TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠKHOA SƯ PHẠM

THIẾT KẾ CÁC BÀI THÍ NGHIỆM CHO CHƯƠNG TRÌNH THỰC TẬP HÓA SINH

Luận văn tốt nghiệpNgành: HÓA HỌC

GV hướng dẫn:ThS.Thái Thị Tuyết Nhung Sinh viên thực hiện Thái Ngọc Triển Lớp: SP Hóa K31 Mã số SV: 2051762

Cần Thơ, 2009

LỜI CẢM ƠNThế kỷ 21, con người sẽ được chứng kiến sự phát triển vượt bậc của nền kinh tế tri

thức, mà nổi bật là xu thế quốc tế hóa nền kinh tế thế giới và hướng tới “xã hội thông tin”. Mà động lực để xã hội tiến bộ không ngừng là tri thức và sự phát triển của nó. Con người luôn tìm tòi, khám phá để tăng thêm sự hiểu biết về thế giới và xã hội. Chính vì thế mà nó đã làm cho nhiều tri thức khoa học mới ra đời và không ngừng nhân kho tàng tri thức con người lên gấp bội.

Tuy nhiên để làm công tác nghiên cứu khoa học, không phải ai cũng có thể làm được. Ngoài trình độ chuyên môn giỏi, người làm công tác nghiên cứu khoa học phải có lòng đam mê, có khả năng tư duy độc lập và đặc biệt là phải biết phương pháp nghiên cứu.

Trong thực tế nhìn chung các trường Đại Học ở Việt Nam cho thấy, nhiều sinh viên sau khi ra trường đã gặp rất nhiều khó khăn khi giải quyết các vấn đề liên quan đến thực tiễn. Bởi đa số họ chỉ tích lũy kiến thức suông, kỹ năng thực hành kém, năng lực hoạt động thực tiễn bị hạn chế, không đáp ứng đựơc những nhu cầu thực tế của xã hội.

Chính vì thế mà theo em thì luận văn tốt nghiệp là một học phần rất cần thiết và có ý nghĩa thiết thực đối với tất cả sinh viên. Bởi vì nó là một nghiên cứu khoa học đầu tiên, giúp sinh viên bước đầu làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học, khả năng tư duy sáng tạo, có khả năng nghiên cứu, ứng dụng các thành tựu khoa học về hoá học, cách khám phá, phát hiện và trình bày một vấn đề hoá học phục vụ đúng chuyên ngành của mình. Thông qua đó đã rèn luyện cho chúng em khả năng tư duy độc lập, kích thích tính chủ động sáng tạo cũng như cách thức làm việc khoa học, giúp chúng em tự khám phá vấn đề và tích lũy cho mình vốn kiến thức chuyên môn sâu sắc. Đồng thời, để hoàn thành được đề tài này em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình, và học tập được rất nhiều kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm quý báu từ các thầy cô hướng dẫn.

Em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: Cô THÁI THỊ TUYẾT NHUNG – giáo viên hướng dẫn đã theo sát, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.

Thầy NGUYỄN VĂN HÙNG- tổ trưởng tổ hữu cơ đã đóng góp ý kiến và tận tình chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Thầy NGÔ QUỐC LUÂN, thầy NGUYỄN MỘNG HOÀNG đã đóng góp ý kiến và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài.

Cô LÊ THỊ LỘC cán bộ phụ trách phòng thí nghiệm hữu cơ đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Thầy BÙI PHƯƠNG THANH HUẤN- cố vấn học tập, cùng tất cả quý thầy cô Bộ Môn Hóa đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn này.

Ngoài ra em xin chân thành cảm ơn đến tất cả các bạn sinh viên lớp sư phạm hóa 31 đã nhiệt tình giúp đỡ, khuyến khích và động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

2

Cô Thai Thi Tuyêt Nhung-

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN CHÂM LUÂN VĂN

3

Thây Phan Thanh Chung - Luân văn gôm 121 trang ( tư trang 9-130), trinh bay kha công phu. Cac công thưc

hoa hoc, hinh ve ro rang, đep. - Tac gia đa hoan thanh tôt muc tiêu cua đê tai đa đê ra la lưa chon đươc 44 thi

nghiêm cho 5 loai bai thưc hanh. Cơ sơ ly thuyêt cua cac bai thưc hanh va cac ky thuât thi nghiêm cung an toan lao đông trong phong thi nghiêm đa đươc tac gia trinh bay công phu, phong phu. Cac thi nghiêm đươc trinh bay chi tiêt tư nguyên tăc đên thưc nghiêm, kem theo phân giai thich kêt qua thi nghiêm se giup cho ngươi thưc hanh hiêu ro hơn ban chât cua thi nghiêm.

- Tuy nhiên, co môt sô phân ly thuyêt đươc trich dân không cân sư dung cho cac bai thi nghiêm như: phân xac đinh nông đô chinh xac cac dung dich vi cac thi nghiêm thiêt kê la thi nghiêm đinh tinh. Co thê bo qua phân xac đinh cac chi sô cua chât beo vi đây la phân đinh lương. Phân rut kinh nghiêm vê sư thanh công hay thât bai đa đê ra trong muc tiêu chưa thê hiên ro trong phân nôi dung cua tưng thi nghiêm đươc đê nghi.

- Nhin chung, tac gia đa hoan thanh tôt muc tiêu cua đê tai đa đê ra. Cac thi nghiêm đa đươc trinh bay trong luân văn co thê la tư liêu tham khao đê lưa chon. Cac thi nghiêm phu hơp vơi điêu kiên thưc tê phong thi nghiêm đê xây dưng môt chương trinh thưc hanh Hoa Sinh co tinh kha thi.

Thây Nguyên Văn Hung- Luân văn đươc thưc hiên kha công phu, phân ly thuyêt va phân thưc hanh gôm 130

trang A4. Tac gia đa trinh bai kha ky phân ly thuyêt va thưc hanh cua môn hoa sinh hoc.- Đê tai co tinh kha thi, co thê ap dung cho chương trinh thưc tâp hoa sinh.

MỤC LỤCTrang

4

LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................1NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ................................................................................................2MỤC LỤC..............................................................................................................................4TÓM TẮT NỘI DUNG..........................................................................................................8PHẦN MỞ ĐẦU....................................................................................................................91.LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI......................................................................................................92. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI.................................................................................................93. GIẢ THIẾT CỦA ĐỀ TÀI.................................................................................................94. PHẠM VI NGHIÊN CỨU...............................................................................................105. PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI.......................................105.1. Phương pháp..................................................................................................................105.1.1. Phương pháp nghiên cứu lí luận.................................................................................105.1.2. Phương pháp nghiên cứu thực tiễn.............................................................................105.2. Phương pháp thực hiện đề tài........................................................................................106. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI.................................................................................107. THUẬN LỢI VÀ KHÓ KHĂN TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI.............117.1. Thuận lợi.......................................................................................................................117.2. Khó khăn.......................................................................................................................11PHẦN NỘI DUNG..............................................................................................................111. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐỀ TÀI................................................................................111.1. Một số yêu cầu chung trong thực tập hóa sinh..............................................................111.1.1. An toàn trong phòng thí nghiệm.................................................................................111.1.1.1. Mục tiêu..................................................................................................................111.1.1.2. Mở đầu....................................................................................................................111.1.1.3. Nhận thức về an toàn đối với những người làm thí nghiệm....................................121.1.1.4. An toàn về sử dụng thiết bị.....................................................................................121.1.1.5. An toàn về sinh học(Tránh nhiễm khuẩn trong phòng thí nghiệm).........................131.1.1.6. An toàn về sử dụng hóa chất...................................................................................141.1.1.7. An toàn về phòng chống cháy nổ............................................................................161.1.1.8. Kết luận...................................................................................................................171.1.2. Cách sử dụng và bảo quản dụng cụ trong phòng thí nghiệm.....................................181.1.2.1. Mục tiêu..................................................................................................................181.1.2.2. Nội dung..................................................................................................................181.1.2.3. Dụng cụ đo lường....................................................................................................181.1.2.4. Dụng cụ không thể đo lường...................................................................................191.1.2.5. Bảo quản dụng cụ thủy tinh.....................................................................................201.1.3. Các đơn vị và hệ thống đo lường trong hóa sinh........................................................201.1.3.1. Các đơn vị thường dùng..........................................................................................211.1.3.2. Chuyển đổi giữa các đơn vị cũ sang đơn vị SI và ngược lại...................................221.1.3.3. Lý do sử dụng đơn vị SI..........................................................................................221.1.4. Phương pháp cân........................................................................................................221.1.4.1. Tiêu chuẩn cân tốt và một số loại cân thông thường...............................................221.1.4.2. Các phương pháp cân..............................................................................................221.1.4.3. Bảo quản cân...........................................................................................................231.2. Thuốc thử trong phòng thí nghiệm................................................................................231.2.1. Hóa chất và đơn vị đo lường......................................................................................231.2.2. Dung dịch và cách biểu thị nồng độ dung dịch..........................................................231.2.2.1. Dung dịch phần trăm...............................................................................................23

5

1.2.2.2. Nồng độ phân tử g/l.................................................................................................241.2.2.3. Nồng độ phân tử gam/Kg dung môi........................................................................241.2.2.4. Nồng độ đương lượng.............................................................................................241.2.3. Cách pha dung dịch phần trăm...................................................................................241.2.4. Cách chuyển đổi dung dịch phần trăm sang dung dịch có nồng độ phân tử gam hay nồng độ đương lượng...........................................................................................................271.2.5. Một số dung dịch chuẩn độ........................................................................................281.2.5.1. Những điểm cần chú ý.............................................................................................281.2.5.2. Dung dịch acid sulfuric nguyên chuẩn(49 gam H2SO4 trong một lít).....................281.2.5.3. Dung dịch acid sulfuric 0,1N..................................................................................301.2.5.4. Dung dịch acid clohiđric nguyên chuẩn..................................................................301.2.5.5. Dung dịch NaOH nguyên chuẩn(40 gam NaOH trong một lít)...............................301.2.5.6. Dung dịch kali pemanganat 0,1N(3,16 gam Kali pemanganat trong một lít)..........311.2.5.7. Dung dịch natri hyposulfite 0,1N(24,8 gam Na2S2O3.5H2O trong một lít)..............331.2.5.8. Dung dịch Iod(12,7 gam trong 1 lít)........................................................................341.2.5.9. Dung dịch hydroperoxide(H2O2).............................................................................341.2.5.10. Dung dịch đệm......................................................................................................351.2.5.11. Dung dịch đệm kalidihydrophosphat và natrihydrophosphat(4,94<PH<9,18)......351.2.5.12. Dung dịch đệm acid acetic và natri acetat(3,6<PH<5,6).......................................361.2.5.13. Một số chỉ thị màu thông thường..........................................................................361.3. Lý thuyết sắc ký bản mỏng...........................................................................................371.3.1. Kiến thức tổng quát....................................................................................................371.3.1.1. Các chất hấp thu dùng trong sắc ký lớp mỏng........................................................381.3.1.2. Dung môi giải ly......................................................................................................381.3.2. Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng...........................................................................391.3.2.1. Chuẩn bị vi quản.....................................................................................................391.3.2.2. Chấm mẫu lên tấm bản mỏng..................................................................................391.3.2.3. Giải ly bản mỏng.....................................................................................................411.3.3. Hiện hình các vết sau khi giải ly bằng phương pháp hóa học....................................411.3.4. Phun xịt dung dịch thuốc thử lên bản mỏng và xử lý kết quả....................................422. CƠ SỞ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI.................................................................................432.1. Điều kiện phòng thí nghiệm và thực trạng sinh viên.....................................................432.2. Mục tiêu của các bài thí nghiệm định tính hóa sinh......................................................432.3. Chuẩn bị thí nghiệm......................................................................................................442.4. Tiến hành thí nghiệm.....................................................................................................442.5. Theo dõi tiến trình thí nghiệm.......................................................................................442.5.1. Theo dõi tiến trình thí nghiệm....................................................................................442.5.2. Rút ra kết luận và giải thích.......................................................................................443. CÁC ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU TRONG ĐỀ TÀI....................................................443.1. Bài 1: Glucid.................................................................................................................443.1.1. Tính chất của glucid...................................................................................................443.1.1.1. Định nghĩa...............................................................................................................443.1.1.2. Monosaccharides.....................................................................................................453.1.1.3. Oligosaccharides.....................................................................................................513.1.1.4. Polisaccharides........................................................................................................523.1.2. Thực hành thí nghiệm................................................................................................603.1.2.1. Phản ứng oxi hóa khử..............................................................................................603.1.2.2. Phản ứng màu..........................................................................................................62

6

3.1.2.3. Phản ứng thủy phân.................................................................................................643.2. Bài 2: Amino acid và Protein........................................................................................653.2.1. Tính chất.....................................................................................................................653.2.1.1. Định nghĩa...............................................................................................................653.2.1.2. Cấu tạo của phân tử protein.....................................................................................663.2.2. Thực hành thí nghiệm................................................................................................703.2.2.1. Phản ứng Ninhidrine...............................................................................................703.2.2.2. Phản ứng Xantoproteid............................................................................................713.2.2.3. Phản ứng Pholia......................................................................................................723.2.2.4. Phản ứng Pauli........................................................................................................733.2.2.5. Phản ứng với thuốc thử Isatine................................................................................733.2.2.6. Phản ứng Sacaguchi................................................................................................743.2.2.7. Phản ứng Biurea......................................................................................................743.2.2.8. Sắc ký lớp mỏng định tính hỗn hợp amino acid......................................................753.3. Bài 3: Lipid...................................................................................................................773.3.1. Tính chất ....................................................................................................................773.3.1.1. Định nghĩa...............................................................................................................773.3.1.2. Phân loại..................................................................................................................773.3.1.3. Lipid đơn giản.........................................................................................................793.3.1.4. Lipid phức tạp.........................................................................................................843.3.1.5. Vai trò sinh học của lipid đối với cơ thể.................................................................863.3.2. Thực hành thí nghiệm................................................................................................863.3.2.1. Tính hòa tan của lipid..............................................................................................863.3.2.2. Ly trích Lecithine....................................................................................................873.3.2.3. Phản ứng tạo thành nhũ tương.................................................................................873.3.2.4. Thủy phân lipid.......................................................................................................883.3.2.5. Phản ứng màu của dầu mỡ......................................................................................883.3.2.6. Xác định các chỉ số của dầu mỡ..............................................................................893.4. Bài 4: Vitamine.............................................................................................................923.4.1. Tính chất.....................................................................................................................923.4.1.1. Khái niệm chung.....................................................................................................923.4.1.2. Cấu tạo hóa học, vai trò, chức năng sinh học, nhu cầu và nguồn cung cấp của các vitamine hòa tan trong chất béo...........................................................................................923.4.1.3. Cấu tạo hóa học, vai trò, chức năng sinh học, nhu cầu và nguồn cung cấp của các vitamine hòa tan trong nước.................................................................................................973.4.1.4. Vitamine trong lĩnh vực công nghệ sinh học.........................................................1013.4.2. Thực hành thí nghiệm...............................................................................................1013.4.2.1. Định tính vitamine B1............................................................................................1013.4.2.2. Định tính vitamine B1 với thuốc thử diazo............................................................1023.4.2.3. Phản ứng khử của vitamine B2(riboflavine)..........................................................1023.4.2.4. Phản ứng của vitamine PP(B5-Acid Nicotinic nicotinamide)................................1033.4.2.5. Phản ứng định tính của vitamine B6(Piridoxine)...................................................1043.4.2.6. Phản ứng của vitamine C(Acid Ascorbic).............................................................1043.4.2.7. Phản ứng định tính vitamine A(Retinol)...............................................................1053.4.2.8. Phản ứng của vitamine D(Calcipherol).................................................................1053.4.2.9. Phản ứng của vitamine E(Tocopherol)..................................................................1053.5. Bài 5: Enzyme.............................................................................................................1063.5.1. Tính chất...................................................................................................................106

7

3.5.1.1. Khái niệm về enzyme............................................................................................1063.5.1.2. Tên gọi và phân loại enzyme.................................................................................1063.5.1.3. Bản chất và đặc điểm của enzyme.........................................................................1073.5.1.4. Cấu tạo hóa học của enzyme.................................................................................1073.5.1.5. Tính đặc hiệu của enzyme.....................................................................................1083.5.1.6. Cơ chế xúc tác của enzyme...................................................................................1093.5.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme......................................1103.5.1.8. Ứng dụng của enzyme...........................................................................................1123.5.2. Thực hành thí nghiệm...............................................................................................1133.5.2.1. Định tính succinat hidrogenase.............................................................................1133.5.2.2. Định tính Lipa.......................................................................................................1143.5.2.3. So sánh xúc tác vô cơ và xúc tác enzyme trong phản ứng thủy phân tinh bột.....1153.5.2.4. Tính đặc hiệu của enzyme.....................................................................................1163.5.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của amylase..............................................1163.5.2.6. Ảnh hưởng của PH đến hoạt tính của enzyme......................................................1173.6. Bài 6: Acid Nucleic.....................................................................................................1173.6.1. Tính chất ..................................................................................................................1173.6.1.1. Cấu tạo hóa học của acid Nucleic.........................................................................1183.6.1.2. Cấu trúc, tính chất hóa học của acid nucleic.........................................................1203.6.1.3. Acid Nucleic với công nghệ sinh học....................................................................1243.6.2. Thực hành thí nghiệm...............................................................................................1243.6.2.1. Tính hòa tan...........................................................................................................1243.6.2.2. Các phản ứng màu.................................................................................................1263.6.2.3. Phản ứng thủy phân..............................................................................................127 KẾT LUẬN........................................................................................................................1291. KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC CỦA ĐỀ TÀI.........................................................................1292. Ý NGHĨA THỰC TIỄN.................................................................................................1293. NHỮNG HẠN CHẾ VÀ KHÓ KHĂN CỦA ĐỀ TÀI..................................................129TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................130

TÓM TẮT NỘI DUNG

8

Thực tập Hoá Sinh là một học phần không thể thiếu trong khung chương trình đào tạo dành cho sinh viên sư phạm hóa. Đây là một học phần tương đối khó đối với sinh viên. Cho nên nó đòi hỏi sinh viên phải nắm vững tính chất, đặc điểm và các phản ứng đặc trưng của từng chất. Ngoài ra cùng với sự thay đổi phương pháp dạy học thì việc hoàn chỉnh nội dung bài giảng, bổ sung những kiến thức mới có ý nghĩa thiết thực là một yêu cầu tất yếu. Sinh viên phải nắm được các nguyên tắc trong phòng thí nghiệm, độ an toàn với các chất độc hại, kỹ năng thực hành, cách pha chế hóa chất, kỹ thuật tiến hành phản ứng hóa học. Ngoài ra, sinh viên cần phải rèn luyện tác phong và phương pháp tiến hành thực nghiệm, để thông qua các thí nghiệm mà hiểu kỹ hơn tính chất của các chất. Vì vậy để giúp sinh viên có được những kỹ năng thực hành nhất định và hiểu rõ lý thuyết của các hợp chất hóa sinh đã được học, đề tài “Thiết kế các bài thí nghiệm cho chương trình thực tập hoá sinh” qua 6 bài thí nghiệm định tính với nội dung phong phú hơn nhằm đáp ứng các mục tiêu trên.

Bài 1: GlucidBài 2: Amino acid và ProteinBài 3: LipidBài 4: VitamineBài 5: EnzymeBài 6: Acid Nucleic

Đề tài đã được nghiên cứu, tìm hiểu, tổng hợp các vấn đề lý thuyết có liên quan như sau:- Một số lý thuyết liên quan về sắc ký bản mỏng.- Lý thuyết phân tích định tính.-Thuốc thử hữu cơ.- Lý thuyết hóa sinh.- Cách pha chế hóa chất.

Đề tài thiết kế 6 bài thí nghiệm định tính với bốn phần nội dung chính:- Trình bày cách pha chế các hóa chất, thuốc thử có trong từng bài thí nghiệm.- Tính chất và các phản ứng đặc trưng của mỗi loại hợp chất.- Các thí nghiệm định tính.- Nhận xét và giải thích kết quả. Mỗi bài thí nghiệm được nghiên cứu trên nhiều phản ứng. Mỗi phản ứng đựơc tiến

hành nhiều lần và chọn ra những thí nghiệm có hiện tượng rõ nhất. Kết quả của quá trình thực nghiệm cho thấy có nhiều thí nghiệm cho hiện tượng rất tốt, đáp ứng được yêu cầu về thời gian, hóa chất và dụng cụ sẵn có trong phòng thí nghiệm. Vì thế những thí nghiệm này có thể được lựa chọn để áp dụng vào chương trình thực tập hóa sinh.

Tuy nhiên do hóa chất và các dụng cụ chưa đủ để đáp ứng trong việc thiết kế bài thực hành số 6. Nên đề tài chỉ hoàn thành 5 bài, còn bài 6 thì thiết kế trên lý thuyết, chưa có điều kiện để làm thực nghiệm.

PHẦN MỞ ĐẦU1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

9

Hiện nay với xu thế quốc tế hóa nền kinh tế thế giới thì giáo dục được xem là một mũi nhọn mà mỗi quốc gia cần phải đặc biệt quan tâm.Trong đó đổi mới phương pháp giáo dục là một vấn đề then chốt. Ở Việt Nam, các trường đại học cũng đã và đang khắc phục tình trạng học tập nặng nề, căng thẳng, quá nhấn mạnh đến hệ thống, yêu cầu quá cao về mặt lý thuyết suông mà coi nhẹ những kiến thức kỹ năng thực hành. Để khắc phục được vấn đề trên thì việc thiết kế lại khung chương trình và hoàn chỉnh các giáo trình bài giảng là một yêu cầu cấp thiết. Đặc biệt đối với môn hóa học, việc tăng cường các giờ thực hành tại phòng thí nghiệm là một vấn đề có ý nghĩa thiết thực. Bởi đặc thù của môn hóa là một môn khoa học thực nghiệm. Từ thực nghiệm mà hóa học đã làm nên những điều hết sức kỳ diệu. Chính những thí nghiệm là nguồn gốc dẫn đến lý thuyết đặc thù của ngành hóa. Thông qua các tiết thực hành giúp người học biết tổng hợp củng cố những kiến thức lý thuyết một cách sâu sắc và vững chắc hơn. Đồng thời có tác dụng phát triển tư duy năng động, sáng tạo, củng cố niềm tin khoa học, rèn luyện phẩm chất tốt của người lao động như thận trọng, ngăn nắp, trật tự, gọn gàng, phát triển năng lực phát hiện và giải quyết vấn đề trong học tập và trong cuộc sống, đáp ứng được yêu cầu phát triển nguồn nhân lực, phục vụ công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, phù hợp với nhu cầu thực tiễn của Việt Nam hiện nay.

Trường đại học Cần Thơ được xem là trung tâm văn hóa của khu vực đồng bằng sông Cửu Long. Do đó việc đổi mới giáo dục và thiết kế hoàn chỉnh lại các giáo trình bài giảng cho phù hợp với phương pháp dạy và học là một vấn đề cần thiết. Đó là lý do, chúng tôi chọn đề tài: “Thiết kế các bài thí nghiệm cho chương trình thực tập hóa sinh”.2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI

Hiện nay giáo trình thực tập hóa sinh còn đơn điệu, chưa hoàn chỉnh, số lượng bài và thí nghiệm còn ít. Do đó việc kiểm tra kỹ năng thực hành của sinh viên còn hạn chế, nhiều vấn đề chưa được giải thích rõ. Vì vậy giáo trình này cần được thiết kế lại cho hoàn chỉnh, tạo thêm sự phong phú cho các bài thực tâp nhưng vẫn đáp ứng được yêu cầu về hóa chất và dụng cụ sẵn có trong phòng thí nghiệm. Nội dung đề tài thiết kế bao gồm sáu bài thí nghiệm định tính:

Bài 1: GlucidBai 2: Amino Acid và ProteinBai 3: LipidBài 4: VitamineBai 5: EnzymeBài 6: Acid Nucleic

Với mục đích để phòng thí nghiệm có thể lựa chọn bổ sung cho giáo trình thực tập hóa sinh.3. GIẢ THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài thiết kế các bài thí nghiệm hóa sinh tuy không còn là một đề tài mới lạ. Nhưng với sự đa dạng, phong phú của các chất hữu cơ (trong lĩnh vực hóa sinh), mỗi chất có rất nhiều phản ứng với các thuốc thử và các chất khác. Vì vậy người nghiên cứu phải biết lựa chọn các phản ứng đặc trưng có ý nghĩa thiết thực và phù hợp với điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm. Khi thực hiện các phản ứng phải giải thích và trình bài các hiện tượng quan sát được. Đặc biệt là nêu được cách tiến hành thí nghiệm và pha chế hóa chất, thuốc thử.

Ngoài ra, để đề tài có giá trị thực tiễn đáp ứng nhu cầu cho việc thực tập của sinh viên sư phạm hóa. Mỗi thí nghiệm được tiến hành rất nhiều lần, cùng với kỹ năng thực hành để hiểu rõ nguyên nhân thành công và thất bại của thí nghiệm. Sau đó chọn ra những thí nghiệm có hiện tượng rõ nhất.

10

4. PHẠM VI NGHIÊN CỨUHóa sinh là một học phần khó, phức tạp, các hợp chất của nó rất phong phú và liên

quan đến nhiều môn học khác. Do thời gian thực hiện đề tài tương đối hẹp từ tháng 10/2008 đến tháng 05/2009, nên chỉ có thể nghiên cứu trên một số chất điển hình nhất định, cụ thể là sáu bài thực hành nêu trên. Ngoài ra do điều kiện nghiên cứu còn hạn chế, nên đề tài chỉ đề cập đến những phần có liên quan thiết thực dành cho sinh viên chuyên ngành sư phạm hóa. Mặt khác, đây là đề tài hoàn chỉnh cho các bài thực tập hóa sinh nên chủ yếu đề cập đến các thao tác, kỹ năng trong phòng thí nghiệm. Cung cấp những kiến thức về tính chất và các phản ứng định tính của một số hợp chất hóa sinh, giúp sinh viên hiểu kỹ lý thuyết hơn thông qua các phản ứng đó.5. PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI5.1. Phương pháp5.1.1. Phương pháp nghiên cứu lí luận

Công trình nghiên cứu khoa học đầu tiên của sinh viên là luận văn tốt nghiệp. Vì thế đề tài được thực hiện chủ yếu dựa trên trên cơ sở vận dụng vốn kiến thức hạn hẹp mà em đã tích lũy được qua bốn năm đại học cùng với sự hướng dẫn nhiệt tình của quý thầy cô. Trong đó phương pháp chủ yếu là sưu tầm và tham khảo các tài liệu có liên quan về lý thuyết và thực hành hóa sinh.5.1.2. Phương pháp nghiên cứu thực tiễn

Đây là một đề tài có tính chất thực nghiệm, để hoàn thành đề tài này em đã vận dụng hai phương pháp chủ yếu sau: Phương pháp tổng kết kinh nghiệm:

+ Chọn đề tài+ Sưu tầm tài liệu có liên quan+ Xây dựng mô hình lý thuyết+ Phân tích hệ thống rút ra bài học kinh nghiệm+ Viết bài

Phương pháp thực nghiệm Chuẩn bị thí nghiệm

+ Tổng hợp lý thuyết và chuẩn bị phương tiện dụng cụ thí nghiệm.+ Tra cứu số liệu cần thiết.+ Dự đoán các vấn đề có thể xảy ra trong quá trình thí nghiệm.

Tiến hành thí nghiệm + Theo dõi tiến trình thí nghiệm. + Ghi nhận kết quả.+ Giải thích kết quả.+ Nhận xét, đánh giá kết quả thực nghiệm và viết bài.

5.2. Phương tiện thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm hóa hữu cơ- Bộ Môn Hóa-Khoa Sư

Phạm-Trường Đại Học Cần Thơ.Phương tiện thực hiện đề tài là các dụng cụ và hóa chất sẵn có của phòng thí nghiệm

hóa hữu cơ.6. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Đề tài được thực hiện từ tháng 9/2008 đến tháng 05/2009 qua các giai đoạn:- Giai đoạn chuẩn bị và tìm tài liệu:

+ Nhận đề tài - lập đề cương tổng quát: tháng 9/2008.+ Viết đề cương chi tiết: tháng 10/2008.+ Tìm và thu thập tài liệu có liên quan: tháng 10 và 11/2008.

11

- Giai đoạn thực nghiệm:+ Tiến hành các thí nghiệm trên cơ sở tổng kết kinh nghiệm từ các lý thuyết có sẵn.

Bổ sung và hoàn chỉnh những phần còn thiếu. Ghi nhận kết quả và giải thích các hiện tượng quan sát được: từ tháng 11/2008 đến tháng 2/2009.

+ Nhận xét, so sánh các thí nghiệm để chọn ra kết quả tốt nhất: tháng 2/2009.- Giai đoạn viết nội dung đề tài:

+ Kết luận và tiến hành viết báo cáo: từ cuối tháng 2/2009 đến tháng 4/2009.- Giai đoạn hoàn thành đề tài:

+ Giáo viên hướng dẫn góp ý: tháng 4/2009.+ Điều chỉnh và hoàn tất bài luận văn: cuối tháng 4/2009.

7. THUẬN LỢI VÀ KHÓ KHĂN TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN 7.1. Thuận lợi

Đề tài được thực hiện với những thuận lợi sau: - Sự quan tâm chỉ bảo của giáo viên hướng dẫn, sự giúp đỡ của Cô Lê Thị Lộc cán bộ

nhân viên phòng hữu cơ.- Sự chỉ bảo nhiệt tình của quý thầy cô trong bộ môn. - Sự nỗ lực, chịu khó, ham học hỏi của chính bản thân.

7.2. Khó khănBên cạnh những mặt thuận lợi thì khó khăn mà em gặp phải là thời gian thực hiện

đề tài còn hạn chế, hóa chất và dụng cụ chưa đủ. Nên việc nghiên cứu chưa thật sự phong phú chỉ giới hạn ở một số hợp chất điển hình.

PHẦN NỘI DUNG

1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐỀ TÀI.1.1 Một số yêu cầu chung trong thực tập hóa sinh1.1.1. An toàn trong phòng thí nghiệm1.1.1.1. Mục tiêu

- Giúp mỗi người làm việc trong phòng thí nghiệm nhận thức được trách nhiệm của mình trong việc tạo nên phòng thí nghiệm an toàn.

- Giúp mỗi người trong phòng thí nghiệm hiểu được an toàn đối với trang thiết bị, hóa chất độc và đối với các chất cháy, nổ.

- Từ đó giúp những người làm việc trong phòng thí nghiệm biết cách tổ chức, sắp xếp hóa chất thiết bị để đề phòng và xử lý các sự cố xảy ra.

1.1.1.2. Mở đầu

Do tính chất công việc, những người làm việc trong phòng thí nghiệm luôn phải tiếp xúc với các yếu tố độc hại như hơi độc, khí nén, chất độc dễ cháy, chất ăn mòn, chất độc hay chất nhiễm khuẩn, chấn thương cơ học…

Các sự cố xảy ra trong phòng thí nghiệm thường do hai nguyên nhân sau:

- Môi trường làm việc không an toàn.

- Các nhân viên có thao tác làm việc không đúng quy định về an toàn.

Hiện nay những người làm việc trong phòng thí nghiệm còn chưa được đầy đủ. Những hiểu biết về an toàn trong phòng thí nghiệm sẽ biết được những người làm thí nghiệm các yếu tố nguy hại trong phòng thí nghiệm, từ đó có ý thức phòng tránh và biết

12

cách xử lý các sự cố xảy ra, cũng như biết cách tổ chức, quản lý và sắp xếp phòng thí nghiệm bảo đảm an toàn.

1.1.1.3. Nhận thức về an toàn đối với những người làm thí nghiệm

Người phụ trách và người làm thí nghiệm đều phải chịu trách nhiệm về sự an toàn của phòng thí nghiệm. Người phụ trách có trách nhiệm chủ yếu về sự an toàn. Sự quản lý an toàn phòng thí nghiệm được bắt đầu với việc viết bản nội qui an toàn phòng thí nghiệm.

Trách nhiệm của người phụ trách

- Thiết lập các phương pháp làm việc và các biện pháp an toàn trong phòng thí nghiệm.

- Giám sát và hướng dẫn những người làm thí nghiệm thực hiện công việc.

- Đưa ra thông tin về an toàn thí nghiệm, huấn luyện, trang bị bảo hiểm cá nhân và giám sát về mặt về y tế đối với các kỹ thuật viên.

- Cung cấp đầy đủ các trang thiết bị và tạo điều kiện thuận lợi để các kỹ thuật viên thực thi nhiệm vụ.

- Người phụ trách cũng có trách nhiệm bảo đảm an toàn cho bản thân và an toàn cho các cộng sự.

- Sự làm việc hiệu quả, chuẩn xác và an toàn của kỹ thuật viên là yếu tố quyết định để đạt được một nơi làm việc không có sự cố và tai nạn.

Trách nhiệm của người làm thí nghiệm

- Hiểu biết và tuân theo các phương pháp làm việc trong phòng thí nghiệm đã được thiết lập.

- Có trách nhiệm phục tùng giáo viên hướng dẫn, thân thiện với đồng sự, nghiêm túc và chuẩn xác trong công việc.

- Nhanh chóng thông báo các tình trạng không an toàn cho giáo viên hướng dẫn.

- Cam kết thực hiện công việc một cách an toàn và sử dụng các thiết bị bảo vệ cá nhân.

1.1.1.4. An toàn về sử dụng thiết bị

Các thiết bị phải được chú ý đặc biệt về an toàn khi sử dụng trong phòng thí nghiệm. Người phụ trách phải đề ra các nội quy cho việc sử dụng an toàn các thiết bị, đồng thời yêu cầu người sử dụng phải tuân thủ các nội quy để sử dụng một cách an toàn các thiết bị đó.

Tất cả các phòng thí nghiệm phải có các bản chỉ dẫn nơi có vòi nước cứu hỏa, nơi để những dụng cụ chống cháy, các nhân viên phòng thí nghiệm phải tập luyện định kỳ và kiểm tra thao tác chính xác đối với thiết bị cứu hỏa.

Thiết bị bảo quản hóa chất

- Thiết bị an toàn: Dùng để bảo quản các chất hóa học và các khí nén.

- Các bình an toàn: Dùng để vận chuyển các acid, kiềm hoặc các dung môi khác là các bình có 500 ml và các can dùng để bảo quản, phân phối hoặc sắp xếp các chất có khả năng cháy là các can có thể tích lớn hơn 12,7 lít.

- Các buồng an toàn: Sử dụng để bảo quản các chất lỏng dễ cháy.

13

- Tủ lạnh: Sử dụng để bảo quản các hóa chất dễ cháy.

- Chỉ một số hóa chất sử dụng cần thiết hằng ngày mới được để ngoài thiết bị bảo quản.

- Phải sử dụng các giá đỡ hoặc các bàn kẹp để vận chuyển các bình khí nén và xe đẩy để vận chuyển các thùng lớn.

Các trang thiết bị bảo vệ cá nhân

Các phần cơ thể hay bị tổn thương khi làm việc trong phòng thí nghiệm là mắt, da, đường hô hấp và đường tiêu hóa. Vì vậy, việc sử dụng các trang thiết bị bảo vệ cá nhân là rất cần thiết. Các trang thiết bị gồm các vật dụng sau:

- Kính mắt, kính bảo hộ, tấm che mặt hoặc các tạp dề là những trang thiết bị giúp bảo vệ mắt và mặt người làm thí nghiệm khỏi bị các hóa chất bắn ra. Các kính áp tròng không có tác dụng bảo vệ mắt nên không nên đeo khi làm việc ở phòng thí nghiệm. Bất kỳ dung dịch nào bắn vào mắt đều phải rửa mắt ngay.

- Găng tay và ống tay bằng cao su cần được khi thao tác với các hóa chất ăn da. Các găng tay nhựa latex cần được sử dụng hằng ngày trong phòng thí nghiệm, tuy nhiên, các găng tay bằng polyvinyl có thể được sử dụng thay thế đối với những người bị dị ứng với nhựa latex.

- Các áo choàng trong phòng thí nghiệm (áo blouse) phải có đủ độ dài, đủ khuy và được chế tạo từ các vật liệu không thấm chất lỏng.

- Đi ủng đúng tiêu chuẩn, các giầy rọ, mũi giầy hở hoặc dép sAADNl đều có thể bị tác hại của chất độc trong phòng thí nghiệm.

- Khẩu trang được sử dụng trong một số quá trình làm việc trong phòng thí nghiệm. Khi sử dụng các chất độc hóa học hoặc các chất độc đặc biệt phải sử dụng khẩu trang đặc chủng phù hợp.

- Người phụ trách phải cung cấp các áo choàng, găng tay hoặc các trang bị bảo vệ khác cho tất cả mọi người làm việc bảo vệ trong phòng thí nghiệm có thể bị phơi nhiễm với các chất độc hóa học. Trách nhiệm của người phụ trách là bảo đảm phòng thí nghiệm sạch và duy trì việc sử dụng các trang thiết bị cá nhân của các nhân viên.

Tất cả các trang thiết bị của cá nhân phải được cởi bỏ và sắp xếp ngăn nắp trước khi ra khỏi phòng thí nghiệm.1.1.1.5. An toàn về sinh học (Tránh nhiễm khuẩn trong phòng thí nghiệm)

- Phải luôn đeo găng tay, mặc áo blouse trong phòng thí nghiệm. Không mặc áo blouse vào phòng ăn, phòng họp, ra đường hoặc về nhà.

- Không ăn, uống, hút thuốc lá trong phòng thí nghiệm.

- Không để bất kỳ thức ăn, đồ uống nào trong tử lạnh để hóa chất của phòng thí nghiệm.

- Luôn rửa tay bằng xà phòng sau khi làm thí nghiệm.

1.1.1.6. An toàn về sử dụng hóa chất Nhận biết các quy ước về nhãn mác

Các dấu hiệu để phân biệt các chất độc hại là điều quan trọng không chỉ để cảnh báo người làm thí nghiệm về các chất độc có hiệu lực mà còn để phân biệt các chất đặc biệt có thể gây nên tình trạng khẩn cấp như các chất cháy hoặc nổ. Người ta đã quy định các ký

14

hiệu màu sắc ở phía trên của nhãn để dễ phân biệt các loại chất độc hại, để chỉ có thể nhìn thoáng qua cũng có thể được chất đó thuộc loại gì.

Màu xanh da trời là ký hiệu của loại chất có hại cho sức khỏe: độc với hô hấp, tiêu hóa, có thể hấp thụ qua da, cần phải bảo quản ở chỗ chắc chắn.

Màu đỏ là ký hiệu của loại chất dễ cháy, cần phải bảo quản cách xa các chất có thể cháy.

Màu vàng là ký hiệu của chất dễ phản ứng và dễ oxy hóa: có thể phản ứng mạnh với không khí, nước hoặc hóa chất khác, cần bảo quản cách xa các chất dễ cháy hoặc có thể cháy. Niêm mạc phải bảo quản cách xa các loại chất được ký hiệu màu xanh, đỏ hay vàng nêu trên.

Màu xám là ký hiệu của các loại hóa chất ít độc: bảo quản như các chất hóa học thông thường.

Lưu trữ và sử dụng hóa chất

- Để tránh nhầm lẫn và các sự cố khi sử dụng hóa chất độc hại. Phải có hiểu biết về đặc tính hóa chất sẽ sử dụng. Điều này đặc biệt quan trọng đối với việc vận chuyển, pha chế các hóa chất vì một số có thể tạo ra các hóa chất độc hại, dễ cháy, dễ nổ. Ví dụ:

+ Acid acetic không pha với acid chromic, acid nitric (HNO3).

