. An evaluation of Tamm–Horsfall protein glycans in kidney stone formers using

novel techniques / Argade S., Chen T., Shaw T., Berecz Z., Shi W., Choudhury B., Lowell

Parsons C., Sur R.L. // Urolithiasis – 2015. – Т. 43 – № 4 – С.303–312.

132. Fernández-Llama P. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation / Fernández-

Llama P., Khositseth S., Gonzales P.A., Star R.A., Pisitkun T., Knepper M.A. // Kidney

International – 2010. – Т. 77 – № 8 – С.736–742.

133. Musante L. Biochemical and Physical Characterisation of Urinary Nanovesicles following

CHAPS Treatment / Musante L., Saraswat M., Duriez E., Byrne B., Ravidà A., Domon B.,

Holthofer H. // PLoS ONE – 2012. – Т. 7 – № 7 – С.e37279.

134. Musante L. A Simplified Method to Recover Urinary Vesicles for Clinical Applications,

and Sample Banking / Musante L., Tataruch D., Gu D., Benito-Martin A., Calzaferri G., Aherne

S., Holthofer H. // Scientific Reports – 2015. – Т. 4 – № 1.

135. Bokhove M. A structured interdomain linker directs self-polymerization of human

uromodulin / Bokhove M., Nishimura K., Brunati M., Han L., Sanctis D. de, Rampoldi L.,

Jovine L. // Proceedings of the National Academy of Sciences – 2016. – Т. 113 – № 6 – С.1552–

1557.

136. Raj D.A.A. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in

urinary exosomes / Raj D.A.A., Fiume I., Capasso G., Pocsfalvi G. // Kidney International –

2012. – Т. 81 – № 12 – С.1263–1272.

137. Gаmez-Valero A. Urinary Extracellular Vesicles as Source of Biomarkers in Kidney

Diseases / Gаmez-Valero A., Lozano-Ramos S.I., Bancu I., Lauzurica-Valdemoros R., BorrÃ s

F.E. // Frontiers in Immunology – 2015. – Т. 6.

138. Pisitkun T. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine / Pisitkun T.,

Shen R.-F., Knepper M.A. // Proceedings of the National Academy of Sciences – 2004. – Т. 101

– № 36 – С.13368–13373.

115

139. Hogan M.C. Subfractionation, characterization, and in-depth proteomic analysis of

glomerular membrane vesicles in human urine / Hogan M.C., Johnson K.L., Zenka R.M.,

Cristine Charlesworth M., Madden B.J., Mahoney D.W., Oberg A.L., Huang B.Q., Leontovich

A.A., Nesbitt L.L., Bakeberg J.L., McCormick D.J., Robert Bergen H., Ward C.J. // Kidney

International – 2014. – Т. 85 – № 5 – С.1225–1237.

140. Wachalska M. Protein Complexes in Urine Interfere with Extracellular Vesicle Biomarker

Studies / Wachalska M., Koppers-Lalic D., Eijndhoven M. van, Pegtel M., Geldof A.A.,

Lipinska A.D., Moorselaar R.J. van, Bijnsdorp I.V. // Journal of Circulating Biomarkers – 2016.

– Т. 5 – С.4.

141. Channavajjhala S.K. Optimizing the purification and analysis of miRNAs from urinary

exosomes / Channavajjhala S.K., Rossato M., Morandini F., Castagna A., Pizzolo F., Bazzoni F.,

Olivieri O. // Clinical Chemistry and Laboratory Medicine – 2014. – Т. 52 – № 3.

142. Chen C.Y. Purification of Exosome-Like Vesicles from Urine Elsevier / Chen C.Y., Hogan

M.C., Ward C.J. // Methods in Enzymology – 2013. – С.225–241.

143. Puhka M. KeepEX, a simple dilution protocol for improving extracellular vesicle yields

from urine / Puhka M., Nordberg M.-E., Valkonen S., Rannikko A., Kallioniemi O., Siljander P.,

Hällström T.M. af // European Journal of Pharmaceutical Sciences – 2017. – Т. 98 – С.30–39.

144. Shen C. Antileukaemia Immunity: Effect of Exosomes against NB4 Acute Promyelocytic

Leukaemia Cells / Shen C., Hao S., Zhao C., Zhu J., Wang C. // Journal of International Medical

Research – 2011. – Т. 39 – № 3 – С.740–747.

145. Alvarez-Erviti L. Lysosomal dysfunction increases exosome-mediated alpha-synuclein

release and transmission / Alvarez-Erviti L., Seow Y., Schapira A.H., Gardiner C., Sargent I.L.,

Wood M.J.A., Cooper J.M. // Neurobiology of Disease – 2011. – Т. 42 – № 3 – С.360–367.

146. Chen C. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR / Chen C. // Nucleic

Acids Research – 2005. – Т. 33 – № 20 – С.e179–e179.

147. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4 / Laemmli U.K. // Nature – 1970. – Т. 227 – № 5259 – С.680–685.

148. Towbin H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose

sheets: procedure and some applications. 1979 / Towbin H., Staehelin T., Gordon J. //

Biotechnology (Reading, Mass.) – 1992. – Т. 24 – С.145–149.

116

149. Boeri M. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of

computed tomography detected lung cancer / Boeri M., Verri C., Conte D., Roz L., Modena P.,

Facchinetti F., Calabrò E., Croce C.M., Pastorino U., Sozzi G. // Proceedings of the National

Academy of Sciences – 2011. – Т. 108 – № 9 – С.3713–3718.

