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Universidade de Aveiro
Ano 2010
Departamento de Química
Bruna Martins Gonçalves Estudo da fotodegradação do 4 – MBC em
meio aquoso
Universidade de Aveiro
Ano 2010
Departamento de Química
Bruna Martins Gonçalves
Estudo da fotodegradação do 4 – MBC em
meio aquoso
Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento
dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Química
Analítica e Controlo de Qualidade, realizada sob a orientação
científica da Doutora Maria Eduarda Bastos Henriques dos Santos,
Professora Auxiliar do Departamento de Química da Universidade de
Aveiro.
Dedico esta tese aos meus pais, irmã e namorado…
o júri
presidente Doutor João António Baptista Pereira de Oliveira Professor Associado do Departamento de Química da Universidade de Aveiro.
Doutora Maria Manuel Balseiro Vidal Professora Adjunta da Escola Superior Agrária de Coimbra
Doutora Maria do Rosário Gonçalves Reis Marques Domingues Professora Auxiliar do Departamento de Química da Universidade de Aveiro.
Doutora Maria Eduarda Bastos Henriques dos Santos Professora Auxiliar do Departamento de Química da Universidade de Aveiro.
agradecimentos
O desenvolvimento deste trabalho envolveu um grande número de pessoas
que directa ou indirectamente contribuíram para a sua realização, a todos eles
o meu sincero agradecimento.
Gostaria de agradecer à pessoa que me orientou e tornou todo este trabalho
possível, a Prof. Doutora Eduarda Santos.
Aos meus pais, que apesar de estarem longe, me deram todo o apoio possível
e por acreditarem em mim e nas minhas capacidades. Á minha irmã por todos
os incentivos dados.
Às minhas amigas pelos momentos de alegria e companheirismo, pelo conforto
nas horas de desânimo e pelas sugestões e paciência demonstradas. Obrigada
amigas!
À Doutora Teresa Caldeira pelo apoio, paciência e ajuda sempre que
necessário. Às companheiras de laboratório, que tornaram o trabalho mais
fácil, obrigada pela ajuda, pelos momentos de descontracção e por todos os
sorrisos partilhados.
Ao António José, pela paciência infinita para me ouvir falar de todo este
trabalho vezes sem conta e pela sua presença sempre a meu lado
Muito obrigada a todos!
Palavras-chave
Filtros UV; Fotodegradação; Radiação UV, 4-Metilbenzilideno- Cânfora.
Resumo
Os filtros UV são compostos amplamente utilizados em diversos produtos,
tais como protectores solares, produtos cosméticos, plásticos e têm como
principal função a protecção contra a radiação UV. O 4 – MBC é um dos
filtros UV mais utilizado, apresenta tendência para o bioacumulação, tendo
sido detectado em águas e em peixes e alguns estudos revelam que pode
ter efeitos estrogénicos.
O principal objectivo deste trabalho foi avaliar a fotodegradação do 4 –
MBC em águas, verificar qual o efeito das substância húmicas e do cloreto
e por último identificar os produtos de degradação resultantes. Para o
estudo do efeito das substâncias húmicas foram usados dois tipos de
amostras: ácidos fúlvicos extraídos do rio Vouga e ácidos húmicos
comerciais.
Os resultados obtidos permitem concluir que o 4 – MBC sofre uma
isomerização rápida, seguida de uma degradação lenta ao longo do tempo.
Não se observou efeito significativo dos ácidos fúlvicos e ácidos húmicos
na velocidade de degradação do 4 – MBC. No caso do cloreto os
resultados sugerem que a percentagem de degradação é superior na
presença deste ião relativamente à percentagem de degradação em água.
No que diz respeito aos produtos de degradação foi possível detectar a
formação de quatro produtos de degradação em água. No entanto,
verificou-se que as substâncias húmicas e o cloreto afectam a formação
dos produtos intermediários de degradação, inibindo a formação de alguns
deles. A identificação destes produtos de degradação foi efectuada por
espectrometria de massa tandem. Os produtos identificados não tinham
sido referenciados em estudos anteriores.
keywords
UV Filters; Photodegradation; UV Radiation; 4-methylbenzelidene camphor.
abstract
The UV filters are compounds widely used in several products such as
sunscreens, cosmetics, plastics and their main function is the protection
against UV radiation. 4 - MBC is one of the most widely used UV filters, it
has a tendency to bioaccumulate, it has been detected in waters and in fish
and some studies show that it may have estrogenic effects.
The main objective of this study was to evaluate the photodegradation of 4 -
MBC in waters, to verify what is the effect of humic substances and chloride
and finally to identify the resulting degradation products. To study the effect of
humic substances two types of samples were used: fulvic acids extracted
from river Vouga and commercial humic acids.
The results showed that 4 - MBC undergoes a fast isomerization, followed by
a slow degradation along time. There was no significant effect of fulvic and
humic acids on the degradation rate of 4 - MBC. In the case of chloride the
results suggest that the rate of degradation is higher in the presence of this
ion relatively to the rate of degradation in water.
With regard to the degradation products it was possible to detect the
formation of four degradation products in water. However, it was found that
the humic substances and chloride affect the formation of photo products,
inhibiting the formation of some of them. The identification of these
degradation products was carried out by tandem mass spectrometry. The
identified products have not been referred in previous studies.
ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................................... XVII
ÍNDICE DE TABELAS ..................................................................................................................................... XX
GLOSSÁRIO DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS ..................................................................................... XXI
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1
1.1. Radiação UV e Protecção .............................................................................................. 3
1.2. Filtros UV no ambiente ................................................................................................. 5
1.3. O papel das substâncias húmicas e cloreto na fotodegradação. ................................. 11
1.3.1. Substâncias húmicas ................................................................................................. 11
1.3.2. Ião Cl- ........................................................................................................................ 14
1.4. Características do 4-MBC e importância do seu estudo .............................................. 15
1.5. Espectrometria de massa na identificação de produtos de degradação dos filtros UV
18
1.5.1 Método de ionização por Electrospray ................................................................ 18
1.5.2 Analisadores........................................................................................................ 19
1.5.3 Espectrometria de massa tandem ....................................................................... 20
2. METODOLOGIA ......................................................................................................... 21
2.1. Reagentes e soluções .................................................................................................. 23
2.1.1. Reagentes ........................................................................................................... 23
2.1.2. Preparação de Soluções padrão de 4-MBC .......................................................... 23
2.1.3. Preparação das amostras para os estudos de fotodegradação ........................... 24
2.2. Irradiação das amostras .............................................................................................. 25
2.3. Extracção em Fase Sólida (SPE) ................................................................................... 26
2.4. Análise por cromatografia líquida de alta eficiência (hplc) com detector uv/vis......... 27
2.4.1. Análise por espectrometria de massa ................................................................. 27
3. ESTUDO DA DEGRADAÇÃO DO 4-MBC EM ÁGUA E NA PRESENÇA DE
ÁCIDOS FÚLVICOS, ÁCIDOS HÚMICOS E CLORETO.................................................. 29
3.1. Análise do 4-MBC por HPLC-UV: Rectas de calibração e limites de detecção .................. 31
3.2. Fotoestabilidade De soluções do 4 – MBC 4 mg/L em água ............................................. 31
3.3. Efeito da concentração inicial do 4-MBC ..................................................................... 39
3.3.1. Recuperações do 4-MBC e seus fotoprodutos na pré-concentração das soluções
por Extracção em fase sólida (SPE) ..................................................................................... 39
3.3.2. Comparação da fotodegradação do 4-MBC em soluções 0,2 mg/L e 4 mg/L............. 40
3.4. Efeito das substâncias húmicas ................................................................................... 44
3.4.1. Efeito de ácidos fúlvicos do Rio Vouga na fotodegradação do 4-MBC ................. 44
3.4.2. Efeito dos ácidos húmicos comerciais na degradação do 4 - mbc ........................ 49
3.5. Fotodegradação do 4 -MBC na presença de cloreto .................................................... 50
4. IDENTIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO POR
ESPECTROMETRIA DE MASSA ...................................................................................... 53
4.1. Recolha dos produtos de degradação e analise por espectrometria de massa ........... 55
4.1. Caracterização estrutural dos produtos de degradação por espectrometria de massa
tandem ................................................................................................................................... 62
4.1.1. Produto 1 ............................................................................................................ 62
4.1.2. Produto 2 ............................................................................................................ 65
4.1.3. Produto 3 ............................................................................................................ 68
4.1.4. Produto 4 ............................................................................................................ 70
5. CONCLUSÕES ............................................................................................................. 71
6. REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 75
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Vias de entrada dos filtros UV no meio ambiente (adaptado de Giokas et al., 2007a). ............... 6
Figura 2: Componentes característicos de um espectrómetro de massa. ............................................... 18
Figura 3: Representação esquemática do processo de electrospray ....................................................... 19
Figura 4: Degradação do 4 – MBC em água ao longo do tempo de irradiação . ...................................... 32
Figura 5: Áreas dos picos dos isómeros E e Z do 4- MBC normalizadas em relação ao seu valor máximo
em função do tempo de irradiação . ............................................................................................. 33
Figura 6: Perfil de variação da área total dos dois picos ao longo do tempo de irradiação . .................... 34
Figura 7: Ajuste cinético de pseudo primeira ordem de ln( Atotal /A0
total)em função do tempo . ............... 34
Figura 8: Cromatograma com detecção a 300nm correspondente ao pico adicional quando este atinge o
seu máximo com um tempo de irradiação de 24h. ........................................................................ 35
Figura 9:Perfil de variação da área do pico do produto 1 em função do tempo de irradiação. ................ 35
Figura 10: Cromotograma com detecção a 270 nm da solução 4 mg/de 4 – MBC L em água após 24h de
irradiação. .................................................................................................................................... 37
Figura 11: Perfil de variação da área do pico do produto 2 ao longo do tempo de irradiação. ................ 37
Figura 12: Perfil de variação da área do pico do produto 3 ao longo do tempo de irradiação. ................ 38
Figura 13: Perfil de variação da área do pico do produto 4 ao longo do tempo de irradiação. ................ 38
Figura 14: Valores normalizados C/C0 em função do tempo de irradiação das soluções 0,2 e 4 mg/L de 4–
MBC em água . ............................................................................................................................. 40
Figura 15: Perfil de variação da área total dos dois picos (isómeros E e Z) normalizada em relação a área
total inicial ao longo do tempo de irradiação . .............................................................................. 41
Figura 16: Cromatograma da solução de 0,2 mg/L em água após 10 horas de irradiação. ...................... 41
Figura 17: Perfil de variação da área do pico ao longo do tempo de irradiação do produto 1. ................ 42
Figura 18: Perfil de variação da área do pico ao longo do tempo de irradiação do produto 2. ................ 43
Figura 19: Perfil de variação da área do pico ao longo do tempo de irradiação do produto 3. ................ 43
Figura 20: Perfil de variação da área do pico ao longo do tempo de irradiação do produto 4. ................ 44
Figura 21: Comparação da degradação do 4 – MBC (4mg/L) em água e na presença de 2 mg/L de ácidos
fúlvicos com uma concentração inicial de 4 mg/L de 4 – MBC ao longo do tempo de irradiação . .. 45
Figura 22: Comparação da degradação do 4 – MBC em água e na presença de 15 mg/L de ácidos fúlvicos
com uma concentração inicial de 0,2 mg/L de 4 – MBC ao longo do tempo de irradiação . ............ 46
Figura 23: Perfil de variação da área total dos dois picos (isómeros E e Z) normalizada em relação a área
total inicial ao longo do tempo de irradiação na presença e ausência de ácidos fúlvicos com uma
concentração de 4 – MBC 0,2 mg/L e 15 mg/L de ácidos fulvicos . ................................................ 46
Figura 24: Perfil de variação da área do pico do produto 2 na presença e ausência de ácidos fúlvicos em
função do tempo de irradiação . ................................................................................................... 47
Figura 25:Cromatograma da solução de 0,2 mg/L de 4- MBC e 15 mg/L de ácidos fúlvicos sem irradiar
com detecção a 300 nm. .............................................................................................................. 48
Figura 26:Cromatograma da solução de ácidos fúlvicos com detecção a 300 nm. .................................. 48
Figura 27: Degradação do 4 – MBC (4 mg/L) em água e na presença de 2 mg/L de ácidos húmicos ao
longo do tempo de irradiação . ..................................................................................................... 49
Figura 28: Produto de degradação a um tempo de retenção de 3,45 minutos, com detecção a 250nm na
presença de ácidos húmicos, ácidos fúlvicos e água durante o período de irradiação . .................. 50
Figura 29: Comparação da degradação do 4 – MBC em água e na presença de cloreto ao longo do tempo
de irradiação . .............................................................................................................................. 50
Figura 30: Perfil de variação da área total dos dois picos (isómeros E e Z) normalizada em relação a área
total inicial ao longo do tempo de irradiação . .............................................................................. 51
Figura 31: Perfil de variação da área do pico do produto 2 na presença e ausência de cloretos ao longo
do tempo de irradiação . .............................................................................................................. 52
Figura 32: Perfil de variação da área do pico do produto 3 na presença e ausência de cloretos ao longo
do tempo de irradiação . .............................................................................................................. 52
Figura 33: Cromatograma correspondente a amostra pré concentrada com detecção a 300 nm. ........... 55
Figura 34:Cromatograma correspondente a amostra pré – concentrada. .............................................. 56
Figura 35: Cromatograma correspondente ao pico 1 recolhido da amostra pré concentrada com
detecção a 270 nm. ...................................................................................................................... 56
Figura 36: Cromatograma correspondente ao pico 2 recolhido da amostra pré concentrada com
detecção a 250 nm. ...................................................................................................................... 56
Figura 37: Cromatograma correspondente a amostra pré concentrada. ................................................ 57
Figura 38: Cromatograma correspondente ao pico 3 recolhido da amostra pré concentrada com
detecção a 270 nm. ...................................................................................................................... 57
Figura 39: Cromatograma correspondente ao pico 4 recolhido da amostra pré concentrada com
detecção a 270nm. ....................................................................................................................... 57
Figura 40: Cromatograma correspondente a amostra pré concentrada. ................................................ 58
Figura 41: Cromatograma correspondente ao isómero Z recolhido da amostra pré concentrada com
detecção a 300 nm. ...................................................................................................................... 58
Figura 42: Cromatograma correspondente ao isómero E recolhido da amostra pré concentrada com
detecção a 300 nm. ...................................................................................................................... 58
Figura 43: Espectros de ESI-MS do produto 1. ....................................................................................... 59
Figura 44: Espectros de ESI-MS do produto 2. ....................................................................................... 60
Figura 46: Espectros de ESI-MS do produto 4. ....................................................................................... 61
Figura 45: Espectros de ESI-MS do produto 3. ....................................................................................... 60
Figura 47: Espectros de ESI-MS/MS do ião m/z 285. .............................................................................. 62
Figura 48: Esquema das possíveis vias de fragmentação produto 1 resultante da degradação do 4 – MBC.