+ Carbon tetrachlorid không pha với Natri (Na).

+ Chất lỏng dễ cháy không pha với nước oxy già (H2O2), acid nitric (HNO3).

- Cần sắp xếp, bảo quản hóa chất theo số lượng và đặc tính hóa chất để tránh các sự cố.

- Các hóa chất thường dùng cần được sắp xếp riêng.

- Việc sắp xếp không nên chỉ dựa vào vần A, B, C,...mà còn cần được xếp theo đặc tính của chất. Các loại hóa chất sau cần được sắp xếp riêng rẽ.

+ Chất lỏng dễ cháy + Chất rắn dễ cháy

+ Acid vô cơ + Acid hữu cơ

+ Chất có thể cháy + Chất oxy hóa

+ Acid perchloric + Chất phản ứng với nước

+ Chất phản ứng với không khí

+ Chất phản ứng nhiệt cần phải bảo quản lạnh.

+ Chất không ổn định (chất dễ nổ).

Các chất dễ cháy và các chất có khả năng cháy

Các chất dễ cháy được sử dụng rất nhiều hằng ngày trong các phòng nghiên cứu hóa sinh là những chất rất nguy hiểm vì chúng dễ cháy và dễ gây nổ. Chúng được xếp đặc theo điểm bốc cháy (là nhiệt độ mà ở đó hơi của chúng có khả năng bốc lên để tạo thành một hỗn hợp dễ cháy với không khí).

- Chất lỏng dễ cháy có nhiệt độ bốc cháy < 37,8oC (100oF).

- Chất lỏng có khả năng cháy có điểm bốc cháy ở nhiệt độ ≥ 37,8oC (100oF).

Một số chất lỏng dễ cháy và có khả năng cháy thường được sử dụng là:

15

Aceton Isopropanol

Benzen Methanol

Ethanol Toluen

Heptan Xylen

Chú ý các chất dễ cháy còn gồm các loại chất khí và chất rắn như parafine.

Trước khi mở nút chai chứa các chất dễ cháy cần tránh xa ngọn lửa từ 2-3 m.

Không được đun bình chứa các chất dễ cháy trực tiếp trên ngọn lửa mà không phải đun cách thủy hoặc đun trên bếp điện kín.

Các chất ăn mòn

Bao gồm: các acid như: Acid acetic, acid sulfuric (H2SO4), acid nitric (HNO3), acid clohyđric (HCl), acid tricloacetic (TCA), acid orthophosphoric, acid percloric.

Các kiềm mạnh như: NaOH và KOH.

- Không được dùng pipet hút trực tiếp bằng miệng các chất ăn mòn (dùng pipet có quả bóp cao su hoặc pipet tự động).

- Việc đổ rót các dung dịch ăn mòn phải cẩn thận trọng, từ từ, làm thấp dưới tầm mắt và luôn đeo kính bảo vệ.

- Việc hòa tan các chất ăn mòn ở thể rắn, thể đặc, (ví dụ: Hòa tan NaOH vào nước hoặc hòa loãng các acid đặc) phải hết sức thận trọng vì đây là phản ứng tỏa nhiệt, có thể gây bỏng.

Chú ý: khi hòa loãng acid phải cho acid từ từ vào nước để lượng acid bao giờ cũng ít hơn nước. Không được đổ nước vào acid vì điều này sẽ gây tỏa nhiệt lớn, vỡ bình, bắn acid ra xung quanh và gây nguy hiểm.

Xử lý khi hút phải acid: Dùng NaHCO3 3% xúc miệng, sau đó xúc miệng bằng nước sạch nhiều lần.

Xử lý khi hút phải kiềm hoặc kiềm dính vào da: Xúc miệng hoặc rửa bằng acid acetic 1%, sau đó xúc miệng hoặc rửa bằng nước nhiều lần.

Các hóa chất độc

Những hóa chất độc là những hóa chất gây chết người hoặc gây bệnh nếu ăn phải, uống phải, ngửi phải hoặc tiếp xúc trực tiếp qua da, mắt,... Những chất độc phổ biến trong phòng thí nghiệm là:

Kali cyanur (KCN) Thiosemicarbazid

Hg(NO3)2 Cloroform

Natriazid Methanol

Natri nitroprusiat,...

Phải hết sức thận trọng khi thao tác hoặc tiếp xúc với các hóa chất độc.

Phải thực hiện nghiêm chỉnh việc sử dụng các trang thiết bị cá nhân phù hợp khi thao tác với các hóa chất độc.

1.1.1.7. An toàn về phòng chống cháy, nổ

16

Phân loại chất cháy, nổ

Dựa theo tính chất tự nhiên của sự cháy và các thiết bị chữa cháy, người ta chia nguyên liệu cháy ra thành 4 loại:

- Loại A: Chất liệu rắn thông thường là: Giấy, gỗ, nhựa, cao su, vải,…

- Loại B: Chất lỏng và khí dễ cháy như: Xăng, dầu, mỡ, sơn,..

- Loại C: Các thiết bị điện, động cơ, bộ phận ngắt điện,…

- Loại D: Kim loại dễ cháy, dễ phản ứng: Magnesi (Mg), Natri (Na), Kali (K),…

Cách xử trí cháy, nổ

Phải theo bản chất cháy mà chữa cho đúng cách, bởi vì nếu làm sai chất chữa cháy nhiều khi không dập tắt được cháy mà còn nguy hiểm hơn.

- Loại A: Đối với các chất liệu rắn thông thường như: Giấy, gỗ, nhựa, cao su, vải,…, khi các vật liệu này bị cháy có thể dập lửa bằng nước hoặc hóa chất khô.

- Loại B: Đối với các chất lỏng và khí dễ cháy như: Xăng, dầu, mỡ, sơn,…, khi các vật liệu này bị cháy có thể dập lửa bằng CO2 hoặc hóa chất khô.

- Loại C: Đối với các thiết bị điện, động cơ, bộ phận ngắt điện,… khi các vật liệu này bị cháy có thể dập lửa bằng CO2 hoặc hóa chất khô.

- Loại D: Đối với các kim loại dễ cháy như: Mg, Na, K,…, khi các vật liệu này bị cháy có thể dập lửa bằng cách phủ lên kim loại cháy bằng hóa chất dập lửa khô.

Đối với các thiết bị điện

Phòng thí nghiệm nào cũng sử dụng rất nhiều thiết bị điện, máy móc. Điện giật có thể trực tiếp gây chết người, sốc, bỏng điện có thể gây cháy, nổ. Vì vậy:

- Không đặt các thiết bị ở nơi ẩm thấp, ướt át.

- Phải hết sức cẩn thận khi sử dụng các thiết bị có điện thế cao.

- Các thiết bị điện phải có đường dây nối với đất.

- Không bao giờ vận hành thiết bị điện với bàn tay ướt.

- Phải kiểm tra các dây điện sờn, rách. Không làm việc với dây điện bị hở lõi đồng.

- Phải kiểm tra ngay khi thiết bị có tiếng kêu lạ.

- Phải biết chính xác chổ đặt cầu dao trong phòng thí nghiệm.

- Khi bị điện giật phải lập tức cắt cầu dao điện, cấp cứu người bị giật kịp thời và gửi ngay đến cơ sở cấp cứu gần nhất.

Phòng thí nghiệm phải được thiết kế có đủ các vòi nước chữa cháy sao cho tất cả các vị trí đều có thể có nước cứu hỏa, mỗi phòng thí nghiệm dều phải có bình chữa cháy CO2.

Đối với các khí nén

Các khí nén thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm như: O2, CO2, N2, acetylen, propan, butan… để làm thí nghiệm hoặc để đun nấu, có thể gây cháy, nổ, gây ngạt hoặc tổn thương cơ nặng. Một số yêu cầu đối với việc sử dụng khí nén này là:

- Phải biết rõ loại khí ta sẽ sử dụng.

17

- Các bình khí nén phải được đặt thẳng đứng.

- Các bình khí nén phải luôn được đóng kín.

- Không bao giờ được đặt các chất lỏng dễ cháy và các bình khí nén cùng một chỗ.

- Phải sử dụng bộ phận điều chỉnh (các van) đúng với loại khí được sử dụng.

- Không được tùy tiện thử điều chỉnh hoặc đóng, mở khí bằng bộ phận điều chỉnh khi không sử dụng khí đó.

- Không được tháo bỏ nắp bảo vệ của bình khí nén khí chưa sử dụng bình khí.

- Không được để đóng băng hoặc gắn chặt van bình khí.

- Phải sử dụng xe đẩy để vận chuyển các bình khí lớn.

- Phải luôn kiểm tra tình trạng an toàn của bình khí và phải định kỳ phải xem có sự rò rỉ khí hay không.

- Phải kiểm tra nhãn mác bình khí để biết về loại khí chứa trong bình.

- Bình hết khí phải được ghi chữ “bình rỗng” trên vỏ bình.

1.1.1.8. Kết luận

Để có thể bảo đảm an toàn trong phòng thí nghiệm, người làm thí nghiệm phải thực hiện những điều sau đây:

Tạo thói quen làm việc khoa học

Mặc áo blouse, đeo găng tay, đội mũ blouse (nữ nên quấn tóc gọn gàng).

- Không ăn, uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm.

- Không bao giờ dùng pipet hút trực tiếp bằng miệng mà phải dùng pipet tự động hoặc quả bóp cao su.

- Rửa tay thường xuyên khi xong thí nghiệm.

Giữ gìn ngăn nắp, sạch sẽ nơi làm việc

- Giữ nơi làm việc luôn sạch sẽ, ngăn nắp, không được để bừa bãi các dụng cụ đã sử dụng.

- Các hóa chất để đúng chỗ, dùng xong phải xếp lại gọn gàng ngay.

- Ghi nhãn thuốc thử, hóa chất và dung dịch rõ ràng.

- Ghi nhãn báo hiệu nguy hiểm khi sử dụng các hóa chất độc hại và có khu vực sử dụng riêng.

Thực hiện các thao tác kỹ thuật đúng

- Không được vận hành máy khi: không quen dùng, chưa hiểu biết và chưa được phép dùng.

- Đọc kỹ nhãn hiệu và bản hướng dẫn sử dụng kỹ trước khi sử dụng hóa chất, thiết bị. Phải hiểu rõ đặc điểm, tính năng các loại hóa chất, thiết bị trước khi sử dụng.

- Phải sử dụng các trang thiết bị an toàn cá nhân thích hợp khi làm việc với các hóa chất độc.

- Pha chế, rót, vận chuyển hóa chất hết sức cẩn thận.

- Hiểu quá trình cấp cứu và biết cách xử lý chuẩn xác khi có sự cố xảy ra.

18

1.1.2. Cách sử dụng và bảo quản dụng cụ trong phòng thí nghiệm

1.1.2.1. Mục tiêu

Biết sử dụng và bảo quản những dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm hóa sinh.

1.1.2.2. Nội dung

Những dụng cụ thường dùng trong phòng thí nghiệm hóa sinh có thể chia thành 2 nhóm dựa theo chất liệu: Những dụng cụ thủy tinh và những dụng cụ bằng plastic hoặc phân theo tính năng sử dụng: Những dụng cụ để đo lường và những dụng cụ không thể đo lường.

1.1.2.3. Dụng cụ đo lường

Để hạn chế sai số do những dụng cụ này gây ra khi dùng cần phải lưu ý:

- Những dụng cụ để đo lường phải thật sạch sẽ.

- Sử dụng ở điều kiện nhiệt độ nhất định, thường là ở nhiệt độ phòng.

- Không được đem đun nóng những dụng cụ này.

Pipet

Có 2 loại pipet: pipet thủy tinh và pipet tự động.

Pipet thủy tinh: Có 2 loại: pipet định mức và pipet chia độ.

Pipet định mức (pipet có bầu): trên thân có bầu và có ngấn dùng để lấy những thể tích cần độ chính xác cao. Dung tích của pipet ghi trên bầu, có nhiều loại: 2ml, 5ml, 10ml.

- Loại 1 ngấn: dung tích của pipet tính từ ngấn đến phía dưới của pipet.

- Loại 2 ngấn: dung tích của pipet tính từ ngấn trên đến ngấn dưới.

Pipet chia độ: có nhiều vạch trên thân để chia dung tích trong ống. Loại pipet này dùng để lấy thể tích nhỏ 1/5 ml, 1/10 ml. Độ chính xác không cao.

Pipet tự động

Có 2 loại: pipet cố định và pipet bán cố định.

Pipet cố định: dung tích của pipet ghi trên thân. Có nhiều loại: 20μL, 50μL, 100μL, 500μL, 1000μL.

Pipet bán cố định: là loại pipet có thể điều chỉnh thể tích dịch cần lấy theo ý muốn. Trên pipet có ghi dung tích tối thiểu và tối đa. Có nhiều loại pipet bán cố định.

Buret

Buret thường dùng có dung tích 10mL. Trên thân buret có vạch chia độ tới 1/10mL và có khóa. Buret dùng để chuẩn độ. Khi dùng để tránh sai số về thể tích nên cho chảy với tốc độ chậm. Sau khi dùng xong phải rửa sạch ngay, tránh bằng nước cất, lau khô và bôi mỡ vào khóa để tránh bị kẹt.

Ống đong

19

Ống đong có nhiều cỡ: 5mL, 10mL, 25mL, 50mL, 100mL, 200mL, dùng để đong những chất lỏng. Độ chính xác không cao. Thân ống có vạch chia độ. Thân ống đong càng lớn độ chính xác càng kém.

Cốc chia độ

Dùng để hòa tan các chất và đong các dung dịch với dung tích lớn và không cần độ chính xác cao. Cốc thường có chân, thân cốc có vạch chia độ. Phần miệng cốc rộng hơn phần đáy cốc. Cốc chia độ có nhiều loại: 100mL, 250mL, 500mL, 1000mL.

Bình định mức

Bình có cổ dài và nhỏ. Trên cổ có ngấn đánh dấu dung tích của bình. Phần đáy hình cầu có ghi dung tích của bình. Bình để pha dung dịch cần độ chính xác cao và các dung dịch bay hơi. Bình định mức có nhiều cỡ: 10mL, 50mL, 200mL, 500mL,1000mL.

1.1.2.4. Dụng cụ không thể đo lường

Dụng cụ bằng thủy tinh

Những bình thủy tinh với kích cỡ khác nhau được sản xuất để sử dụng trong phòng thí nghiệm. Những bình này có thể được định cỡ, có thể không. Sự định cỡ chỉ là ước lượng nên không dùng để xác định thể tích chính xác. Những bình này chủ yếu để đựng hoặc chuyển dung dịch từ bình chứa này sang bình chứa khác, gồm các dụng cụ sau:

Cốc có mỏ: Có hình trụ miệng rộng, trên đỉnh có mỏ. Thường dùng để chuyển chất lỏng sang bình khác.

Bình cầu: Đáy bình rộng, cổ hẹp. Loại bình này có dung tích lớn: 1 lít, 5 lít. Thường dùng để đun dung dich.

Bình nón: có hình thon, cổ hẹp. Thương dung đê thưc hiên phan ưng co lăc trôn.

Bộ chưng cất dùng để cất nước, cất khi thu hồi dung môi đã dùng hoặc để tinh chế dung môi cần độ tinh khiết.

Cấu tạo bộ chưng cất: bộ chưng cất gồm: một bình chưng cất có ống ngang, một ống sinh hàn, một bình hứng. Các bộ phận này được nối với nhau bằng nút lie tốt.

Bình chưng cất có dung tích 1 lít hoặc 5 lít. Bình có cổ dài để cất dung môi có độ sôi cao.

Ống sinh hàn: Độ dài ống phụ thuộc dung môi cất. Dung môi có độ sôi thấp như ete, ete dầu hỏa, cồn methylic dùng ống sinh hàn 500-600mm. Dung môi có độ sôi cao dùng ống sinh hàn ngắn hơn, khoảng 200mm.

Phương pháp chưng cất

- Chưng cất dưới áp suất thường: cất nước và tinh chế dung môi.

- Chưng cất phân đoạn dưới áp suất bình thường: để tách hỗn hợp nhiều dung môi.

- Chưng cất dưới áp suất thâp: thường dùng chiết suất một số chất.

Dụng cụ bằng plastic

Những dụng cụ bằng plastic dùng trong phòng thí nghiệm có ưu điểm so với dụng cụ thủy tinh: ít bị vỡ, không cắt và an toàn hơn vì có thể dùng một lần. Nhưng chúng cũng có một số nhược điểm như: dễ thấm với khí, dễ bị oxy hóa, bị thay đổi bởi pH và không khử trùng được. Vì vậy khi sử dụng cụ bằng plastic cần chú ý:

20

- Không sử dụng dụng cụ bằng plastic đối với những chất oxy hóa mạnh.

- Những dụng cụ này không để tiếp xúc trực tiếp với lửa hoặc kim loại nóng.

1.1.2.5. Bảo quản dụng cụ thủy tinh

Rửa dụng cụ thủy tinh

Những dụng cụ thủy tinh sau khi làm xong đều phải rửa sạch ngay. Dung dịch rửa có thể chuẩn bị: 47g natri phosphat (Na3PO4), 28g natri oleat. Hoàn thành 500ml với nước cất.

Những dụng cụ bị bẩn phải ngâm trong dung dịch hỗn hợp: natri hoặc kali dicromat và acid sulfuric trong 24 giờ. Sau khi ngâm với dung dịch sulfocromic dụng cụ phải được rửa với nước thường, tráng bằng nước cất và để khô trên bàn, trên giá hoặc tủ sấy. Chú ý với những dụng cụ đo lường bằng thủy tinh phải làm khô bằng không khí tránh làm biến dạng thủy tinh làm thay đổi độ chính xác. Dụng cụ chia độ chính xác cần rửa cẩn thận đảm bảo thật sạch và khô trước khi dùng. Nếu dùng dụng cụ thủy tinh còn ướt phải tráng từ 2 đến 3 lần bằng dung dịch sẽ được dùng.

Riêng dụng cụ thủy tinh đựng bạc nitrat (AgNO3) rửa hoàn toàn bằng nước thường rồi tráng bằng nước cất.

Cách pha dung dịch sulfocromic:

- Dung dịch đặc gồm: Kali dicromat 50g nghiền nhỏ.

- Acid sulfuric công nghiệp 500mL

- Gạn lấy dịch rồi thêm vào 1 thể tích acid mới.

- Dung dịch loãng gồm:

+ Dung dịch Kali dicromat 10% trong 1 thể tích

+Acid sulfuric công nghiệp ½ thể tích

Đổ acid vào dung dịch dicromat rồi lắc đều.

Mỡ bôi khóa thủy tinh

Mỡ bôi khóa buret: Lanoline, Vaseline.

Hai mỡ này lấy lượng bằng nhau. Đun cách thủy cho tan hết, trộn đều. Nếu buret dùng kalipermanganat thì dùng vaseline tinh khiết để bôi.

Mỡ bôi khóa chân không: Parafine, cao su sống.

Hai chất này lấy bằng nhau, đun chảy rồi trộn đều.

1.1.3. Các đơn vị và hệ thống đo lường trong hóa sinhNgay từ năm 1984, hội nghị toàn thể về trọng lượng và đo lường Quốc tế đã quyết

định định nghĩa các đơn vị dùng cho các lĩnh vực khoa học khác nhau. Đến năm 1960, danh mục đó gọi là hệ thống đơn vị quốc tế và được gọi tắt là hệ thống SI (Systemes international unites) đã được thiết lập. Hệ thống đơn vị quốc tế đó đã được áp dụng rộng rãi trên thế giới, trong đó có nước ta.

Hệ thông SI đánh dấu sự phát triển của hệ thống đo lường; có 3 loại đơn vị:Đơn vị cơ sở (độ dài, khối lượng, thời gian, cường độ dòng điện, nhiệt độ động học,

cường độ ánh sáng và lượng chất).Đơn vị dẫn xuất (m2, m3, m/s, mol/L).

21

Đơn vị phụ (Radian, Steradian).Khi sử dụng đơn vị cơ sở và những đơn vị dẫn xuất biễu thị các thông số sinh học

của con người, người ta thường dùng những bội số và ước số thập phân của chúng.1.1.3.1. Các đơn vị thường dùng Đơn vị khối lượng-Kilogram (Kg) và các bội sốKilogram (kg)Gam (g)= 0,001 kg = 10-3 kgMiligam (mg) = 0,001 g = 10-3 gMicrogam (µg) = 0.000001g = 10-6 gNanogam (ng) = 0.000 000 001 g = 10-9gPicrogam (pg)= 0.000 000 000 001 g = 10-12g Đơn vị lượng chất – mol và các bội sốMol Milimol (mmol) = 0,001 mol = 10-3molMicromol( µ mol) = 0.000 001 mol = 10-6molNanomol (nmol) = 0,000 000 001 mol = 10-9molPicromol (pmol) = 0,000 000 000 001 mol = 10-12mol Đơn vị thể tíchLit (L) =0,001 m3

= 1dm3 Decilit (dL) = 0,1LMililit (mL) = 0,001L = 10-3 LMicrolit (μL) = 0,000 001L = 10-6L Đơn vị thời gianGiâyPhút (min) = 60 giâyGiờ (h) = 60 phút =3600 giây Đơn vị nồng độ Nồng độ lượng chấtMol/lít (mol/L)Milimol/lít (mmol/L)Micromol/lít (μmol/L)Nanomol/lít (nmol/L)Picromol/lít (pmol/L) Nồng độ khối lượngGam/lít (g/L)Miligam/lít (mg/L)Microgam/lít (μg/L)Nanogam/lít (ng/L)Picrogam/lít (pg/L) Nồng độ đương lượngEquivalan (Eq)=mol x hoá trịMili Equivalan (mEq)= mmol x hoá trị1.1.3.2. Chuyển đổi giữa các đơn vị cũ sang đơn vị SI và ngược lại

Chuyển đổi từ đơn vị nồng độ lượng chất sang nồng độ khối lượng và ngược lại

Lg / x TLPT

1 = mol/L hoặc g/L = mol/L x TLPT

m Lg / x TLPT

1 = mmol/L hoặc mg/L = mmol/L x TLPT ( TLPT: Trọng lượng phân tử)

22

Chuyển đổi từ đơn vị nồng độ lượng chất sang nồng độ đương lượng và ngược lại1mmol/L x hóa trị = 1mEq/LmEq/L x = 1mmol/L1.1.3.3. Lý Do Sử Dụng Đơn Vị SI

Về pháp lý: Cần thống nhất các loại đơn vị trên toàn thế giớiVề khoa học: biểu thị theo đơn vị mới giúp ta hiểu rõ hơn mối liên quan sinh lý giữa

các chất.1.1.4. Phương pháp cân1.1.4.1. Tiêu chuẩn cân tốt và một số loại cân thông thường

Cân được dùng để xác định khối lượng của vật. Cân là dụng cụ không thể thiếu trong mỗi phòng thí nghiệm. Cân dùng trong mỗi phòng thí nghiệm phải là cân tốt.

Tiêu chuẩn cân tốt:Một cân tốt phải có 3 tiêu chuẩn sau: Cân đúng, cân tin và cân nhạyCân đúng: khi cân trọng lượng của vật phải đúng bằng trọng lượng của các quả cân

và được thăng bằngCân tin: Khi cân nhiều lần bằng cách đặt vật ở những vị trí khác nhau trên đĩa cân

kết quả vẫn không thay đổi.Cân nhạy: Khi để một lượng chất rất nhỏ lên đĩa cân cân mất thăng bằngMột số loại cân thường dung trong phòng thí nghiệm:Cân đĩa: Dùng để cân những vật có trọng lượng từ 20g đến 10kg. Có thể cân hơn

hoặc kém 0.5gCân quang: Cân được những vật có trọng lượng từ 0.05g đến 20gCân chính xác: Dùng để cân những vật có trọng lượng từ 1mg đến vài gam. Độ

chính xác từ 1/10mg đến 1/100mg. Cân chính xác có nhiều loại:Cân dao động tự do còn gọi là cân phân tíchCân không dao độngCân dâyCân ghi tự độngCân điện tửCân chính xác có độ nhạy 1/10 mg là đủ dùng cho phòng thí nghiệm hóa sinh.

1.1.4.2. Các phương pháp cânCó thể sử dụng những phương pháp cân sau:

Cân đơnĐầu tiên kiểm tra vị trí kim gần không, rồi cân bì. Đạt được thăng bằng thì đặt quả

cân đúng bằng trọng lượng cần cân. Thêm dần vật cần cân vào phía bì cho đến khi cân bằng trở lại. Cân kép

Vật định cân được cân 2 lần. Lần đầu đặt lên đĩa bên trái, lần sau đặt lên đĩa cân bên phải. Lấy trung bình cộng kết quả 2 lần cân Cân điện tử

Thường có bản hướng dẫn sử dụng cân. Có thể tóm tắt một số thao tác chính: Kiểm tra độ thăng bằng của cân, cân bì, rồi cho vật cần cân vào bì để cân. Loại cân này thao tác nhanh đơn giản.1.1.4.3. Bảo quản cân

Cân phải để nơi vững chắc, cao ráo, không có ánh nắng chiếu vào, cân chính xác cần phải đặt nơi cố định, tốt nhất nên có buồng riêng.

Khi di chuyển phải nhẹ nhàng, phải tháo quang và đòn cân.

23

Không cân quá sức, sức cân là trọng lượng tối đa có thể đặt lên đĩa cân và được ghi trên cán cân.

Không đổ trực tiếp hóa chất lên đĩa cân.Đối với cân phân tích, phải luôn kiểm tra đĩa cân.

1.2. Thuốc thử trong phòng thí nghiệmNgày nay, trong phòng thí nghiệm tự động hóa cao, dường như việc chuẩn bị các loại

thuốc thử do những cán bộ kỹ thuật của phòng thực hiện là ít cần thiết. Hầu hết những vật liệu phục vụ các thí nghiệm được bán bởi các hãng sản xuất và dưới dạng “kít” dùng được ngay. Tuy nhiên, ở những phòng thí nghiệm có liên quan đến việc nghiên cứu khoa học hoặc các phân tích đặc biệt, một số thuốc thử cần phải tự pha chế tại phòng. Bởi vậy, những hiểu biết về hóa chất và dung dịch, dung dịch chuẩn, dung dịch đệm, nước cất… là rất cần thiết.1.2.1. Hóa chất và đơn vị đo lường

Các hóa chất tồn tại với khoảng rộng về chất lượng tinh khiết: loại hóa chất tinh khiết hóa học (chemically pure-CP); loại hóa chất tinh khiết cao (ultrapure). Những loại hóa chất này đảm bảo độ tinh khiết để dùng cho phòng thí nghiệm. Loại hóa chất tinh khiết cao được dùng trong các bước tinh chế những sản phẩm đặc biệt như sắc ký lớp mỏng, hấp thụ nguyên tử, phép đo huỳnh quang hoặc những kĩ thuật khác có yêu cầu nghiêm ngặt về độ tinh khiết của hóa chất.1.2.2. Dung dịch và cách biểu thị nồng độ dung dịch

Dung dịch có thể được định nghĩa như là một hỗn hợp đồng nhất của hai hay nhiều chất. Chất được gọi là chất tan khi nó được hòa tan trong một dung dịch, khuôn chất lỏng (matrix) dùng để hòa tan chất tan gọi là dung môi nồng độ của dung dịch là lượng hóa chất (chất tan) có trong một trọng lượng hay một thể tích nhất định của dung dịch và có nhiều cách biểu thị khác nhau. Thông thường, nồng độ của các dung dịch được biểu thị bằng: nồng độ % (percent solution), nồng độ phân tử gam/lit (mol/L= molarity), nồng độ phần tử gam/kg dung môi (mol/L= molality), nồng độ đương lượng (normality).1.2.2.1. Dung dịch phần trăm

Các dung dịch này có nồng độ biểu thị bằng phần trăm (%) tức là số lượng chất tan trong một trăm đơn vị dung dịch. Ba cách biểu thị nồng độ %: trọng lượng/trọng lượng (% w/w) thể tích/thể tích (% v/v)và thông thường nhất là trọng lượng/ thể tích (% w/v).

Trọng lượng/thể tích (%w/v): được dùng làm đơn vị đo lường khi chất tan là chất rắn và dung môi ở thể lỏng. Nồng độ %w/v thí dụ như 5% w/v được hiểu rằng đơn vị đo lường của dung dịch là gam/100ml. Như vậy, dung dịch 5% là tương đương với 5g chất tan trong 100ml dung dịch. Khi tính toán dung dịch % này người ta muốn xác định có bao nhiêu gam chất tan cần cho 100ml dung dịch.

Trọng lượng/trọng lượng (%w/w) là nồng độ % được tính với trọng lượng của dung dịch và đơn vị đo lường trọng lượng là gam.

Thể tích/thể tích (%v/v) là nồng độ % của dung dịch được dùng khi chất tan và dung môi đều là chất lỏng. Đơn vị đo lường đặc trưng là ml chất tan trong 100ml dung dịch. 1.2.2.2. Nồng độ phân tử g/l

Là nồng độ của một dung dịch của dung dịch được xác định bằng số phân tử của chất tan trong một lít dung dịch và đơn vị đo lường là mol/L hay M. Một phân tử (mol) chất tan bằng trọng lượng phân tử gam của nó. Biểu thị của hệ thống đơn vị quốc tế (SI) cho nồng độ phân tử truyền thống là số phân tử chất tan trong thể tích dung dịch được giới hạn là lít. Biểu thị hệ thống đơn vị quốc tế của nồng độ mol/l, mmol/l, lmol /µ , nmol/l.1.2.2.3. Nồng độ phân tử gam/kg dung môi

24

Là nồng độ của dung dịch được xác định bằng số lượng chất tan trong một kg dung môi. Nồng độ này đôi khi bị nhầm lẫn với nồng độ phân tử g/l, nhưng thực ra việc phân biệt giữa hai cách biểu thị nồng độ dung dịch này cũng dễ dàng bởi vì nồng độ mol/kg luôn được biểu thị bằng trọng lương/trọng lượng hay phân tử gam/kg và được xác định bằng số phân tử gam (mol)/1000g(1kg) dung môi.1.2.2.4. Nồng độ đương lượng

Được định nghĩa là số đương lương gam trọng lượng chất tan trong một lít dung dịch (Equivalent weight/lit =Eq/L) một đương lượng gam của một chất tương đương với trọng lượng phân tử của chất chia cho hóa trị của chất đó. Nồng độ đương lượng gọi là nồng độ nguyên chuẩn (ký hiệu là N).

Đương lượng của một muối bằng trọng lượng phân tử của chất chia cho tổng số hóa trị của gốc acid.Thí dụ: NaCl Cl- =1, Eq=M ( trọng lượng phân tử)

CaCO3−2

3CO =2 Eq=M/2

Fe2(SO4)3−2

43SO =6 Eq=M/6Đương lượng của một acid hoặc một bazơ là lượng chất đó ứng với một ion H+

hay OH- tham gia phản ứng.Thí dụ: HCl Eq=M

H2SO4 Eq=M/2H3PO4 Eq=M/3NaOH Eq=MBa(OH)2 Eq=M/2

Đương lượng của một chất oxi hóa khử tương ứng với sự trao đổi một mol lượng chất đó trong phản ứng.

Thí dụ:2Fe3+ + 2I- 2Fe2+ + I2

2Fe3+ +2e 2Fe2+

Vậy: Fe2(SO4)3 có Eq=M/21.2.3. Cách pha dung dịch phần trăm

Các dung dịch phần trăm được chia gần đúng bằng cách cân hoặc đong một lượng chất cần thiết để hòa trong một trọng lượng hay một thể tích dung dịch.- Pha 300g dung dịch NaCl 20% w/w như thế nào ?Trọng lượng của chất tan NaCl cần thiết là:

mNaCl = 300100

20x =60g NaCl

Trọng lượng của dung môi hòa tan (nước cất) là:300g dung dịch cần có =

Hòa tan 60g NaCl với 240g H2O- Cần bao nhiêu gam glucose để pha 100 ml dung dịch 10% w/vÁp dụng công thức sau:

g = ml

Xg

100 X ml dung dịch pha

Lượng glucose cần thiết là

g = ml

g

100

10100 ml dung dịch pha =10g glucose

Cho 10g glucose vào bình định mức 100ml, thêm nước cất cho đến khi đạt thể tích toàn phần của dung dịch hòa tan là 100ml

25

- Cần bao nhiêu ethanol để pha được 150 ml dung dịch 15% v/v ?

mL = mL

mL

100

15ethanol x 150ml dung dịch cần pha =22,5 mL ethanol

Trộn 22,5 ml ethanol với 127,5 ml nước cất- Cần bao nhiêu muối Natri carbonat (Na2CO3) khan để pha 1500 ml dung dịch Na2CO3 5% có tỷ trọng 1.050 ?1500ml dung dịch Na2CO3 5% có trọng lượng1500 x1.050 =1575 gTrọng lượng muối Na2CO3 cần để pha dung dịch

→ x = gx

75,78100

15755 = natri carbonat

- Cần nhiêu muối Na2CO3, 10H2O khan để pha 2000 ml dung dịch Na2CO3 5% có tỷ trọng 1.050 ?2000ml dung dịch Na2CO3 5% có trong lượng là:2000 x 1.050 =2100 gTrọng lượng muối Na2CO3 khan cần để pha dung dịch:

→ x = gx

105100

21005 = natri carbonat khan

Trọng lương muối Na2CO3, 10H2O cần để pha dung dịch (phân tử của Na2CO3 khan =106, phân tử của Na2CO3, 10H2O = 286)

→ x = gx

280106

286105 = Na2CO3,10H2O

- Với 300 g NaCl pha được bao nhiêu dung dịch NaCl 10% có tỷ trọng 1.071 ?Gọi x là thể tích của dung dịch NaCl 10% pha được

Ta có: 1,071* x =1.071x g trong lượng dung dịch NaCl 10%

→ x = mLx

x2861

071.110

300100 =

- Với 60 g muối Na2CO3.10H2O ( phân tử của Na2CO3.10H2O = 286) Pha được bao nhiêu dung dịch Na2CO3 4% có tỷ trọng 1.040 ?

Gọi x là trọng lượng Na2CO3 (phân tử lượng =106) tương ứng với 60 Na2CO3, 10H2O286 – 106

60 – x , → x = gx

23286

60106 = Na2CO3 khan

Gọi x là thể tích dung dịch Na2CO3 4% pha được

100 – 4 → x = 540040.14

23100 =x

xml

1.040x – 23 - Cần bao nhiêu ml dung dịch HCl 34%(có tỷ trọng là 1,169) để pha 2000ml dung dịch HCl 10% có tỷ trọng 1.047 ?Trọng lượng của thể tích dung dịch HCl 10% cần pha:

2000 x 1.047 =2094 gTrọng lượng HCl nguyên chất cần để pha dung dịch HCl 10%100 – 10

2094 – x → x = gx

4,209100

209410 = HCl nguyên chất

Số lượng HCl 34% cần

100 – 34 → x = gx

61634

4,209100 = HCl 34%

26

X – 209,4

ml8,527169.1

616 = dung dịch HCl 34% có tỷ trọng 1.169

- Với 120ml dung dịch H2SO4 60% có tỷ trọng 1.498, pha được bao nhiêu dung dịch H2SO4

5% có tỷ trọng 1.032 ?Trọng lượng của dụng dịch H2SO4 60%120 x 1.498 =179,76gSố g H2SO4 nguyên chất trong dung dịch H2SO4 60%

→ x = gx

8,107100

76.17960 = H2SO4 nguyên chất

Gọi x là thể tích dung dịch H2SO4 5% có tỷ trọng 1.032 pha được:1.032 * x = 1.032x

→ x = mlx

x2089

032.15

8,107100 =

Vậy: Thể tích của dung dịch H2SO4 5% có tỷ trọng 1.032 pha được là 2089 ml- Với dung dịch HCl 10% có tỷ trọng 1.047 và dung dịch HCl 34% có tỷ trọng 1.169 pha như thế nào để có dung dịch HCl 20%?

10% 14%

20%

34% 10%

Vậy: mL4,13047,1

14 = dung dịch HCl 10% thêm 169,1

10= 8,55mL dung dịch HCl 34%

- Với dung dịch HCl 5% tỷ trọng 1.023 và dung dịch HCl 30% tỷ trọng 1.149 pha như thế nào để có 2000ml dung dịch HCl 15% có tỷ trọng 1.075 ?30% 15g:1,023=14,7ml dung dịch HCl 5%

15%

30% 23,4 - 14,7

2000 - x1 x1 = 4,23

20007,14 x = 1256 ml dung dịch HCl 5%

23,4 - 8,7

2000 - x2 x2 = 4,23

20007,8 x= 744 ml dung dịch HCl 30%

- Với dung dịch NaCl 10% và muối NaCl pha như thế nào để có 1000ml dung dịch NaCl 20% có tỷ trọng 1.148 ?

