BRUCELLOSSDE LABORATUVAR TEHS,

SAALTIM ve KORUNMA YNTEMLER

Prof.Dr. Nejat AYDIN

nsan ve hayvanlarda Brucella cinsi ierisindeki mikroorganizmalar tarafndan oluturulan Brucellosis, genellikle, subakut ve kronik olarak seyreden infeksiyzbir hastalktr.Hayvanlarda, zellikle, abortuslara ve bazen de infertiliteye neden olan Brucellosis insanlarda daha ziyade, vcut ssnn aralkl ykselii, ate, yorgunluk, romatizma benzeri eklem ve kas arlarna neden olan bir zoonotik infeksiyondur.

nfeksiyz hastalklara ynelik hijyenik nlemlerin alnmasyla birlikte, hastalklarla ilgili kontrol almalarnn yaplmas da gz nnde tutulmas gerekir. Zira, hastalk srye bir defa girecek olur ise eradikasyon almalar byk lde golmaktadr. Bunun yansra Brucella etkenlerinin intraseller karakter tamalar ve her trl olumsuz d etkilere dayankl olmalargz nnde tutulduunda alnacak nlemlerde ne derece handikap tekil edecei kanlmazdr.Dolaysiyle, bunun gibi eradikasyonu olduka g olan infeksiyonlarda saaltmdan ziyade korunmaya nem verilmesi gereklilii de aktr.

Genellikle, yavru atmndan baka klinik belirtiye rastlanmayan hastalk, Campylobacteriosis, Trichomonas fetus, Chlamydiapsittaci, mikotik abortuslar, viral abortuslar ve gda zehirlenmeleri ile kartrlabilir. Bu nedenle kesin tehis iin laboratuvar muayeneleri esastr.Laboratuvara gnderilen materyallerin muayenesini ise, balca 5 aamada gerekletirilebilir. Laboratuvar muayeneleri iin en ok kullanlan marazi maddeler atk yavruya ait kotiledonlar, ftal membranlar, ftusun mide ierii, ftus karacieri, ayrca anaya ait vaginal akntlar, atlmam plasenta, st ve kandr.

1) Bakteriyoskopi:Bakteriyoskopi:

Laboratuvara ulatrlan materyallerden, ncelikle, frotilerhazrlanarak, Gram, modifiye Ziehl Neelsen, Stamp ve Kster boyama yntemleri ile boyamalar yaplarak mikroskop altnda etken aranr. zellikle, Stamp boyama yntemi Chlamydia psittaci, Coxiellaburnetti ve Brucella etkenlerini ayrmada nem tamaktadr.Bakteriyoskopide ayrca, Fluoresceinle hazrlanm zel konjugatlar ile direkt Fluoresans Antikor Testinden de yararlanlmaktadr. Son yllarda Ko-aglutinasyon testi de alternatif bir yntem olarak kullanlmaktadr.

2) Kltr:

Gnderilen materyallerden eitli besi yerlerine ekimler yaplarak izolasyona gidilir. Bu amala en ok kullanlan besi yerleri, serumlu Tryptose Agar, Brucella AlbimiAgar, Trypticase Soy Buyyon gibi zenginletirilmi besi yerleridir. lk izolasyonlarda B.abortus iin %10 CO2li atmosferden yararlanlr. Ekim yaplan besi yerlerini ieren petriler 37 Cde 5-7 gn inkubasyona braklarak reyen koloniler Brucella etkenleri ynnden deerlendirilerek identifikasyoniin eitli biyokimyasal testlere bavurulur.

3) Hayvan Deneyi:

Kontamine materyallerden veya pheli kolonilerden etken izolasyon ve identifikasyonu iin, genellikle, kobaylardanyararlanlr. Erkek kobaylara periton ii inokulasyon yapldktan sonra 3-6 hafta sre iinde hayvanlar gzlem altnda tutularak bu sre iinde kobaylardan kan alnr ve serolojik testleruygulanr. len veya ldrlen kobaylarn nekropsilerinde, testislerde oritis (Straus Reaksiyonu), lenf dmlerinde byme, dalak demi ve karacierdeki deiiklikler kaydedilerek bunlardan Brucella iin zel zenginletirilmi besiyerlerineekim yaplarak etken izolasyonuna gidilir.