.................................................................................................................................................... 63
Figura 49: Possíveis vias de fragmentação do produto 1 ........................................................................ 64
Figura 50: Espectros de ESI-MS/MS do ião m/z 403. .............................................................................. 65
Figura 51: Espectros de ESI-MS3 do ião m/z 309. ................................................................................... 66
Figura 52: Esquema das possíveis vias de fragmentação do ião m/z 253 para a formação do produto 2
resultante da degradação do 4 – MBC. ......................................................................................... 66
Figura 53: Possíveis vias de fragmentação do produto 2. ....................................................................... 67
Figura 54: Espectro ESI – MS/MS do ião m/z 285. .................................................................................. 68
Figura 55: Possíveis vias de fragmentação do produto 3. ....................................................................... 69
Figura 56: Possível estrutura do produto 4. ........................................................................................... 70
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1:Principais famílias químicas dos filtros UV, bem como os respectivos compostos individuais
dentro de cada família correspondente e as designações pelas quais são referidos. ........................ 4
Tabela 2: Tipo e concentrações de filtros UV detectados em amostras ambientais. ................................. 8
Tabela 3: Propriedades físico – químicas do 4 – MBC. ........................................................................... 15
Tabela 4: Tempos de retenção e respectivos espectros UV/Vis dos produtos de degradação e dos
isómeros do 4 – MBC. .................................................................................................................. 36
Tabela 5: Percentagens de recuperação do processo de SPE dos produtos de degradação e dos
respectivos isómeros (E e Z – 4 – MBC). ........................................................................................ 39
Tabela 6: Iões [M - H]
de maiores abundâncias relativas referentes aos quatros produtos de
degradação. ................................................................................................................................. 61
GLOSSÁRIO DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
µg Microgramas
3-BC 3-Benzilideno - Cânfora
4-MBC 4-Metilbenzilideno- Cânfora
AF Ácidos Fúlvicos
AH Ácidos Húmicos
BCSA 3 –( 4’ – sulfobenzilideno) cânfora
BM-DBM 1-(4-tert-butilfenil)-3-(4-metoxifenil) propano-1,3 -diona
BZ – 2 Benzofenona-2
BZ-3 Benzofenona-3
BZ-4 Benzofenona-4
CBM 3 - (4’-trimetilamónio – benzilideno)-1-bornano-2-ona-
metilsulfato
DBT Dietilhexil Butamido Triazona
DHBZ 4,4-Dihidroxibenzofenona
DHHB Dietilamino hidroxibenzoil hexil benzoato
DRT Drometrizolo - triziloxano
EHS Salicilato de 2- etil - hexilo
EMC 4 – metoxinamato de octilo
EMT Bis – etilhexiloxifenol metoxifenol triazina
Et - PABA Etil - PABA
Et al. Entre outros
ETA Estação de Tratamento de Água
ETAR Estação de Tratamento de Águas Residuais
FPS Factor de Protecção Solar
GC Cromatografia Gasosa (Gas Chromatography)
GC - MS Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa
HMS Homosalato
HPLC-UV Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção com UV
hυ Energia da radiação incidente (eV)
IMC 4 – metoxicinamato de isoamilo
INCI Nomenclatura Internacional para Produtos Cosméticos
(Internation Nomenclature for Cosmetic Ingredient)
MBP Metileno-bis-benzotriazolil tetrametilbutilfenol
ng Nanogramas
nm Nanómetros
OC Octocrileno
OD-PABA Octildimetil PABA
OT Octiltriazona
P-15 Dimeticodietilbenzalmalonato
PABA Ácido p-aminobenzóico
PBC Poliacrilamidometil benzilideno cânfora
PDSA 3,3’ -(1,4 -fenilenodimetileno) bis [ácido 7,7 -dimetil-2-
oxobiciclo-(2,2,1) hept-1-ilmetanossulfónico]
PDT Disódio fenil dibenzimidazol tetrasulfoneto
PEG-25PABA 4-aminobenzoato de etilo etoxilado
PMDSA Ácido – 2 Fenil – benzimidazol – 5 -sulfónico
SH Substâncias Húmicas
UV Ultravioleta
UV-A Ultravioleta A
UV-B Ultravioleta B
UV-C Ultravioleta C
MOD Matéria Orgânica Dissolvida
UV-Vis Ultravioleta e visível
1. INTRODUÇÃO
1. Introdução
Universidade de Aveiro Página | 3
1.1. RADIAÇÃO UV E PROTECÇÃO
O nosso planeta encontra-se repleto de radiação visível e invisível, sem a qual não
haveria qualquer tipo de vida. De todo o espectro solar, apenas radiação infravermelha com
comprimentos de onda na gama 780 – 5000 nm, luz visível (400 – 780 nm) e radiação
ultravioleta com comprimentos de onda na gama 290 – 400 nm alcançam a superfície
terrestre, numa proporção de 56%, 39% e 5% respectivamente (González et al., 2008). A
radiação UV que atinge a superfície terrestre classifica-se em dois grupos: UV-A (315 –
400nm) e UV-B (280 – 315 nm). A radiação UV – C (200 a 290nm) é completamente absorvida
pela camada do ozono, a qual assume um papel fundamental na protecção da vida na terra.
Nas últimas décadas, e devido à emissão de alguns poluentes, verificou-se a destruição
progressiva da camada do ozono, com a sua consequente rarefacção, a qual facilita a
passagem da radiação UV para a superfície terrestre. Hoje em dia existe uma grande
preocupação relativamente ao aumento da radiação UV que incide no nosso planeta, devido
ao efeito prejudicial que este tipo de radiação pode causar no ser humano (por exemplo,
cancro da pele e cegueira, assim como a diminuição das defesas imunológicas) (González et
al., 2008). Devido a este facto, foram desenvolvidas substâncias, geralmente designadas por
filtros UV, que absorvem a radiação ultravioleta e são adicionadas a produtos cosméticos e a
diversos tipos de materiais a fim de atenuar os efeitos negativos da exposição a este tipo de
radiação.
Os filtros UV são classificados em dois grupos de acordo com a sua natureza,
podendo ser filtros orgânicos e filtros inorgânicos. Os filtros inorgânicos reflectem e/ou
dispersam a radiação incidente e os filtros orgânicos absorvem a radiação incidente (Díaz-
Cruz et al., 2008). Os filtros inorgânicos apresentam protecção mais elevada, em comparação
com os filtros orgânicos, não sendo solúveis em água. No entanto, a preparação de
cosméticos baseados em filtros inorgânicos é bastante difícil, pois estes desagregam a
emulsão constituinte desses cosméticos.
No que diz respeito aos filtros orgânicos, estes são compostos com alta absortividade
molar na gama ultravioleta. Estes filtros UV podem ser classificados em UV-A, os quais
protegem na gama dos 315-400nm e filtros UV-B protegendo na gama dos 280-315 nm
(Balmer et al., 2005). No entanto, um único filtro UV não protege em toda a gama UV-A e UV-
B sendo efectuadas combinações com vários filtros, as quais apresentam uma protecção mais
ampla. Os filtros UV orgânicos são compostos que normalmente possuem estruturas
1. Introdução
Página | 4 Departamento de Química
aromáticas únicas ou múltiplas, estando por vezes conjugadas com ligações duplas carbono-
carbono ou/e grupos carbonilo. O processo de protecção baseia-se no facto de os fotões de
radiação UV serem absorvidos pelas moléculas dos filtros UV provocando a excitação dos
seus electrões. As moléculas excitadas rapidamente voltam ao estado fundamental por
relaxação vibracional perdendo energia sob a forma de calor. Assim, se não ocorrer nenhuma
degradação dos filtros UV eles podem absorver mais fotões e assim repete-se o processo,
protegendo a pele contra a radiação UV (Giokas et al., 2007a).
Com a preocupação de evitar possíveis malefícios do uso de filtros UV em produtos
cosméticos, foram elaboradas directrizes em diferentes países (União Europeia, Estados
Unidos e Japão) que regulam a utilização destes compostos. A União Europeia permite
actualmente a utilização de 26 destes filtros UV orgânicos. Num trabalho de revisão recente,
Díaz-Cruz et al. (2008) apresentaram uma tabela indicando os nomes e estruturas destes
compostos e algumas das suas propriedades como a solubilidade em água e o coeficiente de
partilha octanol/água, Kow. Na Tabela 1 apresentam-se as principais famílias químicas a que
pertencem esses compostos, bem como os compostos individuais dentro de cada família e as
respectivas designações comuns pelas quais são referidos.
Tabela 1:Principais famílias químicas dos filtros UV, bem como os respectivos compostos individuais
dentro de cada família correspondente e as designações pelas quais são referidos.
Família de compostos Filtros UV específicos
Cinamatos
Etilhexil-metoxicinamato ou 4 – metoxicinamato de octilo
ou OMC ou EHMC
4-metoxicinamato de isoamilo ou 4 – metoxicinamato de
isopentilo ou IMC ou IAMC
Benzofenonas Benzofenona – 3 ou oxibenzona ou BZ – 3 ou BP – 3
Benzofenona – 4 ou BZ – 4 ou BP - 4
Ácido p- aminobenzóico e
derivados
Ácido p-aminobenzóico ou PABA
4-aminobenzoato de etilo etoxilado ou PEG-25PABA
Octildimetil PABA ou OD-PABA
Salicilatos Homosalato ou HMS
Salicilato de 2- etil - hexilo ou EHS
Derivados da cânfora
3,3’ -(1,4 -fenilenodimetileno) bis [ácido 7,7 -dimetil-
2-oxobiciclo- (2,2,1) hept-1-ilmetanossulfónico] ou PDSA
Ácido alfa -(oxo -2 -bornilideno -3) -tolueno -4-sulfónico ou
BCSA
Poliacrilamidometil benzilideno cânfora ou Polímero de N -
1. Introdução
Universidade de Aveiro Página | 5
{(2 e 4) -[(2 -oxoborn -3 -ilideno) metil] benzil}acrilamida ou
PBC
4-metilbenzilideno- cânfora ou 3 -(4′ -metilbenzilideno) d -
1 -cânfora ou 4 – MCB
3-benzilideno – cânfora ou 3 – BC
Sulfato de metilo N, N′, N -trimetil -4 -[(2 -oxo -3-
bornilideno) -metil] anilínio ou CBM
Triazinas Octil triazona ou OT
Dietilhexil butamido triazona ou DBT
Bis – etilhexiloxifenol metoxifenol triazina ou EMT
Benzotriazois Drometrizolo - triziloxano ou DRT
Metileno-bis-benzotriazolil tetrametilbutilfenol ou MBP
Derivados de Benzimidazois Ácido -2 -fenil -benzimidazol -5 -sulfónico ou PDSA
Sal monossódico de ácido 2,2’-bis -(1,4-fenileno) 1H -
benzimidazol -4,6 –dissulfónico ou PDT
Derivados de
Dibenzoilmetanos
1-(4-tert-butilfenil)-3-(4-metoxifenil) propano-1,3 -diona ou
BM-DBM
Dietilamino hidroxibenzoil hexil benzoato ou DHHB
Outros Dimeticodietilbenzalmalonato ou Polisilicone 15 ou P-15
Octocrileno ou OC
As concentrações máximas permitidas são também reguladas, sendo permitidas
concentrações de até 10% na União Europeia, dependendo do composto utilizado (Giokas et
al., 2007a).
1.2. FILTROS UV NO AMBIENTE
Nos últimos anos, a utilização dos filtros UV orgânicos teve um aumento drástico, o
que suscita algumas preocupações relativamente ao impacto negativo que estes podem ter
no ambiente, mais especificamente no meio aquático, sobretudo atendendo ao facto de a
maioria destes compostos serem lipofílicos (valores de Kow elevados, frequentemente
superiores a 4), o que lhes confere tendência para a bioacumulação. No entanto,
actualmente, para a maioria dos compostos, não se possuem dados suficientes de
ecotoxicidade e degradabilidade, o que dificulta a previsão dos seus efeitos em humanos,
organismos aquáticos e ecossistemas (Dias – Cruz et al., 2008; Giokas et al., 2007a)
1. Introdução
Página | 6 Departamento de Química
Os filtros UV têm duas principais vias de entrada no meio aquático. A primeira é de
forma directa (por exemplo, através de actividades recreativas, sendo libertados
directamente da pele durante banhos em zonas balneares) e a segunda via é de forma
indirecta (por exemplo, através das estações de tratamento de água), estando representados
na Figura 1 os diferentes tipos de fontes de contaminação (Li et al., 2007; Jeon et al., 2006;
Giokas et al., 2007a; Díaz - Cruz et al., 2008; Cuderman et al., 2007).
Figura 1: Vias de entrada dos filtros UV no meio ambiente (adaptado de Giokas et al., 2007a).
Processo de produção dos
filtros UV/ comercialização
Diferentes aplicações
Cosméticos e produtos
de cuidado pessoal
Aplicação na pele
Outras aplicações (protecção
de superfícies vulneráveis à
radiação UV, polidores de
carros, têxteis, plásticos, etc)
Penetração na
pele
Excreção
Lavagem de
roupa
Esgoto
Desperdícios
industriais
Aterro sanitário
Estação de tratamento
de efluentes industriais
Actividades
recreativas
(banhos em
piscinas, lagos e
no mar)
Águas do subsolo (por
lixiviação).
Estações de
tratamento
de água
Águas superficiais
Sem tratamento
em Etar
Banhos
1. Introdução
Universidade de Aveiro Página | 7
Em grande parte dos estudos que se podem encontrar na literatura sobre a análise
de filtros UV, a matriz é constituída por produtos cosméticos, sendo poucos os que fazem
estudos referentes à presença destes no meio ambiente. No entanto, verifica-se que esta
tendência está a mudar uma vez que nos últimos anos têm sido feitos vários estudos em
matrizes ambientais.
Na Tabela 2 estão compilados alguns resultados apresentados em estudos recentes
relativos à concentração de alguns filtros UV detectados mais frequentemente em águas de
piscinas, águas de rios, lagos e mar, e também em peixes e em estações de tratamento de
águas residuais (ETARs). Diversos artigos publicados na literatura referem que as
concentrações de filtros UV presentes em águas onde se desenvolvem actividades
recreativas crescem nos meses de Verão, especialmente nos dias e horas de maior calor, ou
seja, quando a aplicação de protectores solares é mais intensa (Giokas et al., 2007a; Poiger et
al., 2004; Balmer et al., 2005; Giokas et al., 2005; Díaz - Cruz e Barceló, 2009).
No que diz respeito às ETARs pode-se verificar que a remoção de filtros UV por vezes
não é eficiente, sendo referidas percentagens de remoção após o tratamento que variam
entre 28 e 43 %, o que significa que os filtros UV são libertados para os meios hídricos
receptores. Um estudo efectuado no sul da Califórnia evidenciou a existência de filtros UV
em água captada para consumo humano, em níveis de concentração que atingiram valores
entre 0,36 e 0,79 g/L no caso da BZ – 3 e valores entre 0,56 e 5,61 g/L no caso do EMC.
Também na água já tratada foi detectada a presença da BZ – 3 e do EMC, com concentrações
de 0,26 e 0,45 g/L respectivamente, o que denota que os tratamentos das Estações de
Tratamento de Água podem não ser eficazes para a eliminação dos filtros UV (Loraine e
Pettigrove, 2006).
1. Introdução
Página | 8 Departamento de Química
Tabela 2: Tipo e concentrações de filtros UV detectados em amostras ambientais.