10% 80g dung dịch NaCl 10%

20%

100%

27

1000 ml dung dịch NaCl 20% cần có trọng lượng:1000 x 1.148 = 1148 g dung dịch NaCl 20%

90 – 80 → x = gx

102090

114880 = dung dịch NaCl 10%

1148 – x1148 - 1020 = 128g muối NaCl1.2.4. Cách chuyển đổi dung dịch phần trăm sang dung dịch có nồng độ phân tử gam hay nồng độ đương lượng- Tính nồng độ phân tử gam/L của dung dịch NaCl chứa 87 g NaCl trong 1L dung dịch

= x 5,58

1mol hay 1,49 M

- Có bao nhiêu g NaOH trong 500 mL dung dịch NaOH 4M

gNaOHmL

LmL

mol

g

L

molg 80

1000

1500

1

404 ==

- Có bao nhiêu mmol HCl trong dung dịch HCl 0,35% (w/v)?Dung dịch HCl 0,35 w/v có nghĩa 1L dung dịch có 3,5g HCl

Lmmol

molmol

gmol

Lg

Lmmol

9,951

10005,36

115,3 ==

Dung dịch HCl 0,35 w/v hay dung dịch HCl 95,9 mM- Có bao nhiêu phân tử gam NaCl trong dung dịch NaCl chứa 127 g NaCl trong 1000g nước cất (phân tử lượng NaCl = 58,5)

= x = OgH

mol

21000

17,2

- Tính nồng độ đương lượng của dung dịch NaCl có chứa 150 g NaCl trong 1 lít (phân tử lượng NaCl = 58.5)

NL

eq

g

molx

mol

eqx

LL

eq56,256,2

5,58

1

1

1

1

150 ===

- Tính nồng độ đương lượng của dung dịch chứa 75g Ba(OH)2 trong 850 ml nước cất (phân tử lượng Ba(OH)2=171)

mol

eq

g

molx

l

mlx

ml

g

L

eq

1

2

171

1

1

1000

850

75=

03,103,1 ==L

eqN

- Tính nồng độ mili đương lượng của dung dịch chứa 25 g BaCl2 trong 2 lít (phân tử lượng của BaCl2 =208)

LmEq

mol

eqx

g

molx

eq

mEqx

l

g

L

meq

/120

1

2

208

1

1

1000

2

25

=

=

- Tính nồng độ đương lượng của dung dịch 5M H2SO4

NL

eql

eqx

l

mol

L

eq

1010

1

2

1

5

==

=

- Tính nồng phân tử của dung dịch 12N H3PO4

= x =4x=4M- Tính nồng độ % w/v của dung dịch 0,4M NaOH (phân tử lượng của NaOH=40)

28

vwmL

g

mL

Lx

mol

gx

L

mol

mL

g

/%6,1100

6,1

100

1,0

1

40

1

4,0

100=

==

- Tính nộng độ phân tử gam của dung dịch HCl 38% có tỷ trọng 1,19

ML

mol

xL

mLx

mLx

g

mol

L

mol

4,124,12

101

1

1

19,1.38

5.36

1

==

=

1.2.5. Một số dung dịch chuẩn độ1.2.5.1. Những điểm cần chú ý

Khi hai dung dịch tác dụng với nhau, dung dịch thứ nhất N1 lần nguyên chuẩn và dung dịch thứ hai N2 lần nguyên chuẩn ta có hệ thức:

N1.V1=N2.V2

V1,V2 là những thể tích tương ứng với các dung dịch có nồng độ nguyên chuẩn N1 và N2

Một dung dịch nguyên chuẩn chứa lượng P được tính theo công thức

1000

V

n

MP =

M: phân tử lượngn: hệ số chuẩn độn=1 với HCl, NaOHn=2 với H2SO4…V: thể tích dung dịch(ml)Dung dịch có N là nguyên chuẩn Ta có:

1000

VN

n

MP =

1.2.5.2. Dung dịch acid sulfuric nguyên chuẩn (49g H2SO4 trong 1 lit)Đong vào một ống đong chia độ 33mL acid H2SO4 nguyên chất có tỷ trọng 1.83 đổ

từng ít một lượng acid trên vào 500mL lớn nước cất đựng trong bình cầu. Lắc đều, làm lạnh bình cầu bằng một vòi nước lạnh khi dung dịch đã nguội, đổ dung dịch sang bình định mức 1000mL, thêm nước cất để tráng bình cầu và nước cất vào bình tới ngấn 1000mL. Đậy nút, lắc đều. Kiểm tra độ chuẩn của dung dịch H2SO4 vừa pha bằng các phương pháp sau:

Phương pháp cânNguyên tắc: Cho BaCl2 tác dụng H2SO4 ion SO4

2- tủa dưới dạng BaSO4 theo phương trình

HClBaSOBaClSOH 24242 +→+* Thuốc thử: Dung dịch BaCl2 10%Acid HCl 10% Dung dịch AgNO3 10%Alcol ethylic nguyên chấtEte*Cách tiến hành

Cho vào một bình nón 10mL dung dịch H2SO4 cần chuẩn độ, 50 mL nước cất với 5 giọt HCl 10%. Đun sôi và lắc đều (lưu ý tránh để bắn dung dịch ra ngoài). Cho từng giọt 20mL dung dịch BaCl2 10% và tiếp tục đun 10 phút. Đảm bảo tủa được hoàn toàn bằng cách thử với dung dịch BaCl2 (dung dịch không tủa thêm)

29

Gạn nước trong còn nóng bằng phễu có giấy lọc loại không tro. Rửa tủa còn lại trong bình nón với nước sôi, lắc và để lắng 5 phút. Gạn và lọc như trên. Rửa lại như trên vài lần. Cuối cùng, đổ tủa lên giấy lọc, dùng đủa thủy tinh có đầu đủa bọc cao su để khóe tủa khỏi thành của bình nón. Rửa tủa ở trên giấy lọc bằng nước cất đun sôi cho đến khi nước rửa không còn tủa với dung dịch AgNO3 nhằm loại BaCl2 thừa, rửa tủa lần cuối cùng bằng alcol rồi bằng ete đặt cả phễu và giấy lọc vào tủ sấy 110oC, sấy tới khô hoàn toànNhấc cẩn thận tờ giấy lọc từ phễu rồi đặt giấy vào chén nung bằng bạch kim hay thạch anh đã cân trước ( chén này được đốt nóng đỏ rồi để nguội) cầm chén nung bằng kiềm kim loại và đốt cho đến khi cận tủa thành than. Để nguội thêm vào 2-3 giọt HNO3, nung chén lại một lần nữa cho tới khi có tàn tro trắng. Để nguội chén trong bình hút ẩm. Cân chén.* Cách tính

Gọi P là lượng BaSO4 tạo thành do kết tủa dung dịch H2SO4 cần chuẩn độ và 1g BaSO4 tương ứng với 0.42g H2SO4

Dung dịch H2SO4 cần chuẩn độ có chứa:

P=10

1000..42.0 p

Điều chỉnh lại dung dịch hoặc xác định lại hệ số chuẩn độ Phương pháp chuẩn độ bằng Na2CO3

Nguyên tắcNa2CO3 bị phá hủy bởi H2SO4 theo phản ứng:

→+ 3242 CONaSOH Na2SO4 + H2O + CO2

Thuốc thử: Na2CO3 khan, tinh khiếtHeliantin 2% trong nước

Tiến hànhSau khi kiểm tra hóa chất Na2CO3 không lẫn muối Chlor và Sulfat, sấy khô ở 2500C

để nguội Na2CO3 trong bình hút ẩm rồi cân chính xác 1,06g. Cho Na2CO3 vào bình nón, hòa với 100mL nước cất và thêm 1 giọt heliantin 2% nhỏ dung dịch H2SO4 cần kiểm tra bằng buret cho đến khi dung dich trong bình nón chuyển màu từ vàng sang đỏ da cam* Cách tính:

Nếu dung dịch H2SO4 N chính xác thì phải dùng hết 20 mL dung dịch H2SO4 với một giọt H2SO4 có sai số là %25.0± Chú ý: Chỉ cần một giọt heliantin vào bình nón, nếu cho nhiều thì sự chuyển màu khó nhận biết

Phương pháp này nhanh hơn phương pháp cân và độ chính xác đảm bảo Có thể dùng KHCO3 tinh khiết và khan thay cho Na2CO3

Dung dịch H2SO4 giữ được lâu với đều kiện được bảo quản trong lọ nút kính không bị bốc hơi1.2.5.3. Dung dịch acid sulfucric 0.1N

Cho 100mL dung dịch H2SO4 nguyên chuẩn N vào một bình định mức 1000mL. Hòa thêm nước cất vừa đủ tới mức 1000mL rồi lắc đều kiểm tra lại bằng những phương pháp trên. 1.2.5.4. Dung dịch acid clohidric nguyên chuẩn

Acid HCl thường chứa 30-40g HCl trong 100mL. Đong 120mL acid này vào ống đong chia độ rồi thêm nước cất vừa đủ 1000mL. Chuẩn độ dung dịch HCl từ dung dịch NaOH NĐịnh lượng dung dịch HCl dựa trên một trong hai phản ứng trung hòa sau:

→+ NaOHHCl NaCl +H2O→+ 322 CONaHCl 2NaCl +CO2 +H2O

30

Thuốc thửDung dịch NaOH N hoặc dung dịch Na2CO3 N Helinantine 2% trong nước hoặc phenol phtalein 1% trong alcol. Tiến hành

Với helinantin trong một bình nón 10mL dung dịch NaOH N, 10mL nước cất đã đun sôi và một giọt helinantin 2%. Nhỏ dung dịch acid cần chuẩn độ bằng buret vào bình nón cho đến khi dung dịch trong bình nón chuyển từ vàng sang hồng Gọi V là thể tích acid cần chuẩn độ đã dùng để trung hòa 10mL dung dịch NaOH N Độ chuẩn của dung dịch acid là 10/V *[N]Nồng độ dụng dịch HCl là V/10*36.5g/L1.2.5.5. Dung dịch NaOH nguyên chuẩn (40g NaOH trong 1 lít)

NaOH dù rất tinh khiết nhưng vẫn luôn ngậm một ít nước và ít nhiều đều bị Carbonat hóa. Bởi vậy, pha dung dịch NaOH không có Carbonat phải tiến hành như sau:

Cân khoảng 70g NaOH rồi hòa tan với 100-150 mL nước cất đun sôi để nguội. Sau khi NaOH tan hết, đổ dung dịch sang một bình thủy tinh có đậy nút. Để 3-4 ngày, Na2CO3

ít tan trong dung dịch NaOH đậm đặc và tủa lắng xuống đáy bình. Gạn nước trong vào bình định mức 1000mL, thêm nước cất đã loại bỏ CO2 vừa đủ tới vạch định mức. Dung dịch NaOH này có nồng độ xấp xỉ bằng 1N Định lượng NaOH bằng dung dịch H2SO4 1NNguyên tắc: NaOH được trung hòa bởi H2SO4 theo phương trình:

→+ NaOHSOH 242 Na2SO4 +2 H2OThuốc thửDung dịch H2SO4 1NHeliantine 2% trong nước Phtalein phenol 1% trong cồn Tiến hành

Trong một bình nón cho 10mL dung dịch NaOH cần chuẩn độ và một giọt heliantine 2%. Nhỏ dung dịch H2SO4 1N bằng buret vào bình nón cho đến khi dung dịch chuẩn chuyển sang màu hồng Có thể định lượng ngược lại như sau:

Trong bình nón cho 10mL dung dịch H2SO4 1N, thêm 20mL nước cất đã đun sôi và 1-2 giọt phtalein phenol. Nhỏ dung dịch NaOH cần định lượng bằng buret vào bình nón cho đến khi dung dịch chuẩn trong bình xuất hiện màu hồng bền vững Cách tínhGọi V là thể tích dung dịch H2SO4 1N dùng để trung hòa 10ml dung dịch NaOH cần chuẩn Nồng độ NaOH là: V/10*40g(NaOH trong 1 lít) Dung dịch AgNO3 0,1N (17g AgNO3 trong 1lít)

Cân 17g AgNO3 hòa tan với 100mL nước cất hai lần và thêm nước cất vừa đủ 1000ml.Định lượng bạc nitrat bằng dung dịch HCl 0.1N.

Nguyên tắc: Bạc bị tủa bởi một lượng acid HCl nhất định thành AgCl. Lượng AgNO3 thừa sẽ được phát hiện bởi K2CrO4 trong môi trường trung tính

33427223

342423

33

324 HNOKNOCrOAgKOHOCrKAgNO

KNOCrOAgCrOKAgNO

HNOAgClHClAgNO

++→+++→+

+→+

Thuốc thửDung dịch HCl 0,1 N

31

CaCO3

Heliantin 2% trong nướcDung dịch K2Cr2O7 10%

Cách tiến hành Trong một bình nón, cho vào 10mL dung dich HCl 0,1 N, 1 giot dung dịch Heliantin

2% và một ít CaCO3. Lắc bình nón cho đến khi dung dịch có heliantin chuyển màu vàng da cam. Thêm 5 giọt dung dịch kalicromat 10%. Nhỏ dung dịch cần chuẩn độ bằng buret vào bình nón cho đến khi dung dịch trong bình nón chuyển màu sang đỏ gạch( bạc cromat tan ở nhiệt độ nóng và môi trường acid, vì vậy quá trình chuẩn độ phải tiến hành ở nhiệt độ thấp và môi trường trung tính ). Ở môi trường bazơ mạnh bạc tủa dưới dạng AgOH nên phải trung hòa acid bằng CaCO3, không được trung hòa bằng NaOH.

Cách tính Gọi V là thể tích của dung dịch AgNO3 cần chuẩn độ để định lượng 10mL dung dịch

HCl 0.1N. Độ chuẩn của dung dịch AgNO3 là:

10.

.10

V

N

Chú ý dung dịch AgNO3 phải pha bằng nước cất tốt, bảo quản trong lọ màu, kín và sạch, dung dịch sẽ giữ được lâu. Tuy nhiên sau một thời gian bạc sẽ bị khử và bám ở thành chai đựng và ít nhiều độ chuẩn của dung dịch bị thay đổi 1.2.5.6. Dung dịch kali pemanganat 0.1N(3.16g kali pemanganat trong 1lít)

Dung dịch KMnO4 N chứa: P = = 5

158 = 31,6g kali pemanganat trong 1 lít

Dung dịch KMnO4 chứa 3.16 g kali pemanganat trong 1 lít KMnO4 không bao giờ tinh khiết. Cần 3,3 g KMnO4, cho vào một bình tráng men có mỏ. Hòa tan dần với một ít nước cất nóng, gạn sang bình định mức 1000ml, khi pemanganat tan hết thì thêm nước cất tới vạch 1000ml Lắc đều, để vài ngày tránh ánh sáng (đựng trong lọ màu). Định lượng bằng một trong các phương pháp sau:

Định lượng pemanganat bằng dung dịch acid oxalic 0.1NNguyên tắc: trong môi trường acid sulfuric, acid oxlalic bị oxi hóa bởi

kalipemanganat theo phương trình sau:( ) →++ 4224 352 SOHCOOHKMnO 2MnSO4 + K2SO4 + 10CO2 + 8H2O

Thuốc thử- Acid sunfuric tinh khiết (acid không được có phản ứng với pemanganat, kiểm tra bằng cách thêm một giọt KMnO4 vào 10 ml dung dịch acid và màu hồng xuất hiện bền vững).- Acid oxalic 0,1N (H2C2O4.2H2O = 126).

Cân chính xác 6,3 g acid oxalic tinh khiết (126:20). Kiểm tra độ chuẩn bằng dung dịch NaOH 0,1N ở nhiệt độ nóng với chỉ thị màu phtalein phenol (tương tự như định lượng dung dịch HCl 0,1N).

Tiến hànhCho vào hình nón:

Acid oxalic 0,1N 10 mlAcid sunfuric 1-2 ml

Đun 50-600C(thực hiện phản ứng ở nhiệt độ nóng để sự oxi hóa nhanh và hoàn toàn), không đun trên 600C để tránh sự phân hủy của acid oxalic. Nhỏ pemanganat kali bằng buret vào bình nón cho đến khi dung dịch trong bình nón xuất hiện màu hồng bền vững.

Cách tính

32

Gọi V là thể tích KMnO4 cần dùng để định lượng 10 ml dung dịch acid oxalic 0,1N.

Độ chuẩn của pemanganat 10

10 N

V×=

Định lượng kali pemanganat bằng dung dịch sắt (II) sunfat 0,1N.Nguyên tắc: Trong môi trường acid sunfuric, pemanganat kali oxi hóa sắt (II) sunfat

thành sắt (III) sunfat theo phản ứng:10FeSO4 + 8H2SO4 + 2KMnO4 5Fe2(SO4)3 +K2SO4 + 2MnSO4 +8H2O

Thuốc thử- Acid sunfuric đậm đặc.- Natri hydro carbonat (NaHCO3)- Dung dịch sunfat kép sắt và amino 0,1N (muối Mohr).Muối Mohr { FeSO4-(NH4)2SO4.6H2O} vững bền, dễ tinh khiết.

Cho 50 ml nước cất đun sôi để nguội vào bình định mức 100 ml. Thêm 4 ml acid sunfuric tinh khiết, một ít NaHCO3 để đẩy không khí ra khỏi bình. Khi hết hiện tượng sủi bọt, cho thêm 3,92g muối Mohr (3,92g FeSO4-(NH4)2SO4.6H2O – cân chính xác). Thêm nước cất đun sôi để nguội vừa đủ 100 ml. Đậy nút, lắc đều.

Tiến hànhCho vào bình nón:

Nước cất đun sôi, để nguội 100 mlAcid sunfuric đậm đặc 10 mlNaHCO3 một ítDung dịch muối Mohr 10 ml

Nhỏ dung dịch KMnO4 bằng buret vào bình nón cho đến khi dung dịch trong bình nón xuất hiện màu hồng bền vững.

Cách tínhGọi V là thể tích dung dịch KMnO4 dùng để định lượng 10 ml dung dịch muối Mohr

0,1N.

Độ chuẩn của KMnO4 10

10 N

V×=

Chú ý: bảo quản dung dịch KMnO4 trong lọ màu.1.2.5.7. Dung dịch natri hyposulfite 0,1N (24,8g Na2S2O3.5H2O trong 1 lít).

Cân 25 – 26 hyposulfite, cho vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 20 ml nước cất đun sôi, để nguội. Lắc tới tan, cho nước cất vừa đủ 100 ml. Định lượng dung dịch natri hyposulfite bằng acid sunfuric 0,1N

Nguyên tắc: Hỗn hợp kali iodid và kali iodat ở môi trường acid sunfuric sẽ phản ứng theo phương trình:

5KI + KIO3 + 3H2SO4 3K2SO4 +3H2O +3I2 Iod giải phóng sẽ bị khử bởi natri hyposulfite:

2Na2S2O3 + I2 Na2S4O6 + 2NaIThuốc thử:- Acid H2SO4

- Dung dịch KI 10% không có iod tự do- KIO3

- Hồ tinh bội 0,2%: Hòa 2g tinh bột vào 10 ml nước lạnh. Thêm 0,05g thủy ngân clorua (HgCl2) để giữ hồ tinh bột được lâu. Đổ từng ít một dung dịch hồ tinh bột vào một ít nước sôi, vừa đổ vừa khuấy. Tiếp tục đun sôi khoảng 30 phút . Để nguội. Thêm nước cất vừa đủ 1000 ml.

Tiến hành.

33

Cho vào bình nón:Dung dịch KI 10% 10 mlNước cất đã loại CO2 100 mlKIO3 0,2-0,3g

Lắc tan, dung dịch không màu. Thêm 10 ml dung dịch H2SO4 0,1NNhỏ dung dịch natri hyposulfite bằng buret tới khi dung dịch trong bình nón xuất

hiện màu vàng nhạt. Thêm vài giọt hồ tinh bột 0,2%, tiếp tục nhỏ dung dịch natri hyposulfite vào bình nón cho đến khi dung dịch trong bình nón hoàn toàn mất màu xanh.

Cách tínhGọi V là thể tích natri hyposulfite dùng để định lượng 10 ml dung dịch kali

pemanganat 0,1N

Độ chuẩn của natri hyposulfite 10

10 N

V×=

Định lượng natri hyposulfite bằng kali pemanganat 0,1NNguyên tắc: Trong môi trường acid sunfuric, iodur bị oxi hóa bởi pemanganat theo

phản ứng:

5KI + KMnO4 + 4H2SO4 3K2SO4 +MnSO4 + 4H2O + 22

5I

Iod giải phóng được định lượng bằng hyposulfite.Thuốc thử

Kali pemanganat 0,1NDung dịch kali iodur 10%

Iodur có lẫn iodat, muối iodat ở môi trường acid sẽ tác dụng với iodur để giải phóng iod. Kiểm tra iodur không có iodat bằng cách lấy một ít dung dịch kali iodur và thêm vào vài giọt acid sunfuric 50% và phản ứng phải không có màu.

- Acid sunfuric 50%- Hồ tinh bột 2%

Tiến hànhCho vào bình nón:Dung dịch kali iodur 10% 10 mlAcid sunfuric 50% 1-2 mlDung dịch kali pemanganat 0,1 10 ml

Nhỏ dung dịch hyposulfite bằng buret vào bình nón cho tới khi dung dịch trong bình nón có màu vàng nhạt. Thêm vài giọt hồ tinh bột, tiếp tục định lượng tới khi màu xanh của dung dịch trong bình nón mất mau hoàn toàn.

Cách tínhGọi V là thể tích natri hyposulfite dùng để định lượng 10 ml dung dịch kali

pemanganat 0,1N

Độ chuẩn của natri hyposulfite 10

10 N

V×=

Chú ý: dung dịch natri hyposulfite không giữ được lâu. Khi dùng phải kiểm tra lại. Có thể ổn định dung dịch này để giữ được lâu hơn bằng 0,1g % natri borat.1.2.5.8. Dung dịch iod (12,7g trong 1 lít)

Dung dịch iod 0,1N có thể pha thẳng từ iod tinh khiết bằng cách cân chính xác 12,7g iod trong 1 lít. Dung dịch này có thể làm dung dịch chuẩn để định lượng hyposulfite.

Tuy nhiên, iod là chất oxi hóa mạnh, dễ bay hơi, vì vậy, tốt hơn là pha iod với lượng 12,7g càng chính xác càng tốt và sau đó định lượng lại dung dịch này bằng dung dịch natri hyposulfite 0,1N đã được chuẩn độ.

34

Iod không tan trong nước, tan nhiều trong dung dịch đậm đặc kali iodur. Cho 25g KI không có chứa KIO3 vào bình định mức 1000 ml, thêm 30-40 ml nước cất. Khi trong bình tan hết, cho 12,7g iod và lắc tới tan hết, thêm nước cất vừa đủ 1000 ml. Định lượng iod bằng natri hyposulfite 0,1N

Cho vào bình nón: 10 ml dung dịch iod cần chuẩn độ và 20 m nước cất. Nhỏ dung dịch natri hyposulfite 0,1N bằng buret vào bình nón cho đến khi dung dịch trong bình nón có màu vàng nhạt, thêm vài giọt hồ tinh bột 0,2% và tiếp tục định lượng tới khi dung dịch trong bình nón mất màu xanh hoàn toàn.

Gọi V là thể tích natri hyposulfite dùng để định lượng 10 ml dung dịch iod

Độ chuẩn của iod 10

10 N

V×=

1.2.5.9. Dung dịch hydroperoxide (H2O2)Pha dung dịch hydroperoxide như sau: cân khoảng 1g dung dịch H2O2 đậm đặc, pha

loãng thành 100 ml với nước cất bằng bình định mức 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch này để chuẩn độ.

Định lượng hydroperoxide bằng kali pemanganat 0,1NNguyên tắc: Định lượng hydroperoxide bằng kali pemanganat dựa trên tính khử của

H2O2 theo phương trình:

5 H2O2 + 2KMnO4 +3H2SO4 K2SO4 +2MnSO4 + 8H2O + 10O2

Dung dịch H2O2 nguyên chất chứa: gn

MP 17

2

34 === H2O2 trong 1 lít

Dung dịch hydroperoxide có thể biểu thị bằng nồng độ phần trăm.Thí dụ: Dung dịch H2O2 đậm đặc có chứa 27,5-31% H2O2, dung dịch H2O2 chứa 2,7-3,3% H2O2

Ngoài ra, dung dịch H2O2 có thể biểu thị bằng nồng độ “thể tích”, tức là số lít oxygen mà 1 lít dung dịch H2O2 có thể giải phóng khi bị phân hủy (người ta không gọi là số lít mà gọi là thể tích). Thí dụ: H2O2 dược dụng có 10 thể tích (10V) nghĩa là 1 lít H2O2 (10V) khi phân hủy sẽ giải phóng 10 lít oxygen (5 H2O2 5H2O + 5O2)1 H2O2 tương ứng với 1 oxy

6,54

1

2)( 2

2222 === O

OHNOH lít oxygen

Độ chuẩn của H2O2 theo thể tích oxy bằng nồng độ chuẩn N của dung dịch H2O2 nhân với 5,6

Tiến hànhTrong một bình nón, cho:Nước cất 100 mlH2SO4 đặc 5 mlDung dịch H2O2 cần định lượng 10 ml

Nhỏ dung dịch kali pemanganat 0,1N bằng buret vào bình nón cho đến khi dung dịch trong bình nón có màu hồng nhạt bền vững. Cần làm 2-3 lần lặp lại như trên, lấy kết quả gần giống nhau.

Cách tínhGọi V là thể tích kali pemanganat 0,1N dùng để định lượng 10 ml dung dịch H2O2.

Độ chuẩn của H2O2 10

10 N

V×=

Để biểu thị dung dịch H2O2 theo nồng độ phần trăm hay nồng dộ thể tích chỉ cần thay N/10 bằng trị số 1,7g/l hay 0,56 lít.

35

Chú ý: Dung dịch H2O2 để lâu dễ hỏng, cần bảo quản trong lọ có nút thủy tinh, ở tủ lạnh và tránh những chất hữu cơ.

Những điểm cần chú ý khi sử dụng dung dịch chuẩn độCác dung dịch chuẩn độ phải bảo quản trong lọ thủy tinh trung tính, tránh ánh sang, đậy bằng nút thủy tinh ( trừ một số dung dịch đặc biệt).- Không cho ống hút vào lọ đựng dung dịch chuẩn độ. Phải cho dung dịch chuẩn độ vào một cốc với lượng xấp xỉ thể tích cần dùng, sau đó dùng ống hút để lấy dung dịch trong cốc. Dung dịch thừa trong cốc không được đổ lại lọ đang đựng dung dịch chuẩn độ.

Trường hợp trời nóng, trước khi dùng cần lắc lọ đựng dung dịch chuẩn độ để hòa những giọt nước bốc hơi của dung dịch đọng ở thành lọ, tránh làm sai độ chuẩn của dung dịch.1.2.5.10. Dung dịch đệm

Dung dịch đệm là những dung dịch có khả năng giảm sự thay đổi nồng độ ion H+ và OH- tức là pH của dung dịch, khi thêm vào dung dịch đó một acid mạnh hay một base mạnh. Dung dịch đệm thường có hai loại sau:

Hỗn hợp của một acid yếu và muối của acid đó với base mạnh. Thí dụ: acid acetic và natri acetate, kali dihydrophosphat và natri hydrophosphat.

Hỗn hợp của một base yếu và muối của base đó với một acid mạnh. Thí dụ: amino acid và amino clorua.1.2.5.11. Dung dịch đệm kali dihydrophosphat và natri hydrophosphat (4,94 < pH < 9,18)

Để có dung dịch với pH cần thiết, trộn lẫn hai dung dịch kali dihydrophosphat và natri hydrophosphat theo chỉ dẫn sau:

Dung dịch KH2PO4

M/5 (ml)

Dung dịch Na2HPO4

M/5 (ml)pH

Dung dịch KH2PO4

M/5 (ml)

Dung dịch Na2HPO4

M/5 (ml)pH

9,909,759,509,008,007,006,005,00

0,100,250,501,002,003,004,005,00

4,945,295,595,916,246,476,646,81

4,003,002,001,000,500,250,100,00

6,007,008,009,009,509,759,9010,00

6,987,177,387,738,048,348,679,18

Dung dịch kali dihydrophosphat: KH2PO4 M/5 (ml): 9,078g/lítDung dịch natri hydrophosphat : Na2HPO4 M/5 (ml): 11,876g/lít1.2.5.12. Dung dịch đệm acid acetic và natri acetat (3,6<pH<5,6)

Acid acetic M/5 (ml)

Natri acetat M/5 (ml)

pHAcid acetic M/5 (ml)

Natri acetat M/5 (ml)

pH

36

18,517,616,414,712,610,2

1,52,43,65,37,49,8

3,63,84,04,24,44,6

8,05,94,22,91,9

12,014,115,817,118,1

4,85,05,25,45,6

Dung dịch acid acetic M/5 (ml): 12,005g CH3COOH trong 1 lítDung dịch Natri acetat M/5 (ml): 27,217g NaCH3COO.3H2O trong 1 lít1.2.5.13. Một số chỉ thị màu thông thường

Chỉ thị màupH

chuyển màu

Số giọt

trong 10 ml

Cách pha màu

% Dung môi acid base

Tím methylTím methylTropeolin 00Xanh thymolβ -dinitrophenolVàng dimethylXanh bromophenolĐỏ congoHeliantinNatri alizallinXanh bromocresolĐỏ methylĐỏ sim bromocresolĐỏ chlorophenolXanh bromothymolp.nitrophenolĐỏ phenolAcid rozolicĐỏ cresolα naphtolphataleinTropeolin 000PhenolphthaleinXanh thymolα naphtol benzolThymol phtaleinVàng alizarinTropeolin

0,1-1,51,5-3,51,3-3,21,2-2,82,4-4,02,9-4,03,0-4,63,0-5,23,1-4,43,7-5,24,0-5,64,4-6,25,2-6,85,4-6,86,2-7,65,0-7,06,8-8,06,8-8,07,2-8,27,3-8,77,6-8,98,0-10,08,0-9,69,0-11,09,4-10,610,0-12,011,0-13,0

3-81-41

1-21-21111111111

1-5111

1-51

1-51-51-5111

0,50,50,10,10,10,10,10,10,10,10,10,20,10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,1

Nước--

Alcol 200

Alcol 500

Alcol 900

Alcol 200

Nước--

Alcol 200

Alcol 500

Alcol 900

Alcol 200

Nước--

Alcol 200-900

Alcol 200-900

Alcol 200

NướcAlcol 200-900

Alcol 200-700

NướcAlcol 700

-

VàngXanhĐỏĐỏK.màuĐỏVàngXanhĐỏVàngVàngĐỏVàngVàngVàngK.màuVàngVàngVàngHồngVàngK.màuVàngVàngK.màuVàngVàng

XanhTímVàngVàngVàngVàngTím xanhĐỏD camTímXanhVàngĐỏ simĐỏXanhVàngĐỏĐỏĐỏLụcĐỏ hồngĐỏXanhXanhXanhTím hoa càNâu vàng

1.3. Lý thuyết sắc ký bản mỏng1.3.1. Kiến thức tổng quát

Kỹ thuật sắc ký đã được sử dụng nhiều từ thế kỷ trước để tách các chât mau từ cây cỏ. Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp này được phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ

37

thuật khác nhau. Có các loại sắc ký: sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký điện di.

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, thí dụ như silicagel hoặc oxid alumine. Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ trên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.

* Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ,…bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy.* Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ như

silicagel, alumine,..được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ sulfat calci khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ.

* Mẫu cần phân tích: Mẫu chất cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1 microlit (1 µl) dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình. Pha động: Là dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ vào tính mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với mỗi vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. Với chất hấp thu là silicagel và alumine, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực sẽ di chuyển chậm.1.3.1.1. Các chất hấp thu dùng trong sắc ký lớp mỏng

Các chất hấp thu dùng trong sắc ký lớp mỏng cần lưu ý về kích cỡ của hạt và độ đồng nhất của các hạt hấp thu, vì điều này rất quan trọng nó quyết định đến độ bám dính của chất hấp thu lên bề mặt tấm bản mỏng. Các hạt phải đồng đều và có đường kính trong khoảng 10-25μm. Một số chất hấp thu dùng trong sắc ký lớp mỏng như: Silicagel, kieselguhr (celite), alumina, bột giấy, polyamide, sephadex(R).

Các chất hấp thu thương mại đều có trộn hoặc không trộn thêm chất kết dính hoặc chất chỉ thị phát huỳnh quang. Chất kết dính giúp cho chất hấp thu bám tốt vào tấm kiếng hoặ tấm plastic, hoặc giúp cho lớp mỏng thêm bền, không bị trầy sước. Tuy vậy, đôi khi cũng có một vài nhược điểm, thí dụ chất bám dính là tinh bột hoặc là một vài nguyên liệu có nguồn gốc polymer: ở giai đoạn làm hiện hình các vết trên tấm bản bằng những dung dịch tác chất có tính ăn mòn, tấm bản mỏng sẽ bị hư hại. Tấm bản mỏng có trộn thêm chất

38

Nắp đậy bình sắc ký

Bình sắc ký

Pha động(dung môi)

Mẫu cần phân tích

Pha tĩnh(chất hấp thu)

Bình sắc ký lớp mỏng

Tấm lớp mỏng bằng plastic hoặc nhôm

bám dính sulfat calci sẽ không phù hợp khi giải ly với dung môi là nước lý do sulfat calci hòa tan nhẹ trong nước.1.3.1.2. Dung môi giải ly

Nguyên tắc chọn dung môi là nên chọn loại dung môi rẻ tiền, vì phải cần một lượng lớn, có độ tinh khiết cao, tránh có chứa các vết kim loại. Dung môi không được quá dễ bay hơi(ví dụ như etyl ete), nhiệt độ sôi khoảng 350C gần bằng nhiệt độ của phòng thí nghiệm vào mùa nóng(miền nam Việt Nam). Dung môi dễ bay hơi sẽ dễ dàng đi khỏi tấm lớp mỏng sau khi giải ly.

Mỗi mẫu chất cần phân tích có chứa nhiều cấu tử khác nhau. Khả năng tách riêng các hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tỷ lệ phân phối của các hợp chất này giữa chất hấp thu và dung môi giải ly. Muốn thay đổi khả năng tách, người ta thay đổi thành phàn các dung môi sử dụng để giải ly. Thường người ta giải ly với hỗn hợp hai dung môi, khả năng giải ly tăng tuy thuôc vao đô phân cưc cua dung môi được trình bày trong bảng sau:

Hệ dung môi Tỷ lệ phaBenzenBenzen:cloroform 1:1CloroformCyclohexanol:etyl acetat 8:2Cloroform:aceton 95:5Benzen:aceton 9:1Benzen:etyl acetat 8:2Cloroform:dietyl eter 9:1Benzen:metanol 95:5Benzen:dietyl eter 6:4Cyclohexanol:etyl acetat 1:1Cloroform:dietyl eter 8:2Benzen:aceton 8:2Cloroform:metanol 99:1Benzen:metanol 9:1Cloroform:aceton 85:15Benzen:dietyl eter 4:6Benzen:etyl acetat 1:1Cloroform:dietyl eter 6:4Cyclohexanol:etyl acetat 2:8Butyl acetatCloroform:metanol 95:5Cloroform:aceton 7:3Benzen:etyl acetat 3:7Butyl acetat:metanol 99:1Benzen:dietyl eter 1:9

Về nguyên tắc tổng quát, nếu có thể, nên tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có nhiều hơn 2 cấu tử, vì hỗn hợp phức tạp như thế dễ dàng dẫn đến việc thay đổi pha khi có sự thay đổi nhiệt độ. Sự lựa chọn dung môi để tách tốt các chất khác nhau vẫn tùy vào kinh nghiệm cá nhân, nhưng những hiểu biết về đặc tính của hợp chất cần phân tích sẽ giúp ích cho người nghiên cứu. 1.3.2. Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng

39

1.3.2.1. Chuẩn bị mao quảnMao quản là một ống thủy tinh có đường kính trong của ống phải nhỏ, khoảng

1-2mm, một đầu được vuốt nhọn. Các nhà sản xuất có bán sẵn các mao quản có khắc độ trên thành ống để tiện biết dung dịch sử dụng.

Trong phòng thí nghiệm sinh viên có thể tự kéo mao quản cho mình. Lấy một ống thủy tinh có đường kính từ 1-2 mm, dài 10-20 cm(loại dùng để đo điểm nóng chảy). Hai tay cầm hai đầu ống, hơ đoạn giữa ống trên ngọn đèn cồn, vừa hơ vừa xoay vòng vòngđể khoảng vùng chính giữa của ống được nóng đều. Khi nhận thấy thủy tinh mềm dẻo có vẻ như muốn nóng chảy, dùng hai ngón tay năm hai đầu ống kéo dang ra xa(về hai phía), thủy tinh của ống sẽ giãn dài ra. Nhớ hai tay vẫn giữ hai đầu ống , chờ đến khi thủy tinh nguội, đông cứng lại mới thôi, nếu không ống còn nóng sẽ chảy cong queo.

Mỗi sinh viên chỉ chuẩn bị một vài cây mao quản có chiều dài chỉ vừa lòng bàn tay. Một ống mao quản có thể sử dụng để chấm nhiều loại mẫu dung dịch khác nhau, chỉ cần sau mỗi lần sử dụng, rửa sạch mao quản bằng dung môi hữu cơ như aceton.

Dùng một lọ thủy tinh nhỏ chứa một ít aceton để dành rửa mao quản. Khi aceton trong lọ hết, thì châm mới thêm một ít. Lọ này có nắp bằng nhựa. Soi thủng nắp nhựa một lỗ sao cho vừa đủ lọt ống mao quản. Khi cần chấm mẫu, rút mao quản ra khỏi lọ aceton, dí nhẹ đầu mao quản lên một tờ giấy thấm để hút bỏ aceton đang có trong ống, nhúng đầu mao quản vào dung dịch mẫu cần sắc ký để chấm lên bản sắc ký. Tiếp theo, muốn dùng mao quản đó để chấm vào dung dịch mẫu thứ nhì thì rửa ống mao quản vài lần với aceton: nhúng mao quản vào lọ aceton, rút ra và dí mao quản lên tờ giấy thấm, rồi lại rửa với aceton…thực hiện vài ba lần là mao quản sạch để tiếp tục làm việc với mẫu dung dịch khác. Không nên kéo vô số ống mao quản để mỗi cây cho một loại dung dịch: rất phí thời gian, mà các ống dùng rồi nếu vô ý vứt bừa bãi dễ gây tai nạn cho người khác, vừa mất công đổ bỏ.13.2.2. Chấm mẫu lên tấm bản mỏng

* Chuẩn bị tấm bản mỏng: Với các bản dùng để theo dõi sắc ký cột có thể tiết kiệm với bản có chiều dài 5cm. Với bản dùng để đo Rf, để sau này công bố kết quả, nên có chiều dài 10cm.

Từ tấm bản mỏng thương mại 20x20cm, dùng kéo cắt các bản có kích thước cần thiết. Lưu ý sao cho tấm bản lọt vào được trong bình giải ly.

Dùng bút chì để vạch nhẹ nét xuất phát và mức tiền tuyến dung môi.

0,5 cm

1 cm

Tiền tuyến dung môi

Mức xuất phát

Dùng bút chì vạch dấu trên bản mỏng

40

* Chuẩn bị dung dịch mẫu: Với mẫu là chất lỏng, có thể chấm trực tiếp mẫu lên bản mỏng, trong trường hợp đây là dung dịch quá sệt, có thể pha loãng mẫu. Với mẫu là chất rắn, phải hòa tan hoàn toàn mẫu trong dung môi hữu cơ phù hợp, với nòng độ 2-5%, dung môi hòa tan mẫu không nhất thiết phải là dung môi giải ly.

Nhờ một mao quản, đặt dung dịch mẫu lên bề mặt của tấm sắc ký lớp mỏng một cách thận trọng, tránh không làm lũng bề mặt của lớp mỏng. Thao tác: cầm mao quản nhúng vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ tự hút dung dịch lên mao quản, rồi đặt đầu mao quản chạm nhẹ lên bề mặt của tấm lớp mỏng, dung dịch trong ống sẽ chảy ra và thấm lên tấm lớp mỏng, để vết chấm chỉ lan rộng ra thành vết tròn có đường kính không qua 1mm.

Sắc ký lớp mỏng là phương pháp định tính vì thế mỗi vết chấm trên bản không nên chứa nhiều hơn 12μg(10μg là tối ưu) mẫu chất.Với một mẫu, có thể chấm nhiều lần, nhưng giữ cho vết chấm đừng lan rộng ra trên bản, vết phải có đường kính không qua 1mm, muốn thế, sau mỗi lần chấm, dùng miệng thổi hơi nhẹ hoặc dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi mới chấm tiếp theo vài lần nữa cho đến khi đủ lượng cần cho một vết chấm.

Sau khi chấm hoàn tất, dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly, điều này đặc biệt cần thiết nếu dung dịch pha mẫu là nước hoặc loại dung môi có độ bay hơi kém.

A B C D1 cm

Có thể chấm mẫu thành một vệt dài nhưng nhớ vẫn chừa

hai bên lề

Mỗi mẫu chấm một vếtCác vết cách nhau 1cm

A và D cách nhau 1,5 cm

Nếu cần khảo sát một lượt nhiều mẫu khác nhau, chuẩn bị các dung dịch mẫu này, mỗi dung dịch mẫu chấm một chấn lên cùng một bản, vết này cách vết kia 1cm. Hai vết ở hai bìa phải cách bờ 1,5 cm( đối với bản có kích thước 20x20 cm).