4) Serolojik Testler:

Brucellosisin tansnda serolojik testlerin ok byk nemi vardr. Kesin tehis koyabilmek iin bir serolojik testle yetinmeyip en az ikinci veya ncsn uygulamak gerekmektedir. Serolojik test uygulamasnda abort yapmhayvanlarda, kan veya kan serumunda gerekletirilecek testler iin gereken kan rnekleri, en erken hafta getikten sonra alnmaldr.Serolojik test uygulamalarn ana balk altnda toplamak mmkndr.

A) Kan Serumu Kullanlarak Yaplan Serolojik Testler

Bu amala, hayvanlarn vena jugularisinden alnan kandan serum elde edilerek aadaki testler uygulanr.1-abuk Aglutinasyon Testi (Plate Test): Kan serumu zerine boyal ve konsantre antijenden bir damla konularak 5-10 dakika iinde oluan aglutinasyon sonucuna gre deerlendirilen bu test, zellikle, sahada genel bir fikir vermesi ynnden nem tayan kalitatif bir testtir. abuk aglutinasyon testi taze kan ile de uygulanabilmektedir.

2-Rose Bengal Plate Test (RBPT): Lam zerinde uygulanabilen bu testte Rose Bengalile boyanm standart antijen kullanlr. Ancak, antijen hazrlamada kullanlan Bufferin pHs3.6 civarndadr. Bu asidite, serumdaki IgMlerin aktivitesini nleyerek, IgGlerin, zellikle, IgG1lerin reaksiyona katlmasna yardmc olur.

3-Serum Aglutinasyon Testi (SAT): Hastaln tehisinde nemli olan temel testlerden birisidir. Genellikle, erken olgularnortaya konulmasnda yarar bulunan bu testin uygulanmasnda ve deerlendirilmesinde dikkat edilmesi gereken hususlar nemlidir.

*Bu test, gerek alama ve gerekse infeksiyon sonu oluan spesifik ve ayrca nonspesifik antikorlar belirler ancak ayrmlarnyapamaz.

*Abortuslardan hemen sonra kandaki antikorlar saptayamaz. Kronik olgularda ise negatif alabilir.

*Ayrca, kullanlan antijenin hazrlanmasndaki ve uygulanmasndaki aksaklklar da testi olumsuz ynde etkileyebilir.

4-Komplement Fikzasyon Testi (KBR): Serum aglutinasyon testine oranla, zellikle, kronik olgularda daha spesifik bir testtir. *Ancak, spesifik olmayan ve inkomple antikorlarn araya girdii durumlarda hemen daima negatiftir. * *nfeksiyonun ortaya karlmasnda nemli bir test olarak deerini korumakta ise de aratrclar, bu testle birlikte Coombs (Antigulobulin) testininuygulanmasyla daha kesin sonu alnacan ileri srmektedirler.

5-Coombs (Antiglobulin) Testi: Brucella etkenlerine karserumda bulunan baz spesifik inkomple antikorlarnaglutinasyon oluturmad bilinmektedir.

*Dolaysiyle bu testin uygulanmasndaki ama, serum aglutinasyon testinde reaksiyon vermeyen bu antikorlarortaya koymaktr.

*Testin uygulannda ilk olarak antijen ve pheli serum inkubasyona braklr, sonra ykama ilemi yaplarak balanmam antikorlar uzaklatlr. Sonra bu komplekse tre spesifik antiglobulin eklenir. Aglutinasyon ekillenmesi pozitif olarak deerlendirilir.

6-Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA): Bu test antikor ya da antijeni saptamak iin direkt veya indirekt olarak uygulanabilmektedir.

*Son yllarda Brucellosisin tehisinde indirekt ELSA daha ok kullanlan duyarl ve gvenilir bir test olup dorulama testi olarak da yararlanlmaktadr.

*Yukarda aklanan testlere gre daha spesifik ve ou zaman da duyarl olan ELISAdan, zellikle, saha taramalarnda yararlanlmaktadr.

*Bu teknikte tercih edilen konjugata (anti-immunoglobulin) bal olarak tm immunoglobulin snf ve alt snflar ayr ayr belirlenebilmektedir.