Matriz
Compostos analisados
BZ-3 4 - MBC EMC BM-DBM OC Referências
Água
Mar jónio (ng/L) 1.4-2.2 Vestígios n.d
Giokas et
al., 2004
Piscina (ng/L) 3.3-5.1 5.9-7.9 3.6-5.4 n.d
Piscina de jogos (ng/L) 4.8-6.6 4.3-6.5 2.6-3.4 n.d
Águas de banho (ng/L) 8.3-11.7 3.3-4.3 3.8-4.4 n.d
Lagos
Giokas et
al., 2007a
Dias mais quentes (ng/L) <2-125 <3-82 <2 - 15
Dias mais frescos (ng/L) <2-35 <2-29 <2 – 7 <20 -24
Lagos localizados em
Suíça
Poiger et al.,
2004
Zurique (ng/L) <2 - 4 3 – 22 <2 - 25 20 2
Huttnersee (ng/L) 5-125 4 - 13 <2 – 19 24 <2 - 27
Golfo fechado localizado numa área turística no
Norte Ocidental da Grécia
Giokas et al.,
2005 Águas de banho (12:00 h)
(ng/L) 5.1-7.9 11.9-14.3 6.5-8.3
Águas de banho (15:00 h) (ng/L)
6.6-9.8 18.4-21.0 9.6-11.8
Águas para consumo
humano (µg/L) 0.36 – 0.79
0.565 – 5.61
Loraine e
Pettigrove,
2006
ETAR
Loraine e
Pettigrove
, 2006
Influente em dias secos (µg/L) 0.84 – 4.4
N.d.
Influente em dias húmidos (µg/L) 0.71 – 2.08
0.40
ETAR
Li et al., 2007
Influente (ng/L) 97-722 475-2128 54-116 34-153
%de remoção após tratamento
28-31% 37-40% 40-43% 36-38%
1. Introdução
Universidade de Aveiro Página | 9
O perigo ambiental dos filtros UV como poluentes reside no facto de apresentarem
carácter lipofílico, o que lhes confere capacidade de bioacumulação nos organismos vivos
podendo causar danos nos ecossistemas aquáticos (Kunz e Fent, 2006a; Kunz e Fent, 2006b;
Fent et al., 2008;Dias –Cruz e Barceló, 2009).
Quanto aos potenciais efeitos tóxicos dos filtros UV, existe ainda alguma
controvérsia, mas diversos estudos têm suscitado preocupação sobre a possibilidade de
alguns destes compostos poderem funcionar como disruptores endócrinos (Giokas et al.,
2007a). No caso dos peixes estudos realizados verificam que alguns filtros UV apresentam
efeitos estrogénicos, que afectam significativamente a reprodução destes (Weisbrod et al.,
2007; Coronado et al., 2008). Schlumpf et al., (2004) consideram os filtros UV como uma
nova classe de químicos com actividade endócrina. Vários estudos efectuados em ratos
revelam que vários filtros UV apresentam actividade estrogénica (por exemplo, 3-BC)
(Schlumpf et al., 2004; Schlumpf et al., 2001). Para além de actividade estrogénica também
Continuação da Tabela 2
ETAR
Balmer et
al., 2005
Influente (µg/L) 0.7-7.8 0.6-6.5 0.5-19 0.1-12
Efluente (µg/L) <0.01-0.3 0.06-2.7 <0.01-0.3 <0.01-0.3
% de remoção após tratamento
68-98% 44-97 % 97->99 88->99
Lago Suíço (ng/L) <2-35 <2-28 <2-7 <2-5
Peixes
Peixes recolhidos em lagos na Suíça
Balmer
et al.,
2005
Peixe branco (ng/g lipídos) n.d n.d 72 n.d
Peixe rocha (ng/g lipídos) 66-112 44-94 64 n.q
Perca (ng/g lipídos) 123 166 n.d 25
Peixe recolhido antes de
uma ETAR (ng/g lipídos) <LOD <LOD 4 ± 5
Zenker et
al., 2008 Peixe recolhido depois de uma ETAR (ng/g lipídos) <LOD <LOD 142 ± 95
Truta recolhida em rio (ng/g) 50-1800 40-2400 Buser et
al.,2006 Peixe branco e rocha
recolhidos num lago (ng/g)
<20-170
n.d.
1. Introdução
Página | 10 Departamento de Química
apresentam actividade antiandrogénica, ou seja, capacidade de inibir a actividade da 5 alfa-
redutase 1, enzima que transforma a testosterona em dihidrotestosterona, a hormona
responsável pelo aumento da próstata (Schlumpf et al., 2004; Kunz e Fent., 2006a). O filtro
UV 3-BC pode causar distúrbios no ciclo estral (ou cio) dos ratos (Faass et al., 2009).
Um dos aspectos a considerar na avaliação do impacto da introdução de filtros UV no
ambiente é a sua persistência. A este respeito, é de referir que a fotodegradação induzida
pela luz solar é a principal via abiótica de degradação de contaminantes em águas
superficiais, contribuindo para a sua auto-remediação, ou, em alguns casos, para a formação
de fotoprodutos mais tóxicos (Calza et al., 2008). Relativamente à fotodegradação de filtros
UV em águas naturais, existem poucos estudos efectuados, verificando-se que os estudos de
degradação estão mais direccionados para a fotoestabilidade dos filtros UV em cremes.
Estudos de fotoestabilidade de diversos filtros UV em cremes demonstraram que alguns
desses filtros não são fotoestáveis daí resultando um decréscimo do factor de protecção
solar (Couteau et al, 2007). No que se refere à degradação dos filtros UV, bem como aos
potenciais sub – produtos formados em águas naturais, os estudos existentes são escassos
(Sakkas et al., 2003; Giokas et al., 2007b; Rodil et al., 2009).
Como citado anteriormente os filtros UV estão presentes/acumulados no ambiente,
especialmente no meio aquático, podendo ocorrer reacções fotoquímicas induzidas pela luz
solar, ou seja, estes podem sofrer fotodegradação. A fotodegradação pode ocorrer por dois
processos distintos, sendo eles a fotodegradação directa e a fotodegradação indirecta (Díaz -
Cruz et al., 2008). A fotodegradação directa (ou fotólise directa) é um processo que ocorre
pela absorção directa do fotão de luz pelo composto, sofrendo assim uma alteração química
(fragmentação, rearranjo molecular, isomerização, dimerização, hidrólise, oxidação). No caso
da fotodegradação indirecta, a reacção inicia-se com outra espécie catalítica presente no
meio que absorve um fotão de luz ficando excitada e que depois interage com outra espécie
transferindo essa energia, provocando a excitação desta, sendo esta que vai participar na
formação de fotoprodutos (Espinoza et al., 2007; Richard et al., 2007). Em seguida é
apresentada a esquematização das reacções para cada caso, para obter uma melhor
percepção.
Fotodegradação directa:
RY RY* (1)
RY* produto (2)
h
1. Introdução
Universidade de Aveiro Página | 11
Fotodegradação indirecta:
F F* (3)
F* + RY F + RY* (4)
RY* produto (5)
Em que RY é o composto poluente (neste caso pode-se considerar um filtro UV); F é
um fotosensibilizador e as espécies RY* e F* representam os respectivos estados electrónicos
excitados.
No meio aquático, os mecanismos de fotoreacções dos contaminantes dependem de
outros componentes presentes no ambiente. As substâncias húmicas (SH) são uma larga
fracção de matéria orgânica dissolvida, tendo um papel determinante nas reacções, como
tem sido demonstrado para várias classes de contaminantes (por exemplo, pesticidas) (Zhan
et al, 2006; Neamtu e Frimmel, 2006, Garbin et al, 2007). Além das SH o ião cloreto pode ter
também um papel importante na degradação de poluentes. A título de exemplo SakKas et al.
(2003) verificam que na presença de substâncias húmicas e do ião cloreto a degradação do
filtro OD – PABA é retardado e na presença do ião cloreto ocorre a formação de compostos
organoclorados.
1.3. O PAPEL DAS SUBSTÂNCIAS HÚMICAS E CLORETO NA
FOTODEGRADAÇÃO.
1.3.1. SUBSTÂNCIAS HÚMICAS
As substâncias húmicas, como citado anteriormente, são uma larga fracção de
matéria orgânica dissolvida. Em águas naturais as concentrações variam entre 0.3 – 30 mg/C
l-1 (Zhan et al, 2006). Estas substâncias resultam da degradação química e biológica de
resíduos orgânicos e da actividade sintética da biota do solo. As substâncias húmicas são
normalmente de cor escura, ácidas, constituídas por estruturas aromáticas e alifáticas,
quimicamente complexas e possuem um peso molecular muito variado. A sua composição
final depende directamente dos materiais de origem e tempo de maturação, e
indirectamente de factores externos como o clima (que afecta a existência de diferentes
espécies de plantas, a quantidade de material vegetal produzido por estas e a intensidade da
h
1. Introdução
Página | 12 Departamento de Química
actividade dos microrganismos que intervêm na sua decomposição), a morfologia do solo e a
incorporação de novos materiais residuais (Lou et al., 2006; Choudhry, 1984; Senesi et al.,
1996).
As SH podem ser subdivididas em três grupos de acordo com a sua solubilidade em
água, sendo eles:
Ácidos húmicos (AH) – uma fracção escura solúvel em meio alcalino, precipitando-se em
forma de produto escuro e amorfo em meio ácido. Quimicamente são muito complexos,
formados por compostos aromáticos e alifáticos com elevado peso molecular (Hessler et
al., 1996; Ou et al., 2008; Choudhry, 1984)
Humina – uma fracção insolúvel em meio alcalino ou em meio ácido diluído que possui
uma reduzida capacidade de reacção.
Ácidos Fúlvicos (AF) – uma fracção colorida e solúvel em meio alcalino ou em meio ácido
diluído. Apresentam uma grande quantidade de grupos carboxílicos e um peso molecular
relativamente baixo, possuem propriedades redutoras (Hessler et al., 1996; Choudhry,
1984).
As substâncias húmicas são o principal material responsável pela absorção de
radiação UV em águas naturais. Como resultado elas sofrem foto - transformações e induzem
processos fotoquímicos no meio aquático, sendo consideradas como as principais
impulsionadoras de processos fotoquímicos nesse meio.
A absorção de radiação solar pelas substâncias húmicas provoca a excitação das
moléculas. Os estados electronicamente excitados apresentam tempos de vida muito curtos
e participam como compostos intermediários reactivos, numa grande variedade de reacções
com substratos orgânicos e inorgânicos presentes em águas naturais.
A maioria das moléculas no seu estado fundamental apresenta um número par de
electrões. Os spins dos electrões no estado fundamental encontram-se normalmente
emparelhados, o que constitui o estado singleto (a molécula de O2 representa uma excepção,
uma vez que o seu estado fundamental se caracteriza por dois electrões desemparelhados,
isto é, encontra-se no estado tripleto). As moléculas de substâncias húmicas quando
absorvem a luz passam ao seu primeiro estado excitado singleto, 1S* (6). A molécula regressa
ao estado fundamental quer através da emissão de luz (fluorescência) (7), quer através de
decaimento não radiativo acompanhado por perda de calor (8).
1. Introdução
Universidade de Aveiro Página | 13
SH 1SH* (6)
1SH* SH + h (7)
1SH* SH + calor (8)
Onde o símbolo “SH” representa a molécula de substâncias húmicas e o símbolo “*”
indica que a molécula se encontra num estado electronicamente excitado.
Também pode ocorrer que a molécula que se encontra no estado singleto excitado
sofra relaxação vibracional e transite posteriormente para o estado tripleto excitado (9)
(cruzamento inter-sistemas) (Aguer et al., 1996).
1SH* 3SH* + calor (9)
O estado de excitação tripleto das substâncias húmicas é o maior responsável pela
degradação fotoinduzida de poluentes orgânicos (Boule et al., 1999). Como se pode ver na
equação (10) as substâncias húmicas transferem a energia para os poluentes orgânicos
ficando estes no estado excitado podendo reagir com outra molécula e formar outra espécie
(Boule et al., 1999).
3SH* + RY SH + 3RY* (10)
Os estados tripleto das SH são muito reactivos e podem também reagir com
moléculas de compostos orgânicos, por exemplo removendo átomos de hidrogénio
conforme exemplificado na equação seguinte para o caso do fenol (Aguer et al .,1999).
3SH* + ArOH HSH + ARO (11)
As moleculas excitadas das substancias húmicas também podem dar origem a outras
especies reactivas nomeadamente oxigénio singleto (1O2), aniões superóxido (O-2), radicais
hidroxilo (OH), radicais peroxilo (ROO) (Aguer et al., 1999; Chen et al., 2009; Canonica e
Laubscher, 2008; Lam et al., 2005). Por exemplo a transferência de energia do estado tripleto
excitado das substâncias húmicas para o oxigénio dissolvido faz com que este passe ao
estado oxigénio singleto (12). O oxigénio singleto, 1O2, é um oxidante mais potente do que o
oxigénio molecular e pode reagir com os contaminantes orgânicos provocando a sua
oxidação (Stumm e Morgan, 1996; Paul et al., 2004). Os radicais hidroxilo são espécies
reactivas, sendo um oxidante bastante forte que ataca a maioria dos compostos orgânicos.
h
1. Introdução
Página | 14 Departamento de Química
Estas espécies formadas podem induzir a transformação de compostos que não absorvem
directamente a radiação solar (Hessler et al., 1996; Chin et al ., 2004).
3S* + O2 S + 1O2 (12)
De facto existem diversos estudos que demonstram que as SH aceleram a
fotodegradação de contaminantes orgânicos. Neamtu e Frimmel (2006), por exemplo, num
estudo referente à fotodegradação do nonilfenol (NP) em águas, verificaram que baixas
concentrações de matéria orgânica dissolvida (MOD) a qual, como se disse anteriormente, é
essencial constituída por substâncias húmicas, aceleram a degradação devido às reacções
fotoquímicas de formação de espécies reactivas por parte da MOD.
No entanto, as substâncias húmicas podem apresentar o efeito contrário, ou seja,
inibir a fotodegradação dos contaminantes orgânicos. Por exemplo, Sakkas et al.(2003)
estudaram a influência doa ácidos húmicos na degradação do OD – PABA verificando que a
degradação deste filtro UV era inibida na presença ácidos húmicos. Esta inibição da
fotodegradação do OD – PABA pode ser explicada por um processo de competição entre os
ácidos húmicos e o OD – PABA para os fotões disponíveis, e consequentemente, provoca
uma retardação no processo de degradação.
1.3.2. IÃO CL-
A presença de filtros UV é demonstrada em diferentes locais, nomeadamente rios,
mar, lagos, etc. Deste modo é bastante importante estudar a influência do ião cloreto na
fotodegradação. A água do mar é uma solução que contem cerca de 70 elementos químicos,
mas apenas seis desses constituem mais de 90% dos sais dissolvidos, sendo o ião cloreto o
anião maioritário em água do mar. Como citado anteriormente, os radicais hidroxilo são
espécies reactivas, sendo um oxidante bastante forte que ataca a maioria dos compostos
orgânicos. No caso da água do mar é necessário ter em consideração que os iões halogeneto,
nomeadamente os iões Cl-, funcionam como sequestradores dos radicais hidroxilo, formando
espécies reactivas de halogéneo radicalares (13 e 14) ou não radicalares (Seiss e Niessner,
2001; Baycan et al.,2007; Grebel et al. 2009).