Với sắc ký lớp mỏng điều chế, dung dịch chất mẫu sẽ được chấm lên bản thành một đường dài, đều, dọc theo mức xuất phát. Có thể áp dụng khoảng 10mg cho một bản có kích thước 20x20 cm và chiều dày bản 5 mm. Trên mức tiền tuyến dung môi(cách bờ cạnh trên 0,5-1 cm), nên dùng một đầu viết chì vuốt nhọn vạch một đường hằn xuống lớp hấp thu. Làm như thế, khi dung môi giải ly đi lên đến đầu trên sẽ bị buột phải ngừng lại, giúp cho mỗi bản sẽ có kết thúc giống như nhau.

Khi dung môi lên đến đầu trên của bản, không nên để bản ở lâu trong bình, nên lấy bản ra khỏi bình giải ly, vì sự khuếch tán và sự bay hơi dung môi có thể làm các vết vừa tách được sẽ bị trải dài ra.1.3.2.3. Giải ly bản mỏng

Chuẩn bị bình giải ly bản mỏng

41

Chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bản mỏng. Kích thước của bình và lượng thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu. Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể vì như thế bầu khí quyển sẽ nhỏ nhất.

Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình. Với sắc ký lớp mỏng định tính, chỉ cần một thể tích khoảng 10 ml dung môi. Quan sát chiều dày của lớp dung môi trong bình giải ly: không được cao quá 1 cm, bởi vì các vết chấm mẫu trên bản mỏng cách bìa 1cm.

Nếu sắc ký lớp mỏng với các tấm bản lớn, sử dụng bình lớn, phải tính toán thể tích dung môi cần dùng để chiều dày của lớp dung môi trong bình không cao hơn khoảng cách của vết chấm trên bản mỏng.

Trước khi cho tấm bản mỏng vào bình, bình cần được bảo hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất, thực hiện bằng cách phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc. Một hậu quả dễ thấy là nếu bình không được bảo hòa dung môi, khi dung môi giải ly là hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung môi sẽ có hình lõm do dung môi đi ở hai bên cạnh nhanh hơn đi ở giữa bản.

Đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, cạnh đáy của bản ngập vào dung dịch giải ly khoảng 0,5-1,0 cm. Hệ dung môi dung ly phù hợp là sau khi giải ly, hệ sẽ cho các vết chính có Rf khoảng từ 0,3 đến 0,6.

Giải ly bản mỏng theo phương pháp để dung môi giải ly di chuyển lênSau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm lớp mỏng vào bình khai triển, để

cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dưới gần đáy bình không chạm vào dung môi. Cạnh đáy của tấm lớp mỏng ngập vào dung dịch giải ly khoảng 0,5-1cm. Lưu ý: Các vết mẫu không được ngập vào dung môi giải ly, vì như thế mẫu sẽ khuếch tán ngay lập tức vào dung môi. Các vết này phải cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,5cm, nghĩa là các vết mẫu phải được chấm cách bờ cạnh khoảng 1 cm.1.3.3. Hiện hình các vết sau khi giải ly bằng phương pháp hóa học

Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ được nhìn bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết cần sử dụng phương pháp hóa học. Phương pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa thuốc thử vào một dung môi thích hợp rồi phun xịt dung dịch thuốc thử này lên bản mỏng. Thuốc thử sẽ kết hợp với các hợp chất để tạo ra các dẫn xuất có màu. Các thuốc thử được xếp thành hai loại: đặc trưng và không đặc trưng.

Thuốc thử không đặc trưng khi nó tạo vết có màu hầu hết với tất cả các loại hợp chất hữu cơ, thí dụ như: iod, acid sulfuric, rhodamino B, chất chỉ thị phát huỳnh quang.

Thuốc thử đặc trưng khi nó chỉ tác dụng với những hợp chất có những nhóm chức hóa học đặc biệt, tạo vết có màu đặc trưng. Thí dụ: thuốc thử dinitrophenylhydrazine tác dụng với những hợp chất có nhóm carbonyl để tạo màu đỏ đậm.

Một vài thí dụ được trình bài trong bản 7:Bản 7: Một vài thuốc thử hiện hình sắc ký lớp mỏng.

Thuốc thử Màu của vết Hợp chấtHơi iod Vàng hoặc nâu Hợp chất hữu cơ nói chung .

Hợp chất bất bão hòa.2,7- Fluorescein Lục-vàng Đa số các hợp chất hữu cơNinhydrine Tím -hồng Amino acid, amino2,4-Dinitrophenylhydrazine Đỏ-cam Aldehyde, cetonClorua antimony Màu đặc trưng Steroid, hợp chất chi hoàn.

Vitamine, carotenoid.

42

Bromophenol blousee, Bromocresol green

Vàng Acid carboxylic

Diphenylcarbazid Màu đặc trưng Kim loại1.3.4. Phun xịt dung dịch thuốc thử lên bản mỏng và xử lý kết quả

Muốn khảo sát các hợp chất trên bản mỏng bằng các thuốc thử đặc trưng, phải thấm bản mỏng với dung dịch thuốc thử, có thể thực hiện theo hai cách:

* Phun xịt bản mỏng bằng bình phun xịt: Thuốc thử pha theo qui định và cho vào bình, thể tích thuốc thử chỉ được chiếm tối đa hai phần ba thể tích chứa của bình. Sử dụng khí nén hoặc một quả bóp cao su để tạo sức nén, giúp dung dịch đi ra khỏi bình dưới dạng giọt sương mịn. Phải bóp vài cái trước để tạo ra các giọt sương đều, rồi mới hướng đầu ra của bình vào tấm bản mỏng, sao cho hơi sương phủ đều lên bề mặt bản mỏng.

Phương pháp này có ưu điểm là dung dịch thuốc thử được sử dụng với lượng vừa đủ để tạo phản ứng màu với hợp chất trên bản mỏng, nhược điểm là cần phải có thao tác khéo léo, chuyên nghiệp nếu không dung dịch thuốc thử được phủ lên bản không đều, chỗ nhiều gây loang lỗ, chỗ ít không đủ để làm xuất hiện vết.

* Nhúng bản mỏng vào một lọ có chứa dung dịch thuốc thử: Ưu điểm của phương pháp này là dung dịch thuốc thử có thể phủ đều lên mặt bản. Nhựơc điểm là các chất mẫu nằm trên bản khi gặp một luợng lớn thuốc thử, chúng sẽ hòa tan luôn trong thuốc thử, có thể biến mất khỏi bản. Sau mỗi lần nhúng bản vào dung dịch, một lượng nhỏ chất hấp thu silicagel sẽ rơi vào dung dịch, sau một thời gian đáy bình chứa đầy silicagel, do đó phải thay dung dịch mới.

* Thường sau khi phun xịt dung dịch thuốc thử lên bản mỏng hoặc nhúng bản vào dung dịch thuốc thử, cần phải xúc tiến phản ứng bằng cách sấy nóng bản mỏng cho đến khi các vết xuất hiện. Sau đó cần ghi lại những thông tin cần thiết, các chi tiết có thể ghi lên mặt trước của bản bằng bút chì, hoặc ghi lên mặt sau bằng bút benzen. Các chi tiết như: dung môi giải ly, giá trị Rf của mẫu chất, hình dạng, màu sắc của vết, thuốc thử dùng để hiện hình các vết… Tờ bản mỏng cần được lưu trữ bằng cách bảo quản trong một bao plastic. Nhưng nếu để lâu, bản cũng sẽ bị phai màu hoặc hư hỏng. Tốt nhất là đối với các bản quan trọng cần phải lưu tài liệu, có thể làm các cách như sau:

- Đặt tấm bản mỏng dưới tờ giấy trong, dùng bút chì tô lại các vết đậm nhạt, vị trí các vết…

- Photocopy lại tấm bản mỏng.- Tốt nhất là chụp hình màu để lưu lại hình ảnh nguyên tấm bản với đầy đủ màu sắc

của các vết. Xử lý kết quảĐể công bố của một hợp chất, bên cạnh các số liệu phổ RMN, các đặc tính vật lý như

điểm nóng chảy, năng lực triền quang…cũng cần cho biết giá trị Rf của hợp chất đó. Mỗi hợp chất tinh khiết có một vết với sắc ký lớp mỏng, với giá trị Rf không đổi, trong một hệ dung môi dung ly xác định, bởi bản sắc ký của một lô sản xuất nhất định.

* Muốn đo Rf ta sử dụng thước để đo khoảng đường di chuyển của hợp chất và của dung môi. Thực hiện bài toán chia, kết quả Rf là con số không có đơn vị, luôn luôn nhỏ hơn 1(Rf

<1). Qui ước viết Rf với 2 con số lẻ sau dấu phẩy.

43

==b

aR f

==b

aR f

44,04411,05,8

75,3 ==cm

cm

b=8,5 cm

Tiền tuyến dung môi

Mức xuất phát

a= 3,75 cm

Nếu vết mẫu hiện trên bản mỏng là một vết tròn, nhỏ, đo khoảng cách từ mức xuất phát đến tâm của vết đó. Nếu vết mẫu quá to, phải thực hiện sắc ký lớp mỏng lại, giảm lượng mẫu chấm, sao cho vết hiện nhỏ, gọn.

Tuy rằng Rf của một chất có thể thay đổi theo nhiều yếu tố, nhưng có thể sử dụng Rf

để so sánh xem hai hợp chất có giống nhau hay không, vì khi chấm hai mẫu lên trên cùng một bản mỏng thì các yếu tố nói trên đã không còn ảnh hưởng. Muốn kết luận xem hai hợp chất nào đó có giống nhau hay không, phải đáp ứng cùng lúc hai điều kiện sau, thiếu một cũng không được, vì lý do sắc ký lớp mỏng có độ phân giải thấp.

* Về Rf của hai chất so sánh: Cả hai chất phải có hai vết với Rf luôn giống nhau. Chỉ cần có một bản có sự sai biệt giữa hai vết thì đó là hai chất khác nhau.

* Về màu sắc của hai vết đối với một loại thuốc thử: hai vết phải cho cùng một màu đối với một loại thuốc thử sử dụng. Nếu cho vết có Rf giống nhau mà màu khác nhau, cũng là hai chất khác nhau.

2. CƠ SỞ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI2.1. Điều kiện phòng thí nghiệm và thực trạng sinh viên Nhìn chung trang thiết bị về dụng cụ, hóa chất của phòng thí nghiệm là khá đầy đủ để thực hiện đề tài này. Tình hình sinh viên: Thực hành hóa sinh là một học phần được tiến hành sau khi sinh viên đã được trang bị khá đầy đủ các kiến thức cơ bản về hóa sinh, thực hành hóa hữu cơ… Vì vậy với những bài thí nghiệm định tính trong đề tài này là hoàn toàn phù hợp với nội dung chương trình.2.2. Mục tiêu của các bài thí nghiệm định tính hóa sinh+ Minh họa cho phần lý thuyết hóa sinh + Rèn luyện thao tác thực nghiệm cho sinh viên+ Hướng dẫn kỹ thuật tiến hành phản ứng hóa học cho sinh viên+ Rèn luyện tác phong và phương pháp tiến hành thực nghiệm hóa học cho sinh viên.2.3. Chuẩn bị thí nghiệm

Việc chuẩn bị cho thí nghiệm đóng vai trò rất quan trọng vào việc thành công hay thất bại của quá trình thí nghiệm. Cần hiểu rõ mình phải làm gì trong quá trình thực nghiệm và lý do vì sao phải làm như vậy. Trước khi thực hiện các bài thí nghiệm định tính này em phải sưu tầm rất nhiều tài liệu, tổng hợp các kiến thức liên quan đến tính chất của các hợp chất hóa sinh, phân tích và tra các dữ liệu cần thiết. Cuối cùng là dự đoán trước các vấn đề có thể xảy ra trong quá trình thí nghiệm, đặt ra các câu hỏi chuẩn bị. 2.4. Tiến hành thí nghiệm

Để thu được những thí nghiệm định tính thành công với hiện tượng rõ nhất, thì việc nắm vững lý thuyết của từng bài là cần thiết. Ngoài ra, các yếu tố thực nghiệm như cân, cách pha chế, nồng độ các chất, thao tác thí nghiệm cũng ảnh hưởng đến kết quả. Do đó, người làm thí nghiệm phải thật cẩn thận, chịu khó quan sát để nâng cao kỹ năng sau mỗi thí nghiệm. Vì vậy mỗi thí nghiệm phải được tiến hành lặp lại nhiều lần.

44

2.5. Theo dõi tiến trình thí nghiệmKhi tiến hành một thí nghiệm thì việc theo dõi là rất quan trọng và có ý nghĩ rất lớn

đối với người làm thực nghiệm. Nó giúp cho người làm thực nghiệm nắm được một cách hệ thống tiến trình thí nghiệm từ đó thấy được nguyên nhân của sự thành công hay thất bại của thí nghiệm. Nhất là đối với các thí nghiệm mang tính chất định tính thì việc quan sát là rất quan trọng. Sau mỗi bài em đều nhận xét, đánh giá để chọn ra những thí nghiệm có hiện tượng rõ nhất.2.5.1. Theo dõi tiến trình thí nghiệm+ Ghi rõ thời điểm bắt đầu và kết thúc của từng quá trình (phản ứng, đun cách thủy, lọc …)+ Quan sát sự thay đổi tốc độ, nhiệt độ khi cho các chất tác dụng với nhau và trong quá trình phản ứng.+ Ghi rõ các hiện tượng xảy ra trong hệ phản ứng: sự thu hay toả nhịêt, sự thay đổi màu sắc, sự hình thành các chất khí hoặc chất kết tủa và sự tách lớp…2.5.2. Rút ra kết luận và giải thích+ Giải thích các hiện tượng quan sát được+ Phân tích được những yếu tố nào dẫn đến thành công hay thất bại của thí nghiệm.+ Chọn ra hiện tượng rõ nhất trong các lần thực hiện cho từng thí nghiệm.+ Đặt ra các câu hỏi.3. CÁC ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU TRONG ĐỀ TÀI

Phạm vi đề tài này chỉ thực hiện trên sáu loại hợp chất, tương ứng với sáu bài thực hành định tính thuộc chương trình thực tập hóa sinh dành cho sinh viên sư phạm hóa.3.1. Bài 1: Glucid3.1.1. Tính chất của glucid3.1.1.1. Định nghĩa

Glucid là một nhóm các hợp chất hữu cơ phổ biến trong cơ thể thực vật, động vật và vi sinh vật, được tạo thành từ các nguyên tố C, H, O. Ngoài ra, trong thành phần cấu tạo của Glucid phức tạp còn có một số nguyên tố khác như N, S, P… Do tỉ lệ các nguyên tố H và O ở đa số Glucid giống nước, nên trước đây Glucid được gọi là Hidratcacbon. Sau đó người ta phát hiện thấy một số Glucid có thành phần nguyên tố không giống nước (đường desoxiribose – C5H10O4), một số hợp chất không có bản chất Glucid cũng có thành phần cấu tạo giống nước (acid lactic (CH2O)3), vì vậy tên gọi Hidratcacbon không phản ánh đầy đủ nhóm hợp chất hữu cơ này, vì vậy nó chỉ còn mang ý nghĩa lịch sử.

Hàm lượng Glucid rất cao trong các mô thực vật (chiếm khoảng 80% khối lượng khô) nhưng không đáng kể trong các mô động vật (chiếm khoảng 2% khối lượng khô).

Vai trò của Glucid rất quan trọng, tham gia mọi hoạt động sống của tế bào, cơ thể, thực hiện một số chức năng sinh học sau: - Là nguồn dinh dưỡng dự trữ dễ huy động (Glycogen động vật, tinh bột thực vật), cung cấp chủ yếu các chất trao đổi trung gian và năng lượng cho tế bào. - Là yếu tố cấu trúc của thành tế bào thực vật, vi khuẩn (peptidoglycan, xenlulose), hình thành nhóm bộ khung bảo vệ nhóm động vật chân khớp (chitine) …- Là thành phần cấu tạo của nhiều hợp phần quan trọng của tế bào như ADN, ARN, glycoprotein… Tham gia tích cực trong các quá trình tích lũy, sao chép thông tin di truyền, giữ vai trò “chìa khóa” ghi nhận các tín hiệu sinh học trên bề mặt màng tế bào, đảm bảo đặc hiệu giữa các tế bào.

Glucid gồm ba nhóm chính: Monosaccharides, Oligosaccharides, Polisaccharides. 3.1.1.2. Monosaccharides

Monosaccharides có công thức chung là: CnH2nOn (n>=3)

45

Theo công thức hoá học thì các monosaccharides là dẫn xuất của polyalcol ở dạng aldehyde hoặc ceton.

- Monosaccharides có chứa nhóm aldehyde gọi là aldose.

Monosaccharides có chứa nhóm ceton gọi là cetose.

Trừ dioxyaceton, tất cả các monosaccharides khác có chứa từ 3C trở lên đều có chứa nguyên tử carbon bất đối xứng (C*) và do đó có hiện tượng đồng phân quang học. Đặc điểm của các đồng phân quang học là có tính hoạt quang, nghĩa là có khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang phải (+) hoặc sang trái (-).

Số đồng phân quang học được tính theo công thức:N = 2n (n: số C* )

Danh pháp tương đối D – L : kí hiệu D và L biểu thị nhóm – OH của C* đứng xa nhóm carbonyl nhất ( tức cạnh C cuối cùng) nằm về phía bên phải hoặc bên trái đoạn thẳng hình chiếu của mạch carbon (nguyên tắc Fisher).

Hầu hết các monosaccharid trong thiên nhiên đều thuộc dãy D.Trong dung dịch, phân tử glucose và fructose có thể tạo thành mạch vòng 6 cạnh

hoặc 5 cạnh (phổ biến là vòng 6 cạnh).

Ở trạng thái tinh thể, cả hai dạng thẳng và vòng của monosaccharid có khả năng tồn tại riêng biệt, nhưng trong dung dịch chúng biến đổi qua lại từ dạng này sang dạng kia.

46

CHO

CH2OH

(CHOH)n Dạng aldose

CH2OH

(CHOH)n

CH2OH

C O

Dạng cetose

CHO

C*

CH2OH

H OH

CHO

C*

CH2OH

HO H

D- glyceraldehydeL- glyceraldehyde

CH2OH

H

CH2OH

OH

OH H

H OHO

H2CHC

OH

CH CH

OH

C

OH

CH2

OH OHO CH2OH

H

OH

CH2OH

OH H

H HOOdd dd

CH2OH

H

CH2OH

OH

OH H

H OHO

HO

H

OH

H

OHH

OH

CH2OH

HH O

Fructose Glucose

Fructose mạch hởAlpha fructose Beta fructose

Tính chất vật lý Monosaccharid là những chất rắn kết tinh, không màu, dễ tan trong nước, khó tan

trong alcol, không tan trong eter, cloroform và các hidrocacbon. Khi đun nóng các monose dễ bị phân huỷ.- Các dung dịch của chúng có tính chất trung tính, có vị ngọt khác nhau.

VD: Nếu độ ngọt của saccarose (đường mía) là 100% thìFructose : 173%Glucose (nho) : 74%Mantose : 32%Lactose (sữa) : 16%Xilose (gỗ) : 4%

Tính chất hóa họcVề mặt công thức hoá học thì monose là các polyhydroxi aldehyde hoặc

polyhydroxi ceton nên ta xét tính chất hoá học của 2 loại nhóm chức này. Phản ứng của nhóm cacbonyl- Phản ứng oxi hoá- Tác dụng với thuốc thử Tollens:

HOCH2[CHOH]4 -CHO + 2[Ag(NH3)2]OHto

3NH3 + 2H2O + 2Ag + HOCH2[CHOH]4COONH4

- Tác dụng với thuốc thử Feling:

- Tác dụng với nước Brom: các aldose bị oxi hoá thành acid aldonic.

Đây là phản ứng để phân biệt aldose và cetose. Trong môi trường acid, các acid aldonic dễ biến thành lacton.

- Tác dụng với HNO3: các aldose có nhóm chức aldehyde và cả nhóm alcol bậc 1 đều bị oxy hoá thành diacid. Đó là acid polyhidroxi dicarbonxylic có tên gọi chung là acid saccarid hay acid AADNric. Sau đó chúng có thể chuyển thành lacton hay dilacton.

47

HOCH2[CHOH]4 -CHOCu(OH)2,NaOH

NaOOC[CHOH]2COOKHOCH2[CHOH]4 -COONa + Cu2O

D - manose Natri D- manonat

HOCH2[CHOH]4 -CHOBr2 , H2O

HOCH2[CHOH]4 -COOH

D - glucose Acid D- gluconic

HOCH2[CHOH]4 -COOH- H2O

C

H OH

HO H

H OH

CH2

O

O

HO

CHO

H OH

H

OH

OH

CH2OH

HO

H

H

HNO3

COOH

H OH

H

OH

OH

COOH

HO

H

H

- H2O

H

CH2OH

H OH

OH H

OO

dung dịch

dung dịch

- Phản ứng khửKhi khử các monose cho polyalcol tương ứng. Tác nhân khử thường dùng là H2(Ni),

NaBH4, hỗn hống Na – Hg trong H2SO4 loãng.

Phản ứng tạo thành ozazonCác aldose có nhóm khi tác dụng với hydrazine hay phenyl hydrazine (có số mol gấp

3 lần) cho sản phẩm bis – 1,2 – hydrazon gọi là ozazon. Ozazon thường là những sản phẩm kết tinh, dễ tách khỏi hỗn hợp phản ứng.

Các cetose cũng tạo thành ozazon

Sự tạo thành ozazon chỉ liên quan đến C số 1 và 2 của monose. Vì vậy các aldose, cetose có cấu hình từ số 3 trở đi giống nhau sẽ cho cùng một ozazon.

Phản ứng tạo ozazon rất quan trọng trong việc nghiên cứu các glucid. Nó không những dùng để nhận biết, tách chât và chuyển hoá mà còn dùng để thiết lập cấu hình của glucid.- Phản ứng nối dài mạch C: ( PP Kiliani – Fisher)

Các aldose tác dụng HCN cho cặp đồng phân ciano, sau đó thuỷ phân thành acid, tiếp theo là khử acid sẽ thu được 2 aldose tăng thêm 1 C trong phân tử.- Phản ứng giảm mạch C:

+ PP Rup: Trước tiên oxy hoá aldose thành acid aldonic, sau đó oxy hoá muối Canxi của acid này bằng H2O2 có mặt sắt III acetat. Cuối cùng thu được aldose có ít hơn một nguyên tử C so với aldose đầu. + PP Von: là phương pháp thoái phân mạch C cho aldose. Lấy aldose cho tác dụng với hidroxyl amino NH2OH. Sau đó cho phản ứng với aldehyd acetic. Khi thuỷ phân giải phóng trở lại các nhóm OH, còn nhóm CN bị phân cách thành nhóm aldehyd giảm đi 1 C. - PP lên men: glucose nhờ enzyme (men rượu) biến thành etanol

C6H12O6 2C2H5OH + CO2

Phản ứng của nhóm OH:- Tác dụng Cu(OH)2 trong môi trường kiềm cho phức màu xanh.

48

HOCH2[CHOH]4 -CHONa , Hg

H+

HOCH2[CHOH]4 C

O

CH2OH

HOCH2[CHOH]4CH2OH

+H2

NiHOCH2[CHOH]5CH2OH

CH2OH

C=O

[CHOH]n

CH2OH

C6H5NHNH2

-C6H5NH2

-NH3

-H2O

CH=N

C=N

[CHOH]n

CH2OH

NHC6H5

NHC6H5

Ozazon

O

OH

HO

HO

CH2OHH

Cu(OH)2

OHOH2C

OH

O

O

OO

HO

CH2OH

CuO

OHH

H

- Phản ứng tạo eter: Nhóm OH hemiacetal của các monose dạng vòng có phản ứng cao. Có thể metyl hoá bằng tác nhân metyl hoá nhẹ nhàng như CH3OH/ HCl khan.

C

H OH

H

CH2OH

H OH

O + CH3OHHCl khan

C

H OH

H

CH2OH

H OCH3

O

Mỗi monose dạng vòng chỉ có một nhóm OH hemiacetal, các OH khác gọi là OH alcol. Các nhóm OH alcol bị metyl hoá bởi các tác nhân oxy hoá mạnh hơn. Ví dụ như (CH3)2SO4, NaOH hoặc CH3I, AgOH.- Phản ứng tạo este: Các nhóm OH của monosaccarid ( kể cả OH hemiacetal và OH alcol khác) có thể được este hoá bởi tác nhân acyl mạnh như halogenur acid hay alhydric acid trong môi trường baz yếu như piridine hay natriacetat.- Phản ứng tạo acetal và cetal vòng: Các monose tác dụng với acetol hay benzaldehyde có mặt HCl khan sẽ tạo ra dẫn xuất iso propyliden (cetal của acetal) hay benzyliden (acetal của benzaldehyd) tương ứng.

O

OH

OH

OH

CH2OH

OH

O

OH

O

OH

CH2OH

O

CCH3

CH3

OH

O

OHOH

CHOH

CH2OH

OH

O

O

O

CHOH

CH2OH

C CH3

CH3

aceton

HCl khan

-H2O

D-Glucose

49

Phản ứng tạo acetal hay cetal vòng thường được sử dụng để khoá nhóm OH nhằm bảo vệ. Nhóm acetal tương đối bền trong môi trường trung tính và baz, nhưng bị phân huỷ trong môi trường acid và đun nóng.

- Tác dụng với acid peiodic HIO4: Khi oxy hoá bằng HIO4 các monose bị oxy hoá gãy mạch cho sản phẩm là aldehyd và acid carboxylic có mạch ngắn hơn.

R-CHOH-CHOH-R’ + HIO4 RCHO +R’CHO +HIO3 + H2OR-CHOH-CHOH-CHOH-R’ + HIO4 RCHO+R’CHO + HCOOH +HIO3 +H2O

Một số monose tiêu biểuTriose

Monose có 3 nguyên tử cacbon: C3H6O3

Đó là ADNehyde glycerid và dioxiacetol.

CH

H OH

CH2OH

OCH2OH

C

CH2OH

O

Tetrose Là những monose có 4 nguyên tử cacbon : C4H8O4

Pentose Là những monose có 5 nguyên tử cacbon : C5H10O5

Trong tự nhiên thường gặp dưới dạng polysaccrid gọi chung là pentozal (C5H8O4)n. Khi đun nóng trong dung dịch acid, pentozal bị phân huỷ thành pentose.

(C5H8O4)n + n H2O n C5H10O5

Các pentozal có giá trị thường gặp trong tự nhiên là:

- D-xilose là thành phần chính trong nhựa cây, cũng như trong thành phần của hemixenlulozơ ở gỗ, rơm rạ, ngô, bông. Có thể tồn tại ở dạng mạch hở hay vòng.

50

D-glyceraldehyde Dioxiacetol

H+

to

CHO

H OH

HO H

H OH

CH2OH

O

OH

OH

OH

OH

O

OH OH

OH

OH

CH2OH

O

OH

OH

OH

OH

CH2OH

O

OCOCH3

OCOCH3

OCOCH3

OCOCH3

CH2OCOCH3

O

OCOCH3OCOCH3

OCOCH3

OCOCH3

CH2OCOCH3

(CH3O)2O

D - Glucose

-D-ribose và D-deoxiribose có vai trò quan trọng về mặt sinh học. Có trong thành phần của acid ribonucleic (ARN).

Khi loại bỏ oxi của nhóm OH ở C số 2 trong D-ribose được D-deoxiribose.

Các deoxiribose tham gia vào thành phần của acid deoxiribonucleic (ADN).

Hexose

- D-Glucose: monose phổ biến nhất trong tự nhiên và ý nghĩa quan trọng nhất.Được gọi là đường nho (do có nhiều trong quả hoa quả chín nhất là nho). Trong

máu người và đông vật có một lượng nhất định glucose (máu người có 0,1%). D-Glucose được điều chế trong công nghiệp bằng cách thuỷ phân tinh bột trong acid HCl loãng, trong nồi hấp áp suất khoảng 2atm. - D-Fructose: chất này có góc quay trái nên đôi khi còn gọi là levulose. Trong các loại quả, lá và hạt thì Fructose ở dạng tự do, trong cơ thể động vật thì D-Fructose được sinh ra như là sản phẩm từ sự thuỷ phân của saccarose hoặc là sự chuyển hoá của glucose.- D-Galactose: trong cơ thể gia súc D-galactose gặp trong thành phần của đường sữa lactose, gặp trong mô thần kinh dưới dạng các phức chất cerebroside, galactose3.1.1.3. Oligosaccharides

Định nghĩa

Oligosaccharide là carbohydrate có từ 2 đến 20 gốc monosaccharide, các gốc monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycoside. Oligosaccharide phổ biến nhất là disaccharide có hai gốc monosaccharide mà điển hình là sucrose (saccharose hay đường mía).

Một số oligosaccharide phổ biến

Maltose

Có nhiều trong mầm lúa, kẹo mạch nha, ... Maltose ít tồn tại ở dạng tự do mà chủ yếu được tạo thành khi thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase và khi hạt nảy mầm. Maltose được cấu tạo từ hai phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết glycoside giữa

51

CHO

H OH

H

H OH

OH

CH2OH

O

OHOH

CH2HO

OH

OCH2HO

OH

OH

C1 của một gốc glucose với C4 của một gốc glucose còn lại. Trong cấu tạo của maltose còn có một nhóm -OH tại vị trí C1 ở trạng thái tự do, do đó maltose là một đường khử.

Lactose: còn gọi là đường sữa (có trong sữa của động vật và người), là disaccharide được tạo thành từ một phân tử D-galactose và một phân tử D-glucose. Lactose là một disaccharide có tính khử do một nhóm -OH ở vị trí C1 của gốc đường glucose còn ở trạng thái tự do.

Saccharose: còn được gọi là sucrose hay đường mía, có nhiều trong củ cải đường, thân cây mía và nhiều loại củ quả khác. Saccharose không được tạo ra trong cơ thể động vật. Khi thủy phân saccharose bằng acid hoặc enzyme saccharase sẽ thu được α-D-glucopyranose và β-D-fructofuranose. Hai phân tử đường đơn này liên kết với nhau bằng liên kết 1,2-glycoside (hình 3.8). Khác với maltose và lactose, saccharose không có tính khử. Saccharose là một sản phẩm trung gian quan trọng của quang hợp, trong cơ thể thực vật, saccharose là dạng vận chuyển đường từ lá về các bộ phận khác của cơ thể thực vật.

3.1.1.4. Polisaccharides

Khái niệm

Trong tự nhiên hầu hết carbohydrate tồn tại ở dạng polysaccharide. Polysaccharide là carbohydrate chứa trên 20 gốc monosaccharide, một số polysaccharide chứa tới hàng trăm hoặc hàng ngàn gốc monosaccharide. Polysaccharide còn gọi là glycan, chúng khác nhau về đơn vị cấu tạo, độ dài của mạch và độ phân nhánh. Polysaccharide không có vị ngọt, không có khả năng tạo thành dung dịch thật khi tan trong nước, nếu tan trong nước chúng chỉ tạo ra dung dịch keo. Trong cơ thể sinh vật, polysaccharide chủ yếu giữ vai trò cấu trúc hoặc dự trữ. Khác với protein, polysaccharide không có phân tử lượng đặc trưng. Sự khác nhau này là do sự khác nhau trong cơ chế sinh tổng hợp hai loại polymer này. Protein được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu (mARN) với trình tự và độ dài xác định. Sinh tổng hợp polysaccharide không theo khuôn mẫu, chương trình sinh tổng hợp polysaccharide do bản chất của enzyme xúc tác và không có điểm kết thúc đặc trưng trong quá trình tổng hợp. Polysaccharide được chia thành hai nhóm: polysaccharide thuần (homopolysaccharide) và polysaccharide tạp (heteropolyssaccharide). Ngoài ra, theo quan điểm dinh dưỡng động vật, người ta còn chia polysaccharide thành hai nhóm: tinh bột và polysaccharide phi tinh bột (nonstarch polysaccharide: NSP).

52

Polysaccharide thuần

Polysaccharide thuần chỉ chứa một loại đơn vị cấu tạo duy nhất (hình 3.9). Một số polysaccharide thuần đóng vai trò dự trữ các gốc đường đơn để cung cấp nhiên liệu cho cơ thể. Tinh bột và glycogen là những polysaccharide thuần thuộc nhóm này. Một số polysaccharide thuần khác như cellulose và chitin đóng vai trò là yếu tố cấu trúc của thành tế bào thực vật và vỏ cứng của nhiều loài động vật như côn trùng, giáp xác.

53

- Tinh bột: được tạo ra từ thực vật, là nguồn năng lượng dự trữ quan trọng của thực vật và là thức ăn quan trọng của động vật và người. Tinh bột có nhiều ở hạt, củ, quả. Trong các mô ở thực vật, tinh bột thường tồn tại ở dạng hạt có hình dáng kích thước và cấu tạo khác nhau tùy theo nguồn gốc. Các hạt tinh bột không tan trong nước lạnh. Khi đun nóng và khuấy đều trong nước, tinh bột nở ra và khuyếch tán thành dung dịch keo gọi là hồ tinh bột, hồ tinh bột tác dụng với iod cho màu xanh tím.

Tinh bột có hai thành phần là amylose (chiếm khoảng 20%) và amylopectin (chiếm khoảng 80%) và không có tính khử. Hai thành phần này có một số đặc điểm cấu tạo và tính chất khác nhau, tuy vậy chúng đều được cấu tạo từ các đơn phân là α-D-glucose. Amylose tan được trong nước, cho màu xanh với iod, có cấu tạo mạch thẳng do các đơn vị α-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết (α 1→ 4) glycoside (hình 3.10 và 3.12). Khi tan trong nước, mạch amylose có thể bị xoắn lại. Amylopectin không tan trong nước, tạo thành tính keo của hồ tinh bột và cho màu tím với iod. Amylopectin được tạo thành từ các đơn vị α-D-glucose nối với nhau bằng liên kết (α 1→ 4) và tại điểm phân nhánh là (α 1→ 6). Từ 24 đến 30 gốc glucose lại có một điểm phân nhánh. Tinh bột bị thủy phân bởi acid vô cơ ở nhiệt độ cao hoặc bởi enzyme trong đường tiêu hóa để tạo thành các sản phẩm trung gian có tên gọi chung là dextrin cho màu khác nhau với iod, sau đó tạo thành maltose và cuối cùng là glucose: hồ tinh bột (màu xanh tím với iod) → Amylodextrin (màu tím với iod) → Erythrodextrin (tím nhạt đến đỏ nâu với iod) → Acrodextrin (màu đỏ nâu với iod) → Maltose (không cho màu với iod) → Glucose (không cho màu với iod).

54

- Glycogen: là polysaccharide dự trữ của các tế bào động vật. Cũng giống như amylopectin, glycogen là một polymer được tạo thành do các đơn vị glucose nối với nhau bằng liên kết (α 1→ 4) và liên kết (α 1→ 6) tại điểm phân nhánh. Tuy vậy, số lượng nhánh trong phân tử glycogen lớn hơn nhiều so với số lượng nhánh trong phân tử amylopectin, cứ 8 đến 10 gốc glucose lại có một điểm phân nhánh. Glycogen có nhiều trong gan và cơ vân của động vật. Trong mô gan, glycogen có thể chiếm đến 7% trong lượng của gan tươi và hạt glycogen có kích thước lớn do sự tạo thành các bó glycogen từ những hạt có kích thước nhỏ hơn. Cuối mỗi nhánh có một đầu không có tính khử, do đó số lượng đầu không có tính khử của glycogen bằng số lượng nhánh có trong phân tử. Khi glycogen được sử dụng như một nguồn năng lượng, các đơn vị glucose được tách dần ra khỏi phân tử glycogen từ đầu không có tính khử. Enzyme phân giải glycogen chỉ có thể xúc tác từ đầu không có tính khử, nhưng có thể thực hiện việc xúc tác đồng thời trên nhiều nhánh khác nhau, do đó đảm bảo tốc độ phân giải nhanh glycogen thành monosaccharide, các thông tin chi tiết về sự phân giải glycogen sẽ được trình bày trong chương chuyển hóa carbohydrate. Việc dự trữ glucose dưới dạng glycogen có ý nghĩa quan trọng đối với tính thẩm thấu cũng như đối với khía cạnh năng lượng. Người ta đã tính toán rằng tế bào gan dự trữ glycogen với số lượng tương đương nồng độ glucose 0,4M. Glycogen là dạng không hòa tan và chỉ đóng góp một phần rất nhỏ đến khả năng thẩm thấu (osmolarity) của tế bào chất (chỉ khoảng 0,01 μM). Nếu nồng độ glucose trong tế bào chất là 0,4M thì khả năng thẩm thấu sẽ tăng cao đến mức đe dọa sự sống của tế bào, sẽ dẫn đến sự di chuyển của nước từ ngoài vào tế bào chất và tế bào có thể bị vỡ. Ngoài ra, với nồng độ glucose nội bào là 0,4M trong lúc đó nồng độ

55

glucose ngoại bào chỉ khoảng 5mM, sự thay đổi năng lượng tự do trong quá trình thu nhận glucose ngược gradient nồng độ quá lớn là rất lớn và quá trình thu nhận glucose từ ngoài vào tế bào có thể bị ngăn trở.

- Dextran: là polysaccharide của vi khuẩn và nấm men được tạo thành từ các đơn vị D-glucose nối với nhau bằng liên kết (α 1→ 6). Tất cả các loại dextran đều có mạch nhánh ở liên kết (α 1→3), một số dextran có mạch nhánh ở liên kết (α 1→ 2) và (α 1→ 4).

- Cellulose: là chất có cấu trúc dạng sợi và không tan trong nước, được tìm thấy trong thành tế bào thực vật. Cellulose là thành phần chính của gỗ, bông chứa cellulose gần như nguyên chất. Cũng giống như amylose, cellulose là polysaccharide thuần không phân nhánh, được cấu tạo từ 10.000 đến 15.000 đơn vị D-glucose. Tuy vậy có sự khác nhau rất quan trọng: cellulose được tạo thành từ các đơn vị β-D-glucose trong khi đó amylose, amylopectin và glycogen được tạo thành từ các đơn vị α-D-glucose. Các đơn vị glucose trong cellulose nối với nhau bằng liên kết (β 1→ 4) glycoside, ngược lại với amylose, amylopectin và glycogen là liên kết (α 1→ 4) glycoside. Sự khác nhau này đã dẫn đến sự khác nhau rất lớn về mặt cấu trúc và tính chất vật lý giữa cellulose và amylose. Nhiều loài động vật không thể sử dụng cellulose làm nguồn nhiên liệu vì không có enzyme thủy phân liên kết (β1→ 4) glycoside. Động vật nhai lại và một số loài động vật khác như thỏ, ngựa có khả năng sử dụng cellulose làm nguồn nhiên liệu chính do chúng có hệ vi sinh vật phong phú trong đường tiêu hóa, những vi sinh vật này tiết ra enzyme để phân giải cellulose. Phương pháp Weende (phân tích gần đúng / approximate analysis) đã dẫn đến thành phần xơ thô khi phân tích thành phần dinh dưỡng của thức ăn có nguồn gốc thực vật. Thành phần chủ yếu của xơ thô là cellulose, pentosane và lignine (dẫn xuất của phenylpropan).- Chitine: là một polysaccharide thuần được cấu tạo từ các đơn vị N-acetylglucosamino nối với nhau bằng liên kết (β1→ 4) glycoside. Sự khác nhau duy nhất về mặt hóa học giữa chitin và cellulose là sự thay thế nhóm hydroxyl ở vị trí C2 bằng một nhóm được acetyl hóa (CH3-CO-NH-) (hình 3.17). Chitine có dạng sợi giống như cellulose và động vật cũng không tiêu hóa được chitin. Chitine là thành phần cơ bản của lớp vỏ cứng của nhiều loài sinh vật, là polysaccharide phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose.