*Yakn zamanlarda, monoklonal antikor kullanlarak uygulanan CompetetifELISAin de Ig snflarnn saptanmas ve al hayvanlar ayrmada yardmcolan bir test olarak uyguland ileri srlmektedir.

7-Pasif Hemaglutinasyon Testi: Spesifik ve duyarlolduu bildirilen bu yntemden de Brucellosisinteshisinde yararlanlmaktadr.

8-Fluoresans Antikor Teknii (FAT): Bu testin, zellikle, sr Brucellosisinin tehisinde yarar salad, spesifik ve duyarl bir test olarak uyguland ileri srlmektedir.

B) St ve St Serumu ile Yaplan Serolojik Testler

1-Ring Test: Bir saha tarama testi olarak yararlanlan bu test, reaktr srleri ortaya koymada neme sahiptir.

-Bu testin esas stle kartlan antikorlarn saptanmasdr. -Hematoksilen veya tetrazoliumla boyanm antijenden 1 ml. st iin 1 damla damlatlarak oda ssnda bekletilir. ayet st zerinde krmz veya mavi renkte bir halkaoluursa pozitif olarak deerlendirilir. Homojen dalm ise negatiftir.

2-St Serumu ile Aglutinasyon Testi:-Hastalktan pheli hayvanlardan alnan yeterli miktardaki st rnekleri laboratuvarda 3000 dev/dak ile 10-15 dakikasantrifje edildikten sonra tortu ve ya ksm atlarak sadece st ksm alnr. -Bunun her mlsine peynir mayas (rennin) katlarak 37 Cdesu banyosunda 6 saat bekletilir. Berrak olan sv alnarak tekrar santrifje edilir ve bu ekilde elde edilen st serumu aynen kan serumu gibi ilenir.

-St serumu ile aglutinasyon tpk kan serumundaki gibi tpteve lamda uygulanabilir. Hastaln tehisinde, st serumu kan serumu kadar deerli deildir.

C) Dier Testler

1-Vaginal Mukus Aglutinasyon Testi:Hastalktan pheli ineklerden alnan vaginalmukus, fenoll fizyolojik tuzlu su ve santrifgasyon yardm ile klarifiye edildikten sonra yava tp aglutinasyon testi uygulamak suretiyle deerlendirme yaplr.

2-Sperma ile Aglutinasyon Testi: Erkek hayvanlardan alnan sperma kuvvetlice santrifje edildikten sonra st ksm (seminalplazma) alnarak yava tp aglutinasyontestine tabi tutularak deerlendirme yaplr.

3-Kas svs ile Aglutinasyon (Myoaglutinasyon):Atlm yavrunun kas paralar ezilip, homojenizeedilerek, santrifgasyondan sonra st sv yavatp agltinasyon testinde kullanlr.

4-Bakteriyofaj Testi: Brucella etkenlerinin identifikasyonunda Tibilisi (Tb), Weybridge; Berkeley ve Anti Rough fajlarndanyararlanlmaktadr.

-Steril bir pamuk tamponla izgi halinde kesif bir Brucella suspansiyonundan ekim yapldktan sonra zerinde bir damla faj dilusyonlarndan (RTD) konulur ve 48 saat 37 Cde inkubasyondan sonra lize olma durumu gzlenerek deerlendirme yaplr.

5-Allerjik Testler: Baz lkelerde sr, koyun, kei ve domuz Brucellosisini ortaya karmak iin allerjik testler kullanlmaktadr.

- Genellikle, Brucellin olarak bilinen allergenlerle (Brucellalysate, Brucellergen, Melitin, MBP vs.) yaplan bu test daha ziyade sr, koyun ve keilerin kuyruk alt derisine 0.1-0.2 ml miktarnda uygulanmaktadr. Domuz ve keilerin kulak st ve srlarn koyun derisi altna da 0.5 ml verilmektedir.

- Alanmam srlerde infeksiyonun belirlenmesinde byk nem tayan bu test, al ve doal bir infeksiyon sonucu iyileen hayvanlarda geerli olmamaktadr.

Bahsedilen tm bu testler dnda konu ile ilgili almalarda kullanlan Opsonositofajik test ve F