1. Introdução
Universidade de Aveiro Página | 15
OH(aq) + Cl- ClHO- (13)
ClHO- + H+ Cl + H2O (14)
Como se verifica através da equação (13), com um aumento da concentração de
cloreto em solução este reduz a concentração de radicais livres hidroxilo (Seiss e Niessner,
2001). Assim sendo, se a reacção dos radicais hidroxilo com contaminantes orgânicos for
uma via importante da fotodegradação, é de esperar que na presença de cloretos o processo
de fotodegradação seja diminuído, uma vez que o número de radicais hidroxilo para reagir
com estes contaminantes é menor.
Por outro lado a formação de espécies reactivas de cloro, por exemplo, radicais Cl,
pode provocar a formação de compostos organoclorados ((Seiss e Niessner, 2001); Baycan et
al., 2007). A equação (15) traduz uma reacção possível para a formação de compostos
organoclorados.
Cl + R2C CR2 R2ClC – CR2 (15)
Este radical vai dar origem a um composto organoclorado.
1.4. CARACTERÍSTICAS DO 4-MBC E IMPORTÂNCIA DO SEU
ESTUDO
O 3- (4-metilbenzilideno) cânfora (4-MBC) pertence ao grupo dos derivados da
cânfora, sendo um filtro UV lipofílico (coeficiente de partilha octanol/água Log KWO=4,95). Em
seguida apresentam-se na Tabela 3 as principais propriedades físico – químicas do 4-MBC.
Tabela 3: Propriedades físico – químicas do 4 – MBC.
Propriedades Referências
Nome INCI 4 - Metilbenzilideno- Cânfora Dias – Cruz et al., 2008
Número de referência da
UE 18 Dias – Cruz et al., 2008
Número de registo (CAS) 36861-47-9 Dias – Cruz et al., 2008
1. Introdução
Página | 16 Departamento de Química
Estrutura
CH3
CH3CH3
CH3
O
Balmer et al., 2005
Fórmula molecular C18H22O
Peso molecular 254,37 g mol-1
Solubilidade em água a 25°C 5.1 ×10-3 g /L Dias – Cruz et al., 2008
Log KOW 4.95 Dias – Cruz et al., 2008
λmáx (nm) 300 Dias – Cruz et al., 2008
Este composto é comercializado apenas no isómero E, no entanto quando exposto à
luz este sofre isomerização fotoquímica reversível para o isómero Z. Quer o E – 4 – MBC quer
o Z – 4 MBC são quirais podendo-se apresentar sob a forma de dois enantiómeros. Os
enantiómeros apresentam propriedades físico – químicas idênticas, mas podem apresentar
comportamento biológico diferente em relação à absorção, metabolismo e excreção,
podendo muitas vezes diferir na sua toxicidade e em outros efeitos biológicos (Buser et al.,
2005; Sakkas et al., 2009; Díaz-Cruz et al., 2008). Contudo, apesar da óbvia quiralidade do 4 –
MBC, a esterioquímica do composto quase não é considerada em estudos ambientais e
toxicológicos.
O 4-MBC tem sido um dos filtros UV orgânicos mais vulgarmente utilizado em
produtos de cuidado pessoal, tais como cosméticos, cremes, e protectores solares, podendo
ser usadas concentrações até 4 % (w/w) (Schauer et al., 2006). O interesse particular do
estudo do 4-MBC não reside só no facto de este ser um dos filtros UV mais usados em
produtos de cuidado pessoal mas também no facto de este ter sido detectado em águas
superficiais, águas residuais e também em peixes, conforme se pode confirmar pelos dados
apresentados na Tabela 2 (Schlumpf et al., 2001; Giokas et al., 2004; Giokas et al., 2007a;
Poiger et al., 2004; Giokas et al., 2005; Li et al., 2007; Balmer et al., 2005). Um outro motivo
para o interesse resulta dos estudos publicados sobre os seus eventuais efeitos tóxicos.
Estes estudos relevam que em células de mamíferos o 4-MBC tem efeitos
estrogénicos similares ao 17 –beta – estradiol, podendo causar mudanças fisiológicas e no
1. Introdução
Universidade de Aveiro Página | 17
processo de desenvolvimento mediado por mecanismo de sinalização do receptor
estrogénico (Klann et al., 2005). Estudos efectuados em ratos demonstram que este filtro
apresenta actividade estrogénica e anti – androgénica, afectando a reprodução destes
(Schlumpf et al., 2004; Schlumpf et al., 2001; Schauer et al., 2006). No caso dos peixes os
estudos efectuados demonstram que o 4 – MBC altera os níveis de vitelogenina, verificando-
se assim que apresenta actividade estrogénica ( Díaz- Cruz e Barceló, 2009).
No que se refere aos efeitos em humanos existe um estudo que demonstra que este
foi detectado no leite humano com concentrações de 15.5 ± 5.9 ng/g lipídos, indicando assim
uma possível exposição em fetos e crianças (Schlumpf et al., 2008).
Como citado anteriormente existem poucos estudos referentes a degradação dos
filtros UV em águas naturais. No que se refere ao 4 – MBC esses estudos também são
bastante escassos, sendo em seguida descritos os estudos efectuados até a data.
Rodil et al. (2009) estudaram a degradação do 4 – MBC em água utilizando radiação
UV artificial. Neste estudo verificou-se uma isomerização do 4 – MBC e para verificar se
ocorria degradação do 4 – MBC foi quantificada a resposta conjunta dos dois isómeros, ou
seja, foi feita a soma da resposta dos dois isómeros ao longo do tempo de radiação,
verificando-se que este composto não sofre degradação uma vez que a soma dos dois
isómeros se mantém constante ao longo do tempo. Giokas et al. (2007b) estudaram o efeito
da matéria orgânica dissolvida e de cloretos na degradação do 4 - MBC. Neste estudo não são
apresentadas quaisquer curvas de variação da concentração ao longo do tempo. Os autores
referem apenas que ajustaram uma cinética de 1ª ordem aos resultados, sem mencionar se é
referente a um dos isómeros ou soma dos dois isómeros. Estes autores concluem apenas que
a degradação do 4 – MBC é acelerada na presença de ácidos húmicos comerciais dissolvidos
e é inibida na presença de cloretos. Uma vez que os efeitos da matéria orgânica podem
depender da sua natureza no presente trabalho fez-se o estudo do efeito de ácidos fúlvicos
extraídos do rio Vouga. Nenhum dos trabalhos anteriores se refere a detecção e identificação
dos produtos de degradação em águas naturais.
O único trabalho realizado até a data que se refere aos produtos de degradação é de
Sakkas et al. (2009) mas este refere-se a fotodegradação na presença de TiO2 e H2O2,
podendo assim concluir-se que há alguma deficiência de estudos de degradação do 4 – MBC
em águas naturais
No presente trabalho pretende-se combater essa falha fazendo o estudo da
degradação do 4 – MBC em água, na presença de substâncias húmicas e do cloreto dando
1. Introdução
Página | 18 Departamento de Química
especial relevância à detecção e tentativa de identificação dos produtos de degradação em
solução aquosa.
1.5. ESPECTROMETRIA DE MASSA NA IDENTIFICAÇÃO DE
PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO DOS FILTROS UV
Os espectrómetros de massa constam de quatro partes básicas (Figura 2): um sistema
para introduzir a amostra no equipamento; uma fonte de iões, na qual é produzido um feixe
de iões resultantes das moléculas de analito proveniente da amostra; um analisador que
separa iões de acordo com a sua razão massa/carga (m/z); e um detector, no qual os iões
separados são recolhidos. O detector está ligado a um computador que permite integrar a
informação recebida e transformá-la num espectro de massa, que apresenta no eixo das
abcissas os valores de m/z dos iões formados na fonte – (razão massa/ carga do ião), e no
eixo das ordenadas, a abundância relativa desses mesmos iões, depois de uma normalização
relativamente aos iões de maior abundância. Uma característica importante do
espectrómetro de massa é o alto vácuo presente no instrumento (10-5- 10-7 Torr) que permite
o percurso livre dos iões pelo espectrómetro sem que ocorram reacções ou alterações dos
mesmos.
1.5.1 MÉTODO DE IONIZAÇÃO POR ELECTROSPRAY
O método de ionização por Electrospray (ESI) é uma das técnicas de ionização com
mais vasta utilização na actualidade.
Neste método de ionização, a substância a ser estudada está dissolvida num solvente
que normalmente é muito mais volátil do que o analito, e de seguida esta solução é injectada
na fonte através de um capilar, de metal, num fluxo contínuo, por acção de uma bomba de
Injector Analisador Fonte de iões
Detector de iões
Introdução da amostra GC HPLC Injecção directa
Ionização
ESI
APCI
APPI
MALDI
Analisador de massa
Trapa de iões
Quadrupolo
TOF
Detector de iões
Multiplicador de electrões
Figura 2: Componentes característicos de um espectrómetro de massa.
1. Introdução
Universidade de Aveiro Página | 19
seringa. De seguida é aplicada uma diferença de potencial na agulha metálica, que provoca a
formação de um cone de líquido na sua ponta, conhecido como cone de Taylor, em que a
solução é empurrada para fora do capilar e forma um aerossol em forma de pequenas gotas.
Um gás inerte, como o azoto, é frequentemente utilizado para ajudar a formação do spray de
pequenas gotas, e também à evaporação do solvente das gotículas. O solvente ao evaporar,
torna as gotas mais pequenas e força as moléculas do analito a ficarem mais próximas, o que
vai fazer com que a repulsão entre elas aumente e as gotículas se partam em gotículas cada
vez mais pequenas. O processo repete-se até que o analito fique sem solvente nenhum,
ficando apenas o analito em forma de ião. Os iões carregados são então extraídos para os
analisadores e analisados, por espectrometria de massa ( Figura 3).
Figura 3: Representação esquemática do processo de electrospray (www.rsc.org).
Os espectrómetros de massa variam na sua fonte de ionização e no analisador. As
fontes dos espectrómetros de massa estão, em geral, situadas numa região de vácuo. No
caso de fonte de ionização por electrospray esta encontra-se à pressão atmosférica,
permitindo a evaporação do solvente por intermédio de um fluxo de um gás, em geral, azoto.
Os iões gerados são depois transferidos desta zona de alta pressão para a zona de alto vácuo
do analisador de massa.
1.5.2 ANALISADORES
A fonte de ionização por electrospray pode ser combinada com diferentes
analisadores de massa, tal como o “ion trap”, o quadrupolo,e o tempo de voo (TOF). Todos
eles diferem na precisão (o erro na determinação da massa exacta comparada com o valor
1. Introdução
Página | 20 Departamento de Química
teórico), e na resolução (valor da massa dividido pela diferença de massas entre dois iões
com uma pequena diferença de massa).
Neste trabalho foi utilizado o espectrómetro ESI- trapa linear do inglês “ linear ion
trap”. Este aparelho utiliza o método de ionização (ESI), apresentando um poder de
resolução, uma precisão e sensibilidade elevadas, permitindo fazer espectrometria de massa
tandem (MSn).
A trapa linear de iões é um analisador que utiliza um campo eléctrico oscilatório para
aprisionar os iões, que depois serão analisados. Quando dentro da trapa, os iões voam ao
longo do eixo dos zz entre os eléctrodos, enquanto que oscilam simultaneamente no plano
xy devido a um potencial RF. A aplicação de voltagem DC à parte final dos quadrupolos
também permite que os iões sejam aprisionados. Esta voltagem repele os iões que se
encontram dentro da trapa e esta repulsão é tanto maior quanto mais perto os iões se
encontram dos extremos. Os iões são assim repelidos do centro do quadrupolo se for
aplicada a cada extremo a mesma voltagem repelente (Douglas et al., 2005).
O principal método de medição dos iões baseia-se na saída da trapa de iões por
ordem crescente de razão massa/carga.
1.5.3 ESPECTROMETRIA DE MASSA TANDEM
As principais características dos espectros de massa obtidos com o método de
ionização suave são a ausência de fragmentação, o que permite a determinação rigorosa de
massas moleculares de constituintes de misturas. No entanto, nestas condições pouca
informação é obtida acerca da sua estrutura molecular. Para esse efeito é necessário
proceder à fragmentação do ião desejado, induzindo a dissociação dos iões formados na
fonte, por colisão, normalmente através de um gás. Esta técnica é chamada de
espectrometria de massa tandem ou MS/MS.
Esta técnica envolve geralmente 2 passos: inicialmente é utilizado um primeiro
analisador para isolar o ião precursor e em seguida são analisados os iões produto. Esta
técnica é identificada como MS/MS, no entanto pode-se aumentar o número de passos de
modo a efectuar MSn (n representa o número de gerações de iões a ser analisados).
Usando essa tecnologia, podemos retirar várias conclusões sobre a estrutura das
moléculas analisadas e os espectros obtidos dão-nos não só as formas de quebra molecular
mais frequente, como as mais favoráveis.
2. METODOLOGIA
2.Metodologia
Universidade de Aveiro Página | 23
2.1. REAGENTES E SOLUÇÕES
De forma a minimizar as fontes de contaminação, todo o material utilizado foi lavado
com água, sendo posteriormente imerso numa solução de derquim (2,5%) durante um período
de 12-24 horas. Em seguida o material foi lavado com água destilada e imerso durante 24
horas numa solução de HNO3 4 mol/L, sendo lavado novamente com água destilada.
2.1.1. REAGENTES
Foram utilizados os seguintes reagentes: Metanol e Acetato de Etilo (p.a.) da Panreac
Química SA; 4-Metilbenzilideno- Cânfora (≥98%), da Sigma Aldrich; Acetonitrilo e Clorofórmio
(qualidade para HPLC), da Lab – Scan analytical sciences; diclorometano (p.a.) da Riedel – de -
Haën; Cloreto de Sódio (p.a.) da Pronalab., Para o estudo da influência das substâncias
húmicas na fotodegradação do 4-MBC usaram-se ácidos húmicos comerciais (húmatos de
sódio da Fluka), e ácidos fúlvicos extraídos do rio Volga recolhidos na zona do Cabo Carvoeiro
em Setembro de 1991, segundo metodologia baseada na absorção em resina XAD – 8,
conforme descrito por Santos e Duarte (1998). A água ultrapura usada como solvente foi
obtida com um sistema Milli – Q (Millipore);
2.1.2. PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES PADRÃO DE 4-MBC
Foram preparadas soluções mãe de 4-MBC em acetonitrilo com concentrações
aproximadamente 500 e 40 mg/L. Para tal pesou-se, respectivamente, 12,5 e 2 mg do
composto 4 – MBC, e dissolveu-se em acetonitrilo num balão volumétrico de 25 mL e 50 mL
respectivamente. Estas soluções foram devidamente revestidas com papel de alumínio, de
modo a evitar o efeito da luz solar e foram posteriormente utilizadas na preparação dos
padrões de calibração para as análises por HPLC- UV e na preparação das soluções a irradiar.