56

- Inuline: là một polysaccharide dự trữ của thực vật, được cấu tạo từ các đơn vị fructose. Phân tử lượng của inuline thấp vì nó chỉ có khoảng 30 gốc fructose, do đó polysaccharide này dễ dàng hòa tan trong nước. - Glucane: có cấu tạo tương tự cellulose, chúng được tạo thành từ các đơn vị β-glucose. Tuy vậy, ngoài liên kết (β1→ 4) còn có liên kết (β1→ 3) glycoside với tỉ lệ giữa hai loại liên kết này là từ 3-4/1.

Polysaccharides tạp

Polysaccharide tạp là những đại phân tử có cấu trúc phức tạp, được tạo ra từ nhiều loại monosaccharide khác nhau, dẫn xuất của các monosaccharide hay còn có thêm những chất khác. Polysaccharide có nhiều trong tự nhiên và có nhiều vai trò sinh học quan trọng. Ở mô bào động vật, nhiều loại polysaccharide tạp có trong khoảng giữa các tế bào, chúng tạo thành matrix giữa các tế bào, từ đó làm cho các tế bào có thể liên kết được với nhau, giúp tế bào giữ được hình dạng, bảo vệ và trợ giúp cho tế bào, mô, và cơ quan trong nhiều hoạt động khác nhau. - Hemicellulose: Hemicellulose là một nhóm chất gồm nhiều loại polysaccharide của thực vật, cùng với cellulose tạo nên thành tế bào thực vật, có nhiều trong các bộ phận của thực vật như rơm rạ, bẹ ngô, trấu, vỏ cứng của hạt, các bộ phận đã hóa gỗ của thực vật. Về mặt hóa học, hemicellulose được tạo thành từ polysaccharide của xylose (xylan), arabinose (araban), mannose (mannan), galactose (galactan).

- Pentosane: Pentosane là polysaccharide được cấu tạo từ arabinose và xylose, là một bộ phận cấu tạo của hemicellulose. Hàm lượng pentosane có thể chiếm đến 20% vật chất khô của cỏ. - Pectine: Pectine là polysaccharide của thực vật, được cấu tạo từ galacturonic acid. Một số nhóm carboxyl của các gốc galacturonic acid được ester hóa với methanol. Pectine có nhiều trong củ, quả, mô mềm như lá cây.

57

- Polysaccharide tạp của thành tế bào vi khuẩn (peptidoglycan) và tảo (agar): Thành tế bào vi khuẩn chứa polysaccharide tạp, polysaccharide này được tạo thành do sự thay đổi luân phiên giữa các gốc N-acetylglucosamino (GlcNAc) và N-acetylmuramic acid (Mur2Ac), các gốc này nối với nhau bằng liên kết (β1→ 4) (hình 3.18). Các phân tử này nằm cạnh nhau và được gắn với nhau bằng liên kết ngang (cross-link) thông qua một đoạn peptide mạch ngắn, cấu trúc chính xác của đoạn peptide này phụ thuộc vào từng loài vi khuẩn. Các đoạn peptide này giúp cho các chuỗi polysaccharide tạo thành một lớp vỏ chắc bao xung quanh tế bào và ngăn chặn sự trương nở dẫn đến sự tan vỡ tế bào do sự hút nước từ ngoài môi trường vào tế bào. Lysozyme tiêu diệt vi khuẩn bằng cách thủy phân liên kết (β1→ 4) giữa N-acetylglucosamino và N-acetylmuramic acid. Mắt và một số loại virus của vi khuẩn cũng có khả năng tiết lysozyme. Penicilline và các kháng sinh liên quan khác tiêu diệt vi khuẩn bằng cách ngăn cản sự tổng hợp đoạn peptide mạch ngắn làm nhiệm vụ nối các chuỗi polysaccharide, do đó làm cho thành tế bào vi khuẩn bị yếu và có thể bị tan vỡ.

Một số loại tảo đỏ và rau câu có thành tế bào chứa agar, là một polysaccharide tạp. Agar có hai thành phần: một thành phần không phân nhánh là agarose và một thành phần phân nhánh là agaropectin (hình 3.19).

- Polysaccharide tạp của matrix ngoại bào: Khoảng giữa các tế bào trong các mô bào của động vật đa bào tồn tại một chất đặc quánh tương tự gel gọi là matrix ngoại bào. Matrix

58

ngoại bào liên kết các tế bào với nhau, tạo ra các lỗ cho sự khuyếch tán của các chất dinh dưỡng và oxy đi đến tất cả các tế bào. Matrix ngoại bào được tạo ra do sự cài vào nhau của heteropolysaccharide và các protein hình sợi như collagen, elastin, fibronectin và laminoin. Các polysaccharide tạp này là các glycosaminoglycan (mucopolysaccharide). Các glycosaminoglycan được cấu tạo từ các đơn vị disaccharide, mỗi disaccharide có một monosaccharide là N-acetylglucosamino hoặc là N-acetylgalactosamino, trong hầu hết các trường hợp một monosaccharide còn lại là uronic acid mà thông thường là D-glucuronic hoặc L-iduronic acid. Trong một số glycosaminoglycan, một hoặc nhiều nhóm hydroxyl của đường amino được ester hóa với sulfate. Glycosaminoglycan được gắn vào các phân tử protein ngoại bào để tạo thành proteoglycan (hình 3.20). Có thể kể một số glycosaminoglycan quan trọng như sau:+ Hyaluronic acid: được cấu tạo từ N-acetylglucosamino và D-glucuronic acid. Hyaluronic acid tạo thành dung dịch trong và rất nhớt có tác dụng làm trơn các khớp xương và làm cho thủy tinh dịch của mắt động vật có xương sống đặc như thạch. Hyaluronic acid còn là thành phần quan trọng của matrix ngoại bào của sụn và gân, làm tăng tính co giãn và chắc của các tế bào này vì hyaluronic acid tương tác mạnh với các thành phần khác trong matrix ngoại bào. Hyaluronidase là enzyme được tiết ra bởi một số vi khuẩn gây bệnh, enzyme này có thể thủy phân liên kết glycoside của acid hyaluronic làm cho các mô bào dễ bị vi khuẩn xâm nhập. Ở nhiều loài sinh vật, một enzyme tương tự có trong tinh dịch có thể xúc tác cho quá trình thủy phân glycosaminoglycan bao xung quanh tế bào trứng để giúp tinh trùng xâm nhập vào bên trong tế bào chất. + Chondroitin sulfate: là một glycosaminoglycan có nhiều trong tổ chức sụn, tổ chức liên kết (gân, da, van tim và thành động mạch).+ Heparin: là chất chống đông máu do tế bào lớn (mast cell, một loại tế bào bach cầu) tiết ra và được đưa vào máu. Heparin chống đông máu bằng cách gắn vào phân tử protein antithrombin. Sự gắn kết này của heparin tạo ra sự gắn kết của antithrombin vào thrombin và ức chế enzyme protease này.+ Keratan sulfate: là glycosaminoglycan không có uronic acid. Keratan sulfate có trong giác mạc, sụn, xương, sừng, tóc, móng, vuốt.

59

- Glycoprotein và glycolipid+ Glycoprotein: có một hoặc nhiều chuỗi oligosaccharide liên kết cộng hóa trị với một phân tử protein (hình 3.21). Glycoprotein được tìm thấy trên bề mặt ngoài của màng nguyên sinh chất, trong matrix ngoại bào và trong máu. Ở trong tế bào, glycoprotein có trong một số bào quan như phức hệ golgi, các hạt thải tiết và lysosome. Tỉ lệ oligosaccharide của glycoprotein ít hơn rất nhiều so với các chuỗi glycosaminoglycan trong proteoglycan. + Glycolipid: là lipid màng trong đó các phân tử oligosaccharide nằm ở đầu ưa nước (hình 3.22). Giống như glycoprotein, oligosaccharide hoạt động như là vị trí nhận biết của các protein liên kết với carbohydrate.

3.1.2. Thực hành thí nghiệm3.1.2.1. Phản ứng oxi hóa khử

Các đường khử có nhóm -CHO trong phân tử có thể bị oxi hóa cho acid tương ứng. Phản ứng Trome- Nguyên tắc

Các nhóm -CHO của đường có thể bị oxi hóa bởi ion Cu2+ trong môi trường kiềm tạo thành muối acid tương ứng. Phản ứng này được nhận biết trên sự xuất hiện kết tủa Cu2O màu đỏ.CH2OH-(CHOH)4-CHO + 5NaOH + 2CuSO4 CH2OH-(CHOH)4-COONa + 2Na2SO4 + Cu2O↓ + 3H2O

Màu đỏ- Hóa chất

+ Glucose 2%, Maltose 2%, Fructose 2%, Saccharose 2%. Cân chính xác mỗi chất 2 gam cho vào becher, sau đó thêm nước cho đủ 100g.

+ NaOH 10%: Cân 10 gam NaOH hòa tan trong 90 gam nước.

60

+ CuSO4 5%: Cân 7,81gam CuSO4.5H2O hòa tan trong nước sau đó thêm nước vào cho đủ 100 gam. - Thực hành

Lấy 4 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 4, lần lượt cho vào mỗi ống 1 ml NaOH 10%, thm vo mỗi ống từng giọt CuSO4 5% đến khi xuất hiện kết tủa. Sau đó thêm tiếp vào mỗi ống như sau:- Ống 1: 2ml Glucose 2% - Ống 2: 2ml Maltose 2% - Ống 3: 2ml Fructose 2% - Ống 4: 2ml Saccharose 2% Đun sôi các ống nghiệm, quan sát và giải thích ?- Kết quả và giải thích: Ở ống 1, 2, 3 đều có hiện tượng kết tủa đỏ Cu2O xuất hiện, còn ống 4 không hiện tượng. Do glucose và maltose đều có nhóm –CHO nên chúng bị oxi hóa bởi ion Cu2+ trong môi trường kiềm tạo kết tủa đỏ Cu2O. Còn fructose không có nhóm –CHO nhưng trong môi trường kiềm nhóm ketone của fructose sẽ biến đổi thành nhóm aldehyde, cho nên nó cũng có kết tủa đỏ Cu2O xuất hiện. Saccharose không có nhóm –CHO nên không có hiện tượng trên. Phản ứng tráng gương- Nguyên tắcCác monosaccharides khử muối bạc thành kim loại Ag. Cơ chế phản ứng :

( )[ ] 34234323 NONHOHNHAgOHNHAgNO OH + →+

CO

(HCOH)4

CH2OH

H

+ 2[Ag(NH3)2] OH

3NH3 H2O

CO

(HCOH)4

CH2OH

ONH4+ 2Ag

- Hóa chất

+ AgNO3 5%: Cân 5 gam AgNO3 hòa tan trong 95 gam nước.

+ Glucose 5%, Maltose 5%, Fructose 5%, Saccharose 5%. Cân mỗi chất 5 gam hòa

tan trong 95 gam nước.

+ NH3 đặc.

- Thực hành

Lấy bốn ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1ml AgNO3 5% và từng giọt NH3 đặc để tạo

thành kết tủa. Sau đó thêm từ từ NH3 vào cho đến khi kết tủa tan hoàn toàn ( không cho

thừa NH3). Tiếp tục cho vào mỗi ống:

+ Ống 1: 3 ml Glucose 5% + Ống 2: 3 ml Maltose 5% + Ống 3: 3 ml Fructose 5% + Ống 4: 3 ml Saccharose 5%

Đun sôi các ống trong 5 phút. Quan sát sự tạo thành lớp bạc trắng bao quanh ống nghiệm và giải thích ?- Kết quả và giải thích: Đun sôi lần lượt các ống nghiệm ta thấy ở ống 1, 2, 3 có lớp bạc trắng xuất hiện, còn ống 4 không hiện tượng. Do glucose, maltose có nhóm –CHO nên khử

61

Glucose

được muối bạc trong môi trường NH3 tạo ra lớp bạc trắng. Còn fructose không có nhóm –CHO nhưng trong môi trường base yếu nhóm ketone chuyển thành nhóm aldehyde (-CHO) nên khử được muối bạc. Phản ứng Nilander- Nguyên tắc

Bi(OH)3 có thể bị -CHO của đường khử thành Bi ↓.

3332 )()( NaNOOHBiNaOHNOOHBi +→+3CH2OH-(CHOH)4-CHO+2Bi(OH)3 3CH2OH-(CHOH)4-COOH+ 2Bi↓ + 3H2O- Hóa chất

+ Glucose 1%, Maltose 1%, Fructose 1%, Saccharose 1%: Cân mỗi chất 1gam hòa tan trong 99 gam nước.

+ Thuốc thử Nilander: Hòa tan 2 gam bismut oxinitrat [BiO(NO)3.H2O) và 4 gam muối seignet trong 100 ml NaOH 10%. Đun nóng trên nồi cách thủy sôi, khuấy đều, để nguội lọc tủa, được dung dịch trong, bảo quản trong lọ màu. - Thực hành

Lấy 4 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 4, lần lượt cho vào:- Ống 1: 2ml Glucose 1% + 15 giọt thuốc thử Nilander- Ống 2: 2ml Maltose 1% + 15 giọt thuốc thử Nilander - Ống 3: 2ml Fructose 1% + 15 giọt thuốc thử Nilander- Ống 4: 2ml Saccharose 1% + 15 giọt thuốc thử Nilander

Đun sôi các ống nghiệm trong khoảng 4 phút, quan sát và giải thích ?- Kết quả và giải thích: Đun sôi các ống nghiệm ta thấy ở ống 1,2,3 xuất hiện kết tủa đen. Ống 4 không hiện tượng. Do glucose, maltose có nhóm –CHO nên khử được Bi(OH)3 của thuốc thử Nilander thành Bi có màu đen. Còn fructose không có nhóm –CHO nhưng trong môi trường base nhóm ketone chuyển thành nhóm aldehyde (-CHO) nên khử được Bi(OH)3

thành Bi. Còn saccharose không có nhóm –CHO nên không có hiện tượng. Phản ứng Fehling- Nguyên tắc

Các đường khử có thể khử phức alcolat Cu thành Cu2O.

- Hóa chất+ Glucose 2%, Maltose 2%, Fructose 2%, Saccharose 2%.+ Thuốc thử Fehling: Thuốc thử Fehling pha chế bằng cách trộn hai thể tích tương

đương của hai dung dịch sau: Dung dịch 1: Hòa tan 63,9g CuSO4.5H2O tinh khiết trong nước. Acid hóa nhẹ

dung dịch thu được bằng dung dịch H2SO4 loãng. Thêm nước cất đến 1 lít. Dung dịch có màu xanh da trời.

Dung dịch 2: Hòa tan 346g tactrat kép kali natri (muối Seignette) và 120g NaOH trong nước sau đó thêm nước cất đến thể tích 1 lít. Dung dịch này không màu.

Trộn 2 dung dịch theo tỉ lệ 1:1 ngay trước khi sử dụng . Khi bảo quản lâu phải để riêng 2 dung dịch.

62

NaOH2 4

COOK

CH-O

CH-O

COONa

H

H2 2

CH OH(CHOH) -COONa 2 4

+

+ Cu O+2H O

COOK

CH-O

CH-O

COONa

CuO

O

CH

CHH

H

COONa

COOK

4CH OH(CHOH) -CHO +2

- Thực hànhLấy 4 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 4, lần lượt cho vào:

- Ống 1: 1ml Glucose 2% + 10 giọt thuốc thử Fehling- Ống 2: 1ml Maltose 2% + 10 giọt thuốc thử Fehling - Ống 3: 1ml Fructose 2% + 10 giọt thuốc thử Fehling- Ống 4: 1ml Saccharose 2% + 10 giọt thuốc thử Fehling

Đun sôi các ống nghiệm trong khoảng 3 phút, quan sát và giải thích?- Kết quả và giải thích: Đun sôi lần lượt các ống nghiệm, quan sát ta thấy ở ống 1, 2, 3 đều có hiện tượng kết tủa đỏ Cu2O xuất hiện, còn ống 4 không hiện tượng. Do glucose và maltose đều có nhóm –CHO nên chúng có thể khử phức alcolat trong môi trường kiềm tạo kết tủa đỏ Cu2O. Còn fructose không có nhóm –CHO nhưng trong môi trường kiềm nhóm ketone của fructose sẽ biến đổi thành nhóm aldehyde, cho nên nó cũng có kết tủa đỏ Cu2O xuất hiện. Saccharose không có nhóm –CHO nên không có hiện tượng trên. 3.1.2.2. Phản ứng màu Phản ứng với thuốc thử Molish:- Nguyên tắc

Dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc các pentose và hexose bị khử nước cho furfural và hidroximetil furfural, các chất này trong môi trường acid cho phản ứng thế thân điện tử trên α-Naptol cho sản phẩm có màu tím(quinoit).

Màu tím

- Hóa chất-Naptol 1%: Cân 1g α-Naptol hòa tan trong 99g cồn tuyệt đối.

+ H2SO4 đậm đặc.+ Glucose 2%, Fructose 2%, Saccharose 2%.

- Thực hànhLấy 4 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 4, lần lượt cho vào:

- Ống 1: 2ml nước cất + 5 giọt α-Naptol1% (mẫu đối chứng)- Ống 2: 2ml Glucose 2% + 5 giọt α-Naptol1%- Ống 3: 2ml Fructose 2% + 5 giọt α-Naptol1%- Ống 4: 2ml Saccharose 2% + 5 giọt α-Naptol1%

63

HO-CH2

O

OH OH

OHH H

H

H

H SO2 4

Ribose

2

FurfuralO

CHO + 3H O

OCHO + 2

OH

+ H O2

HO OH

CH

O

HO OH

CH

O

H SO2 4

HO

C

O

O

Cho tiếp vào mỗi ống 1ml H2SO4 đậm đặc (nghiêng các ống nghiệm và cho từ từ theo thành ống), quan sát sự xuất hiện vòng màu giữa 2 lớp chất lỏng, giải thích?- Kết quả và giải thích: Khi cho từ từ H2SO4 đậm đặc vào các ống nghiệm, quan sát ta thấy ở ống 2, 3, 4 xuất hiện vòng nâu có màu tím đậm ở giữa. Còn ở ống 1 không có vòng nâu. Do glucose, fructose , saccharose dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc chúng bị khử nước cho furfural và hidroximetil furfural, các chất này trong môi trường acid cho phản ứng thế thân điện tử trên α-Naptol cho ra sản phẩm có màu tím. Phản ứng của nhóm carbonil-Sự tạo thành Ozazon với Phenilhidrazine- Nguyên tắc

Nhóm carbonil của đường cho phản ứng cộng thân hạch, tiếp theo là phản ứng khử nước với Phenilhidrazine trong môi trường acid tạo thành các ozazon có tinh thể khác nhau về hình dạng và tính chất vật lý. Phản ứng này dùng để nhận danh các đường.

- Hóa chất+ Glucose 5%, maltose 5%, saccharose 5%: Cân mỗi chất 5 gam hòa tan trong 95

gam nước.+ Acid acetic glacial (acid acetic băng).+ Phenilhidrazine.

- Thực hànhLấy 3 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 3, lần lượt cho vào:

- Ống 1: 3ml Glucose 5% + 5 giọt Acid acetic glacial và 5 giọt dung dịch Phenilhidrazin- Ống 2: 3ml maltose 5% + 5 giọt Acid acetic glacial và 5 giọt dung dịch Phenilhidrazin- Ống 3: 3ml Saccharose 5% + 5 giọt Acid acetic glacial và 5 giọt dung dịch Phenilhidrazine

Nung các ống nghiệm trên các nồi cách thủy khoảng 50 phút, quan sát hiện tưọng và giải thích ?- Kết quả và giải thích: Sau khi nung trên nồi cách thủy khoảng 30 phút quan sát ta thấy ở ống 1, 2, 3 xuất hiện kết tủa vàng. Do glucose và maltose là các đường khử có nhóm cacbonyl nên chúng phản ứng được với phenilhidrazine tạo thành các tinh thể ozazon có màu vàng. Còn saccharose là đường không khử nhưng trong môi trường acid saccharose bị thủy phân tạo glucose và fructose phản ứng được với phenilhidrazine, vì thế saccharose tạo được kết tủa. Phản Ứng Selivanop- Nguyên tắc: Dưới tác dụng của acid đặc, các monosaccharides bị khử nước tạo thành oximetylfurfural, sau đó kết hợp với rezoxine tạo thành sản phẩm có màu đỏ anh đào. Phản ứng đặc trưng với các xetohexose nhưng không nhạy đối với aldohexose.- Hóa chất

+ Thuốc thử Selivanôp: hòa tan 0,5 gam rezoxine trong 100 ml HCl 20%.+ HCl 20%: + Fructose 1%, glucose 1%: Cân mỗi chất 1 gam hòa tan trong nước, sau đó thêm

nước cho đủ 100 gam. - Thực hành

64

H OHHHOOHOH

HH

CHO

CH OH2

+ 3 NH -NH-C H 2 6 5

H HHOOHOH

HH

CH OH2

6C=N-NH-C H

5

CH=N-NH-C H56

+ NH + 2H O

+ NH -C H3 2

2 56

Lấy 2 ống nghiệm, cho vào ống 1: 1ml fructose 1%; ống 2: 1ml glucose 1%. Thêm vào mỗi ống 3 giọt thuốc thử Selivanôp, đun sôi các ống nghiệm khoảng 5 phút. Quan sát hiện tượng thu được và giải thích kết quả ?- Kết quả và giải thích: Đun sôi các ống nghiệm ta thấy ở ống 1 xuất hiện màu đỏ anh đào tươi, còn ống 2 xuất hiện màu đỏ anh đào. Do fructose và glucose dưới tác dụng của HCl đặc chúng bị khử H2O tạo thành oximetylfurfural, sau đó chúng kết hợp với rezoxin tạo sản phẩm có màu đỏ anh đào, fructose phản ứng nhạy hơn glucose. 3.1.2.3. Phản ứng thủy phân- Nguyên tắc

Các disaccharide và polisaccharide được tạo thành từ các phân tử đường bởi liên kết O-Glucoside (các Acetal), các liên kết này có thể bị thủy giải với xúc tác acid hoặc enzyme cho monosaccharide.- Hóa chất

+ Tinh bột 1%: Cân 1gam tinh bột cho thêm nứơc vào đủ 100 gam, đặt lên bếp khuấy đến khi dung dịch trong, nhắc xuống để nguội là sử dụng được. + Thuốc thử Liugol: Hòa tan 2,5 gam KI trong 10 ml nước cất, sau đó cho 1 gam I2

vào dung dịch KI, khuấy đều, cho I2 tan hoàn toàn. Dùng nước cất dẫn đến mức 100 ml. Bảo quản trong lọ màu.

+ Thuốc thử Fehling.+ NaOH 10%.+ Saccharose 5%.+ HCl đậm đặc.

- Thực hành+ Thí nghiệm 1

Lấy 2 ống nghiệm đánh số từ 1, 2, cho vào mỗi ống 3ml Saccharose 5%. Sau đó cho vào ống 2 ba giọt HCl đđ. Đun 2 ống nghiệm trong nồi cách thủy 15 phút, rồi trung hòa ống 2 bằng dung dịch NaOH 10% (dùng giấy quỳ để thử pH dung dịch). Sau đó cho vào mỗi ống 2ml dung dịch thuốc thử Fehling (1ml Fehling A và 1ml Fehling B), đun sôi khoảng 3 phút, quan sát hiện tượng trong 2 ống nghiệm và giải thích.- Kết quả và giải thích: Khi cho vào mỗi ống 2ml dung dịch thuốc thử Fehling và đun nóng một lúc ta thấy ở ống 2 có kết tủa đỏ (Cu2O) xuất hiện, còn ở ống 1 thì không hiện

tượng. Do saccharose được cấu tạo từ α-Glucose và β-Fructose bởi liên kết O-Glucoside nên trong môi trường acid sẽ bị thủy phân cho ra các monosaccharide. Ở ống 2 có acid HCl nên saccharose sẽ bị thủy phân cho α-Glucose khử phức alcolat (trong thuốc thử Fehling) cho kết tủa đỏ. Còn ở ống 1 không có acid nên saccharose không bị thủy phân nên không có hiện tượng. + Thí nghiệm 2

Lấy 2 ống nghiệm đánh số từ 1, 2, cho vào mỗi ống 3ml tinh bột 1%. Sau đó cho vào ống 2 năm giọt HCl đậm đặc. Đem đun sôi 2 ống nghiệm và thỉnh thoảng thử dung dịch trong 2 ống nghiệm bằng cách thêm vào 2 giọt thuốc thử Lugol, đến khi ống 2 với thuốc thử Lugol không còn màu xanh (vàng nhạt). Lấy 2 ống nghiệm ra và trung hòa ống 2 bằng NaOH 10% (dùng giấy pH để thử). Sau đó cho vào mỗi ống 2ml dung dịch thuốc thử Fehling (1ml Fehling A và 1ml Fehling B), đun sôi khoảng 3 phút, quan sát hiện tượng trong 2 ống nghiệm và giải thích.- Kết quả và giải thích: Khi cho vào mỗi ống 2ml dung dịch thuốc thử Fehling và đun nóng một lúc ta thấy ở ống 2 có kết tủa đỏ (Cu2O) xuất hiện, còn ở ống 1 thì không hiện

tượng. Do tinh bột được cấu tạo từ nhiều gốc α-Glucose bởi liên kết O-Glucosid nên trong

65

môi trường acid sẽ bị thủy phân cho ra các monosaccharide. Ở ống 2 có acid HCl nên tinh bột sẽ bị thủy phân cho α-Glucose khử phức alcolat (trong thuốc thử Fehling) cho kết tủa đỏ. Còn ở ống 1 không có acid tinh bột không bị thủy phân nên không có hiện tượng. 3.2. Bài 2: Amino acid và protein3.2.1.Tính chất 3.2.1.1. Định nghĩa

Protein (Protit hay Đạm) là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là amino aicd. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein. Công thức tổng quát:

H2N CH

R1

CO NH CH

R2

CO....[ NH CH

Rn

CO]n OH

Trong tế bào của cơ thể sinh vật, protein chiếm tỉ lệ ít so với các hợp chất hữu cơ khác như glucid, lipit nhưng lại có vai trò quyết định đến toàn bộ quá trình trao đổi chất.Protein có hàng loạt các đặc tính mà không thể có được ở bất kỳ một hợp chất hữu cơ nào khác. Những đặc tính này đảm bảo chức năng của các thể protein với tư cách là những chất mang sự sống. Đó là tính muôn màu muôn vẻ trong cấu trúc, tính đặc hiệu khá cao về loài, có nhiều những biến đổi lý hóa khác nhau, có khả năng tương tác nội phân tử, có khả năng thích ứng với những thay đổi có quy luật của cấu hình phân tử khi có tác dụng từ bên ngoài, có thể tái lập trạng thái ban đầu khi ngừng tác dụng, tương tác với các hợp chất hóa học khác để hình thành các phức hợp và các cấu trúc trên phân tử, đồng thời có khả năng xúc tác sinh học…3.2.1.2. Cấu tạo của phân tử protein

Phân tử protein được tạo thành từ các amino aicd. Vì thế muốn hiểu được cấu tạo, tính chất của protein, trước hết phải xét cấu tạo, tính chất của amino aicd. Amino aicd

Amino aicd là những dẫn xuất của acid hữu cơ aliphatic trong đó một nguyên tử hiđro( đôi khi hai) của gốc alkyl được thay thế bởi nhóm amino (-NH2).Công thức tổng quát của acid α amino:

R CH

NH2

COOHα

Tùy theo nhóm amino (-NH2) đính vào các vị trí khác nhau của nguyên tử cacbon trong gốc alkyl (R) so với nhóm cacboyl (-COOH) mà ta có các acid α- amino hoặc acid β- amino hoặc acid γ- amino.

Các amino aicd gặp trong tế bào động, thực vật hầu hết là các acid α- amino. Cho đến ngày nay người ta chỉ phát hiện thấy trong phân tử protein động, thực vật, có chứa khoảng 19 amino aicd và 2 amide. Có nhiều cách sắp xếp các amino aicd thành các nhóm khác nhau, một trong những cách này là chia thành hai nhóm dựa vào tính phân cực và không phân cực của amino aicd.* Các amino aicd thường gặp trong protein của tế bào động thực vật

Amino aicd phân cực Amino aicd không phân cựcTên gọi thông

thườngViết tắt Tên gọi thông

thườngViết tắt

Serine Ser Glycine GlyThreonine Thr Alanine AlaCysteine Cys Valine Val

66

Tyrosine Tyr Leucine LeuAsparagine Asn Isoleucine IleGlutamino Gln Methionine MetAspartic acid Asp Phenylalanine PheGlutamic acid Glu Tryptophan TrpLysine Lys Proline ProArginine ArgHistidine His

Trong số các amino aicd kể trên, có một số cơ thể ngưòi và động vật không tự tổng hợp được mà phải lấy từ thức ăn thực vật, người ta gọi là amino aicd không thay thế được (hay amino aicd cần thiết). * Các amino aicd không thay thế

Số TT Tên amino aicd Viết tắtAlanineLeucineIsoleucineThreonineMethionineLysineTryptophanPhenylalanineHistidine

ValLeuIleThrMetLysTrpPheHis

Trong thực tế, để nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn cho người và động vật, người ta thường phối trộn các loại thức ăn khác nhau nhằm bổ sung sự thiếu hụt amino aicd không thay thế của từng loại thức ăn. Bột dinh dưỡng của trẻ em và thức ăn của gà công nghiệp là những ví dụ rõ nét về vấn đề này. Một số tính chất hóa lí của amino aicd

Tính đồng phân quang học (đồng phân lập thể) của amino aicd Tính hoạt quang là một đặc tính quan trọng của các amino aicd trong protein. Trừ

glycine là amino aicd không chứa nguyên tử cacbon bất đối xưng (C*), tất cả các amino aicd khác đều có một hoặc hai nguyên tử cacbon bất đối, do đó chúng đều có khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực, nghĩa là chúng đều là những chất hoạt quang.

Người ta quy ước lấy amino aicd serine làm đơn vị so sánh để xét đồng phân quang học của amino aicd.

COOH

C* HH2N

CH2OH

COOH

C* NH2H

CH2OH

L Serine D Serine

Tất cả các amino aicd có trong protein đều có cấu hình L ở các nguyên tử Cα , cấu hình D rất ít gặp. Người và động vật không thể đồng hóa các amino aicd thuộc dãy D. Một số amino aicd như threonine, oxiproline, isoleusine… có 2 nguyên tử cacbon bất đối, do đó chúng có 4 đồng phân quang học, ký hiệu L được dùng để chỉ chất đồng phân quang học có trong protein, kí hiệu D để chỉ chất đồng phân gương của nó, còn lại hai chất kia được ký hiệu là L-allo và D-allo tùy theo nguyên tử Cα của chúng có cấu hình L hay D.

67

Như vậy số đồng phân quang học của amino aicd là 2n ( n là số nguyên tử cacbon bất đối có trong phân tử amino aicd ). Dạng D hay L chỉ cấu hình của phân tử amino aicd, còn ký hiệu (+) hay (-) biểu hiện tính quang hoạt của amino aicd. Trong tự nhiên, thành phần amino aicd của protein chủ yếu là L(-) amino aicd. Vì thế ta có thể giải thích tại sao protein lại có tính chất làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang trái.

Tính chất lưỡng tính của amino aicdPhân tử amino aicd vừa có nhóm (-NH2) thể hiện tính base vừa có nhóm (-COOH) thể

hiện tính acid. Vì thế phân tử amino aicd mang tính chất lưỡng tính.Trong dung dịch nước, các phân tử amino aicd có thể phân li thành ion H+ và ion OH-

các amino aicd sẽ biến đổi thành các dạng cation hoặc anion tùy theo PH của môi trường.Trong môi trường acid, nhóm cacboxyl bị kiềm hãm phân li phân tử amino aicd tích

điện dương, trong điện trường một chiều nó dịch chuyển về cực âm. Trong môi trường kiềm xảy ra hiện tượng ngược lại.

Tùy theo cấu tạo hóa học của amino aicd và PH của môi trường mà nó tồn tại, ở PH môi trường mà amino aicd trung hòa về điện được gọi là điểm đẳng điện của amino aicd, kí hiệu là PI (point isoelectric). Tại điểm đẳng điện của amino aicd, tổng số điện tích bằng 0 và không dịch chuyển trong điện trường một chiều, đồng thời có độ hòa tan kém nhất.

Tùy theo số nhóm –COOH và số nhóm –NH2 có trong phân tử amino aicd và tùy thuộc vào hằng số phân li của các nhóm này mà PI của các amino aicd khác nhau là khác nhau. Ví dụ: Acid aspactic có PI= 2,77. Acginine PI= 10,78. Valine PI= 5,96.

Phản ứng của gốc RGốc R là nhóm nguyên tử trong phân tử amino aicd vốn liên kết với Cα, không tham

gia tạo liên kết peptide.Các amino aicd khác nhau có gốc R khác nhau, điều này đã tạo nên tính muôn hình

muôn vẻ của protein. Bản chất hóa học của R cho phép thực hiện nhiều phản ứng hóa học khác nhau như

phản ứng tạo muối, amide hóa, halogen hóa, nitro hóa, khử amino hóa, este hóa ……Tính phân cực và không phân cực của gốc R quy định tính hòa tan của protein trong các dung môi khác nhau.- Phản ứng đặc trưng của amino aicd là phản ứng Ninhidrine (xem phần thực hành).Phản ứng Ninhidrine được sử dụng để định tính và định lượng amino aicd nhờ phương pháp sắc ký trên giấy, sắc ký trên cột nhựa trao đổi ion bằng máy phân tích amino aicd tự động. Đây là phản ứng nhạy, cho phép phát hiện được các amino aicd ở nồng độ vài microgam. Peptide

Peptide là sản phẩm ngưng tụ của các amino aicd trong đó liên kết peptide (-CO-NH-) được tạo thành do nhóm COOH của amino aicd này kết hợp với nhóm NH2 của amino aicd kia, loại trừ đi một phân tử nước.

H2N CH

R1

CO OH +H NH CH

R2

COOH - H2OH2N CH

R1

CO NH CH

R2

COOH

Tùy theo số gốc amino aicd tham gia tạo liên kết peptide mà ta có dipeptide, tripeptide…polipeptide.Giữa polipeptide và protein được phân biệt nhau bởi khối lượng phân tử và tính tan trong dung dịch tricloaxetic 10%.

68

Nếu M≥ 5000, quy định gọi là phân tử protein, còn ngược lại được gọi là chuỗi polipeptide. Chuỗi polipeptide có thể tan được trong dung dịch tricloaxetic 10%. Cấu trúc của phân tử protein

Theo thuyết polipeptide trong cấu tạo phân tử protein được E.Fisher đề xướng dựa trên những ý kiến của A.Ja. Danhilepski về vai trò của các liên kết peptide trong phân tử protein. Theo thuyết này thì các phân tử protein đều là những polipeptide khổng lồ, được tạo thành từ hàng chục, có khi từ hàng trăm gốc amino aicd, chúng liên kết với nhau bằng liên kết peptide. Ví dụ như trong phân tử insuline có trong tuyến tụy của người và động vật, được tạo nên từ 51 amino aicd, Tripsinogen(chất tiền thân của emzyme Tripsine) được tạo nên bởi 234 amino aicd. Rất nhiều bằng chứng xác thực đã chứng minh cho học thuyết này. Cấu trúc bậc một: Các amino aicd nối với nhau bởi liên kết peptide hình thành nên chuỗi polypepetide. Đầu mạch polypeptide là nhóm amino của amino aicd thứ nhất và cuối mạch là nhóm cacboxyl của amino aicd cuối cùng. Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp của các amino aicd trên chuỗi polypeptide. Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các amino aicd trên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptide, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng như vai trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các amino aicd có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein. Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không gian. Chuỗi polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β, được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những amino aicd ở gần nhau. Các protein sợi như keratin, Collagen... (có trong lông, tóc, móng, sừng) gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu có nhiều nếp gấp β hơn. Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc không gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của protein. Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm -R trong các mạch polypeptide. Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfur (-S-S-), nhóm -R của proline cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị nước thì chui vào bên trong phân tử... Các liên kết yếu hơn như liên kết hyđro hay điện hóa trị có ở giữa các nhóm -R có điện tích trái dấu. Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhau thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein. Các chuỗi polypeptide liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như liên kết hyđro. Tính chất lí học, hóa học và sinh học của protein Tính chất lí học

- Khối lượng phân tử protein: Protein có khối lượng phân tử lớn, từ hàng nghìn đến hàng triệu hoặc lớn hơn nữa. Enzyme Ribonucleaza có khối lượng phân tử thấp: 12700, Eudestine của bông có khối lượng phân tử trung bình 300.000, lớn hơn cả khối lượng phân tử của virus bệnh khảm thuốc lá: 40 triệu.

- Sự biến tính của protein: Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ học... hay tác nhân hóa học như acid, kiềm mạnh, muối kim loại nặng,... các cấu trúc bậc hai, ba và bậc bốn của protein bị biến đổi nhưng không phá vỡ cấu trúc bậc một của nó, kèm theo đó là sự thay đổi các tính chất của protein so với ban đầu. Đó là hiện tượng biến tính protein. Sau khi bị biến tính, protein thường thu được các tính chất sau:

69

+ Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ nước vốn đã chui vào bên trong phân tử protein

+ Khả năng giữ nước giảm + Mất hoạt tính sinh học ban đầu + Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme proteaza do làm xuất hiện các liên

kết peptide ứng với trung tâm hoạt động của proteaza + Tăng độ nhớt nội tại + Mất khả năng kết tinh

- Tính hấp thụ trên bề mặt của phân tử protein: Protein có khả năng hấp thụ các hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ và các ion ở trên bề mặt của nó hoặc giữ chặt các chất này trong lòng phân tử. Nhờ vậy mà phân tử protein có thể hoàn thành những chức năng đặc biệt của mình trong cơ thể sinh vật như vận chuyển các sản phẩm trao đổi chất, hấp thụ và trao đổi khoáng ở cơ thể thực vật.

- Phân tử protein còn có hàng loạt các tính chất vật lí khác như: Tính di động trong điện trường, tính hoạt quang, tính hấp thụ tia tử ngoại… những tính chất này có thể dùng định lượng protein hoặc dùng để xác định khối lượng phân tử của chúng. Tính chất hóa học của protein( xem phần thực hành thí nghiệm) Tính chất sinh học của protein

Được thể hiện ở một số chức năng sinh học chính của protein:- Chức năng xúc tác: Do protein là thành phần cơ bản của enzyme nên nó đóng vai trò xúc tác cho hầu hết các phản ứng của quá trình trao đổi chất. Cơ chế của chức năng này được đề cập chi tiết ở chương enzyme.- Chức năng vận chuyển: Ví dụ: hemoglobin vận chuyển O2 trong máu người và động vật. Do phân tử hemoglobin có cấu trúc đặc biệt nên nó đã kết hợp được với phân tử O2 để vận chuyển tới các tế bào, tại đây nó lại kết hợp với phân tử CO2 để loại trừ ra khỏi cơ thể. Có thể hình dung theo sơ đồ sau:

Hb + O2 HbO2

HbO2 + CO2 HbCO

- Hoạt tính hocmon hay hoạt tính kích thích: Đó là khả năng tác dụng lên các nhóm phản ứng hóa học trong quá trình trao đổi chất của cơ thể.- Chức năng bảo vệ: Khả năng tạo các chất kháng thể ở cơ thể người và động vật khi có vi khuẩn gây bệnh xâm nhập vào cơ thể đều có liên quan mật thiết với tiểu phân γ-globulin ccủa protein máu. Các chất kháng thể dễ dàng kết hợp với kháng nguyên( vi khuẩn gây bệnh) để tạo thành phức hợp kháng thể-kháng nguyên không hoạt động.3.2.2. Thực hành thí nghiệm3.2.2.1. Phản ứng Ninhidrine- Nguyên tắc

Ở nhiệt độ cao các α-Amino Acid bị khử CO2, NH3 tạo thành Aldehyde có ít hơn Amino Acid ban đầu một carbon, NH3 sinh ra cho phản ứng cộng với 2 phân tử Ninhidrine. Tiếp theo là sự khử nước tạo thành Ruheman có màu tím xanh.