150. Landoni E. Proposal of supervised data analysis strategy of plasma miRNAs from

hybridisation array data with an application to assess hemolysis-related deregulation / Landoni

E., Miceli R., Callari M., Tiberio P., Appierto V., Angeloni V., Mariani L., Daidone M.G. //

BMC Bioinformatics – 2015. – Т. 16 – № 1.

151. Efron B.An Introduction to the Bootstrap / B. Efron, R. J. Tibshirani – Boston, MA:

Springer US, 1993.

152. Chanutin A. The precipitation of plasma proteins by short-chain fatty acids / Chanutin A.,

Curnish R.R. // Archives of Biochemistry and Biophysics – 1960. – Т. 89 – С.218–220.

153. Steinbuch M. The isolation of IgG from mammalian sera with the aid of caprylic acid /

Steinbuch M., Audran R. // Archives of Biochemistry and Biophysics – 1969. – Т. 134 – № 2 –

С.279–284.

154. Habeeb A.F. Preparation of human immunoglobulin by caprylic acid precipitation / Habeeb

A.F., Francis R.D. // Preparative Biochemistry – 1984. – Т. 14 – № 1 – С.1–17.

155. Chomczynski P. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium

thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on / Chomczynski P., Sacchi

N. // Nature Protocols – 2006. – Т. 1 – № 2 – С.581–585.

156. McKinney M.M. A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins

from serum and ascites fluid / McKinney M.M., Parkinson A. // Journal of Immunological

Methods – 1987. – Т. 96 – № 2 – С.271–278.

157. Bull H.B. Binding of fatty acids by proteins / Bull H.B., Breese K. // Archives of

Biochemistry and Biophysics – 1967. – Т. 120 – № 2 – С.303–308.

158. Zakrzewski K. Human serum albumin. Tyrosyl residues and strongly binding sites /

Zakrzewski K., Goch H. // Biochemistry – 1968. – Т. 7 – № 5 – С.1835–1842.

117

159. Kirschner M.B. Haemolysis during Sample Preparation Alters microRNA Content of

Plasma / Kirschner M.B., Kao S.C., Edelman J.J., Armstrong N.J., Vallely M.P., Zandwijk N.

van, Reid G. // PLoS ONE – 2011. – Т. 6 – № 9 – С.e24145.

160. Blondal T. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other

biofluids / Blondal T., Jensby Nielsen S., Baker A., Andreasen D., Mouritzen P., Wrang Teilum

M., Dahlsveen I.K. // Methods – 2013. – Т. 59 – № 1 – С.S1–S6.

161. Occhipinti G. The choice of endogenous controls in exosomal microRNA assessments from

biofluids / Occhipinti G., Giulietti M., Principato G., Piva F. // Tumor Biology – 2016. – Т. 37 –

№ 9 – С.11657–11665.

162. Bostwick D.G. The association of benign prostatic hyperplasia and cancer of the prostate /

Bostwick D.G., Cooner W.H., Denis L., Jones G.W., Scardino P.T., Murphy G.P. // Cancer –

1992. – Т. 70 – № S1 – С.291–301.

163. Karube K. Study of latent carcinoma of the prostate in the Japanese based on necropsy

material / Karube K. // The Tohoku journal of experimental medicine – 1961. – Т. 74 – № 3 –

С.265–285.285.

164. Guess H.A. Benign prostatic hyperplasia and prostate cancer / Guess H.A. // Epidemiologic

reviews – 2001. – Т. 23 – № 1 – С.152–158.

165. Miah S. BPH and prostate cancer risk / Miah S., Catto J. // Indian Journal of Urology –

2014. – Т. 30 – № 2 – С.214.

166. De Nunzio C. The Controversial Relationship Between Benign Prostatic Hyperplasia and

Prostate Cancer: The Role of Inflammation / De Nunzio C., Kramer G., Marberger M.,

Montironi R., Nelson W., Schröder F., Sciarra A., Tubaro A. // European Urology – 2011. – Т.

60 – № 1 – С.106–117.

167. Bryzgunova O.E. MicroRNA-guided gene expression in prostate cancer: Literature and

database overview / Bryzgunova O.E., Konoshenko M.Y., Laktionov P.P. // The Journal of Gene

Medicine – 2018. – Т. 20 – № 5 – С.e3016.

168. Takayama K. Significance of microRNAs in Androgen Signaling and Prostate Cancer

Progression / Takayama K., Misawa A., Inoue S. // Cancers – 2017. – Т. 9 – № 12 – С.102.

118

169. Cozar J.M. Genetic markers a landscape in prostate cancer / Cozar J.M., Robles-Fernandez

I., Martinez-Gonzalez L.J., Pascual-Geler M., Rodriguez-Martinez A., Serrano M.J., Lorente

J.A., Alvarez-Cubero M.J. // Mutation Research/Reviews in Mutation Research – 2018. – Т. 775

– С.1–10.

170. Miyahira A.K. The 24th Annual Prostate Cancer Foundation scientific retreat report /

Miyahira A.K., Soule H.R. // The Prostate – 2018. – Т. 78 – № 12 – С.867–878.

171. Eeles R. Men with a susceptibility to prostate cancer and the role of genetic based screening

/ Eeles R., Raghallaigh H.N. // Translational Andrology and Urology – 2018. – Т. 7 – № 1 –

С.61–69.

bq - frcftm.ru · 7 fhgblhjbg] ijhp_kkz lh _klv lj_[mxlky fzjd_ju dhlhju_ iha\hebeb [u gz^_`gh b...

Documents