A partir das soluções mãe referidas anteriormente, preparam-se sete soluções padrão,
por diluição em acetonitrilo. Para o estudo da fotodegradação das soluções de 4-MBC com
concentração inicial de 4 mg/L, a gama de concentrações dos padrões variou entre 0,5 e 8
mg/L. No caso dos estudos de fotodegradação das soluções de 4 – MBC de concentração inicial
0,2 mg/L, uma vez que estas soluções foram sujeitas a uma concentração prévia por extracção
2. Metodologia
Página | 24 Departamento de Química
em fase sólida (SPE), as concentrações dos padrões abrangeram uma gama mais alta, situando-
se entre 0,5 e 19 mg/L. Os balões volumétricos contendo estas soluções foram devidamente
envolvidos em papel de alumínio a fim de evitar o efeito da luz solar. Em cada dia de análise
das soluções irradiadas analisaram-se sempre dois padrões.
2.1.3. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS PARA OS ESTUDOS DE
FOTODEGRADAÇÃO
2.1.3.1. Soluções de 4-MBC em água
De modo a estudar a fotodegradação do 4 – MBC em água Milli-Q, foram preparadas
soluções com duas concentrações diferentes de 4 – MBC com o intuito de verificar qual a
influência da concentração na degradação do composto. As concentrações do 4 – MBC
estudadas foram 4 mg/L e 0,2 mg/L em água Milli-Q, sendo preparadas a partir das soluções
mãe, 500 mg/L e 40 mg/L respectivamente, como referenciado na secção 2.1.2.
2.1.3.2. Soluções de 4-MBC contendo substâncias húmicas
Para o estudo da influência dos ácidos fúlvicos na fotodegradação do 4 – MBC foram
preparadas soluções com proporções diferentes de 4-MBC e ácidos fúlvicos extraídos do rio
Vouga. Soluções contendo 2 mg/L de ácidos fúlvicos e 4 mg/L de 4 – MCB em água Milli-Q
foram preparadas a partir de solução mãe de 4-MBC 500 mg/L e de uma solução mãe de
ácidos fúlvicos 20 mg/L em água Milli-Q. Soluções contendo 15 mg/L de ácidos fúlvicos e 0,2
mg/L de 4-MBC em água Milli-Q foram preparadas por diluição de solução mãe de 4-MBC 40
mg/L e de uma solução mãe de ácidos fúlvicos 50 mg/L em água Milli-Q. Embora as soluções
mãe de 4-MBC tenham sido preparadas em acetonitrilo, a percentagem de acetonitrilo nas
soluções finais foi sempre inferior a 1%.
Para estudar o efeito da natureza das substâncias húmicas na fotodegradação do 4-
MBC, preparam-se também soluções contendo 2 mg/L de ácidos húmicos comerciais (sal
sódico Fluka) e 4 mg/L de 4-MBC. Para a preparação dessas soluções usou-se solução mãe de
4-MBC 500 mg/L referida em 2.1.2., e solução mãe de ácidos húmicos comerciais 20 mg/L. Esta
última foi preparada por dissolução do sólido em água Milli-Q.
2.Metodologia
Universidade de Aveiro Página | 25
2.1.3.3. Soluções de 4-MBC contendo cloreto de sódio
Por último, foi efectuado um estudo para verificar qual a influência do cloreto na
degradação do 4 – MBC. Para a preparação dessas soluções usou-se solução mãe de 4-MBC
500 mg/L referenciada na secção 2.1.2. para preparar uma solução com concentração de 4
mg/L. Para a preparação das soluções de NaCl pesou-se aproximadamente 8,75 g de NaCl e
dissolveu-se em 100 mL de água Milli – Q e transferiu-se para um balão volumétrico de 250
mL. Adicionou-se 2 mL da solução mãe do 4 – MCB e perfez-se o volume do balão volumétrico.
Embora as soluções mãe de 4-MBC tenham sido preparadas em acetonitrilo, a percentagem de
acetonitrilo nas soluções finais foi sempre inferior a 1%.
2.2. IRRADIAÇÃO DAS AMOSTRAS
As amostras foram sujeitas a irradiação imediatamente após a sua preparação. Os estudos
de fotodegradação foram efectuados em tubos de quartzo, onde se colocaram 20 mL de
solução, tendo sido tapados com parafilme. Posteriormente, estes tubos foram colocados num
suporte adequado e sujeitos a radiação artificial utilizando um simulador solar Solarbox 1500
com uma lâmpada de Xenon, com uma irradiância constante de 550 W/m2. Na concentração
mais elevada de 4 – MBC, ou seja, 4 mg/L o efeito da radiação ao longo do tempo foi estudado
sujeitando diferentes tubos com amostra a diferentes tempos de irradiação: 0,5; 1; 2; 3; 4; 6;
8; 10; 18 horas, no caso do estudo da degradação em água os tempos estudados foram mais
longos até 44 horas de irradiação. Na concentração mais baixa de 4 – MBC (0,2 mg/L) as
amostras foram sujeitas a um tempo máximo de irradiação de 10 horas, sendo os tempos
estudados de 0,5; 1; 2; 3; 4; 8 e 10 horas. Em simultâneo com as amostras irradiadas foram
submetidas às mesmas condições, soluções de controlo colocadas em tubos de quartzo
revestidos com folha de papel alumínio mantidos no sistema de irradiação durante 18 horas
para a concentração mais elevada de 4 – MBC (4 mg/L) e 10 horas para a concentração mais
baixa de 4 – MBC (0,2 mg/L). Tanto para a amostra inicial, a qual não foi irradiada como para
cada tempo de irradiação considerado foram realizadas três réplicas não simultâneas.
Nos casos em que a concentração inicial de 4-MBC era 4 mg/L as soluções foram
analisadas logo após irradiação, por HPLC-UV conforme descrito em 2.4. No que se refere às
soluções de concentração mais baixa, ou seja de 0,2 mg/L de 4 – MCB, foi realizada uma pré-
2. Metodologia
Página | 26 Departamento de Química
concentração utilizando o método de SPE, conforme as condições descritas em 2.3., antes da
análise por HPLC-UV.
2.3. EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE)
Neste trabalho a extracção em fase sólida foi utilizada com o principal propósito de pré –
concentrar as amostras mais diluídas (concentração inicial de 4-MBC = 0,2 mg/L) antes da
análise por HPLC-UV.
Os cartuchos utilizados para realizar a extracção em fase sólida foram cartuchos comerciais
supelclean envi-18 de 500 mg, adquiridos na Supelco (com diâmetro de poro de 75 Å e com
um tamanho de partícula de 56 μm). As condições de SPE utilizadas foram adaptadas das
propostas por Giokas et al. (2007b), para a pré-concentração de soluções 0,2 mg/L de 4-MBC
em água, antes e após irradiação, sendo em seguida descritas.
Os cartuchos inicialmente foram pré condicionados da seguinte forma:
2.5 mL de Acetato de etilo/ diclorometano 1:1 (v/v).
5 mL de metanol
3 mL de água Milli-Q
Posteriormente ao pré condicionamento do cartucho, fez-se passar 18 mL de amostra.
Em seguida procedeu-se à lavagem com 5 mL de água Milli – Q para remover alguns resíduos
da amostra e deixando-se secar o cartucho durante 30 minutos com corrente de azoto.
Depois da secagem do cartucho procedeu-se à eluição da amostra com 5 ml de
Acetato de etilo/diclorometano 1:1 (v/v). O eluato recolhido foi evaporado à secura sob
corrente de azoto, posteriormente o resíduo seco foi redissolvido com 300 µL de acetonitrilo e
analisado por HPLC-UV. Depois de se realizar a pré concentração, a amostra encontra-se 60 ×
mais concentrada do que a inicial.
2.Metodologia
Universidade de Aveiro Página | 27
2.4. ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA (HPLC) COM DETECTOR UV.
O estudo da degradação do 4 – MBC foi realizado utilizando como método a
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) num equipamento Jasco HPLC apparatus,
equipado com uma bomba PU-980 e o detector Barspec UV , sendo o comprimento de onda
seleccionado de 300 nm.
A separação dos compostos foi efectuada com uma coluna Phenomenex C18
(150×4.60mm, 5 μm, 110 A °). As amostras foram injectadas num loop de 20 μL. A fase móvel,
composta pelos eluentes acetonitrilo / água (80:20) (v/v), com um fluxo de 0.7 mL min-1, sendo
está previamente filtrada utilizando filtros de 20 μm NL 16 (Schleicher & Schuell). Todas as
análises foram efectuadas à temperatura ambiente. Realizaram-se três réplicas das injecções
de cada amostra. Sendo a quantificação do 4 – MBC efectuada pelo método da recta de
calibração, ou seja, prepararam-se soluções padrão do 4- MBC na gama de concentrações em
que existe uma relação linear entre a absorvência e a concentração. Com o auxílio de uma
folha de cálculo é verificada a linearidade e é determinada a equação da recta (y = mx+b), que
posteriormente foi utilizada para saber a concentração do 4 – MBC presente na amostra.
2.4.1. ANÁLISE POR ESPECTROMETRIA DE MASSA
Os produtos de degradação formados durante a irradiação foram analisados por
espectrometria de massa utilizando ionização por electrospray, utilizando o espectrómetro de
massa electrospray linear ion trap.
O espectrómetro de massa trapa de iões linear LXQ (ThermoFinnigan, Palo Alto,USA)
foi utilizado em modo positivo, com as seguintes condições de electrospray: voltagem do
electrospray de 5 kV; temperatura do capilar de 275°C, o fluxo do gás de 25 unidades. No
modo negativo foram utilizadas as mesmas condições alterando apenas: a voltagem do
electrospray de 4,7kV. Foram realizados espectros de MS2 e MS3 nos iões de interesse,
variando a energia de colisão entre 18-40 de unidades arbitrárias. Para o tratamento de
resultados foi utilizado o programa de software Xcalibur (V2.0).
3. ESTUDO DA DEGRADAÇÃO DO 4-MBC EM ÁGUA
E NA PRESENÇA DE ÁCIDOS FÚLVICOS, ÁCIDOS
HÚMICOS E CLORETO
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Universidade de Aveiro Página | 31
3.1. ANÁLISE DO 4-MBC POR HPLC-UV: RECTAS DE
CALIBRAÇÃO E LIMITES DE DETECÇÃO
Uma vez que as análises das amostras foram efectuadas em diferentes dias, foram
preparadas soluções padrão de calibração sempre que necessário, não existindo, por isso,
apenas um valor de coeficiente de correlação e de limite de detecção (LOD), associados às
rectas de calibração, mas sim uma gama de valores. Os coeficientes de correlação foram
sempre superiores a 0,9995. Os LOD foram determinados com a ordenada na origem mais três
vezes o desvio padrão residual da recta; a conversão para unidades de concentração foi feita
dividindo pelo declive da recta. Foram usadas duas gamas de concentração dos padrões: uma
gama mais elevada (0,5 – 19 mg/L) com um LOD a variar entre 0,179 e 0,310 mg/L e uma gama
baixa (0,5 – 8 mg/L) com um LOD a variar entre 0,099 e 0,234 mg/L.
3.2. FOTOESTABILIDADE DE SOLUÇÕES DO 4 – MBC 4 mg/L
EM ÁGUA
Com o intuito de estudar a degradação do 4 – MBC foram preparadas soluções com uma
concentração aproximadamente 4 mg/L de 4 -MBC em água, sendo estas sujeitas a diferentes
tempos de irradiação.
Para garantir que quaisquer alterações observadas nas soluções eram atribuíveis à
fotodegradação, foram feitos ensaios de controlo, colocando no sistema de irradiação Solar
Box tubos de quartzo com a mesma solução em análise, revestidos com papel de alumínio,
durante o período máximo de irradiação. As variações de concentração observadas nas
soluções de controlo relativamente à concentração inicial foram sempre inferiores a 4,5%,
apesar de a temperatura atingida no sistema de irradiação Solar Box, durante longos períodos
de tempo de irradiação, ser bastante elevada (atingindo um máximo de 47 °C). Assim, pode
concluir-se que as alterações observadas nas soluções irradiadas são atribuíveis à
fotodegradação.
Na Figura 4 encontra-se representada a variação da concentração do E-4 – MBC em
água em função do tempo de irradiação.
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Página | 32 Departamento de Química
Figura 4: Degradação do 4 – MBC em água ao longo do tempo de irradiação (
) .
Pela análise da Figura 4 pode-se verificar um acentuado decréscimo nos primeiros 30
minutos, o que demonstra que a degradação do 4 – MBC é bastante rápida nesse período de
tempo. Nos restantes tempos de irradiação verifica-se que este decréscimo é mais lento. Este
decréscimo inicial muito rápido pode ser explicado pela isomerização do composto, também
observada por outros autores (Rodil et al., 2009). De facto, o decréscimo acentuado do pico do
E-4-MBC é acompanhado de um aumento concomitante de um pico ao tempo de retenção de
9,70 minutos atribuível ao isómero Z. Na Figura 5 encontram-se representadas as áreas dos
picos dos isómeros E e Z do 4- MBC, normalizadas em relação ao seu valor máximo, em função
do tempo. Pode-se verificar que o decréscimo muito acentuado do isómero E nos primeiros 30
minutos de irradiação é concomitante com o aumento muito acentuado do pico do isómero Z.
De facto, a área do pico do isómero Z sofre um aumento muito acentuado inicialmente,
começando a decrescer a partir das 3 horas de irradiação, sendo este decréscimo gradual até
às 24 horas. No estudo de Rodil et al. (2009), referente à fotodegradação do 4-MBC em água,
os autores referem também a ocorrência de uma isomerização rápida do composto, após a
qual a proporção entre os dois isómeros se mantém constante. No presente trabalho também
se observou que a proporção entre os dois isómeros se mantinha constante (razão das áreas
dos picos constante) entre 30 minutos e 18 horas de irradiação. No entanto, os autores não
referem qualquer decréscimo lento das concentrações dos isómeros E e Z – 4 – MBC após a
isomerização inicial, decréscimo esse que foi observado no presente trabalho.
É de notar que no trabalho de Rodil e tal (2009) o isómero Z está presente mesmo para
um tempo de irradiação 0, indicando que a experiência foi iniciada com os dois isómeros já
presentes. No presente trabalho tal não se verifica (ver Figura 5) uma vez que se teve o
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Co
nce
ntr
ação
(mg/
L)
Tempo de irradiação (h)
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Universidade de Aveiro Página | 33
cuidado de revestir as soluções com papel de alumínio após a sua preparação, demonstrando
que o reagente comercializado é o isómero E e que a protecção efectuada às soluções de E-4-
MBC com papel de alumínio evitou a isomerização do composto. De facto, fez-se o teste de
deixar algumas soluções sem protecção, isto é, expostas à luz existente no laboratório, e
verificou-se que, nesse caso, ocorria isomerização.
Figura 5: Áreas dos picos dos isómeros E e Z do 4- MBC normalizadas em relação ao seu valor máximo
em função do tempo de irradiação (
).