70

O

O

O

+ NH3

O

O

NH + H O 2

O

O

O

+ 2[H]

OH

O

N

O

OH O2

NH2

OH

O

+ NH 3

O

OO

N

ONH4

-3

R CH COO

NH3

NHCH R +H2O

RCHO + NH

H2CO2

H2O

--

-t 0

Ruheman(màu tím xanh)

Riêng đối với Proline phản ứng với 1 phân tử Ninhidrine cho màu vàng:

- Hóa chất+ Glycine 0,5%: Cân 0,5 gam Glycine hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cho đủ

100 gam.+ Albumine 1%: Cân 1 gam albumine hòa tan trong nước nóng, thêm nước cho đủ

100 gam. Nếu sử dụng lâu thì thêm một một ít muối NaCl.

+ Ninhidrine 0,2%: Cân 0,2 gam ninhidrine hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cho đủ 100 gam.- Thực hành

Lấy 2 ống nghiệm, lần lượt cho vào:-Ống 1: 1ml Glycine 0,5%-Ống 2: 1ml Albumine 1% Thêm vào mỗi ống 5 giọt Ninhidrine 0,2%. Đun nóng trong 1 phút, quan sát hiện tượng màu, giải thích ? - Kết quả và giải thích: Khi đun nóng 2 ống nghiệm ta thấy cả hai ống đều có màu xanh tím (ống 1 màu đậm hơn ống 2) . Do Glycine và Albumine bị khử tạo NH3 và NH3 cộng hợp với 2 phân tử ninhidrine, tiếp theo là sự khử nước tạo thành ruheman có màu tím xanh. 3.2.2.2. Phản ứng xantoproteid- Nguyên tắc

Là phản ứng đặc trưng cho các Amino Acid vòng thơm như Phenilalanine, Tryptophan, Tyrosine. Khi phản ứng với HNO3 tạo hợp chất nitro hoặc đinitro có màu

vàng. Thêm dung dịch kiềm tạo thành muối natri hay amon của dinitrotirozin màu vàng da cam.

71

O

O

O NH

COOH

+

O

O

N

Ninhidrine Proline Màu vàng

OH

CH - CH - COOH

NH2

2

+ 2 HNO 3

2

2NH

CH - CH - COOH

OHNO2O2N

+ 2H O2

Tyrosine Dinitrotyrosine (màu vàng)

Dinitrotyrosine Muối Natrium của Dinitrotyrosine- Hóa chất

+ Phenol 1%: Cân 1 gam phenol hòa tan trong 99 gam nước.+ HNO3 2:1 : Lấy 2 thể tích HNO3 nguyên chất hòa tan trong 1 thể tích H2O.+Gelatine 1%: Cân 1 gam Gelatine hòa tan trong nước nóng, thêm nước cho đủ 100

gam. Nếu sử dụng lâu thì thêm một ít muối NaCl.- Thực hành

Lấy 3 ống nghiệm, lần lượt cho vào:-Ống 1: 1ml Phenol 1%-Ống 2: 1ml Albumine 1%-Ống 3: 1ml Gelatine 1%

Thêm từ từ (theo thành ống nghiệm) mỗi ống 10 giọt HNO32:1. Đun sơi trong 1 pht màu vàng xuất hiện,để nguội. Cho từ từ từng giọt NaOH 30% đến khi màu vàng ở ống 1 và ống 2 biến đổi. Cũng tiến hành như vậy với ống 3 và so sánh kết quả 3 ống này, giải thích?- Kết quả và giải thích: Khi cho từ từ từng giọt NaOH 30% vào mỗi ống nghiệm ta thấy ở ống 1 và 2 có màu da cam (ống 1 màu đậm hơn ống 2), còn ống 3 có màu vàng nhạt. Do phenol và albumine phản ứng với HNO3 tạo ra các hợp chất nitro có màu vàng, khi thêm NaOH vào tạo ra muối Na có màu vàng da cam.3.2.2.3. Phản ứng pholia- Nguyên tắc

Trong các phân tử Cisteine và Metionine liên kết S-C không bền dễ bị thay thế dưới tác dụng của dung dịch base tạo thành Sulfur Natrium, và Sulfur Natrium này phản ứng với Acetate Chì tạo thành kết tủa PbS màu đen.

72

+ NaOH

ON

ONa

O

CH - CH – COO-

NH3

+2

2NH

3

+

CH - CH – COO-

OHNO2O2N

2NH

3

+

CH - CH – COO-

NO2O2NONa

Pb(CH COO) + 2NaOH Pb(OH) + 2CH COONa2 23 3

2Pb(OH) + 2NaOH Na PbO + 2H O

2 2 2

Na PbO + Na S + 2H O PbS + 4NaOH2 2 2 2

+ 2NaOH

CH -OH

CH -NH

COOH

2

2

Serine

+ Na S + H O2 2

CH -SH

CH -NH

COOH

2

2

Cisteine

- Hóa chất+ Cisteine 0,2%: Cân 0,2 gam cisteine hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cho đủ

100 gam.+ Pb(CH3COO)2 5%: Cân 5 gam Pb(CH3COO)2 hòa tan trong nước, sau đó thêm nước

cho đủ 100 gam.+ NaOH 10%: Cân 10 gam NaOH hòa tan ttrong 90 gam nước.

- Thực hànhLấy 3 ống nghiệm, lần lượt cho vào:

-Ống 1: 1ml Cisteine 0,2%-Ống 2: 1ml Albumine 1%-Ống 3: 1ml Gelatine 1%

Thêm vào mỗi ống 4ml NaOH 10%, đun sôi nhẹ trong 3 phút, để nguội. Thêm vào mỗi ống vài giọt (CH3COO)2Pb 5%. Quan sát, so sánh và giải thích?- Kết quả và giải thích: Khi đun nhẹ với NaOH và cho thêm vài giọt (CH3COO)2Pb vào ta thấy ở ống 1, 2 xuất hiện màu nâu đen, còn ống 3 không hiện tượng. Do khi đun với NaOH các liên kết C-S trong Albumine và cisteine bị cắt đứt nên khi cho (CH3COO)2Pb vào thì ion S2- kết hợp với ion Pb2+ tạo ra PbS có màu nâu đen. Còn Gelatine trong phân tử không có liên kết C-S nên không bị thủy phân cho ra ion S2- vì thế không xuất hiện màu nâu đen.3.2.2.4. Phản ứng Pauli- Nguyên tắc

Tirosine, Histidine là các Amino Acid có nhân thơm cho phản ứng với chất thân điện tử là Acid diazobenzensulfonic tạo hợp chất màu azo.

- Hóa chất+ Na2CO3 10%: Cân 10 gam Na2CO3 hòa tan trong 90 gam nước.

73

OH

CH -CH-COOH

NH2

2

+ N -C H -SO2 6 4 3 NaO S

Na CO3

32

N=N SO Na3

OHN=N-

CH -CH-COOH

NH2

2

+ CO2 + H

2O

Màu azo

+ Na CO2 3

+ 2 O S3 N

2

N

N

CH -CH-COOH

NH2

2

H

= N-

Acid diazobenzensulfonic

3 NNaO SN

N

H

3N SO Na-N=

CH -CH-COOH

NH

2

2

+ CO + H O2 2

Histidine

+ Thuốc thử diazo: Hòa tan 1 gam acid sunfanilic trong 100 ml HCN 1N, sau đó trộn với 10 ml nitritnatri 0,7% trong nước cất nhận được acid diazobenzosunfuric. Acid diazobenzosunfuric dễ bị phá hủy, vì vậy chỉ pha trước khi dùng.

+ Histidine 0,1%: Cân 0,1 gam histidine hòa tan trong nước nóng, tiếp tục thêm nước cho đủ 100 gam.

+ Tirosine 0,1%: Cân 0,1 gam tirosine hòa tan trong nước nóng, tiếp tục thêm nước cho đủ 100 gam.- Thực hành

Lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống vài giọt thuốc thử diazo và 5 giọt Na2CO310%. Sau đó lần lượt cho vào:-Ống 1: vài giọt Histidine 0,1%, lắc đều-Ống 2: vài giọt Tirosine 0,1%, lắc đều-Ống 3: nhỏ từ từ theo thành ống dung dịch Albumine 1% cho đến khi xuất hiện một vòng màu trên mặt phẳng phân cách giữa 2 lớp chất lỏng, lắc đều.

Quan sát màu dung dịch trong 3 ống nghiệm, giải thích?

- Kết quả và giải thích: Khi phản ứng xảy ra ta thấy ống 1 có màu đỏ, ống 2 có màu da cam, ống 3 có màu đỏ da cam. Khi tác dụng với thuốc thử diazo histidine tạo phức chất màu đỏ, tirosine tạo phức chất màu da cam. Còn albumine tạo phức với thuốc thử diazo có màu đỏ da cam. 3.2.2.5. Phản ứng với thuốc thử Isatine- Nguyên tắc

Proline và Hidroxi proline cho phản ứng súc hợp với Isatine trong môi trường acid cho sản phẩm có màu. Phản ứng này dùng để phát hiện Proline và Hidroxi proline.

Chât có màu- Hóa chất

+ Thuốc thử Isatine: Cân 0,03 gam Isatine hòa tan trong CH3COOH kết tinh (acid băng), thêm acid cho đủ 100 gam.

+ Proline 0,1%: Hòa tan 0,1 gam proline vào nước, sau đó thêm nước cho đủ 100 gam.

+ Albumine 1%.-Thực hành

Lấy 3 ống nghiệm, lần lượt cho vào:+Ống 1: 1ml Proline 0,1%+Ống 2: 1ml Hidroxi proline 0,1%+Ống 3: 1ml Albumine 1%

Thêm vào mỗi ống vài giọt thuốc thử Isatine, đun cách thủy 5 phút. So sánh hiện tượng trong các ống nghiệm, giải thích ?- Kết quả và giải thích: Thêm vào mỗi ống vài giọt thuốc thử Isatine và đun cách thủy ta thấy ở ống 1 có màu xanh lơ đậm, ống 2 có màu xanh nhạt, ống 3 có màu xanh lơ. Do proline, hidroxi proline và albumine phản ứng với thuốc thử Isatine tạo ra các sản phẩm có màu.3.2.2.6. Phản ứng Sacaguchi- Nguyên tắc

74

O

ONH

2 +NH

COOHO

NH

NH

O NH

+ CO + 2H O22

Các dẫn xuất của Guanidine như Arginine, Metyl guanidine, Glicocianine cho phản ứng thế thân điện tử với α-Naptol và oxid hóa với NaOBr cho sản phẩm màu. Phản ứng này dùng để phát hiện Arginine.

- Hóa chất+ Arginine 0,1%: Cân 0,1 gam arginine hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cho đủ

100 gam.+ NaOH 15%: Cân 15 gam NaOH hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cho đủ 100

gam.+ α-Naptol+ NaOBr(sacaguchi II): 8 ml Brôm + 500 ml NaOH 5%.

- Thực hànhLấy 2 ống nghiệm, lần lượt cho vào:

-Ống 1: 1ml Arginine 0,1%-Ống 2: 1ml Albumine 1%

Thêm vào mỗi ống 1ml NaOH 15%, 2 giọt α-Naptol, lắc đều, thêm 2 giọt dung dịch NaOBr. Quan sát hiện tượng và giải thích?

- Kết quả và giải thích: Khi cho α-Naptol và NaOBr vào 2 ống nghiệm ta thấy cả hai ống có màu đỏ gạch. Do arginine và albumine cho phản ứng thế thân điện tử trên α-Naptol và bị oxi hóa bởi NaOBr tạo ra sản phẩm có màu đỏ gạch.3.2.2.7. Phản ứng Biurea- Nguyên tắc

Trong môi trường kiềm mạnh, các nhóm -NH, -OH trong liên kết peptide cho phản ứng với Cu(OH)2 tạo thành phức màu, cường độ màu tùy thuộc vào lượng Cu2+

và các nhóm amide có trong phân tử.

- Hóa chất

+ CuSO4 1%: Cân 1,5625 gam CuSO4.5H2O hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cho đủ 100 gam.

+ Urea tinh thể.+ Albumine 1%.+ NaOH 10%.

75

2 NH

C=NH

C=NH

OH

OH

Biurea dạng enol

+ Cu(SO) + 2NaOH4 CuNH

C=NH

C=NH

ONa

O

NH

ONa

O

HN=C

HN=C

to2 O=C

NH2

NH2

Biurea

O=CNH2

NH

O=CNH2

NH

C=NH

C=NH

OH

OH

Biurea dang enol

- Thực hànhLấy 2 ống nghiệm, lần lượt cho vào:

-Ống 1: 1 ít tinh thể urea, đun nóng trên ngọn lửa đến khi nóng chảy rồi cứng lại được biurea, để nguội.-Ống 2: 2ml Albumine 1%

Thêm vào mỗi ống 1ml NaOH 10% và vài giọt CuSO4 1%. Lắc đều, quan sát và giải thích kết quả ?

- Kết quả và giải thích: Lắc đều 2 ống nghiệm, quan sát ta thấy ở ống 1 có màu tím đỏ, còn ống 2 có màu xanh tím. Do trong môi trường kiềm các nhóm –NH, -OH trong biurea và albumine phản ứng với Cu(OH)2 tạo phức có màu. 3.2.2.8. Sắc ký lớp mỏng định tính hỗn hợp amino acid- Nguyên tắc

Trong những điều kiện nhất định (dung môi, nhiệt độ thí nghiệm, loại chất hấp thu- nồng độ bảo hòa của dung môi trong bình sắc ký...) mỗi Amino acid sẽ có tốc độ di chuyển khác nhau được đặc trưng bằng các Rf. Sau một thời gian sắc ký các Amino acid được tách ra khỏi hỗn hợp. Để nhận biết các Amino acid này có thể dùng thuốc thử thích hợp.

Với: a= khoảng di chuyển của Amino acid b= khoảng di chuyển của dung môi.

- Hóa chất: + Mẫu chuẩn Arginine+ Mẫu chuẩn Valine+ Mẫu chuẩn Proline+ Mẫu hỗn hợp amino acid (M)+ Thuốc thử hiện hình amino acid: Cân 0,2 gam ninhydrine pha trong aceton, sau đó

thêm aceton cho đủ 100 gam. Tiếp tục thêm vào dung dịch thuốc thử vài giọt acid acetic.+ Dung môi giải ly: etanol:acid acetic. Hai chất trộn theo tỷ lệ thể tích là: 7:3 về thể

tích. + Bản sắc ký lớp mỏng.

- Thực hành* Chuẩn bị bản sắc ký lớp mỏng: Dùng kéo cắt một bản mỏng có kích thước chiều dài 10cm, chiều rộng 4,5 cm. Sau đó dùng bút chì kẻ hai vạch nét đứt: một vạch là mức tiền tuyến, một vạch là mức xuất phát như hình vẽ.* Chuẩn bị bình sắc ký: Dùng một cốc miệng bằng, có nắp đậy kín và sao cho tấm bản mỏng để lọt vào trong cốc. Cho dung môi sắc ký vào cốc sao cho mức dung môi trong bình cao khoảng 0,75 cm để khi đặt tấm bản mỏng vào các vết chấm không ngập vào dung môi. Để khoảng 10 phút cho bầu không khí trong bình sắc ký bão hoà dung môi hoặc được thực hiện bằng cách phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc. Sau đó đặt bản mỏng vào bình.

76

b

aR f =

4,5 cm

7 cm

Mức tiền tuyến

Mức xuất phát

0,5 cm

1 cm0,75 cm0,75 cm 1 cm

1 2 3 4

1 : Arginine

2 : Valine3: Proline

4 : Hỗn hợp amino acid M

* Chấm mẫu: Dùng vi quản chấm các mẫu chuẩn Arginine, valine, Proline và hỗn hợp amino acid trên mức xuất phát theo số thứ tự 1, 2, 3, 4. Mỗi vết chấm 3 lần, sau mỗi lần chấm phải sấy khô vết chấm rồi mới chấm tiếp, sao cho vết chấm không lan rộng và đường kính của mỗi vết chấm không quá 1mm. Sau đó đặt bản mỏng vào bình sắc ký và nhanh chóng đậy nắp bình lại. Quan sát đến khi dung môi sắc ký chạy đến mức tiền tuyến thì lập tức lấy bản mỏng ra. Sau đó sấy khô giấy sắc ký.* Hiện màu: dùng bình phun thuốc thử, phun sao cho thuốc thử phân bố đều trên giấy sắc ký và sấy khô.

So sánh màu của các vết Amino acid theo các vết chấm chuẩn và mẫu, đo và tính các Rf, cho biết thành phần Amino acid trong hỗn hợp mẫu M ?- Kết quả và giải thích:

* Sau khi phun thuốc thử hiện màu và sấy khô bản mỏng, quan sát các vết trên bản ta thấy:

+ Ở vị trí số 4 (hỗn hợp M) xuất hiện 3 vết có màu lần lượt giống như màu của 3 vết ở các vị trí 1, 2, 3.

+ Ở vị trí 1(Arginine) ta có Rf = 0,7/5,1= 0,14+ Ở vị trí 2(Valine) ta có Rf = 3,9/5,1= 0,77+ Ở vị trí 3(Proline) ta có Rf = 3,1/5,1 = 0,61

* Ở vị trí số 4 khi đo và tính các Rf của 3 vết cũng cho kết quả lần lượt giống với Rf ở 3 vị trí 1, 2, 3.

Hỗn hợp M chứa 3 amino acid: Arginine, valine và proline.3.3. Bài 3: Lipid3.3.1. Tính chất3.3.1.1.Định nghĩa

Lipid là este phức tạp của các acid béo bậc cao với glycerol hoặc với các alcol khác có cấu tạo đặc biệt.3.3.1.2.Phân loại

Có nhiều cách phân loại lipid (dựa vào thành phần, tính chất, vai trò, nguồn gốc…).* Chủ yếu phân loại theo thành phần cấu tạo:- Lipid thuần: là những este của rượu và acid béo, thành phần nguyên tố gồm C, H, O. Gồm có 3loại: Glycerid, cerid, sterid.- Lipid tạp : trong thành phần phân tử ngoài alcol và acid béo còn có các chất khác do đó thành phần nguyên tố của chúng ngoài C, H, O còn có P, N, S. Gồm có 2 loại: Phospholipid, glucolipid.* Căn cứ vào tính chất thủy phân, người ta còn phân biệt:

77

- Lipid xà phòng hóa được.- Lipid xà phòng hóa không được (steroid )* Các hợp phần của Lipid:

Về mặt cấu tạo hóa học, lipid là những sản phẩm ngưng tụ của các acid béo và alcol. Cũng có thể định nghĩa lipid là những este hoặc amid của acid béo. Acid béo

Acid béo là thành phần không thể thiếu của tất cả các lipid. Acid béo có rất ít dưới dạng tự do mà phần lớn chúng tồn tại dưới dạng liên kết este ( số ít là liên kết amide ) trong phân tử lipid. Thông thường acid béo là những acid có một nhóm cacboxyl, có số cacbon chẵn và cao, từ 4 đến 30. Chuỗi acid béo có thể bão hòa hoặc chưa bão hòa, có nhánh, đôi khi có vòng hoặc mang chức alcol. * Acid béo được chia thành 2 nhóm lớn: - Acid béo bão hòa có dây nối đơn. - Acid béo chưa bão hòa, có nối đôi. Acid béo bão hòa- Acid béo bão hòa có chuỗi không nhanh: Loại acid này phổ biến nhất trong tự nhiên. + Công thức phân tử: CnH2nO2 ( n là số chẳn ) + Công thức cấu tạo chung: CH3-(CH2)n-COOH. + Danh pháp: quy định cacbon số 1 là cacbon gốc –COOH, cacbon số 2 và 3 còn được gọi là cacbon alpha(α) và beta(β).Cách đánh số cacbon của chuỗi acid béo. (β) (α)CH3 - CH2 - CH2- CH2………..CH2-CH2-COOH

n (n-1) (n-2) (n-3) 3 2 1

Acid béo bão hòa phổ biến trong thiên nhiên là:- Acid palmitic: C15H31COOH.- Acid stearic: C17H35COOH. Acid béo bão hòa mach không nhánh

Phần lớn các acid béo bão hòa có 1 nhánh. Ví dụ: acid béo bão hòa có nhánh của vi khuẩn Kock, acid tuberculo stearic.

CH3-(CH2)17-CH-(CH2)8-COOH

CH3

Acid béo chưa bão hòaLà những acid béo chuỗi thẳng (đôi khi có nhánh) có trong cấu trúc một hoặc nhiều

dây nối đôi. - Acid béo monoethylenic:

+ Công thức phân tử : CnH2n-2O2

Dây nối đôi trong acid béo được ký hiệu bởi chữ delta (∆) kèm theo sau là vị trí cacbon có dây nối đôi. Ví dụ Acid oleic: C17H33COOH (∆9) ; CH3-(CH2)7- CH=CH-(CH2)7-COOHAcid oleic là một acid béo phổ biến có trong tất cả các dầu, mỡ động vật và thực vật, trong mỡ dự trữ của bò lợn (40%), dầu olive (80%). Acid oleic ở thể lỏng ở nhiệt độ thường.

78

Acid tuberculo stearic

Acid béo polyethylenic Acid béo có 2 nối đôi. Công thức phân tử chung: CnH2n-4O2.Acid quan trọng nhất là acid linoleic, có 2 nối đôi ở vị trí giữa cacbon 9-10 và 12-13. Acid linoleic có nhiều trong dầu thực vật và là một acid béo cần thiết đối với người. Acid béo mang chức alcolAcid cerebronic có trong lipid tạp của não.

CH3 (CH2)27 CH

OH

COOH

Acid cerebronic

Acid béo có vòng Acid prostanoic là một acid có vòng 5 cạnh với 20 cacbon và mang hai chuỗi

thẳng. Acid prostanoic có dẫn xuất là prostaladin. ProstaglADNin là một nhóm hợp chất tìm thấy ở tuyến tiền liệt và nhiều tổ chức khác. Prostagladin có tầm quan trọng về mặt dược lý và hóa sinh do có nhiều tác dụng lên các cơ quan sinh dục, cơ trơn của nhiều tổ chức (phổi, ruột …) thần kinh, tim mạch, mô mỡ.

Alcol của lipidAlcol trong thành phần của lipid gồm chủ yếu glycerol và cholesterol. Các alcol được

phân thành hai nhóm: alcol thẳng và alcol vòng. Alcol thẳng- Alcol không có chứa nitơ: glycerol+ Glycerol là môt alcol có 3 chức rượu và 3 vị trí este hóa. Vị trí của các nguyên tử carbon trong glycerol được ghi bằng chữ số 1, 2, 3 hoặc ký hiệu + CTPT: C3H8O3

+ CTCT: HO-CH2-CHOH-CH2OH- Aminoalcol hoặc alcol có nitơ:

Khác với trường hợp glycerol được kết hợp với acid béo bằng liên kết este, các alcol có nitơ kết hợp với acid béo bằng liên kết amide.

NH2 CH2OHCH2

Colamine (ethanolamine)

CH2OHCH2N+

CH3

CH3

CH3

Choline (Colamin trimethyllamine)

NH2 CH2OHCH

COOHSerine

CH3 (CH2)12 CH CH CHOH

CHNH2

CH2OHSphingosine

Alcol vòngSterol là những alcol bậc nhì bão hòa hoặc chưa bão hòa, chứa một nhân đa vòng.

Nhân mang 2 gốc –CH3 và một nhánh có 8 carbon. Trong số các sterol, phổ biến và quan trọng nhất là cholesterol, cholesterol có trong tất cả các tế bào. + CTPT: C27 H41O + CTCT:

79OH

A B

C D12

3

45

6

7

89

10

1911

12

13

14 15

1617

18

2120

22

23

24

25

26

27

Cholesterol

+ Một nhân cyclopentano perhydrophenanthren với 3 vòng A, B, C và vòng D, năm cạnh.+ Một alcol bậc nhì ở C3.+ Một dây nối đôi ở C5-C6 ở vòng B.+ Hai gốc –CH3 gắn ở C10 và C13.+ Một nhánh có 8 carbon gắn ở C17.3.3.1.3. Lipid đơn giản Glycerid (chất béo) Cấu tạo hóa học

Glycerid là những hợp chất este hóa các chức alcol của glycerol bởi những acid béo. Về cấu tạo người ta phân biệt:+ Monoglycerid:

+ Diglycerid:

+ Triglycerid:

R1, R2, R3 là mạch carbon của các acid béo tương ứng. R1, R2, R3 có thể giống hoặc khác nhau.

Các nguyên tử carbon của glycerol được đánh số 1, 2, 3 theo thứ tự từ trên xuống dưới. Các liên kết este ở C-1 và C-3 cũng gọi là liên kết este (hoặc α và α’ ) còn liên kết ở C-2 gọi là liên kết este β .

Khi thủy phân glycerid thường nhận được các acid béo có số nguyên tử carbon chẵn (từ 14-22 carbon), thường gặp nhất là các acid béo có 16 hoặc 18 carbon. Các acid béo này có thể no hoặc không no.- Các acid béo no: thường là mạch thẳng kéo thành chuỗi dài.- Các acid béo không no: có thể tồn tại dưới 2 dạng đồng phân. Dạng cis: mạch carbon bị uốn cong 300.Dạng trans: có dạng chuỗi mạch carbon không khác nhiều so với acid béo no.Thông thường trong tự nhiên các acid béo không no thường gặp ở dạng cis, và đặc điểm uốn cong mạch carbon có ý nghĩa quan trọng đối với màng sinh học.

80

CH2O C

CH

CH2O

O

R1

H

OH

Monoglycerid

CH2O C

OCH

CH2O

O

R1

H

C

O

R2

Diglycerid

CH2 O

CH

C

CH2

O

O

R1

C

O

R2

O C

O

R3

C CR2

H

R1

HC C

H

R2

R1

HCis Trans

Tính chất vật lý - Glycerid có tỉ trọng nhỏ hơn nước, vào khoảng 0,866-0,973 (ở 150). - Glycerid không tan trong nước, khi trộn lẫn với nước tách thành 2 lớp. - Ở điều kiện nhất định, dưới tác dụng của một số chất như: protein, muối của acid mật, xà phòng và các chất hoạt động bề mặt khác, glycerid có thể tạo thành nhủ tương. Nhờ sự tạo thành nhủ tương bền làm cho mỡ của thức ăn được tiêu hóa dễ dàng. (Nói chung, các chất tạo nhủ tương thường là những chất khi hòa tan vào nước tạo thành dung dịch keo và có hoạt động bề mặt lớn. Do đó chúng làm giảm sức căng bề mặt, làm giảm độ bền của các giọt dầu mỡ. Kết quả làm cho các giọt chất béo có khuynh hướng phân thành các hạt nhỏ hơn, tạo điều kiện để tạo thành nhủ tương bền). - Tính chất của glycerid phụ thuộc vào thành phần acid béo của chúng. Tính chất của acid béo phụ thuộc vào chiều dài mạch carbon và độ không no của phân tử. - Glycerid có thành phần là acid béo no thì nhiệt độ sôi, nhiệt độ nóng chảy của chúng cao và thường ở thể rắn. - Glycerid có thành phần là acid béo không no thì nhiệt độ sôi, nhiệt độ nóng chảy của chúng thấp hơn và thường ở thể lỏng. Ví dụ: Tristearin và tripalmitin nóng chảy ở nhiệt độ gần 800C, trong khi triolein vẫn ở trạng thái lỏng ngay cả ở nhiệt độ 00C. Nhiều dầu thực vật thường ở thể lỏng vì hàm lượng acid béo không no trong thành phần của nó khá cao. Ví dụ: Dầu hướng dương có hàm lượng acid oleic và acid linoleic đạt đến 85% nên có nhiệt độ nóng chảy là -21%.- Dầu ca cao chứa 35% acid palmitic và 40% acid stearic có nhiệt độ nóng chảy khoảng 30-340C.- Mỡ đông vật có hàm lượng acid béo no cao nên trong điều kiện nhiệt độ thường nó ở thể rắn. Tính chất hóa học Phản ứng thủy phân Dưới tác dụng của acid hoặc enzyme (lipaz) liên kết este trong phân tử glycerid có thể bị thủy phân tạo thành glycerol và acid béo tự do. Quá trình thủy phân xảy ra dưới tác dung của kiềm (KOH hoặc NaOH), sản phẩm được tạo thành là glycerol và muối của acid bậc cao. Muối này còn được gọi là xà phòng, vì vậy phản ứng này còn được gọi là phản ứng xà phòng hóa glycerid.

CH2O C

O

R1

CH

CH2O C

O

R3

OC

O

R2+ 3NaOH

CH2OH

CHOH

CH2OH

+ R1COONaR2COONaR3COONa

- Các chỉ số của chất béo+ Chỉ số acid: là số mg KOH dung để trung hòa acid béo tự do có trong 1 gam chất béo. Kí hiệu: A.

81

Chỉ số acid dùng để đánh độ tươi của các chất béo dùng làm thực phẩm. Chỉ số acid càng cao chứng tỏ chất béo càng không tươi, đã bị thủy phân một phần.- Chỉ số xà phòng hóa: là số mg KOH dùng để xà phòng hóa 1gam chất béo và trung hòa acid béo tự do có trong 1 gam chất béo này. Kí hiêu: X- Chỉ số este: là số mg KOH cần dùng để trung hòa acid béo liên kết với glycerol, được giải phóng khi xà phòng hóa 1gam chất béo. Do đó chỉ số este bằng hiệu số giữa chỉ số xà phòng và chỉ số acid. Kí hiệu: E E = X – A- Chỉ số iod: là số gam iod kết hợp với 100g chất béo. Iod kết hợp vào các nối đôi trong phân tử acid béo không no.

CH CHI2

CH CH

I I

Chỉ số iod phản ánh mức độ không no của các acid béo. Các chất béo có chứa nhiều acid béo không no có chỉ số iod càng lớn. Các chất béo có chỉ số iod càng lớn có nhiệt độ nóng chảy càng thấp.- Chỉ số peroxid: là số gam iod được giải phóng bới peroxid có trong 100gam chất béo. Chỉ số này phản ánh mức độ ôi của chất béo.Dầu mỡ để lâu ngày thường có mùi khét khó chịu, gọi là sự ôi mỡ. Hiện tượng này có thể do nhiều nguyên nhân tuy nhiên điều kiện phổ biến nhất là do oxi trong không khí kết hợp vào nối đôi trong phân tử acid béo không no tạo thành peroxid theo phản ứng sau:

R1 C C R2

H H

+ O2 R1 C R2C

O O

H H

Khi cho KI phản ứng với chất béo bị ôi, nó sẽ phản ứng với peroxid, giải phóng iod theo phản ứng sau:

R1 C R2C

O O

H H

+ 2KI +H2O R1 CH CH R2

O

+ I2 + 2KOH

Dùng thiosulfat để chuẩn độ lượng iod được giải phóng.Mặc dầu mỡ có thể bị ôi do nhiều nguyên nhân khác nhau, theo nhiều cơ chế khác nhau, nhưng kết quả của các quá trình này dẫn đến việc tạo thành các aldehyde, ceton, acid phân tử thấp có mùi khó chịu.Quá trình ôi mỡ tăng nhanh ở điều kiện ẩm, nhiệt độ cao và có ánh sang. Một số ion kim loại như đồng, chì cũng xúc tác cho phản ứng này.Trong thực tế, để ngăn ngừa quá trình oxi hóa mỡ, người ta thường thêm các chất chống oxi hóa như: galatpropyl, galatetyl… hoặc tìm cách loại bỏ oxi trong môi trường bảo quản. Cerid (Sáp)

Sáp cũng thuộc lipid đơn giản, ở trạng thái rắn trong điều kiện nhiệt độ bình thường. Sáp tạo thành lớp mỏng bao phủ trên bề mặt lá, than, quả của nhiều cây. Nhiều tác giả cho rằng sáp được tạo thành trong tế bào biểu bì, sau đó được đưa qua các ống dẫn nhỏ ra khỏi tế bào ở lại trên bề mặt của mô và kết tinh thành hình bản nhỏ. Lớp sáp trên bề mặt lá Caripha cariphera ở Nam Mĩ có màu vàng, rất rắn, nóng chảy ở

82

83-900C; do đó có thể dùng làm nến. Sáp có tác dụng giữ cho lá quả khỏi bị thấm nước, không bị khô và ngăn ngừa vi sinh vật xâm nhập vào. Khi lớp sáp trên bề mặt quả bị vi phạm, quả dễ bị hỏng trong quá trình bảo quản.

Sáp cũng có ở động vật, ví dụ như sáp ong, sáp ở lông cừu. Sáp ong bảo vệ cho ấu trùng ong phát triển bình thường và bảo vệ cho mật ong khỏi bị hư hỏng. Lanoline giữ cho lông cừu khỏi bị thấm ướt. Lanoline cũng được dùng nhiều trong y học, trong công nghệ mỹ phẩm. Cấu tạo hóa học của sáp Sáp là các este được tạo thành từ các alcol bậc một mạch thẳng, phân tử lớn, với các acid béo bậc cao. Sáp có công thức cấu tạo chung như sau:

R- O- CO – R1

Trong đó: R là gốc alcol thường có số nguyên tử cacbon chẵn.Các alcol đã được biết là: - Alcol xetilic: C16H33OH- Alcol xerilic: C26H53OH- Alcol montanilic: C28H57OH- Alcol minixilic: C30H61OHVà R1 là gốc acid béo. Trong thành phần của sáp cũng tìm thấy các acid béo thường gặp trong mỡ như acid palmitic, acid stearic, acid oleic… Ngoài ra còn có một số acid béo khác đặc trưng của sáp, có khối lượng phân tử lớn hơn nhiều như:- Acid cerotic: C25H51COOH- Acid montanic: C27H55COOH- Acid melisxic: C29H59COOH Ví dụ: thành phần chủ yếu của sáp ong là este của tricontanol và acid palmitic có công thức như sau:

C30H61- OCO – C15H31

Trong thành phần của sáp ngoài các este của alcol với acid béo phân tử lớn, còn có các hidrocacbon, acid béo tự do và alcol phân tử lớn tự do.Sáp cũng được tìm thấy trong than đá, than bùn, gọi là sáp khoáng. Sáp khoáng có chứa acid montanic và các este của nó. Tính chất của sáp- Tất cả các loại sáp tương đối bền dưới tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ, các chất oxi hóa và các yếu tố khác. Ngoài ra, sáp cũng khó bị thủy phân, do đó có thể dễ dàng bảo quản sáp trong thời gian dài.- Ở nhiệt độ thường sáp ở thể rắn.- Không tan trong nước, ít tan trong rượu, tan trong dung môi hữu cơ.- Bị thủy phân trong môi trường kiềm (không bị thủy phân trong môi trường acid). Sterid Cấu tạo hóa học

Sterid là este vòng và acid béo phân tử lớn. Các acid béo thường gặp trong thành phần sterid là acid palmitic, acid stearic, acid oleic.

Alcol vòng của sterid là sterol. Sterol là dẫn xuất của ciclopentanoperhidro phenantren. Đại diện quan trọng của sterol là cholesterol và ecgosterol.

Sterol phổ biến ở đông vật, thực vật, ở nấm men và môt số loài tảo. Ở đông vật bậc cao, cholesterol được tổng hợp chủ yếu trong gan. Cholesterol cũng có nhiều trong mô thần kinh, máu, tinh trùng, trong lớp mỡ dưới da… Ở thực vật cholesterol có nhiều trong phấn hoa, trong hạt, đặc biệt là ở các cây có dầu.

83

Vai trò sinh học quan trọng của sterol là ở chỗ chúng có thể chuyển hóa thành các chất điều hòa sinh học khác nhau (các hoocmôn sinh dục, hoocmôn coocticoit vitamine D…)và tham gia tạo thành màng tế bào. Cholesterol được sử dụng trong công nghiệp hóa dược để sản xuất các hoocmôn steroid, vitamine D. Sterid cũng như sterol là chất rắn không màu, không tan trong nước, tan trong dung môi của chất béo như clorofooc, ete… Các sterid có thể bị thủy phân dưới tác dụng của kiềm hoặc enzyme tương ứng. Sterol bền đối với các yếu tố thủy phân.

Sterol phổ biến ở đông vật, thực vật, ở nấm men và môt số loài tảo. Ở đông vật bậc cao, cholesterol được tổng hợp chủ yếu trong gan. Cholesterol cũng có nhiều trong mô thần kinh, máu, tinh trùng, trong lớp mỡ dưới da… Ở thực vật cholesterol có nhiều trong phấn hoa, trong hạt, đặc biệt là ở các cây có dầu. Vai trò sinh học quan trọng của sterol là ở chỗ chúng có thể chuyển hóa thành các chất điều hòa sinh học khác nhau (các hoocmôn sinh dục, hoocmôn coocticoit vitamine D…)và tham gia tạo thành màng tế bào. Cholesterol được sử dụng trong công nghiệp hóa dược để sản xuất các hoocmôn steroid, vitamine D. Tính chất của sterid

Sterid cũng như sterol là chất rắn không màu, không tan trong nước, tan trong dung môi của chất béo như clorofooc, ete…

Các sterid có thể bị thủy phân dưới tác dụng của kiềm hoặc enzyme tương ứng. Sterol bền đối với các yếu tố thủy phân.3.3.1.4. Lipid phức tạpPhospholipid Là este của alcol đa chức với acid béo cao phân tử, có gốc acid phosphoric và base nitơ phân cực đóng vai trò là nhóm bổ sung. Glycerophospholipid

Cấu tử alcol của nó là glycerol. Hai nhóm hidroxil ở C-1 và C-2 của glycerol bị este hóa với các acid báo phân tử lớn, còn nhóm hidroxil ở C-3 este hóa với acid phosphoric.- Công thức cấu tạo chung:

84

OH

A B

C D12

3

45

6

7

89

10

1911

12

13

14 15

1617

18

2120

22

23

24

25

26

27

Cholesterol

CH2O C

O

R1

CH

CH2O

O

OC

O

R2

P

O-

O-

Photphatidat

CH2O C

O

R1

CH

CH2O

O

OC

O

R2

P

O-

OB

OH

Ecgosterol

- Các gốc acid béo thường gặp trong thành phần của glycerophospholipid là acid palmitic, stearic, và các acid béo không no khác.- Gốc acid phosphoric của glycerophospholipid có thể phản ứng với nhóm hidroxil của các chất khác như serine, etanolamino, choline, glycerol, inozitol… tao thành các dẫn xuất tương ứng.- Lecithine phổ biến rộng rãi trong cơ thể người và động vật, thực vật. Lecithine tham gia trong thành phần các màng sinh học. Phân tử lecithine có tính phân cực: đầu có gốc choline có tính ưa nước và phần có các gốc acid béo có tính chất kị nước. Do đó chúng được sắp xếp định hướng rõ rệt ở ranh giới 2 pha, tham gia trong việc đảm bảo tính thấm của màng sinh học.Dưới tác dụng của enzyme tương ứng lecithinaza (của nọc rắn) liên kết este ở C-2 bị thủy phân tạo thành lizolecithine có tác dụng hoại huyết mạnh.