Rodil et al. (2009) analisaram as soluções de 4-MBC ao longo do tempo de irradiação
por HPLC-MS e quantificaram os isómeros Z e E em conjunto a partir da resposta conjunta dos
mesmos, tendo concluído que esta se mantinha constante ao longo do tempo de irradiação, o
que levou os autores a concluírem que o 4-MBC era foto-estável. No presente trabalho fez-se a
análise por HPLC-UV e não se dispunha de padrão para o Z-4-MBC. No entanto, considerou-se
que a área total dos dois picos seria uma boa forma de quantificar a concentração total dos
dois isómeros ao longo do tempo de irradiação, sobretudo se atendermos a que a proporção
entre os dois isómeros se mantém constante após a isomerização inicial. Assim, na Figura 6
apresenta-se a variação da área total dos dois picos ao longo do tempo de irradiação,
verificando-se um decréscimo da mesma, indicador da degradação dos dois isómeros, sendo
este facto contraditório em relação a afirmação de Rodil et al., (2009) de que o 4 – MBC é foto
– estável. A fotodegradação do 4 – MBC segue uma cinética de pseudo primeira ordem
conforme se pode verificar na Figura 7 onde se representa o ln( Atotal /A0total) em função do
tempo, sendo Atotal a área total dos dois picos (isómeros E e Z) ao fim de cada tempo e A0total a
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Ai/
Am
áx
Tempo de irradiação (h)
Isómero E
Isómero Z
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Página | 34 Departamento de Química
área total inicial. Giokas et al. (2007b) também referem uma cinética de pseudo primeira
ordem para a fotodegradação do 4 – MBC.
Figura 6: Perfil de variação da área total dos dois picos ao longo do tempo de irradiação (
).
Figura 7: Ajuste cinético de pseudo primeira ordem de ln( Atotal /A0total)em função do tempo (
).
É de referir no entanto que nem Rodil et al. (2009) nem Giokas et al. (2007b)
mencionam a ocorrência de quaisquer produtos de degradação. No entanto, no presente
trabalho, a análise dos cromatogramas obtidos com detecção ao comprimento de onda
seleccionado para o E – 4 – MBC (300 nm) revela o aparecimento de um pico adicional, para
além dos dois picos correspondentes aos isómeros E e Z, ao fim de 6 horas de irradiação. Esse
pico apresenta um tempo de retenção de 1,35 minutos, conforme se pode ver na Figura 8,
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 5 10 15 20 25 30
Ato
tal/
A0 t
ota
l
Tempo de irradiação (h)
4 mg/l de 4 -MBC
y = -0,0442x - 0,1485R² = 0,9708
-1,4
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0 5 10 15 20 25 30
ln( A
tota
l/A
0 tota
l)
Tempo (h)
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Universidade de Aveiro Página | 35
Figura 9:Perfil de variação da área do pico do produto 1 em função do tempo de irradiação.
onde se apresenta o cromatograma de uma solução de 4 – MBC após 24 horas de irradiação,
que corresponde ao tempo ao fim do qual o referido pico atinge a sua área máxima.
Na Figura 9 é apresentado o perfil de variação da área do pico adicional ao longo do
tempo de irradiação, podendo-se constatar que este aparece após seis horas e aumenta até às
24 horas, decrescendo para tempos de irradiação superiores.
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Áre
a d
o p
ico
Tempo de irradiação (h)
1º ensaio
2ºensaio
3ºensaio
4ºensaio
0 100 200 300 400 500 600Tempo (segundos)
(Z) – 4-MBC
(E) – 4-MBC
pico 1pico do solvente
Figura 8: Cromatograma com detecção a 300nm correspondente ao pico adicional quando este atinge
o seu máximo com um tempo de irradiação de 24h.
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Página | 36 Departamento de Química
No entanto, analisando os cromatogramas com detecção a outros comprimentos de
onda (250 e 270 nm, respectivamente) foi possível detectar não um mas quatro produtos de
degradação. Os tempos de retenção e os respectivos espectros estão indicados na Tabela 4. A
título de exemplo, na Figura 10 é apresentado um cromatograma, com detecção a 270 nm, no
qual são visíveis os quatro produtos de degradação.
Tabela 4: Tempos de retenção e respectivos espectros UV/Vis dos produtos de degradação e dos isómeros do 4 – MBC.
Produtos de degradação
Tempos de retenção (minutos)
Espectro UV/Vis
Produto 1 1,35
Produto 2 3,45
Produto 3 4,25
Produto 4 5,42
E – 4 – MBC 7,86
0,0
0,5
200 250 300 350 400
Ab
sorv
ânci
a
λ (nm)
0,0
0,1
0,2
200 300 400
Ab
sorv
ânci
a
λ (nm)
0,0
0,2
200 240 280 320 360 400Ab
sorv
ânci
a
0,00
0,05
0,10
0,15
200 250 300 350
Ab
sorv
ânci
a
λ (nm)
0,00,20,40,60,8
200 250 300 350 400
Ab
sorv
ânci
a
λ (nm)
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Universidade de Aveiro Página | 37
Z- 4 - MBC 9,70
Figura 10: Cromotograma com detecção a 270 nm da solução 4 mg/de 4 – MBC L em água após 24h de irradiação.
Nas Figuras 11, 12 e 13 apresentam-se os perfis de variação da área dos picos
correspondentes aos restantes três produtos de degradação ao longo do tempo de irradiação.
Pela análise do perfil de variação da área do produto 2 pode-se verificar que este sofre um
aumento até às 32 horas de irradiação, começando a decrescer lentamente após esse tempo.
Figura 11: Perfil de variação da área do pico do produto 2 ao longo do tempo de irradiação.
0
0,2
0,4
200 250 300 350 400
Ab
sorv
ânci
a
λ (nm)
0 100 200 300 400 500 600 700 800Tempo (segundos)
Produto 1
Produto 2
Produto 3
Produto 4
(E) – 4 – MBC
(Z) – 4 – MBC
Pico do solvente
2000
3000
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3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Página | 38 Departamento de Química
No que se refere ao perfil de variação da área do pico do produto 3 ao longo do tempo
de irradiação verifica-se que este aparece após 6 horas de irradiação apresentando um
aumento até às 24 horas, onde atinge o seu máximo. No entanto, após as 24 horas de
irradiação, verifica-se que este sofre um decréscimo bastante acentuado.
Figura 12: Perfil de variação da área do pico do produto 3 ao longo do tempo de irradiação.
O produto 4 só foi detectado após 24 horas de irradiação (ou seja, aparece entre as 18
horas e as 24 horas). A área máxima deste pico foi observada após 24 horas de irradiação
verificando-se um decréscimo após esse tempo.
Figura 13: Perfil de variação da área do pico do produto 4 ao longo do tempo de irradiação.
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Tempo de irradiação (h)
1º ensaio
2ºensaio
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Universidade de Aveiro Página | 39
3.3. EFEITO DA CONCENTRAÇÃO INICIAL DO 4-MBC
Uma vez que a concentração inicial de 4 – MBC é um pouco elevada relativamente às
concentrações ambientais, resolveu-se verificar se a concentração influencia a cinética de
degradação do 4 – MBC. Para isso, fez-se um estudo com um nível de concentração de 4-MBC
mais baixo, 0,2 mg/L. Neste estudo, como a concentração é muito pequena, teve de se
proceder à pré – concentração das soluções irradiadas, por extracção em fase sólida, conforme
descrito na secção 2.3. As soluções pré-concentradas foram então analisadas por HPLC – UV.
3.3.1. RECUPERAÇÕES DO 4-MBC E SEUS FOTOPRODUTOS NA PRÉ-
CONCENTRAÇÃO DAS SOLUÇÕES POR EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE)
De modo a verificar se o processo de pré – concentração era eficiente, o mesmo
procedimento de pré-concentração foi aplicado às soluções de concentração inicial 4 mg/L ao
longo da sua irradiação. Analisaram-se as soluções antes e após pré-concentração e foram
determinados os valores de percentagem de recuperação, tanto para os isómeros do 4-MBC
como para os produtos de degradação. No caso dos produtos de degradação e do isómero Z –
4 – MBC, uma vez que não dispomos de padrões para a calibração, as percentagens de
recuperação foram calculadas com base nas áreas dos picos obtidos antes e após pré-
concentração e tendo em consideração o factor de concentração na SPE. No que refere ao
isómero E esta percentagem foi calculada a partir das concentrações antes e após pré-
concentração, as quais foram determinadas com base na recta de calibração. Na tabela
seguinte encontram-se as percentagens de recuperação dos produtos de degradação e dos
isómeros do 4 – MBC.
Tabela 5: Percentagens de recuperação do processo de SPE dos produtos de degradação e dos
respectivos isómeros (E e Z – 4 – MBC).
Produto 1 Produto 2 Produto 3 Produto 4 E - 4-MBC Z - 4-MBC
50 – 65% 20 – 25% 87 – 90 % 90 – 118% 90 – 104 % 90 – 95%
Como se pode verificar, obtiveram-se boas percentagens de recuperação dos produtos
3, 4, E - 4-MBC e Z - 4-MBC. No caso dos produtos 1 e 2 estas percentagens foram bastante
baixas, o que introduz limitações na sua análise durante os estudos de fotodegradação das
soluções de 4-MBC 0,2 mg/L.
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Página | 40 Departamento de Química
3.3.2. COMPARAÇÃO DA FOTODEGRADAÇÃO DO 4-MBC EM
SOLUÇÕES 0,2 mg/L E 4 mg/L
Na Figura 14 apresenta-se a variação da concentração do 4 – MBC em solução,
normalizada em relação à concentração inicial, em função do tempo de irradiação das soluções
com concentrações iniciais 0,2 e 4 mg/L respectivamente. Neste caso foi possível verificar que
a degradação (isomerização) nos primeiros 30 minutos de irradiação é inferior no caso da
solução com concentração inicial de 0,2 mg/L de 4 – MBC e após 2 horas de irradiação a
degradação do 4 – MBC na solução menos concentrada parece ser sempre um pouco superior
à degradação da solução com uma concentração mais elevada. Na Figura 15 representa-se a
variação da área total dos dois picos (isómeros E e Z) normalizada em relação a área total
inicial. Também esta figura sugere que a percentagem de degradação para tempos superiores
a 2 horas de irradiação é um pouco maior na solução menos concentrada. A variação da
concentração inicial de 4 – MBC parece portanto alterar a cinética da reacção de
fotodegradação. Estes resultados encontram-se de acordo com os de Neamtu e Frimmel
(2006) uma vez que estes autores observaram a influência da concentração inicial na
degradação do nonilfenol. Estes autores concluíram que concentrações iniciais de nonilfenol
mais baixas aumentam a velocidade de degradação do nonilfenol.
Figura 14: Valores normalizados C/C0 em função do tempo de irradiação das soluções 0,2 e 4 mg/L de 4–
MBC em água (
).
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C/C
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0,2 mg/L de 4 -MBC em água
4 mg/Lde 4 -MBC em água
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Universidade de Aveiro Página | 41
Figura 15: Perfil de variação da área total dos dois picos (isómeros E e Z) normalizada em relação a área
total inicial ao longo do tempo de irradiação (
).
No que se refere aos produtos de degradação pode-se verificar pela análise da Figura
16, correspondente ao cromatograma da solução 0,2 mg/L em água após 10 horas de
irradiação que é possível detectar quatro produtos de degradação do 4 – MBC. Uma vez que
estes produtos apresentam os mesmos tempos de retenção que os detectados durante a
irradiação de soluções de 4 – MBC com um nível de concentração mais elevada, isso leva a crer
que são os mesmo produtos de degradação.
Figura 16: Cromatograma da solução de 0,2 mg/L em água após 10 horas de irradiação, com detecção a 270 nm.
Nas Figuras 17, 18, 19 e 20 apresentam-se os perfis de variação das áreas dos picos dos
quatro produtos de degradação ao longo do tempo de irradiação
Pela análise da Figura 17 correspondente ao perfil de variação da área do pico do
produto 1 ao longo do tempo de irradiação, este pico apresenta uma área crescente ao longo
do tempo de irradiação, até ao tempo máximo estudado de 10 horas de irradiação. Esta
0,0
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tempo de irradiação (h)
4 mg/L de 4 - MBC em água
0,2 mg/L de 4 - MBC em água
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Produto 1
Produto 2
Produto 3
Produto 4
Z – 4 -MBC
E – 4 -MBC
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Página | 42 Departamento de Química
variação está de acordo com a que foi observada nas soluções mais concentradas onde
também se verifica que a área deste pico até as 10 horas de irradiação está a aumentar. Nas
soluções irradiadas com concentração de 4 mg/L de 4 – MBC só foi possível detectar o pico
após 6 horas de irradiação, enquanto que nestas soluções (0,2 mg/L do 4 – MBC) a sua
detecção ocorreu logo após 3 horas de irradiação. Tal facto é atribuível ao elevado factor de
concentração associado à extracção em fase sólida. De facto as soluções foram pré –
concentradas 60 vezes o que significa que a solução inicial de 0,2 mg/L no final do processo de
pré – concentração se encontra com uma concentração de 12 mg/L, ou seja, uma
concentração muito mais elevada que a solução de 4 mg/L do 4 – MBC.
Figura 17: Perfil de variação da área do pico ao longo do tempo de irradiação do produto 1.
Nas Figura 18 e Figura 19 encontram-se representados os perfis de variação das áreas
dos picos dos produtos 2 e 3 ao longo do tempo de irradiação, respectivamente, verificando-se
que estes apresentam uma área crescente ao longo do tempo de irradiação, até ao tempo
máximo estudado de 10 horas de irradiação. Esta variação está de acordo com a que foi
observado nas soluções mais concentradas onde também se verifica que as áreas destes picos
aumentam até às 10 horas de irradiação. Nas soluções irradiadas com concentração de 4 mg/L
de 4 – MBC só foi possível detectar ambos os picos após 6 horas de irradiação, enquanto que
nestas soluções (0,2 mg/L do 4 – MBC) a detecção do produto 2 ocorreu logo após 4 horas de
irradiação e do produto 3 após 3 horas de irradiação. Como citado anteriormente este facto é
atribuível ao elevado factor de concentração associado à extracção em fase sólida.
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Figura 18: Perfil de variação da área do pico ao longo do tempo de irradiação do produto 2.
Figura 19: Perfil de variação da área do pico ao longo do tempo de irradiação do produto 3.
No que se refere ao perfil de variação da área do pico do produto 4, representado na
Figura 20 verifica-se que este apresenta uma área crescente até às 8 horas de irradiação e
posteriormente a esse tempo começa a decrescer até ao tempo máximo estudado de 10 horas
de irradiação. Esta variação não está de acordo com a observada na solução mais concentrada,
onde o pico aparece entre as 18 horas e as 24 horas, a sua área máxima ocorre após 24 horas
de irradiação e posteriormente é verificado um decréscimo. Neste caso verifica-se que a
detecção ocorre mais cedo, surgindo após 4 horas de irradiação. Tal facto é atribuível ao
elevado factor de concentração associado à extracção em fase sólida, como citado
anteriormente. O facto de ser observado um decréscimo após 8 horas de irradiação na solução
menos concentrada sugere uma degradação mais rápida deste produto intermediário nas
soluções mais diluídas, sendo necessário efectuar mais estudos de forma a compreender este
comportamento.
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3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Página | 44 Departamento de Química
Figura 20: Perfil de variação da área do pico ao longo do tempo de irradiação do produto 4.
De um modo geral, podemos concluir que embora haja um ligeiro aumento da
velocidade de degradação nas soluções mais diluídas, os produtos que se formam são os
mesmos e, à excepção do produto 4, apresentam os mesmos perfis de variação ao longo do
tempo.
3.4. EFEITO DAS SUBSTÂNCIAS HÚMICAS
Num estudo realizado por Giokas et al. (2007b), sobre a fotodegradação do 4 – MBC na
presença de substâncias húmicas, os autores concluíram que na presença de substâncias
húmicas a degradação do 4 – MBC sofria um aumento. No entanto, o efeito das substâncias
húmicas depende da natureza das mesmas (Zhan et al., 2006).
Assim, no presente trabalho incluiu-se um estudo do efeito de ácidos fúlvicos extraídos
do rio Vouga (Santos e Duarte, 1998) na fotodegradação do 4 – MBC.
3.4.1. EFEITO DE ÁCIDOS FÚLVICOS DO RIO VOUGA NA
FOTODEGRADAÇÃO DO 4-MBC
O efeito dos ácidos fúlvicos na fotodegradação do 4-MBC foi estudado usando duas
proporções diferentes entre a concentração de 4-MBC e ácidos fúlvicos: 15 mg/L de ácidos
fúlvicos com 0,2 mg/L de 4 – MBC (ou seja, correspondente a uma razão de 75:1) e 2 mg/L de
ácidos fúlvicos com 4 mg/L de 4 – MBC (correspondente a uma razão de 0,5:1).
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Tempo de irradiação (h)
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3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
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No caso do nível de concentração do 4 – MBC mais baixo teve de se proceder a uma pré-
concentração das soluções por extracção em fase sólida antes da análise, conforme descrito na
secção 2.3.
Na Figura 21 apresentam-se os valores de C/C0 em função do tempo de irradiação para
as soluções com concentrações iniciais de E – 4 – MBC de 4 mg/L, na presença e ausência de
ácidos fúlvicos. Pela análise da Figura pode-se verificar que a cinética de degradação do 4 –
MBC não é afectada na presença de ácidos fúlvicos, quando utilizada uma proporção de ácidos
fúlvicos e 4 – MBC de 0,5:1.
Figura 21: Comparação da degradação do 4 – MBC (4mg/L) em água e na presença de 2 mg/L de ácidos
fúlvicos com uma concentração inicial de 4 mg/L de 4 – MBC ao longo do tempo de irradiação
(
).
Na Figura 22 apresentam-se os valores de C/C0 em função do tempo de irradiação para
as soluções com concentrações iniciais de E – 4 – MBC de 0,2 mg/L, na presença e ausência de
ácidos fúlvicos. A análise da Figura 22 sugere que, nas soluções de 0,2 mg/L de 4-MBC,para
uma proporção elevada de ácidos fúlvicos: 4 – MBC, o decréscimo inicial do isómero E é mais
rápido na presença de ácidos fúlvicos do que em água. No entanto, para tempos de irradiação
superiores a 2 horas, a percentagem de degradação do 4-MBC é idêntica na presença e na
ausência de ácidos fúlvicos. Na Figura 23 representa-se a variação da área total dos dois picos
(isómeros E e Z) normalizada em relação a área total inicial, verificando-se que estes
resultados não evidenciam um efeito claro dos ácidos fúlvicos na cinética de degradação do 4 –
MBC.
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C/C
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Na presença de 2 mg/L de AF e 4 mg/L de 4- MBC
4 mg/L de 4 -MBC em água
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Página | 46 Departamento de Química
Figura 22: Comparação da degradação do 4 – MBC em água e na presença de 15 mg/L de ácidos fúlvicos
com uma concentração inicial de 0,2 mg/L de 4 – MBC ao longo do tempo de irradiação (
).
Figura 23: Perfil de variação da área total dos dois picos (isómeros E e Z) normalizada em relação a área total inicial ao longo do tempo de irradiação na presença e ausência de ácidos fúlvicos com uma
concentração de 4 – MBC 0,2 mg/L e 15 mg/L de ácidos fúlvicos (
).
Estes resultados contrastam com os de Giokas et al, (2007b) uma vez que estes
autores observaram um efeito positivo de ácidos húmicos comerciais, isto é, verificaram que
estes actuavam como foto-sensibilizadores. Este facto pode-se dever à influência da natureza
das substâncias húmicas, uma vez, que o efeito destas depende da natureza das mesmas (Zhan
et al., 2006).
No que se refere aos produtos de degradação neste estudo era de esperar o
aparecimento de pelo menos três produtos de degradação uma vez que o quarto produto na
solução de 4 mg/L de 4 – MBC em água só aparece após 24 h de irradiação e como neste
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Tempo de irradiação (h)
0,2 mg/L de 4 -MBC em água
Na presença de 15 mg/L de AF e 0,2 mg/L de água
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Tempo de irradiação (h)
Na presença de 15 mg/L de ácidos fúlvicos e 0,2 mg/L de 4 - MBC
0,2 mg/Lde 4- MBC em água
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Universidade de Aveiro Página | 47
estudo o tempo máximo de irradiação foi de 18 horas não era esperado o aparecimento desse
produto. Ao contrário do que era esperado, na solução de 2 mg/L de ácidos fúlvicos e 4 mg/L
de 4 – MBC só foi detectado um produto de degradação com um tempo de retenção de 3,40
minutos, o qual corresponde ao produto 2. Na Figura 24 encontra-se representado o perfil de
variação da área do pico do produto 2 na presença e ausência de ácidos fúlvicos em função do
tempo de irradiação. Como se pode observar na Figura a variação da concentração deste
produto ao longo do tempo é idêntica na presença e ausência de ácidos fúlvicos
O facto de só se identificar um produto de degradação leva-nos a concluir que, embora
os ácidos fúlvicos não afectem a velocidade de degradação do E-4 – MBC, afectam a formação
de produtos intermediários.
Figura 24: Perfil de variação da área do pico do produto 2 na presença e ausência de ácidos fúlvicos em
função do tempo de irradiação (
).
Na solução de 0,2 mg/L de 4 – MBC e 15mg/L de ácidos fúlvicos teve de se recorrer ao
método de pré concentração e verificou-se que esse produto não aparecia. No entanto
observa-se o aparecimento de um pico intenso com um tempo de retenção de 2,20 minutos,
não correspondendo a qualquer produto de degradação identificado anteriormente, o qual
está presente logo na solução inicial, antes de irradiar. A fim de averiguar se este pico podia
ser atribuído aos ácidos fúlvicos preparou-se uma solução com 15 mg/L de ácidos fúlvicos, a
qual foi sujeita a uma pré – concentração, como descrito na secção 2.3, sendo posteriormente
analisada por HPLC-UV. Comparando a Figura 25 onde se apresenta o cromatograma da
solução inicial de 0,2 mg/L de 4 – MBC e 15 mg/L de ácidos fúlvicos, com a Figura 26
correspondente à solução de 15 mg/L de ácidos fúlvicos pode-se concluir que o pico intenso é
correspondente aos ácidos fúlvicos. O facto de o produto 2 não ser identificado pode-se dever
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Ácidos Fúlvicos
Água
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
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a um obscurecimento devido à banda intensa referente aos ácidos fúlvicos, e também devido
ao facto de a % de recuperação do método de SPE do produto 2 ser muito pequena, como se
pode comprovar na secção 3.3.1. Além disso, esta percentagem de recuperação pode ter sido
afectada pela presença de ácidos fúlvicos, uma vez que as percentagens de recuperação
apresentadas em 3.3.1 foram determinadas na ausência destes.
Figura 25:Cromatograma da solução de 0,2 mg/L de 4- MBC e 15 mg/L de ácidos fúlvicos sem irradiar com detecção a 300 nm.
Figura 26:Cromatograma da solução de ácidos fúlvicos com detecção a 300 nm.
Podemos portanto concluir que os resultados não evidenciam uma aceleração da
degradação do 4 – MBC na presença de ácidos fúlvicos mesmo utilizando proporções elevadas
de ácidos fúlvicos : 4 –MBC, contrariamente ao observado por Giokas et al.,(2007b) na
influencia de ácidos húmicos comerciais. No entanto, a formação de produtos intermediários é
alterada na presença de ácidos fúlvicos.
0 100 200 300 400 500 600 700
Tempo (segundos)
0 100 200 300 400 500 600 700
Tempo (segundos)
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Universidade de Aveiro Página | 49
3.4.2. EFEITO DOS ÁCIDOS HÚMICOS COMERCIAIS NA
DEGRADAÇÃO DO 4 - MBC
A fim de verificar se a natureza das substâncias húmicas influencia a formação dos
produtos intermediários de degradação do 4 – MBC foi efectuado um estudo de degradação
na presença de ácidos húmicos comerciais. Para tal foi utilizada uma concentração de ácidos
húmicos de 2mg/L e 4 mg/L de 4 – MBC. Na Figura 27 encontra-se representada a degradação
do 4 – MBC na presença de ácidos húmicos ao longo do tempo de irradiação.
Figura 27: Degradação do 4 – MBC (4 mg/L) em água e na presença de 2 mg/L de ácidos húmicos ao
longo do tempo de irradiação (
).
Pela análise da Figura 27 pode-se verificar que a degradação do 4 – MBC em água e na
presença de ácidos húmicos apresenta o mesmo comportamento ao longo do tempo de
irradiação. Este facto leva a concluir que a cinética da reacção de degradação do 4 – MBC não
sofre alteração na presença de ácidos húmicos, nesta proporção de ácido húmicos para 4 –
MBC, o que está de acordo com o observado nos ácidos fúlvicos.
No estudo da degradação do 4 – MBC na presença de ácidos húmicos comerciais só foi
possível detectar um produto de degradação, com um tempo de retenção de 3,40minutos,
correspondente ao produto 2. Tal facto encontra-se de acordo com o verificado no estudo da
influência dos ácidos fúlvicos, evidenciando também só o aparecimento deste mesmo produto
de degradação. Na Figura 28 encontra-se representado o perfil de variação da área do pico
correspondente a este produto 2 na presença de ácidos húmicos comerciais, na presença de
ácidos fúlvicos e em água em função do tempo de irradiação. Como se pode verificar o perfil
de variação da área do pico do produto 2 é muito semelhante, verificando-se apenas que a
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Ácidos húmicos
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3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Página | 50 Departamento de Química
detecção deste produto ocorreu mais cedo na presença de ácidos húmicos e fúlvicos,
formando-se após 4 horas de irradiação.
Figura 28: Produto de degradação a um tempo de retenção de 3,45 minutos, com detecção a 250nm na
presença de ácidos húmicos, ácidos fúlvicos e água durante o período de irradiação (
).
3.5. FOTODEGRADAÇÃO DO 4 -MBC NA PRESENÇA DE CLORETO
Por último foi efectuado um estudo para verificar se a degradação do 4 – MBC era
afectada na presença de cloreto. Neste estudo a concentração de 4 –MBC utilizada é de 4 mg/L
e 35 g/L de coreto de sódio. Na Figura 29 encontra-se representada a degradação do 4 - MBC
na presença e ausência de cloreto.
Figura 29: Comparação da degradação do 4 – MBC (4 mg/L) em água e na presença de cloreto ao longo
do tempo de irradiação (
).
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Tempo de irradiação (h)
ácidos húmicos
Ácidos fúlvicos
Água
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0,5
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2,5
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3,5
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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Co
nce
ntr
ação
(mg/
L)
Tempo de irradaiação (h)
Cloreto
Água
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Universidade de Aveiro Página | 51
Comparando a degradação do 4 – MBC em água e na presença de cloreto pode-se
constatar que inicialmente ocorre um decréscimo rápido da concentração do E-4-MBC nos
primeiros 30 minutos, atribuível à isomerização e nos tempos de irradiação seguintes a
degradação na presença de cloreto é mais acentuada. Este facto, leva a concluir que a
degradação do 4 – MBC sofre uma pequena aceleração na presença de cloreto. Esta
aceleração da degradação do 4-MBC na presença de cloreto é melhor evidenciada pela análise
da Figura 30, onde se apresenta a variação da área total dos picos dos dois isómeros do 4-MBC
em função do tempo.
Figura 30: Perfil de variação da área total dos dois picos (isómeros E e Z) normalizada em relação a área
total inicial ao longo do tempo de irradiação (
).
Estes resultados contrastam com os de Giokas et al. (2007b) uma vez que estes autores
observaram um efeito de inibição na degradação do 4 – MBC na presença de cloreto. Outros
autores (Grebel et al., 2009; Baycan et al., 2007), também verificaram que a degradação de
compostos orgânicos na presença de cloreto sofre uma inibição, dado que os iões Cl-
funcionam como sequestradores dos radicais hidroxilo, os quais estão envolvidos na
fotodegradação de muitos contaminantes.
No que se refere aos produtos de degradação, na presença de cloreto foram apenas
detectados dois produtos, com os tempos de retenção 3,45 e 4,59 minutos, correspondentes
aos produtos 2 e 3. Este facto, revela que o cloreto pode afectar a formação de produtos
intermediários da degradação, uma vez que na solução de 4 mg/L em água até 18 horas de
irradiação foi possível detectar três produtos de degradação.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 5 10 15 20 25 30
Ato
tal/
A0 t
ota
l
Tempo de irradiação (h)
Na presença de cloreto
Água
3. Estudo de fotodegradação do 4-MBC
Página | 52 Departamento de Química
Na Figura 31 encontra-se o perfil de variação do produto 2 detectado na presença e
ausência de cloreto. Pela análise da Figura 31 pode-se verificar que o comportamento na
ausência e presença de cloreto é semelhante.
Figura 31: Perfil de variação da área do pico do produto 2 na presença e ausência de cloretos ao longo do
tempo de irradiação (
).
Na Figura 32 encontra-se representado o perfil de variação do produto 3 na presença e
ausência de cloreto. Pela análise da Figura pode-se verificar que a formação do produto 3 na
presença do cloreto é retardada, uma vez que este aparece só após 10 horas de irradiação.
Figura 32: Perfil de variação da área do pico do produto 3 na presença e ausência de cloretos ao longo do
tempo de irradiação (
).
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Áre
a d
o p
ico
Tempo de irradiação (h)
Cloreto
água
0
1000
2000
3000
4000
0 10 20 30 40
Áre
a d
o p
ico
Tempo de irradiação (h)
Cloreto
Água
4. IDENTIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DE
DEGRADAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE MASSA
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Universidade de Aveiro Página | 55
4.1. RECOLHA DOS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO E ANÁLISE POR
ESPECTROMETRIA DE MASSA
A fim de se proceder à identificação por espectrometria de massa dos produtos de
degradação do 4 - MBC, recolheu-se cada pico do cromatograma à saída do detector do HPLC-
UV. Para se proceder a esta recolha foi efectuada uma pré – concentração por SPE, como
descrito na secção 2.1.4,da solução de 4 mg/L de 4-MBC ao fim de 18 horas de irradiação. Na
Figura 33 encontra-se o cromatograma da solução após pré concentração.
Figura 33: Cromatograma correspondente a amostra pré concentrada com detecção a 300 nm.
As soluções correspondentes a cada pico foram recolhidas, concentradas por
evaporação sob azoto e as soluções foram analisadas posteriormente por HPLC – UV de forma
a confirmar que se havia recolhido o pico pretendido. Nas Figuras 35, 36, 38, 39, 41 e 42
encontram-se os cromatogramas das soluções correspondentes a cada composto recolhido.