CH2O C

O

R1

CH

CH2O

O

OC

O

R2

P

O-

O choline

SphingophospholipidChất này được cấu tạo từ các thành phần sau:

- Aminoalcol không no có 18 cacbon là sphingozine.- Acid béo phân tử lớn như acid stearic, acid lignocerinic.- Acid phosphoric.- Choline.

Đại diện của nhóm này là sphingomieline, có công thức cấu tạo như sau:

CH3(CH2)12 CH CH CH

OH

CH CH

NH

C RO

CH2 O P

O

O-

O

CH2 CH2 N+(CH3)3

Acid béo trong phân tử sphingomieline là acid lignocerinic. Các sphingophospholipid khác nhau về thành phần acid béo của chúng. Sphingomieline có nhiều trong chất trắng của não, mô thần kinh, ngoài ra cũng có trong gan, thận phổi. Hàm lượng sphingomieline ở động vật có xương sống bậc cao (10-12%) lớn hơn động vật có xương sống (1-4%). Ở động vật không xương sống hầu như không có chất này. Glucolipid Gliceroglucolipid

Thuộc nhóm này có monogalactozilglicerid, đigalactozilglicerid, sunfoglucozilglicerid khá phổ biến trong lục lạp và các phần khác của tế bào lá. Công thức cấu tạo của chất này như sau:

85

O

CH2OH

OH

OH

OH

O CH2

CHOCOR1

CH2OCOR2

Monogalactozilglycerid

O

OH

OH

OH O

CH2SO3

CH2

CHOCOR1

CH2OCOR2

6-Sulfoglucozilglycerid

Vai trò của chất này chưa rõ, nhưng người ta cho rằng các galactozilflicerid có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất. Sphingoglucolipid

Đại diện của nhóm này là cerebrozit. Cerebrozit được cấu tạo từ 3 thành phần cơ bản:- Acid sphingozine.- Acid béo kết hợp với nhóm amino của sphingozin qua liên kết amide.- Một gốc saccaric là glucose hoặc galactose kết hợp với nhóm hydroxyl ở C-1 của sphingozine.Cerebrozit có công thức cấu tạo như sau:

CH3 (CH2)12 CH CH CH

OH

CH

NH

C R

CH2 O O

CH2OH

O

Các cerebrozit khác nhau về thành phần acid béo trong phân tử của chúng. Các acid béo này thường chứa 24 cacbon, có thể có nối đôi và có các nhóm hidroxil. Ở môt số cerebrozit, gốc acid sulfuric kết hợp vào C-6 của gốc monosaccaric trong phân tử của chúng, gọi là sulfatit.

Cerebrozit có trong mô thần kinh ( đặc biệt có trong chất trắng của não) hồng cầu, bạch cầu, tinh trùng.3.3.1.5. Vai trò sinh học của lipid đối với cơ thể người

86

O

CH2OH

OH

OH

OH

O CH2

oOH

OH

O CH2

CHOCOR1

CHOCOR2

Digalactozilglycerid

HO

Gốc acid béo

β- D-Galactose

Lipid tồn tại trong cơ thể dưới 2 dạng:- Lipid dự trữ: chủ yếu là triglycerid, là nguồn năng lượng dự trữ có hàm lượng thay đổi khoảng 10-20% trọng lượng cơ thể. Lipid dự trữ tập trung nhiều ở dưới da, màng bụng và một số cơ quan nội tạng (tim, thận… ).- Lipid màng: chủ yếu là phospholipids và cholesterol, là thành phần cấu tạo chất nguyên sinh tế bào và có hàm lượng không đổi.- So với glucid, lipid cung cấp nhiều năng lượng hơn: Khi oxi hóa hoàn toàn 1gam lipid giải phóng khoảng 9,5 Kcal (trong khi đó 1gam glucid khoảng 4,1 Kcal; 1 gam protid khoảng 5 Kcal).- Cung cấp các acid béo chưa no cho cơ thể.- Là dung môi của các vitamine A, D, E, K và một số chất hoạt động sinh học khác.- Thực hiện chức năng bảo vệ: Lipid giữ cho mạch máu, thần kinh, cơ quan nội tạng không bị ép lại, và ngăn ngừa chúng khỏi bị tổn thương .- Lipid bảo vệ cơ thể chống lại sự thay đổi nhiệt độ đột ngột của môi trường xung quanh.Trong đó chất béo có nhiều ứng dụng quan trọng trong đời sống.+ Chất béo là thức ăn quan trọng của con người. Nó là nguồn dinh dưỡng quan trọng và cung cấp một lượng đáng kể năng lượng cho cơ thể hoạt động. Nhờ những phản ứng sinh hóa phức tạp, chất béo bị oxi hóa chậm tạo thành CO2, H2O và cung cấp năng lượng cho cơ thể. Chất béo chưa sử dụng được tích lũy trong các mô mỡ.+ Chất béo còn là nguồn nguyên liệu để tổng hợp một số chất khác cần thiết cho cơ thể. Nó có tác dụng bảo đảm sự vận chuyển và hấp thụ các chất hòa tan được trong chất béo.+ Trong công nghiệp, một lượng lớn chất béo dung để điều chế xà phòng và glycerol.Ngoài ra, chất béo còn được dùng trong sản xuất một số thực phẩm khác như mì sợi, đồ hộp,… Dầu mỡ sau khi rán, có thể được sử dụng để tái chế thành nhiên liệu.3.3.2. Thực hành thí nghiệm

3.3.2.1. Tính hòa tan của lipid- Nguyên tắc

Lipid là ester của acid béo cao phân tử và alcol cao phân tử nên ít tan trong nước, tan nhiều trong các dung môi hữu cơ. Độ hòa tan này tùy thuộc vào mỗi loại dung môi hữu cơ.- Hóa chất: Dầu thực vật, nước cất, etanol, aceton, etyl ete.- Thực hành

Lấy 4 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 3 giọt dầu thực vật. Sau đó lần lượt cho vào:-Ống 1: 1ml nước cất.-Ống 2: 1ml etanol. Quan sát, sau đó đun cách thủy 10 phút, lại quan sát và giải thích.-Ống 3: 1ml aceton.-Ống 4: 1ml etyl eter.

Lắc đều, quan sát hiện tượng. So sánh kết quả và giải thích?- Kết quả và giải thích: Lắc đều các ống nghiệm ta thấy ở ống 1 dầu thực vật không tan, ống 2 dầu thực vật tan, ống 3 dầu thực vật tan, ống 4 dầu thực vật tan nhiều nhất. Do ở ống 1 nước cất là dunng môi phân cực nên dầu thực vật không tan, còn ở ống 2,3,4 là các dung môi hữu cơ nên dầu thực vật tan được. Ống 4 là dung môi ít phân cực nhất nên dầu thực vật tan nhiều nhất.3.3.2.2. Ly trích Lecithine

Lecithine là phosphatide phổ biến trong thiên nhiên, tan dễ dàng trong alcol nhưng rất ít tan trong aceton. Dựa vào tính chất này ta có thể ly trích lecithine ra khỏi nguyên liệu và chất béo khác.

87

Cho vào becher 50 ml một muỗng lecithine thô và khoảng 30ml etanol. Đun nóng trên bếp cách thủy, khuấy đều khoảng 10 phút. Lấy ra, lọc bằng phễu lọc thu được dung dịch lecithine trong suốt. Dung dịch này để sử dụng cho thí nghiệm sau.3.3.2.3. Phản ứng tạo thành nhũ tương- Nguyên tắc

Dưới tác dụng của các chất nhũ hóa như acid mật, protein, xà phòng, Na2CO3, các lipid bị phân chia nhỏ thành những hạt lơ lửng trong dung dịch không bị tách lớp gọi là nhũ tương bền.- Hóa chất

+ Nước cất, dầu thực vật, dung dịch lecithine.+ Na2CO3 1%: Cân 1 gam Na2CO3 hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cho đủ 100

gam.+ Dung dịch mật (mật heo): Lấy mật heo hòa tan trong nước cho loãng ra.

- Thực hànhLấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6, lần lượt cho vào:

-Ống 1: 2ml nước cất + 3 giọt dầu thực vật.-Ống 2: 2ml nước cất + 3 giọt dung dịch lecithine. -Ống 3: 2ml dung dịch mật + 3 giọt dầu thực vật.-Ống 4: 2ml dung dịch mật + 3 giọt dung dịch lecithine-Ống 5: 2ml dung dịch Na2CO3 1% + 3 giọt dầu thực vật-Ống 6: 2ml dung dịch Na2CO3 1% + 3 giọt dung dịch lecithine.Lắc đều 6 ống nghiệm, quan sát hiện tượng và giải thích ?- Kết quả và giải thích: Lắc đều 6 ống nghiệm, quan sát ta thấy ở ống 1,2 dầu thực vật và dung dịch lecithine không bị nhủ hóa(dung dịch tách lớp), ở ống nghiệm 3,4, 5, 6 dầu thực vật và dung dịch lecithine bị nhũ hóa tốt (ống nghiệm 3,4 nhũ hóa yếu hơn ống nghiệm 5, 6). Do ở ống nghiệm 1,2 nước cất không nhũ hóa được dầu thực vật và lecithine, ở ống 3,4,5,6 dung dịch mật và Na2CO3 là những chất nhũ hóa nên dầu thực vật và lecithine bị nhũ hóa. Na2CO3 nhũ hóa tốt hơn dung dịch mật.3.3.2.4. Thủy phân lipid

Các lipid có thể bị thủy phân với xúc tác acid, kiềm hoặc enzyme. Tùy theo thành phần chất béo và loại xúc tác mà tạo thành alcol, acid béo hay muối của nó.

- Nguyên tắcLecithine là 1 ester, có thể bị thủy giải trong môi trường kiềm cho glycerine, muối

của acid béo, choline và muối phosphat.

CH2 OCOR

CH OCOR

CH2 O P

O-

O

O

CH2 CH2 N

CH3

CH3

CH3

+ 4H2O NaOHHO CH2 CH2 N (CH)3 OH

Choline

+ 2RCOONa + Na3PO4 + Glycerine

- Hóa chất + Dung dịch lecithine.+ NaOH 10%: Cân 10 gam NaOH hòa tan trong 90 gam nước.+ Quỳ tím.

88

CH OCOR2CH OCOR

CH OCOR2

+ 3H O2

xt3RCOOH +

CH OH

CH OH

CH OH2

2

- Thực hànhCho dung dịch lecithine vừa lọc được vào chén sứ, đun trên nồi cách thủy đến khi

etanol bay hết còn lại lecithine. Cho vào ống nghiệm 1 ít tủa lecithine và 2ml NaOH 10%, đun sôi khoảng 10 phút ( có mùi đặc biệt). Đặt mẩu giấy quỳ đỏ đa thấm nước trên miệng ống nghiệm, quan sát và giải thích?- Kết quả và giải thích: Đặt giấy quỳ đỏ đã thấm nước trên miệng ống nghiệm ta thấy quỳ đỏ chuyển sang màu xanh. Do lecithine bị thủy phân trong môi trường kiềm tạo choline có tính base, khi đun sôi choline bay hơi lên gặp giấy quỳ ẩm nên làm giấy quy đỏ hóa xanh.3.3.2.5. Phản ứng màu của dầu mỡ

Dầu mỡ thường chứa các liên kết đôi trong phân tử khi bị ôi (bị oxi hóa cắt đứt nối đôi) cho các hợp chất chứa nhóm -CHO. Nhóm chức này có thể được phát hiện với một vài thuốc thử đặc trưng. Phản ứng của nhóm aldehyde tự do- Nguyên tắc

Nhóm -CHO tự do trong dầu ôi được định tính bằng thuốc thử Schiff, phản ứng này được ứng dụng để xác định độ hư thối của dầu mỡ.

- Hóa chất+ Dầu tươi, aceton, dầu ôi.+ Thuốc thử Schiff: Hòa tan 0,2 gam fucxine trong 120 ml nước cất nóng, để nguội.

Thêm từ từ dung dịch NaHSO3 cho đến khi dung dịch chuyển thành có màu là được.- Thực hành

Lấy 2 ống nghiệm, lần lượt cho vào:-Ống 1: 2ml dầu tươi + 2ml aceton + 1ml thuốc thử Schiff-Ống 2: 2ml dầu ôi + 2ml aceton + 1ml thuốc thử SchiffLắc đều, để yên 1 giơ, quan sát kết quả ở 2 ống nghiệm, giải thích ?- Kết quả và giải thích: Lắc đều quan sát 2 ống nghiệm ta thấy ở ống 1 không đổi màu. Còn ở ống 2 có màu tím đỏ. Do ở ống 1 là dầu tươi nên chưa bị oxi hóa không có nhóm –CHO nên không tác dụng với thuốc thử Schiff. Ở ống 2 là dầu ôi nên bị oxi hóa giải phóng nhóm –CHO nên phản ứng được với thuốc thử Schiff tạo ra các hợp chất có màu. Phản ứng màu của cholesterol* Chuẩn bị nguyên liệu

Cho 2 - 3g não đã trộn CaSO4 khan va sấy khô vào chén sứ. Nghiền thành bột mịn, thêm vào 15ml CHCl3, khuấy đều trong 10 phút, lọc lấy dung dịch trong chứa cholesterol. Phản ứng Salkovski+Nguyên tắc

Cholesterol bị H2SO4 đặc khử nước cho bicholestadien có màu.+Thực hành

89

2H

SO H3

+ 2R-CHO

N

H

HSO2

N

H

HSO

C C

N

H

H

N

R-C-SO2

OH

H

R-C-SO2

OHNH

NH2

Cho 2ml dung dịch não vào ống nghiệm, thêm 2ml H2SO4 đặc, quan sát sự xuất hiện vòng màu, giải thích.+ Kết quả và giải thích: Khi cho thêm 2ml H2SO4 đặc quan sát ta thấy dung dịch có vòng màu vàng da cam xuất hiện ở giữa, sau đó biến đổi thành màu đỏ nâu. Do cholesterol bị khử nước bởi H2SO4 đặc cho ra bischolestADNien có màu. Phản ứng Lieberman-Burchard+Nguyên tắc

Cholesterol là alcol vòng không no, có thể phản ứng với acid anhydric acetic tạo thành dẫn xuất có màu.+Thực hành

Cho 2ml dung dịch não vào ống nghiệm, thêm khoảng 2ml anhydrid acetic và 2 giọt H2SO4đ. Lắc đều, quan sát và giải thích?+ Kết quả và giải thích: Trong ống nghiệm dung dịch biến đổi màu từ đỏ đến tím đỏ, sau đó chuyển thành màu xanh lá cây đặc trưng, cuối cùng dung dịch có màu xanh đen. Do cholesterol phản ứng với anhydrid acetic tạo ra các dẫn xuất có màu.3.3.2.6. Xác định các chỉ số của dầu mỡ

Các chỉ số xà phòng, acid, ester, Iod và peroxid đặc trưng cho từng loại dầu mỡ và điều kiện bảo quản, và để xác định chất lượng của dầu mỡ. Chỉ số acid

Là số mg KOH cần thiết để trung hòa lượng acid béo tự do có trong 1g chất béo.

* Hóa chất+ Etanol, dầu thực vật.+ Phenolphtalein 1%: Cân 1 gam bột phenolphtalein hòa tan trong cồn, sau đó thêm

cồn cho đủ 100 gam.+ KOH 0,1N : Cân 5,6 gam KOH hòa tan trong cồn 960 (trong bình định mức), sau đó

thêm cồn cho đủ 1 lít.* Thực hành

Cho vào erlen 100ml 10ml etanol, thêm vào 3 giọt phenolphtalein. Chuẩn độ dung dịch bằng dung dịch KOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây. Cho tiếp vào 1 đến 2ml dầu thực vật (trước khi cho dầu thực vật phải đem cân để biết khối lượng của dầu), lắc đều cho dầu tan hoàn toàn. Tiếp tục chuẩn độ dung dịch bằng dung dịch KOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây, ghi thể tích ? Tính kết quả: ta có V= 2,6 ml, mdầu thực vật= 1,72 gam

Chỉ số acid: A= (V* f*5,6)/m = (2,6 * 1,1* 5,6)/1,72 = 9

Với: V = số ml dung dịch KOH 0,1N dùng chuẩn độ kể từ khi thêm dầu thực vật

f = hệ số điều chỉnh nồng độ KOH 0,1N: Cân chính

xác 0,63 gam acid oxalic H2C2O4.2H2O hòa tan trong nước (dùng bình định mức 100 ml) ta được 100ml dung dịch acid oxalic 0,1N. Dùng pipet hút 10ml dung dịch acid cho vào erlen + 2giọt phenolphtalein, sau đó đưa KOH lên buret. Nhỏ từ từ KOH từ buret vào erlen đến khi dung dịch có màu hồng bền trong 30 giây, ngưng chuẩn độ và đọc thể tích KOH trên buret VKOH=9,1 ml

90

1,11,0

11,0

11,01,9

1,0101,91,010

==⇒

≈=⇒=⇔=⇒

f

xCxCxVCVC BBBBAA

m : khối lượng dầu thực vật đã dùng (g) Chỉ số xà phòng

Là số mg KOH cần thiết để trung hòa lượng acid béo tự do và thủy giải ester có trong 1g chất béo.

* Hóa chất+ KOH 0,5N ( pha trong etanol): Cân 28 gam KOH hòa tan trong cồn và cho vào bình

định mức, sau đó thêm cồn cho đủ 1 lít.+ Dầu thực vật, etanol.+ Phenolphtalein 1%(pha trong cồn).+ HCl 0,5N: Cân 49,32 gam dung dịch HCl đặc nồng độ 37% hòa tan vào nước, sau

đó thêm nước cho đủ 1 lít.* Thực hành

Lấy 2 erlen 100ml khô, sạch, erlen thứ 1 dùng làm mẫu đối chứng, cho vào 1ml nước cất và 15ml KOH 0,5N trong etanol. Erlen thứ 2 cho vào 1 đến 2ml dầu thực vật( trước khi cho phải đem cân để biết khối lượng dầu đã dùng) và 15ml KOH 0,5N trong etanol. Đun hoàn lưu 2 erlen 50 phút, để nguội. Thêm vào mỗi erlen 15ml nước cất và 3 giọt phenolphtalein, lắc đều. Chuẩn độ 2 erlen bằng dung dịch HCl 0,5N đến khi mất màu hồng.- Kết quả thu được: V1 = 17,2 ml

V2= 9,2 ml mdầu thực vật = 1,2 gam* Tính kết quả:

Chỉ số xà phòng:

Với: V2 = số ml dung dịch HCl 0,5N dùng chuẩn độ bình thứ 2 V1 = số ml dung dịch HCl 0,5N dùng chuẩn độ bình thứ 1

f = hệ số điều chỉnh nồng độ KOH 0,5N ( 98,05,0

49,0 ==f Cách

chuẩn độ tiến hành như trên) 28 = số mgKOH có trong 1ml dung dịch KOH 0,5N. m : khối lượng dầu thực vật đã dùng (g)

Chỉ số esterLà số mg KOH cần thiết để trung hòa lượng acid béo nằm ở dạng ester có trong 1g

chất béo.Chỉ số ester:

Với: X = chỉ số xà phòngA = chỉ số acid.

Chỉ số IodLà số gam Iod kết hợp với 100g chất béo.

91

(V1 – V

2).f.28

X =m

(17,2 – 9,2) *(0,49/0,5)*28X = = 182,93 ≈ 183 1,2

E = X – A= 183 – 9 = 174

R-CH=CH-R’ + I2 R-CHI-CHI-R’

Chỉ số Iod đặc trưng cho số lượng nối đôi có trong các acid béo không no trong thành phần của chất béo, độ bền của chất béo đối với sự oxid hóa, khả năng polime hóa và khả năng bảo quản chất béo.

* Hóa chất+ Dầu thực vật, etanol.+ I2 0,1N: Cân 12,7 gam I2 hòa tan trong nước sau đó thêm từ từ KI vào và khuấy đến

khi nào I2 tan hết, cuối cùng thêm nước cho đủ 1 lít.+ Na2S2O3 0,1N: Cân 12,4 gam Na2S2O3.5H2O hòa tan vào nước, sau đó thêm nước

cho đủ 1 lít.+ Tinh bột 2%: Cân 2 gam tinh bột hòa tan vào 98 gam nước, đem lên bếp khuấy cho

dung dịch trong là được. * Thực hành

Lấy 2 erlen 100ml có nút đậy kín và khô, sạch; erlen thứ 1 dùng làm mẫu đối chứng, cho vào 1ml nước cất. Erlen thứ 2 cho vào 1 đến 2ml dầu ăn(phải đem cân để biết khối lượng dầu ăn đã dùng trước khi cho vào erlen thứ 2). Thêm vào mỗi erlen 10ml etanol và 10ml I2 0,1N. Lắc đều, đậy nút để yên trong tối 2 giờ. Sau đó lấy ra chuẩn độ 2 erlen bằng Na2S2O3 0,1N đến khi dung dịch có màu vàng nâu nhạt, thêm vào 1 giọt tinh bột 2%. Tiếp tục chuẩn độ đến khi dung dịch đột ngột mất màu xanh.Tính kết quả:

Chỉ số Iod:

Với: V2 = số ml dung dịch Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ bình thứ 2 V1 = số ml dung dịch Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ bình thứ 1

28 = số mgKOH có trong 1ml dung dịch KOH 0,5N. m: khối lượng dầu ăn (g)

3.4. Bài 4: Vitamine3.4.1. Tính chất3.4.1.1. Khái niệm chung

Lịch sử phát hiện ra vitamine cũng như khái niệm vitamine được hình thành có liên quan chặt chẽ với việc xây dựng khẩu phần ăn hoàn toàn có giá trị về dinh dưỡng cho người và động vật. Bệnh hoại huyết (Scorbut) của các thủy thủ có thể ngăn ngừa bằng một lượng rau, quả tươi trong bữa ăn hằng ngày. Năm 1880 L.T Lunin (nhà hóa học Nga) đã nhận thấy rằng chuột bạch nuôi bằng thức ăn có chứa protein, glucid, lipit, sẽ bị chết trong khi nó vẫn phát triển bình thường nếu được nuôi bằng sữa tươi. Năm 1912 Hopskin bằng thực nghiệm trên chuột bạch đã cho thấy rằng trong thức ăn tự nhiên (sữa tươi, rau tươi) có một chất dinh dưỡng quyết định đến sự sống của người và động vật.

Năm 1896, một bác sĩ người Hà Lan là Eijkman đã nhận thấy tù nhân ăn gạo xát kĩ mắc bệnh viêm thần kinh. Năm 1912, Funker (người BaLan) đã chiết xuất từ cám gạo một chất có khả năng chữa khỏi bệnh viêm thần kinh, đề nghị gọi tên là vitamine ( chất nói trên có chứa nhóm amino, vita là sự sống). Nhiều công trình nghiên cứu tiếp theo đã cho phép đi đến một khái niệm chung: Vitamine là những hợp chất hữu cơ có khối lượng phân tử

92

Trong tối

V1= 38,5 mlV2= 37,6 mlmdầu ăn = 1,32 gam

86632,1

1007,12)6,375,38(1007,12)( 21 ≈−=−= xx

m

xxVVI

nhỏ, có khối lượng phân tử rất khác nhau và đều có hoạt tính sinh học nhằm đảm bảo cho các quá trình trao đổi chất trong cơ thể sinh vật tiến hành một cách bình thường.

Các vitamine dù ở dạng vitamine hay tiền vitamine và các dạng khác đều được tổng hợp phần lớn trong cơ thể thực vật ( một số ít được cơ thể người và động vật tổng hợp nhưng cũng không đủ đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng) là những thành phần dinh dưỡng không thể thay thế trong khẩu phần ăn của người và động vật. Không có hoặc thiếu vitamine trong thức ăn sẽ gây ra những rối loạn nghiêm trọng trong quá trình trao đổi chất.

Nhiều khi trong thực vật chỉ chứa những tiền vitamine như: caroten là tiền vitamine A (provitamine A), nhờ enzyme carotenaza, provitamine A chuyển thành vitamine A.

DehidrocolesterinBước sóng

của tia cực tímVitamine D3

Triệu chứng thiếu vitamine ở người và động vật còn được thể hiện khi có mặt chất kháng vitamine. Chẳng hạn: tiaminoase làm mất hoạt tính của vitamine B1 do cơ chế thủy phân tiamino (B1). Sự cung cấp quá nhiều vitamine cũng làm cho quá trình trao đổi chất không bình thường.

Ngày nay, người ta đã tìm được trên 30 vitamine khác nhau và hàng trăm hợp chất gần giống vitamine thiên nhiên. Đã xác lập được công thức hóa học của 20 loại vitamine, điều này cho phép người ta tổ chức ngành kĩ nghệ sản xuất vitamine bằng con đường tổng hợp hóa học. Các vitamine đã biết được phân loại dựa theo tính hòa tan của chúng trong các dung môi khác nhau, chia thành 2 nhóm:- Vitamine hòa tan trong nước: B1, B2, B5, B6, B12, C, B3, H…- Vitamine hòa tan trong chất béo: A, D, E, K, Q…3.4.1.2. Cấu tạo hóa học, vai trò, chức năng sinh học, nhu cầu và nguồn cung cấp của các vitamine hòa tan trong chất béo Vitamine A- Gồm 2 loại: Vitamine A1 C20H30O, vitamine A2 C20H28O.- Công thức cấu tạo:

- Có các tên là retinol, axerophthol...Vitamine A tồn tại trong tự nhiên gồm 2 dạng:- Retinol: dạng hoạt động của vitamine A, nó được đồng hoá trực tiếp bởi cơ thể. - Tiền vitamine A: nó chính là một tiền chất của vitamine A được biết đến nhiều dưới tên bêta-caroten. Tiền chất này được chuyển hoá bởi ruột thành vitamine A để cơ thể có thể sử dụng. * Vitamine A có nhiều chức năng quan trọng đối với cơ thể con người:- Thị giác: mắt được cấu tạo bởi các sắc tố có chứa vitamine A. Nó được hấp thụ bởi luồng thần kinh được vận chuyển nhờ dây thần kinh thị giác. Vì vậy sự có mặt của vitamine A là một phần không thể thiếu đối với việc đảm bảo thị giác của con người. - Các mô: Vitamine A kích thích quá trình phát triển của các biểu mô như mô sừng, ruột và các con đường hô hấp. Nó cũng ảnh hưởng đặc biệt đến da, kích thích sự liền sẹo và phòng ngừa các chứng bệnh của da như trứng cá.

93

H3C CH3 CH2OH

CH3

CH3CH3

- Sự sinh trưởng: do vai trò quan trọng trong sự phát triển tế bào của con người, nên vitamine A là yếu tố không thể thiếu đối với sự phát triển của phôi thai và trẻ em. Vitamine A còn có vai trò đối với sự phát triển của xương, thiếu vitamine A làm xương mềm và mảnh hơn bình thường, quá trình vôi hoá bị rối loạn. - Hệ thống miễn dịch: do các hoạt động đặc hiệu lên các tế bào của cơ thể, vitamine A tham gia tích cực vào sức chống chịu bệnh tật của con người. - Chống lão hoá: Vitamine A kéo dài quá trình lão hoá do làm ngăn chặn sự phát triển của các gốc tự do. - Chống ung thư: hoạt động kìm hãm của nó với các gốc tự do cũng dẫn đến ngăn chặn được một số bệnh ung thư. * Chế độ dinh dưỡng có đầy đủ sinh tố A giữ vai trò tối quan trọng cho mục tiêu phòng bệnh. Theo báo cáo của tổ chức sức khỏe thế giới (WHO), hiện vẫn còn hàng triệu người trong các nước chậm tiến mang bệnh do thiếu sinh tố A. Hàng năm, vẫn có không dưới nửa triệu trẻ con bị mù vì thiếu sinh tố A, trong số đó hơn 2/3 là trường hợp tử vong oan uổng, vì trên thực tế, phương thức phòng ngừa tình trạng thiếu hụt sinh tố A tương đối đơn giản. - Triệu chứng đầu tiên của tình trạng thiếu hụt sinh tố A là dấu hiệu quáng gà, nghĩa là tình trạng giảm sút thị lực vào buổi tối. Nếu nguồn dự trữ sinh tố A không được bù trừ, các triệu chứng khác như da khô, rụng tóc, gãy móng tay sẽ lần lượt xuất hiện. Tình trạng thiếu hụt sinh tố A nếu tiếp tục kéo dài sẽ dẫn đến hậu quả mất hẳn thị giác. Thêm vào đó là khuynh hướng bội nhiễm trầm trọng trên đường hô hấp, vì thiếu sinh tố A thì niêm mạc khí quản bị khô và tạo điều kiện thuận tiện cho vi trùng tác hại.- Nguồn cung cấp sinh tố A chủ yếu là thực phẩm xuất xứ từ nguồn gốc động vật như: gan, cá biển, bơ, sữa, trứng... Thành phần sinh tố A trong thực phẩm động vật có thể đảm nhiệm hoàn hảo phần lớn các chức năng liệt kê ở đoạn trên, nhưng lại không có khả năng phòng chống hiện tượng ung thư và xơ cứng tế bào, vì khả năng này không được đảm nhiệm trực tiếp bởi sinh tố A mà thông qua một tác chất tiền thân của sinh tố A: beta-carotin, còn gọi là tiền sinh tố A. Chất này lại chỉ có trong thực phẩm rau trái như: rau dền, cà rốt, cải broc-coli, bí rợ, cà chua, ớt bị, đu đủ, gấc, dưa hấu, khoai ta... Tiền sinh tố A là thành phần làm trái cây có màu vàng cam, rau cải có màu xanh thẫm. - Trong điều kiện nuôi trồng ở Việt Nam, có vài loại thực phẩm cần được chú trọng vì tuy bình dân nhưng lại cung cấp dồi dào tiền sinh tố A, đó là khoai lang ta, rau dền và đu đủ. Nhu cầu về tiền sinh tố A của cơ thể trung bình vào khoảng 25.000 IU (InteARNtional unit), trong khi:

+ Một củ cà rốt loại trung có thể cung cấp tối thiểu 20.000 IU tiền sinh tố A. + 100g khoai lang ta cung cấp khoảng 27.000 IU tiền sinh tố A. + 100g rau dền cung cấp không dưới 7.000 IU tiền sinh tố A. Chỉ cần quán triệt thêm một chút về khoa dinh dưỡng, người ta có thừa phương tiện

để phòng bệnh xây dựng trên thực phẩm bình dân rẻ tiền.- Sinh tố A được tích trữ lâu dài trong cơ thể. Lạm dụng sinh tố A có thể đưa đến tình trạng nhiễm độc với triệu chứng tổn thương ngoài da, viêm khớp, đau bắp thịt, nôn mửa, rụng tóc và viêm gan. Do đó, đừng quá tin vào quảng cáo hấp dẫn để uống thuốc sinh tố A mỗi ngày nhằm mục tiêu phòng ngừa ung thư. Thuốc sinh tố A thường được định lượng theo thành phần tiêu chuẩn quốc tế IU với 1mg sinh tố A = 3.000 IU. Thuốc sinh tố A liều cao từ 10.000 IU là dược phẩm đặc hiệu và chỉ nên áp dụng một cách giới hạn theo đúng hướng dẫn của thầy thuốc chuyên khoa cho bệnh nhân đang có vấn đề với thị lực, đang đối đầu với chứng mụn dưới dạng nặng hoặc thường gặp tình trạng bội nhiễm trên đường hô hấp. Độc giả cũng nên lưu ý là sinh tố A trong dầu cá không có tác dụng phòng ngừa ung thư,

94

cũng không có khả năng ngăn ngừa bệnh mắt cườm như nhiều người lầm tưởng. Chỉ có thành phần tiền sinh tố A trong rau cải, trái cây mới có khả năng phòng bệnh. Vitamine D- Có các dạng vitamine: D2, D3, D4, D5, D6, D7, thường gặp là D2.- Công thức cấu tạo:

- Có các tên là antirachitic factor, calcitriol…Đây là một nhóm hóa chất trong đó về phương diện dinh dưỡng có 2 chất quan trọng là ecgocanxiferon (vitamine D2) và colecanxiferon (vitamine D3). Trong thực vật ecgosterol, dưới tác dụng của ánh nắng sẽ cho ecgocanxiferon. Trong động vật và người có 7-dehydro-cholesterol, dưới tác dụng cửa ánh nắng sẽ cho colecanxiferon.- Chức năng chủ yếu của sinh tố D tập trung vào quy trình kiến tạo xương, thông qua cơ chế phân phối chất vôi và phosphor. Sinh tố D hưng phấn khả năng hấp thụ hai loại muối khoáng này qua đường tiêu hóa và đồng thời yểm trợ quy trình dự trữ trong mô xương. Lượng sinh tố D đầy đủ trong cơ thể là điều kiện thiết yếu để vôi và phosphor được giữ chặt trong mô xương. Nói một cách tượng hình, thiếu sinh tố D thì cấu trúc của xương bị loãng hoặc không đồng bộ. Ngoài ra, sinh tố D còn ảnh hưởng trên sự phân hóa tế bào trong chiều hướng ngăn chặn hiện tượng biến thể cấu trúc tế bào sinh ung thư. Kết quả thống kê cho thấy bệnh nhân được điều trị với sinh tố D sau quy trình xạ trị ít bị tái nhiễm ung thư, khi so sánh với nhóm bệnh nhân không có sinh tố D trong phác đồ điều trị. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh là sinh tố D có tác dụng giảm thiểu tỷ lệ nhiễm ung thư da gây ra do tia tử ngoại và độc chất trong không khí. - Bệnh chứng điển hình do thiếu sinh tố D là bệnh còi xương với triệu chứng xương dễ gãy, biến dạng xương ức, xương sọ, đốt sống và xương hàm. Trên thực tế, bệnh này hiện nay chỉ còn xuất hiện trên quốc gia nghèo đói, trên trẻ sơ sinh chỉ bú mẹ mà người mẹ lại bị suy dinh dưỡng trầm trọng. - Sinh tố D có nhiều trong cá biển, thịt, trứng, nấm. Liều sinh tố D cần thiết cho mỗi ngày là 5 microgram. Sinh tố D, không như nhiều người lầm tưởng, có rất ít trong sữa! Do đó các bà mẹ còn thiếu kinh nghiệm nuôi con cần lưu ý bổ túc loại sinh tố này cho trẻ sơ sinh. Vì sinh tố D được cơ thể tổng hợp qua ánh sáng mặt trời nên nếu chế độ dinh dưỡng cung ứng đầy đủ thành phần chất béo cho gan và nếu đối tượng có dịp phơi nắng thì ít khi cơ thể rơi vào tình trạng thiếu hụt sinh tố D. Bản so sánh hàm lượng sinh tố D đính kèm dưới đây cho thấy người ăn chay trường rất dễ thiếu sinh tố D, vì hình thức dinh dưỡng xây dựng hoàn toàn trên rau cải khó đáp ứng nhu cầu về sinh tố D. Đây cũng là lý do tại sao phần lớn người ăn chay trường dễ bị chứng loãng xương. Với đối tượng theo đuổi hình thức ăn chay thì nấm là dạng thực phẩm đáng chú trọng, vì trong nấm có nhiều sinh tố D. - Cơ thể người nghiện thuốc lá cũng có nhu cầu về sinh tố D cao hơn bình thường. Người lớn tuổi nếu ít vận động, ít phơi nắng, lại thêm khuynh hướng giới hạn thức ăn thịt cá rất dễ thiếu sinh tố D. Ngược lại, người dầm mưa dãi nắng quá nhiều dễ bị biến dạng xương khớp do rối loạn chuyển hóa sinh tố D. Chỉ cần 15 phút dưới ánh nắng gắt thì cường độ của tia tử ngoại đã đủ để hưng phấn quy trình sản xuất sinh tố D kéo dài 24 giờ... Người phải làm việc thường xuyên dưới trời nắng gắt vì thế phải được bảo vệ đúng mức với mũ áo che kín, hay tốt hơn nữa với các loại kem bảo hộ lao động có tác dụng ngăn chặn tia tử ngoại.

95

H3C CH3

CH3

CH3CH3

HO

H2C

- Sinh tố D được dự trữ khá lâu trong cơ thể nên tình trạng tích lũy có thể dẫn đến hiện tượng nhiễm độc với triệu chứng biếng ăn, nôn mửa, nhức đầu, viêm thận và đặc biệt là sạn thận vì lượng sinh tố D quá cao trong cơ thể sẽ gây tác dụng hồi nghịch vận chuyển chất vôi từ xương đến thận và tích lũy trên đường tiết niệu. Dược phẩm có sinh tố D vì thế chỉ nên được áp dụng theo đúng chỉ dẫn và dưới sự kiểm soát của thầy thuốc. Tác dụng của sinh tố D được hỗ trợ bởi sinh tố C, B6 và khoáng chất vôi. Trên cơ sở vừa trình bày, nên chọn dược phẩm sinh tố D có đi kèm các thành phần vừa kể trong trường hợp phải dùng thuốc. Vitamine E- Còn có các tên là tocopherol... Thường gặp các dạng α, β, γ− tocopherol.- Công thức cấu tạo:

- Vitamine E là một chất chống oxy hoá tốt do cản trở phản ứng xấu của các gốc tự do trên các tế bào của cơ thể.- Vai trò:

+ Ngăn ngừa lão hoá: do phản ứng chống oxy hoá bằng cách ngăn chặn các gốc tự do mà vitamine E có vai trò quan trọng trong việc chống lão hoá.

+ Ngăn ngừa ung thư: kết hợp với vitamine C tạo thành nhân tố quan trọng làm chậm sự phát sinh của một số bệnh ung thư.

+ Ngăn ngừa bệnh tim mạch: vitamine E làm giảm các cholestrol xấu và làm tănng sự tuần hoàn máu nên làm giảm nguy cơ mắc các bênh tim mạch.