0 100 200 300 400 500 600 700 800Tempo (segundos)
Pico 1
Pico 3
Pico 4
Pico 2
Isómero Z
Isómero E
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Página | 56 Departamento de Química
Figura 34:Cromatograma correspondente a amostra pré – concentrada.
Figura 35: Cromatograma correspondente ao pico 1 recolhido da amostra pré concentrada com detecção a 270 nm.
Figura 36: Cromatograma correspondente ao pico 2 recolhido da amostra pré concentrada com detecção a 250 nm.
0 100 200 300 400 500 600 700Tempo (segundos)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Tempo (segundos)
0 100 200 300 400 500 600 700Tempo (segundos)
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Universidade de Aveiro Página | 57
Figura 37: Cromatograma correspondente a amostra pré concentrada.
Figura 38: Cromatograma correspondente ao pico 3 recolhido da amostra pré concentrada com detecção a 270 nm.
Figura 39: Cromatograma correspondente ao pico 4 recolhido da amostra pré concentrada com detecção a 270nm.
0 100 200 300 400 500 600 700
Tempo (segundos)
0 100 200 300 400 500 600 700Tempo (segundos)
0 100 200 300 400 500 600 700Tempo (segundos)
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Página | 58 Departamento de Química
Figura 40: Cromatograma correspondente a amostra pré concentrada.
Figura 41: Cromatograma correspondente ao isómero Z recolhido da amostra pré concentrada com detecção a 300 nm.
Figura 42: Cromatograma correspondente ao isómero E recolhido da amostra pré concentrada com detecção a 300 nm.
0 100 200 300 400 500 600 700
Tempo (segundos)
0 100 200 300 400 500 600 700Tempo (segundos)
0 100 200 300 400 500 600 700Tempo (segundos)
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Universidade de Aveiro Página | 59
Como se pode verificar pelas Figura 35, 36, 38, 39, 41 e 42 a separação dos compostos foi
bem sucedida, tendo-se conseguido obter soluções puras de cada um dos produtos de
degradação. Posteriormente à recolha dos produtos estes foram analisados por
espectrometria de massa. Nas Figuras 43, 44, 45 e 46 são apresentados os espectros de ESI-MS
no modo negativo, representativos de cada um dos quatro produtos de degradação do 4 –
MBC separados no HPLC-UV.
Os espectros de ESI-MS dos quatro produtos de degradação do 4 - MBC foram obtidos no
modo negativo e positivo. No entanto, no modo positivo não foi possível identificar qualquer
produto de degradação devido às características estruturais do 4 – MBC. No que se refere aos
isómeros E e Z do 4 – MBC não foi possível a sua identificação tal facto é devido à sua difícil
ionização.
Figura 43: Espectros de ESI-MS do produto 1.
200 400 600
m/z
0
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
285,1
325,1
398,7 662,6487,2 562,7265,0154,8
[M - H]
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Página | 60 Departamento de Química
Figura 44: Espectros de ESI-MS do produto 2.
200 300 400 500
m/z
0
20
40
60
80
100
Rela
tive A
bundance
402,9
404,9
406,9
308,9
328,9 546,9303,0 407,9214,8
200 400 600
m/z
0
20
40
60
80
100
Rela
tive A
bundance
285,1
653,3562,8325,2
462,8654,4
265,1 587,2199,0
Figura 45: Espectros de ESI-MS do produto 3.
[M - H]
[M - H]
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Universidade de Aveiro Página | 61
Figura 46: Espectros de ESI-MS do produto 4.
Os espectros ESI – MS no modo negativo representados nas Figuras 49, 50, 51 e 52
correspondentes aos quatro produtos de degradação revelam a presença de iões com
abundância relativa elevada, encontrando-se na Tabela seguinte os iões [M - H] de maiores
abundâncias relativas referentes aos quatros produtos de degradação. Como se pode verificar
pela análise dos espectros ESI – MS dos produtos 1 e 3 estes apresentam um ião com o mesmo
valor do m/z com a maior abundância relativa o que nos leva a concluir que estes apresentam
a mesma formula molecular, mas estruturas diferentes, uma vez que o produto 1 é detectado
primeiro que o produto 3 quando se faz a análise por HPLC – UV, o que significa que o produto
1 é mais polar que o produto 3.
Tabela 6: Iões [M - H]
de maiores abundâncias relativas referentes aos quatros produtos de degradação.
Produtos
ESI – MS
Iões [M - H] Identificação
Produto 1 285,1 4- MBC + (OH)2
Produto 2 402,9 4- MBC + (C7H2O4)
Produto 3 285,1 4- MBC + (-OOH)
Produto 4 653,4 4- MBC + (4- MBC +C10H10O)
200 400 600
m/z
0
20
40
60
80
100
Rela
tive A
bundance
653,4
654,5487,4447,3255,2 521,0
339,3 568,8154,9
[M - H]
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Página | 62 Departamento de Química
Após a análise dos espectros ESI – MS vai ser efectuada a caracterização estrutural dos
produtos de degradação por espectrometria de massa tandem vão ser analisados os espectros
ESI – MS/MS de modo a verificar a fragmentação dos produtos, bem como a sua identificação.
4.1. CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DOS PRODUTOS DE
DEGRADAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE MASSA TANDEM
4.1.1. PRODUTO 1
Como referenciado anteriormente foi efectuado o estudo por espectrometria de
massa tandem. Na Figura 47 encontra-se o espectro de ESI – MS/MS correspondente ao ião
m/z 285, ou seja ao ião com maior abundância relativa presente na amostra do produto 1.
Através da fragmentação do ião m/z 285 pode-se verificar que o ião que se forma com maior
abundância relativa é o ião de m/z 267, formado por perda de água (-H2O, -18 Da). Neste
espectro observam-se ainda os iões de m/z 147, formado a partir do ião m/z 285 por perda de
C9H140. O ião m/z 249 forma-se por perda de duas moléculas de água. Por seu lado o ião m/z
239 ocorre por perda do carbonilo, o ião m/z 225 por perda de C3H5. Por último o ião m/z 211
forma-se por fragmentação do ião m/z 267 por perda de C4H8. Na Figura 48 encontra-se o
esquema das possíveis fragmentações seguidas pelo ião m/z 285 formado por oxidação do 4 –
MBC (m/z 253) após degradação.
Figura 47: Espectros de ESI-MS/MS do ião m/z 285.
100 150 200 250 300
m/z
0
20
40
60
80
100
Rela
tive A
bundance
267,0
249,0
210,9
146,8
106,8 196,9158,9 285,1
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Universidade de Aveiro Página | 63
Figura 48: Esquema das possíveis vias de fragmentação produto 1 resultante da degradação do 4 – MBC.
- H2O
+ (OH) 2
- H2O
- C3H5 - CO - C4H8
- C9H14O
m/z= 253
m/z= 285
m/z= 147 m/z= 267
m/z= 225 m/z= 239 m/z= 249 m/z= 211
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Página | 64 Departamento de Química
CH3CH3
CH3
OH
-
CH
OH
OH
-
CH3CH3
CH3
O
-
CH3
O
OH
-
m/z=225 m/z=211
m/z=147
m/z=239
m/z=253
CH3
CH3CH3
CH3
O
-
CH3CH3
CH3
O
OH
OH
-
m/z=249
m/z=285
CH3CH3
CH3
O
OH
-
m/z=267
+(OH)2
- H2O
- H2O
- CO - C3H8
- C9H14O
- C4H8
Figura 49: Possíveis vias de fragmentação do produto 1
O
OH
_
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Universidade de Aveiro Página | 65
4.1.2. PRODUTO 2
O produto 2 foi o segundo a ser detectado na análise por HPLC- UV, o que leva a
concluir que é menos polar que o produto 1.
Na Figura 50 encontra-se o espectro de ESI – MS/MS correspondente ao ião m/z 403,
ou seja ao ião com maior abundância relativa presente na amostra do produto 2. Através da
fragmentação do ião m/z 403 pode-se verificar que o ião fragmento com maior abundância
relativa é o ião de m/z 309, sendo formado por perda C7H10. Na Figura 51 encontra-se
representado o espectro ESI – MS3 correspondente ao ião de m/z 309, que fragmenta para o
ião m/z 265, por perda de CO2. O ião com maior abundância relativa deste espectro de MS3 é o
ião de m/z de 215, sendo formado por fragmentação do ião m/z 309 por perda de CH2O5. Na
Figura 53 encontram-se apresentadas as possíveis vias de fragmentação do produto 2,
podendo-se verificar que o composto original sofrer oxidação após a degradação, e para
ocorrer a formação do produto 2 este sofre dimerização.
Figura 50: Espectros de ESI-MS/MS do ião m/z 403.
200 300 400
m/z
0
20
40
60
80
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
308,8
402,8214,7 358,6248,8180,8
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Página | 66 Departamento de Química
Figura 51: Espectros de ESI-MS3 do ião m/z 309.
100 150 200 250 300
m/z
0
20
40
60
80
100
Rela
tive A
bundance
214,8
308,8264,7112,7 170,7
Figura 52: Esquema das possíveis vias de fragmentação para a formação do produto 2 resultante da degradação do 4 – MBC.
- C7H10
+ C7H2O4
- CO2
- CH2O5
m/z= 253
m/z= 402
m/z= 309
m/z= 265 m/z= 215
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Página | 67 Departamento de Química
CH
_
Figura 53: Possíveis vias de fragmentação do produto 2.
CH3CH3
O
OOH
O
OH
-
O
OOH
O
OH
CH
_
OOH
O
CH
_
m/z=253
m/z=265
m/z=403
m/z=215
m/z=121
CH3
CH3CH3
CH3
O
_
m/z=309
- C7H10
- CO2
+ C7H2O4
- CH2O5
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Página | 68 Departamento de Química
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
m/z
0
20
40
60
80
100
Rela
tiv
e A
bundance
267,0
285,0
210,9146,8 249,0239,0225,0196,9106,7 184,9158,8 271,9173,0134,8
4.1.3. PRODUTO 3
Como referido anteriormente o espectro ESI – MS do produto 3 apresenta um ião de
m/z 285, com a maior abundância relativa, e curiosamente com o mesmo valor do m/z do ião
observado no espectro de ESI-MS do produto 1. Pela análise do espectro ESI – MS/MS
representado na Figura 54, do ião com maior abundância relativa do produto 3, ou seja, o ião
com m/z 285 verifica-se que a fragmentação seguida por este ião é semelhante à seguida pela
fragmentação do ião m/z 285 do produto 1. Através da fragmentação do ião m/z 285 pode-se
verificar que o ião que se forma com maior abundância relativa é o ião m/z 267, resultante da
perda de água. Por outro lado, o ião m/z 147 forma-se a partir do ião m/z 285 por perda de
uma molécula neutra de fórmula C9H140. Os restantes iões apresentados no espectro ESI –
MS/MS do ião m/z 285 formam-se a partir do ião m/z 265, no caso do ião m/z 249 por perda
de água, no caso do ião m/z 239 por perda do carbonilo, o ião m/z 225 por perda de C3H5. Por
último o ião m/z 211 forma-se a por perda de C4H8.
Na Figura 55 encontra-se representado as possíveis vias de fragmentação seguidas
pelo produto 3.
Figura 54: Espectro ESI – MS/MS do ião m/z 285.
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Universidade de Aveiro Página | 69
CH3
CH
OOH
-
CH3CH3
CH3
O
OH
_
CH3CH3
CH3
O
-
Figura 55: Possíveis vias de fragmentação do produto 3.
CH3CH3
CH3
OH
-
CH3
O
OH
-
CH3
CH3CH3
CH3
O
OOH
-
CH3
CH3CH3
CH3
O
_
m/z=253
m/z=285
m/z=225
m/z=211
m/z=239
m/z=249
m/z=147
m/z=267
-H2O
-CH3
-H2O
-CO
+(OOH)
- C9H14O
- C3H5
O
OH
_
m/z=211
- C4H8
4. Identificação dos produtos de fotodegradação
Página | 70 Departamento de Química
4.1.4. PRODUTO 4
No que se refere ao produto 4 pela análise do espectro ESI – MS foi possível verificar
que o ião com maior abundância relativa foi o ião m/z 653. No entanto, não foi possível obter
o espectro ESI MS/MS desse ião. No entanto apresentamos na Figura 56 uma possível
estrutura para o produto 4, apenas baseado no seu peso molecular, sendo necessárias análises
futuras para confirmar, ou não, a estrutura deste composto. Pela análise da Figura pode-se
verificar que o composto original 4 – MBC sofre dimerização no processo de degradação
levando assim à formação do produto 4.
CH3CH3
CH3
OCH3CH3
CH3
O
CH3CH3
CH3
O
Figura 56: Possível estrutura do produto 4.
5. CONCLUSÕES
5. Conclusões
Universidade de Aveiro Página | 73
O trabalho desenvolvido teve como principal objectivo o estudo do efeito de luz solar
simulada na fotodegradação do 4 – MBC, estudar a influência da presença de ácidos fúlvicos e
iões cloreto na degradação do 4 - MBC, bem como a identificar produtos de degradação,
inerentes da fotodegradação do 4 – MBC.
Este estudo permitiu concluir que ocorria a formação de produtos de degradação durante
o processo de irradiação com luz solar simulada, sendo possível detectar quatro produtos
resultantes da degradação do 4 – MBC em água. Este facto é de bastante relevo visto que não
existe nunhum estudo na literatura que relate a formação de produtos de degradação em
águas naturais. Através da análise por espectrometria de massa tandem foi possível propor
estruturas para os quatro produtos de degradação, concluindo-se que o primeiro produto
formado se refere a um hidroxilado, o segundo é formado por ligação do composto original (4
– MBC) a um fragmento do mesmo, assim como o produto 4, e por último o produto 3
corresponde a um composto peroxilado. O estudo da degradação em soluções com
concentração inicial de 4 – MBC muito mais baixa permitiu concluir que se formavam os
mesmos de produtos de degradação. No que se refere a degradação do 4 – MBC na presença
de ácidos fúlvicos e ácidos húmicos foi possível concluir que estes afectam a formação dos
produtos de degradação, tendo só sido detectado unicamente o produto 2. Na presença de
cloreto também se pode concluir que este afecta a formação dos produtos de degradação,
sendo detectado o produto 2 e o produto 3. Nenhum dos produtos referidos no presente
trabalho foi detectado no estudo de Sakkas et al. (2009), referente à degradação do 4 – MBC
catalisada por TiO2.
No que se refere à velocidade de degradação do 4 – MBC foi possível concluir que este
composto sofre uma isomerização muito rápida, após trinta minutos de irradiação. Após esse
tempo a concentração dos dois isómeros decresce lentamente ao longo do tempo de
irradiação. No que se refere aos ácidos fúlvicos não foi observado um efeito claro destes na
velocidade de degradação do 4 - MBC, mesmo utilizando proporções de ácidos fúlvicos: 4 –
MBC diferentes. Referente aos ácidos húmicos comerciais também não foi possível verificar
alterações na cinética de degradação do 4 – MBC.
Por último no estudo da degradação do 4 – MBC na presença de cloretos os resultados
sugerem que estes influenciam a cinética de degradação do 4- MBC, tornando a degradação
deste mais rápida.
6. REFERÊNCIAS
6. Referências
Página | 77 Departamento de Química
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