+ Hệ thống miễn dịch: kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động bình thường bằng việc bảo vệ các tế bào... - Trên thực tế, hầu như không có bệnh chứng chuyên biệt do thiếu sinh tố E. Nhà thống kê đã từ lâu ghi nhận mối liên hệ giữa đối tượng có lượng sinh tố E trong máu rất thấp với các chứng bệnh thời đại như: nhồi máu cơ tim, ung thư, dị ứng. Triệu chứng điển hình thường gặp khi nguồn dự trữ sinh tố E bị thiếu hụt là khuynh hướng mỏi cơ, rối loạn thị lực, co thắt bắp thịt, suy nhược, hay quên. - Sinh tố E có nhiều trong các loại dầu thực vật, trong đậu, mè cũng như trong một số rau cải như: rau dền, củ su hào. Bản so sánh hàm lượng sinh tố E dưới đây cho thấy vai trò quan trọng của các loại dầu ăn dẫn xuất từ đậu phộng, đậu nành, hoa hướng dương.- Nhu cầu lý tưởng của sinh tố E là 12 mg mỗi ngày. Trong điều kiện sinh hoạt bình thường, chỉ tiêu này có thể được đáp ứng dễ dàng với chế độ dinh dưỡng có trọng điểm là nguồn thực phẩm rau cải, khoai lang ta và dầu thực vật. Nhu cầu về sinh tố E gia tăng trong trường hợp có thai, trên đối tượng đang cho con bú, với người đang trong tình trạng căng thẳng thần kinh, người không quen dùng dầu ăn thực vật. Bệnh nhân ung thư và tim mạch nên được tiếp tế với lượng sinh tố E cao gấp 5 lần hàm lượng bình thường mà không sợ bị nhiễm độc vì bệnh chứng do tích lũy sinh tố E trong cơ thể hầu như không có trong thực tế, trừ khi đối tượng có đủ phương tiện để tự đầu độc với liều sinh tố E tối thiểu 800mg mỗi ngày và trong nhiều tháng liên tục. Vitamine K

96

CH3

H3C

HOCH3

O

OCH3

(CH2)3 CH

CH3

(CH2)3 CH

CH3

(CH2)3 CH

CH3

CH31 2

345

67

8

α tocopherol (5,7,8- trimetyl tocopherol)

- Có các dạng: Vitamine K1 và K2.- Tên gọi là Filloquinon.- Công thức cấu tạo:

- Vitamine K rất cần thiết cho quá trình đông máu ở người và động vật. Nó tham gia vào nhóm hoạt động của enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp chất protrompine. Trong cơ thể protrompine pTrompine TFibrinogen F Fibrine. Fibrine giúp cho quá trình đông máu. Thiếu vitamine K, cơ thể bị bệnh chảy máu tự phát (chảy máu cam, chảy máu bên trong), vết thương khó cầm máu. Trẻ sơ sinh, người mắc bệnh gan, bệnh đường ruột, sự tiết mật rối loạn…thường bị thiếu vitamine K, trong những trường hợp này cần bổ sung vitamine K cho cơ thể. Ở thực vật: vitamine K tham gia vào quá trình vận chuyển điện tử trong quang hợp.- Vitamine K có nhiều trong các loại rau: bắp cải, rau dền. Việc tổng hợp vitamine K diễn ra mạnh ở phần xanh, liên quan chặt chẽ với sinh tổng hợp chlorophyl. Vì thế ở lá hàm lượng vitamine K lớn hơn ở quả và các bộ phận khác. Có nhiều ở gan động vật.- Nhu cầu: không lớn lắm đối với người vì hệ vi khuẩn đường ruột tự tổng hợp được. Trẻ sơ sinh 10-15 mg/ngày. Người lớn nhỏ hơn 1mg/ngày. Vitamine Q- Tên gọi là: Ubiquinon- Công thức cấu tạo:

- Tham gia chủ yếu vào các quá trình oxi hóa khử ở cơ thể bằng cách vận chuyển H+ và e-, khi đó nó chuyển từ trạng thái oxi hóa sang dạng khử và ngược lại.

Vitamine Q Vitamine QH2

Quá trình này xảy ra ở trung tâm năng lượng của tế bào như ti thể. Vì thế tại đây

nồng độ Ubiquinon khá cao.- Vitamine Q có phổ biến ở cơ thể sinh vật, thực vật, người, động vật. Đặc biệt ở cơ tim có nhiều Ubiquinon với chỉ số n = 10.3.4.1.3. Cấu tạo hóa học, vai trò, chức năng sinh học, nhu cầu và nguồn cung cấp của các vitamine hòa tan trong nước Vitamine B1

- Có tên Tiamino, aneurine.- Công thức cấu tạo:

97

C

C

O

O

CH3

CH2 CH C

CH3

(CH2)3 CH

CH3

(CH2)3 CH

CH3

(CH2)3 CH

CH3

CH3Vitamine K1(2-metyl-3-phytyl-1,4-naphtoquinon)

OCH3O

O

[CH2O

H3C

H3CCH C

CH3

CH2]nH

Ubiquinon (n= 6-10)

NH2

H3C

CH2N

N

N

S

CH3

CH2 CH2OH

+

Tiamine

khử + 2H+

-2H+ oxi hóa

- Vitamine B1 đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra năng lượng cần thiết cho các hoạt động chức năng của con người.

Tiamine Tiaminpirophotphat

ATP AMP(TTP)

- TTP là nhóm ngoại của enzyme piruvatdecacboxylaza xúc tác cho quá trình chuyển hóa acid piruvic trong trao đổi glucid.- Vai trò:

+ Đồng hoá đường: vitamine B1 cần thiết cho việc tạo ra một loại enzyme (tham gia vào thành phần của coenzyme) quan trọng tham gia vào quá trình chuyển hoá đường và quá trình phát triển của cơ thể. Khi thiếu vitamine B1 acid pyruvic sẽ tích lũy trong cơ thể gây độc cho hệ thống thần kinh. Vì thế nhu cầu vitamine B1 đối với cơ thể tỉ lệ thuận với nhu cầu năng lượng.

+ Nhân tố ngon miệng: kích thích sự tạo thành một loại enzyme tham gia vào quá trình đồng hoá thức ăn, kích thích cảm giác thèm ăn.

+ Sự cân bằng về thần kinh: Vitamine B1 tham gia điều hòa quá trình dẫn truyền các xung tác thần kinh, kích thích hoạt động trí óc và trí nhớ. - Vitamine B1 có nhiều trong cám gạo, nấm men, đậu đỗ, rau quả, và nhiều thực phẩm khác. Nhu cầu: Tùy thuộc vào loại hình, cường độ lao động, lứa tuổi… Người trưởng thành: 1,2-1,8 mg/ngày, trẻ em cần 0,4 -1,8 mg/ngày. Phụ nữ có thai, cho con bú, người ốm, gà, vịt thời kì đẻ trứng cần nhiều vitamine B1 hơn. Vitamine B2 - Tên gọi là Riboflavine vì trong thành phần có rượu ribit 5C. Ngoài ra có màu vàng da cam nên còn được gọi là Lactoflavine (lactis: sữa; flavus: vàng.- Công thức cấu tạo:

- Vitamine B2 giữ vai trò xác định trong các phản ứng của một số enzyme cần thiết cho quá trình hô hấp (tham gia vào thành phần của các enzyme vận chuyển hiđrô). Là nhóm ngoại của enzyme dehidrogenaza háo khí xúc tác cho quá trình vận chuyển H+ và e- trong các phản ứng photphoryl hóa oxi hóa của cơ thể. Vitamine B2 còn tham gia trong các quá trình oxi hóa khử, trong chu trình Krebs, trong sự oxi hóa các acid béo.- Vai trò:

+ Cân bằng dinh dưỡng: vitamine B2 tham gia vào sự chuyển hoá thức ăn thành năng lượng thông qua việc tham gia sự chuyển hoá glucid, lipid và protein bằng các enzyme.

+ Nhân tố phát triển + Tình trạng của da + Thị giác: vitamine B2 có ảnh hưởng tới khả năng cảm thụ ánh sáng của mắt nhất là

đối với sự nhìn màu. Kết hợp với vitamine A làm cho dây thần kinh thị giác hoạt động tốt đảm bảo thị giác của con người.

98

H3C

H3C N

N

CNH

CN

O

O

CH2 (CHOH)3 CH2OH

Vitamine B2

- Vitamine B2 được tổng hợp ở một số cơ thể sinh vật, ở thực vật nó được tổng hợp mạnh vào giai đoạn hạt nảy mầm đến ra hoa. Có nhiều trong nấm men, gan, thận, trứng, sữa, não, cá…- Nhu cầu: Người từ 2-4 mg/ngày, các loại gia cầm từ 2,5-3,5 mg/10kg, riêng gà con cần 0,3-0,4 mg/100kg thức ăn. Vitamine PP- Tên gọi là hỗn hợp của acid Nicotinic và Nicotinamide.- Công thức cấu tạo:

- Có trong thành phần của NAD+ (nicotinamide adenine dinucleotit) và NADP+

(nicotinamide adenine dinucleotit photphat) NAD+ và NADP+ là nhóm ngoại của enzyme dehidrogenaza kị khí, làm nhiệm vụ vận chuyển hiđro (H+) và điện tử e- trong các phản ứng oxi hóa khử của quá trình hô hấp. Các coenzyme này có trong 150 loại dehidrogenaza kị khí khác nhau.- Có nhiều trong bánh mí, khoai tây, gan, thận và nhiều loại thực phẩm khác. Ở người và động vật vitamine PP được tổng hợp từ amino aicd tryptophan. Nhu cầu: 12-18 mg/ngày. Cần tăng thêm vitamine PP khi giá trị calo trong khẩu phần tăng. Vitamine B6

- Tên gọi là Pyridoxine, adermine.- Công thức cấu tạo:

- Khi piridoxal được hoạt hóa bởi ATP để tạo thành photphopiridoxal, nó sẽ tham gia vào nhóm ngoại của enzyme aminotransferaza, xúc tác cho sự chuyển nhóm NH2 từ amino aicd đến xetoacid . Nhờ đó các xetoacid mới và amino aicd mới được tạo thành. Vì thế thiếu vitamine B6, quá trình trao đổi amino aicd và protein bị phá hủy, biểu hiện bệnh lí: rối loạn tuần hoàn, viêm da ở người, còn ở động vật thì rối loạn thần kinh, co giật, ngừng sinh trưởng.- Vitamine B6 có trong mọi loại thức ăn động, thực vật. Nhu cầu: Ở người bình thường 1,5-2 mg/ngày. Ở động vật gà con cần 7 mg/ngày. Vitamine C- Tên gọi là acid ascorbic- Công thức cấu tạo

- Vitamine C là một chất chống oxy hoá tốt, nó tham gia vào nhiều hoạt động sống quan trọng của cơ thể.

99

N

COOH

N

CONH2

Acid nicotinic Nicotinamide

N

CH2OH

CH2OH

HO

H3C

N

CHO

CH2OH

H3C

HO

N

CH2OH

CH2NH2

HO

H3CPiridoxinePiridoxal

Piridoxamine

+ NH3

CH

CC

CO

OHHO

OCH CH2OH

OH

CH

CC

CO

OO

OCH CH2OH

OH

Oxi hoa -2H

Khu +2H

Acid ascorbic Acid dehidro-ascorbic

- Acid ascorbic dễ dàng tham gia các phản ứng oxi hóa khử của quá trình trao đổi chất nhờ khả năng cho và nhận hidro của nó. Noa còn tham gia ào quá trình trao đổi acid nuleic, vào quá trình oxi hóa các amino aicd có nhân thơm như tirozine, phenylalanine.- Vai trò:

+ Kìm hãm sự lão hoá của tế bào: nhờ phản ứng chống oxy hoá mà vitamine C ngăn chặn ảnh hưởng xấu của các gốc tự do, hơn nữa nó có phản ứng tái sinh mà vitamine E - cũng là một chất chống oxy hoá - không có.

+ Kích thích sự bảo vệ các mô: chức năng đặc trưng riêng của viamino C là vai trò quan trọng trong quá trình hình thành collagen, một protein quan trọng đốI với sự tạo thành và bảo vệ các mô như da, sụn, mạch máu, xương và răng.

+ Kích thích nhanh sự liền sẹo: do vai trò trong việc bảo vệ các mô mà vitamine C cũng đóng vai trò trong quá trình liền seo.

+ Ngăn ngừa ung thư: kết hợp với vitamine E tạo thành nhân tố quan trọng làm chậm quá trình phát bệnh của một số bênh ung thư.

+ Tăng cường khả năng chống nhiễm khuẩn: kích thích tổng hợp nên interferon - chất ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn và virut trong tế bào.

+ Dọn sạch cơ thể: vitamine C làm giảm các chất thải có hại đối với cơ thể như thuốc trừ sâu, kim loại nặng, CO, SO2, và cả những chất độc do cơ thể tạo ra.

+ Chống lại chứng thiếu máu: vitamine C kích thích sự hấp thụ sắt bởi ruột non. Sắt chính là nhân tố tạo màu cho máu và làm tăng nhanh sự tạo thành hồng cầu, cho phép làm giảm nguy cơ thiếu máu.- Triệu chứng khiếm khuyết sinh tố C tiến hành tuần tự qua 3 giai đoạn, mau hay chậm tùy theo mức độ thiếu hụt, trước khi bị bệnh Scorbut do thiếu sinh tố C thực sự hội đủ điều kiện thành hình:

+ Giai đoạn 1: mệt mỏi, căng thẳng thần kinh, buồn ngủ, đau nhức cơ khớp. + Giai đoạn 2: chảy máu nướu răng, dưới da, da niêm. + Giai đoạn 3: biến dạng xương khớp, vết thương không lành, hư răng, bội nhiễm.

- Trái cây tươi là nguồn cung ứng chủ yếu sinh tố C, đặc biệt là dâu, chanh, bưởi, ổi, cam, xoài, đu đủ, dưa hấu. Một loại trái cây quen thuộc ở Úc châu nên được nông gia Việt Nam lưu ý hội nhập là trái kiwi, vì đó là nguồn cung cấp dồi dào sinh tố C. Thành phần rau cải có nhiều sinh tố C là ớt bị, cải broccoli, bắp cải, cà chua. Trong đa số trường hợp, chế độ dinh dưỡng với rau trái tươi đủ đảm bảo hàm lượng sinh tố C cho cơ thể. Bản dưới đây cho thấy tỷ lệ hàm lượng của sinh tố C trong các loại rau trái khác nhau, qua đó quan niệm ăn cam mới có sinh tố C không còn đứng vững, vì trên cùng trọng lượng thì ớt bị có hàm lượng sinh tố C cao gần gấp 3 lần lượng sinh tố C trong trái cam.- Cần lưu ý một điểm quan trọng: lượng sinh tố C được cơ thể hấp thu và dự trữ không tỷ lệ thuận với hàm lượng sinh tố trong thực phẩm, thậm chí còn giảm thiểu khi lượng sinh tố C trong thực phẩm quá cao. Nói một cách cụ thể, người vì hết lòng với sinh tố C nếu có thể ăn liền một lúc nửa chục cam sành thì phần lớn sinh tố C sẽ bị đào thải một cách hoang phí trong nước tiểu. Trong trường hợp này, dù tốn tiền, lượng sinh tố C hữu ích cho cơ thể vẫn thấp hơn ở người khôn khéo chỉ ăn một trái cam thôi, nhưng đều đặn sau mỗi bữa ăn. Nhu cầu về liều lượng sinh tố C không có chỉ tiêu cố định:

+ Lượng sinh tố C tối thiểu cần thiết cho cơ thể để ngăn ngừa bệnh Scorbut chỉ là 10mg mỗi ngày.

+ Nhu cầu về sinh tố C trung bình cho người không phải làm việc nặng là 75mg/ngày.

+ Thai sản phụ có nhu cầu sinh tố C cao hơn, khoảng 100-130mg mỗi ngày.

100

+ Bệnh nhân có nhu cầu chống bội nhiễm, dự phòng ung thư, kháng dị ứng sẽ cần tối thiểu 150mg sinh tố C mỗi ngày.

+ Người nghiện thuốc lá, vận động viên, bệnh nhân trong giai đoạn hồi phục, công nhân lao động nặng nên được tiếp tế mỗi ngày với 200mg sinh tố C.

+ Sinh tố C là nguồn dược liệu thiên nhiên cần thiết cho quy trình phục hồi và phòng bệnh xủa cơ thể. Chỉ cần bảo vệ kho dự trữ sinh tố C bằng cách tiếp tế đều đặn sinh tố C cho cơ thể, con người có thể ngăn chặn nhiều bệnh chứng trầm trong qua phương tiện đơn giản với thực phẩm rau trái. Vitamine B3

- Tên gọi là acid pantotenic.- Công thức cấu tạo

- Có trong thành phần của coenzyme A. Coenzyme A lại giữ vai trò quan trọng trong trao đổi acid béo, trao đổi glucid và amino aicd. Vì thế thiếu vitamine B3, coenzyme A không được hình thành, các quá trình trao đổi chất bị vi phạm. Ở người và động vật phát sinh bệnh viêm da, rụng tóc, lông.- Có trong hầu hết các loại thực phẩm: nấm men, gan, lòng đỏ trứng, các loại rau. Nhu cầu: 10 mg/ngày/người. Vitamine H- Tên gọi là biotine.- Công thức cấu tạo

- Biotine là coenzyme của nhiều enzyme xúc tác cho quá trình cố định CO2, trong các phản ứng cacboxyl hóa, chuyển cacboxyl hóa, là những phản ứng rất quan trọng trong sinh tổng hợp acid béo, protein, các base purine và hàng loạt các hợp chất khác. - Gan động vật, lòng đỏ trứng, sữa, hạt đậu đỗ đều là nguồn biotine phong phú. Nhu cầu rất thấp 0,01 mg/ngày/người.3.4.1.4. Vitamine trong lĩnh vực công nghệ sinh học

Trong số các vitamine đã biết thì một số có hàm lượng lớn trong các loại nông sản có nguồn gốc nhiệt đới. Ví dụ: caroten là dạng tiền vitamine A có nhiều trong quả gấc, bí ngô, củ carốt, ớt, quả trứng gà…

Các công trình nghiên cứu cho thấy dầu gấc có chứa 3,6 mg β-caroten/1ml (Nguyễn Văn Đàn 1959). Dầu gấc được sử dụng trong y học, làm nhanh lành các vết thương và hình thành da non. Hợp chất β-caroten và licopen còn có cả ở phần thịt vỏ quả gấc, có ở ruột quả bí ngô…

Bằng các công nghệ chế biến hiện đại, người ta đã chế biến các nông sản trên thành các chế phẩm gồm β-caroten, licopen, bổ sung chất dinh dưỡng cho trẻ em.

Nước ta và nhiều nước trên thế giới đã sản xuất β-caroten bằng công nghệ enzyme. Khi nuôi cấy nấm Actinomyces chrysomallus Var. Carotinoides N2 thì sau 72 giờ thu được

101

HO CH2 C

CH3

CH3

CH CONH

OH

CH2 CH2 COOH

Acid pantotenic

HN

HC CH

NHC

O

H2C CH (CH2)4 COOHS

Biotine

0,63 gam β- caroten/1kg môi trường nuôi cấy. Bằng phương pháp lên men với nhiều chủng loại vi sinh vật khác nhau, nhiều nước đã sản xuất β-caroten với hiệu suất cao(3gam β-caroten/1kg môi trường nuôi cấy).

Sản xuất β-caroten theo phương pháp này được dùng trong chăn nuôi để tăng trọng nhanh, cho sản lượng thịt cao và có thể sử dụng trong công nghiệp dược làm kem dưỡng da…

Vitamine E có nhiều trong một số loại hạt, đặc biệt trong hạt đậu tương nảy mầm trong dầu phôi ngô, dầu mầm lúa mì. Từ các loại dầu này người ta sản xuất chế phẩm vitamine E cô đặc chứa từ 10-30% vitamine E.

Vitamine B1 có trong cám gạo, nguồn nguyên liệu phong phú của mía và nhiều nước trồng lúa gạo. Người ta đã sản xuất chế phẩm giàu vitamine B1 dưới dạng: dầu cám, viên đường, viên nang… dùng trong y học cùng với một lượng lớn vitamine B1 được tổng hợp bằng con đường hóa học.

Các chế phẩm vitamine B1 và vitamine B6 còn được sản xuất dưới dạng lỏng trong ampul hoặc dạng bột phối trộn trực tiếp vào thức ăn, cũng có thể đóng thành gói nhỏ, bảo quản dùng trong một khoảng thời gian nhất định. Nhờ có việc bổ sungcác chế phẩm giàu vitamine này mà trong mấy năm gần đây năng suất sản lượng các loại thịt ở nước ta tăng lên đáng kể. 3.4.2. Thực hành thí nghiệm3.4.2.1. Định tính vitamine B1

- Nguyên tắcTrong môi trường kiềm tiamino bị oxi hóa bởi Fericianurkalium cho sản phẩm là

tiocrom. Dưới ánh sáng tử ngoại tiocrom phát huỳnh quang.

- Hóa chất+ Vitamine B1 1%: Hòa tan 4 viên (mỗi viên nặng 250mg) vào nước .+ NaOH 15%: Cân 15 gam NaOH hòa tan trong 85 gam nước.+ K3Fe(CN)6 1%: Cân 1 gam K3Fe(CN)6 hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cho

đủ 100 gam.+ Alcol Isobutyl.

- Thực hànhCho vào ống nghiệm 2ml vitamine B1 1%, thêm 1ml NaOH 15% và 0,5ml dung dịch

K3Fe(CN)6 1%. Lắc kỹ ống nghiệm cho thêm 2ml rượu Isobutyl. Để yên, dung dịch trong ống nghiệm sẽ tách thành 2 lớp. Để dưới ánh sáng mặt trời hoặc đèn cực tím, quan sát và giải thích.- Kết quả và giải thích: Sau khi cho thêm 2 ml rượu Isobutyl, để yên dung dịch tách thành 2 lớp: lớp dưới có màu vàng chanh, lớp trên không màu. Đem phơi dưới ánh sáng

102

Tiocrom

4

N N H C

CH

NH 2

2

3 2

N C H 3 S CH -CH OH 2 Cl

+ K Fe(CN) + NaOH 3 6

N

N H C

CH

N

2

3 2

N C H 3 S CH -CH OH 2

+ K [Fe(CN)] + NaCl + H O 6 2

Tiamine clorur

mặt trời có hiện tượng phát huỳnh quang. Do trong môi trường kiềm Vitamine B1 bị oxi hóa bởi K3Fe(CN)6 cho sản phẩm là tiocrom, dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời tiocrom phát huỳnh quang. 3.4.2.2. Định tính vitamine B1 với thuốc thử diazo- Nguyên tắc

Trong môi trường kiềm tiamino phản ứng với thuốc thử diazo(hỗn hợp của acid sulfanilic và NaNO2) cho màu vàng cam hoặc đỏ.- Hóa chất

+ Vitamine B1 1%+ Acid sulfanilic 1%: cân 1 gam acid sulfanilic hòa tan trong nước, sau đó thêm nước

cho đủ 100 gam.+ NaNO2 5%: Cân 5 gam NaNO2 hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cho đủ 100

gam.+ Na2CO3 10%: cân 10 gam Na2CO3 hòa tan trong 90 gam nước.

- Thực hànhCho vào ống nghiệm 0,5ml dung dịch vitamine B11%, 0,5ml dung dịch acid

sulfanilic 1%, 0,5ml dung dịch NaNO2 5% và 10 giọt Na2CO3 10%. Lắc đều, nhận xét.- Kết quả và giải thích: Khi cho 10 giọt Na2CO3 vào và lắc đều ta thấy dung dịch có màu đỏ. Do tiamino trong môi trường kiềm phản ứng với hỗn hợp ( acid sulfanilic+NaNO2) cho ra sản phẩm có màu đỏ. 3.4.2.3. Phản ứng khử của vitamine B2 (riboflavine)- Nguyên tắc

Vitamine B2 có màu, dưới tác dụng của chất khử tạo thành Leucoriboflavine (dihidro riboflavine) không màu.

Riboflavine(vàng) Dihidroriboflavine (không màu)- Hóa chất

+ Vitamine B2 0,02%: Hòa tan 10 viên Vitamine B2 vào nước( mỗi viên có trọng lượng là 0,002 gam), sau đó thêm nước cho đủ 100 gam.

+ HCl đậm đặc.+ Zn viên.

- Thực hànhCho vào ống nghiệm 2ml dung dịch vitamine B2 0,02%, thêm vào 1ml HCl đậm đặc

và một viên Zn, quan sát màu của dung dịch. Để yên 20 phút, quan sát màu của dung dịch và giải thích.- Kết quả và giải thích: Trước khi phản ứng xảy ra dung dịch vitamine B2 có màu vàng. Khi phản ứng giữa Zn và HCl xảy ra thì dung dịch bị nhạt màu dần cho đến không màu. Do vitamine B2 la chât oxi hoa, Zn la chât khư nên xay ra qua trinh oxi hoa khư tao thành hợp chất không màu. 3.4.2.4. Phản ứng của vitamine PP (B5 - acid Nicotinic nicotinamide)- Định tính bằng Cu(CH3COO)2

103

H3C

H3C

N

ON

N O

NH

CH2(CHOH)3CH2OH

H3C

H3C

N

ON

N O

NH

CH2(CHOH)3CH2OH

+2H

-2H

H

+ Zn + HCl + ZnCl2

H

Acid Nicotinic phản ứng với Cu(CH3COO)2 trong môi trường acid yếu tạo thành Nicotinat Cu.

Acid Nicotinic Đồng Nicotinat- Hóa chất

+ Vitamine B5 1%: Hòa tan 20 viên (mỗi viên có trọng lượng 0,05 gam) trong nước, sau đó thêm nước cho đủ 100 gam.

+ CH3COOH 15%: cân 15 gam CH3COOH hòa tan trong 85 gam nước.+ Cu(CH3COO)2 5%: Cân 5,5 gam Cu(CH3COO)2.H2O hòa tan trong nước, sau đó

thêm nước cho đủ 100 gam.+ NaOH 40%: Cân 40 gam NaOH hòa tan trong 60 gam nước.+ Giấy quỳ đỏ.

- Thực hànhCho vào ống nghiệm 2ml dung dịch Acid Nicotinic 1%, 1ml CH3COOH 15%. Đun

bắt đầu sôi, thêm vào 1,5ml Cu(CH3COO)2 5%. Quan sát màu kết tủa trong ống nghiệm và giải thích.- Kết quả và giải thích: Khi thêm Cu(CH3COO)2 vào ta thấy các thể vẩn đục màu xanh nhạt, sau đó tạo thành kết tủa xanh của đồng nicotinat. Do trong môi trường acid yếu vitamine B5 phản ứng với Cu(CH3COO)2 tạo kết tủa đồng nicotinat.* Phản ứng với NaOH

Nicotinamide bị thủy giải trong môi trường base cho muối Nicotinat và NH3.

- Thực hànhCho vào ống nghiệm 1 ít bột nicotinamide, 2ml nước cất và 1ml NaOH 40%. Lắc

đều, đun nóng, đặt giấy quỳ đỏ lên trên ống nghiệm. Quan sát màu giấy quỳ, giải thích.- Kết quả và giải thích: Khi đun nóng có mùi khai của NH3, giấy quỳ đỏ hóa xanh. Do nicotinamide bị thủy giải trong môi trường kiềm giải phóng NH3.3.4.2.5. Phản ứng định tính vitamine B6 (Piridoxine)- Nguyên tắc

Piridoxine có 1 nhóm -OH loại phenol, có thể cho phức màu với FeCl3.

- Hóa chất+ Vitamine B6 1%: Hòa tan 4 viên vitamine B6 (mỗi viên có trọng lượng là 250 mg)

vào nước, sau đó thêm nước cho đủ 100 gam.+ FeCl3 5%: Cân 5 gam FeCl3 hòa tan trong 95 gam nước.

- Thực hànhCho vào ống nghiệm 1ml piridoxin 1% và 5 giọt FeCl35%. Lắc đều, quan sát hiện

tượng và giải thích.

104

N

COOH

N

COO

+ Cu(CH3COO)2

2

H2

(CH3COOH) Cu2+

+ 3 CH3COOH

N

CNH2

O

N

COONa

+ NaOH + NH3

NCH3

HO

CH2OH

CH2OH CH2OH

CH2OH

+ FeCl3

CH3 N 3

Fe + HCl3

O

3

- Kết quả và giải thích: Lắc đều ống nghiệm ta thấy xuất hiện màu đỏ (màu rượu chát). Do vitamine B6 có nhóm OH có thể tạo phức với FeCl3 cho màu đỏ.3.4.2.6. Phản ứng của vitamine C (Acid Ascorbic):- Nguyên tắc

Acid Ascorbic rất dễ bị oxid hóa với chất oxid hóa như K3Fe(CN)6.

Acid dehidroascorbic- Hóa chất

+ Vitamine C 1%: Hòa tan 2 viên vitamine A (mỗi viên có trọng lượng 500 mg) vào nước, sau đó thêm nước cho đủ 100 gam.

+ K3Fe(CN)6 5%: Cân 1 gam K3Fe(CN)6 hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cho đủ 100 gam.

+ FeCl3 5%: Cân 5 gam FeCl3 hòa tan trong 95 gam nước.- Thực hành

Cho vào ống nghiệm 1ml Acid Ascorbic 1%, 1ml K3Fe(CN)6 5% và 3 giọt FeCl3

5%. Lắc nhẹ, quan sát hiện tượng và giải thích.- Kết quả và giải thích: Lắc nhẹ ống nghiệm ta thấy dung dịch có màu xanh. Do vitamine bị oxi hóa bởi K3Fe(CN)6 tạo hợp chất có màu.3.4.2.7. Định tính vitamine A (Retinol)* Với H2SO4đ

Vitamine A bị khử nước tạo thành sản phẩm màu không bền, sau đó biến thành màu đặc trưng của lipocrom.- Hóa chất

+ Vitamine A trong CHCl3: Hòa tan 4 viên vitamine A(mỗi viên nặng 500 IU) troang CHCl3.

+ H2SO4 đặc.- Kết quả và giải thích: Lắc đều ống nghiệm ta thấy xuất hiện màu xanh tím không bền sau đó chuyển thành màu đỏ nâu của lipocrom.* Với SbCl3

Vitamine A với SbCl3 cho phản ứng khử nước tạo thành sản phẩm có màu không bền.- Hóa chất

+ Vitamine A trong CHCl3: hòa tan 4 viên dầu cá A-D trong 100 ml CHCl3.+ SbCl3 bảo hòa trong CHCl3.

- Thực hànhCho vào ống nghiệm đã sấy khô 2 giọt dung dịch vitamine A trong CHCl3 và 1ml

SbCl3 bảo hòa trong CHCl3. Lắc đều, quan sát sự đổi màu trong ống nghiệm, giải thích.

105

K3[Fe(CN)6] + Fe 4[Fe(CN)6]

FeCl3

C

C

C

C

CH2

HO

O

O

C

H

O

O

H

OH

+ KCl +3

OH

H

C

C

C

C

CH2

HO

O

O

HO

CHO

H + H

2O

- Kết quả và giải thích: Lắc đều ống nghiệm quan sát ta thấy xuất hiện màu xanh, sau đó chuyển thành màu tím hoặc hồng. Do vitamine A phản ứng khử nước với SbCl3 cho ra các sản phẩm có màu.3.4.2.8. Phản ứng của vitamine D (calcipherol)- Nguyên tắc

Trong môi trường acid, vitamine D phản ứng với aniline tạo thành hợp chất có màu.- Hóa chất

+ Dầu cá.+ CHCl3.+ Aniline.+ HCl đặc.

- Thực hànhCho vào ống nghiệm đã sấy khô 4 giọt dầu cá, 1ml CHCl3 và 4 giọt aniline + 3 giọt

HCl đặc. Lắc đều, đun nóng trong 30 giây, quan sát hiện tượng và giải thích.- Kết quả và giải thích: Lắc đều ta thấy xuất hiện màu vàng, sau đó chuyển thành màu xanh lá cây, cuối cùng biến đổi thành màu đỏ. Do trong môi trường acid vitamine D phản ứng với aniline tạo ra các hợp chất có màu. 3.4.2.9. Phản ứng của vitamine E (tocopherol):- Nguyên tắc

Với chất oxi hóa như HNO3, tocopherol bị oxi hóa cho quinon.

- Hóa chất + Vitamine E 1%: Hòa tan 4 viên vitamine E (mỗi viên nặng 250mg) trong CHCl3.

thêm CHCl3 cho đủ 100 gam. + HNO3 đậm đặc.

- Thực hànhCho vào ống nghiệm đã sấy khô 2ml vitamine E 0,1% và 2ml HNO3đậm đặc. Lắc

nhẹ, sau 1 đến 2 phút quan sát hiện tượng và giải thích.- Kết quả và giải thích: Lắc nhẹ ta thấy dung dịch có màu đỏ. Do vitamine E bị oxi hóa bởi HNO3 tạo ra hợp chất có màu.3.5. Bài 5: Enzyme3.5.1. Tính chất3.5.1.1. Khái niệm về enzyme

Enzyme là những chất xúc tác sinh học do cơ thể sống tổng hợp nên. Nhờ có enzyme mà các quá trình hóa sinh xảy ra rất nhạy, với tốc độ rất nhanh trong những điều kiện sinh lý bình thường mà các chất xúc tác sinh học khác không thể thực hiện nổi.

Enzyme có ở mọi sinh vật, trong tế bào sinh vật và là động lực của mọi quá trình sống. Hay có thể nói enzyme là những chất mà dưới tác dụng của chúng các phản ứng hóa sinh được thực hiện rất nhanh chóng với nhịp điệu, trình tự hết sức rõ ràng, chính xác trong quá trình trao đổi chất của cơ thể. Enzyme là những protein, có khả năng xúc tác chon loc cho các phản ứng hóa học nhất định.

106

Hình 1: Enzyme

CH3HO

CH3CH3

O RCH3

CH3CH3

O

CH3

R

CH3

CH3

OH

O

+ HNO3

CH

H3

α-Tocopherol Tocopherilquinon

3.5.1.2. Tên gọi và phân loại enzyme Tên gọi

Trong thời gian đầu khi enzyme học chưa phát triển, người ta thường gọi tên enzyme một cách tùy tiện. Do đó các tên gọi của enzyme thường lộn xộn và mơ hồ. Sau đó người ta thường gọi tên enzyme bằng cách “lấy tên La Tinh của phản ứng hoặc cơ chất mà enzyme đó tác dụng + tiếp vị ngữ ase”. Ví dụ: enzyme phân giải lipid có tên là lipase; urease là enzyme có tác dụng vào ure; enzyme thực hiện quá trình oxy hóa có tên là oxydase…. Bên cạnh đó vẫn còn các tên gọi cũ theo thói quen lịch sử như enzyme pepsin, trysin,… đây là các enzyme protease. Phân loại

Mục đích của phân loại là để nhấn mạnh một cách chính xác và tổng quát mối quan hệ và những điều giống nhau của một loại enzyme. Cũng giống như những ngành khoa học khác, enzyme học càng phát triển thì sự thống nhất cách gọi tên và phân loại càng trở nên cần thiết. Vì vậy, năm 1961 tiểu ban enzyme học quốc tế đã trình bày một báo cáo, trong đó có đề nghị những nguyên tắc định tên và phân loại enzyme. Người ta chia enzyme ra làm 6 lớp:

- Lớp I: Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng oxy hoá-khử.- Lớp II: Transferase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển vị.

- Lớp III: Hydrolase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân.

- Lớp IV: Lyase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng phân cắt không cần nước.- Lớp V: Isomerase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng đồng phân hoá.

- Lớp VI: Ligase (synthetase): các enzyme xúc tác cho các phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lượng của ATP .v.v.

Ngoài ra, mỗi lớp còn được chia thành nhiều tổ (dưới lớp), mỗi tổ chia thành nhiều nhóm (siêu lớp).

3.5.1.3. Bản chất và đặc điểm của enzyme. Bản chất hóa học của enzyme

Ngoại trừ một nhóm nhỏ ARN có tính xúc tác, tất cả enzyme đều là protein. Tính chất xúc tác phụ thuộc vào cấu tạo của protein. Do vậy, enzyme cũng có đầy đủ các tính chất vật lý và hóa học của protein như hòa tan trong nước hay trong dung dịch muối loãng; do kích thước phân tử khá lớn nên enzyme cũng không qua được màng thẩm tích. Tất cả các yếu tố làm biến tính protein như acid đặc, kiềm đặc, muối của kim loại nặng, nhiệt độ cao… đều có thể làm enzyme bị biến tính. Enzyme cũng thường bị tủa và biến tính trong các dung môi hữu cơ như alcol, aceton… Các chất gây kết tủa thuận nghịch đối với protein như amonsulfat, natri clorur và các dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp cũng có tác dụng tương tự đối với các chế phẩm enzyme.

Đặc điểm hoạt tính của enzyme

Enzyme cũng giống như các chất hóa học khác là làm tăng tốc độ phản ứng, không mất đi, không tăng lên trong quá trình phản ứng. Nó giúp cho phản ứng nhanh chóng đạt tới trạng thái cân bằng động. Nó quyết định chiều hướng của phản ứng, nhưng do trong cơ thể các sản phẩm của phản ứng này lại là cơ chất của các phản ứng tiếp theo nên phản ứng hầu như đi một chiều. Tuy nhiên enzyme có đặc điểm khác với các chất xúc tác khác là:- Enzyme có hiệu lực xúc tác cao nhất so với các chất xúc tác khác (trong 1 giờ 1,6g amylase có thể thủy phân đến 175 kg tinh bột).

107

- Enzyme hoạt động với tính đặc hiệu rất cao. Thường mỗi enzyme chỉ xúc tác cho một loại phản ứng hay một cơ chất tới hàng đồng phân quang học. Sở dĩ có được tính đặc hiệu này là do có sự kết hợp ăn khớp về mặt cấu trúc giữa enzyme với cơ chất (thể hiện bởi các gốc, các chức hóa học).

- Enzyme là chất xúc tác sinh học có khả năng gia tăng tốc độ phản ứng tới 105 - 1011 lần so với phản ứng cùng loại không có sự xúc tác. Có loại enzyme chỉ trong một phút có thể biến đổi hàng triệu chất.- Enzyme hoạt động trong điều kiện sinh lý bình thường. Ở động vật máu nóng, đó là nhiệt độ của cơ thể, pH của mô bào áp suất khí quyển và môi trường nước.3.5.1.4. Cấu tạo hoá học của enzyme

Thành phần cấu tạo

Có những enzyme chỉ là những phân tử protid thuần, nghĩa là sản phẩm của sự thuỷ phân hoàn toàn của chúng chỉ gồm toàn amino aicd. Ví dụ các enzyme thuộc loại hydroxylase.

Có những enzyme bản chất thuộc loại protid tạp nghĩa là thành phần cấu tạo của chúng gồm hai thành phần: một phần là protid thuần được gọi là apoprotein hay apoenzyme; một phần không phải là protid. Phần không phải là protid thường là các chất hữu cơ đặc hiệu có nhiệm vụ cộng tác với enzyme trong quá trình xúc tác. Tuy những tính chất cơ bản của enzyme là do phần apoprotein quyết định nhưng đối với những enzyme loại hai thành phần này, nếu thiếu chất hữu cơ đặc hiệu để làm chất cộng tác thì enzyme cũng không hoạt động đựơc.

Ngoài ra trong thành phần cấu tạo, rất nhiều enzyme có chứa ion kim loại. Một số enzyme vẫn được coi là những protid thuần, ví dụ như trysin, Chymotrysin… thì người ta cũng đã phát hiện thấy phân tử của chúng có chứa ion kim loại. Có ion kim loại là thành phần của chất hữu cơ đặc hiệu của coenzyme như trường hợp sắt (Fe), đồng (Cu), kẽm (Zn), mangan (Mn)….Vai trò của những ion kim loại này có thể là thành phần cấu tạo của phân tử enzyme hoặc phức hợp enzyme cơ chất, hoặc cũng có thể là chất cộng tác trong hoạt động xúc tác của enzyme.

Trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động của enzyme là nơi tiếp xúc

giữa enzyme với đối tượng tác động của nó (tức là cơ chất), là nơi enzyme thực hiện phản ứng. Trung tâm hoạt động được hình thành thông qua cấu trúc bậc III của phân tử protein enzyme, thông qua đó một số gốc amino aicd bình thường nằm xa nhau trong cấu trúc bậc I có thể được phân bố lại gần nhau, phối hợp với nhau để thực hiện chức năng xúc tác của enzyme. Ở các enzyme phức tạp thì do các gốc amino aicd đó kết hợp với nhóm ghép tạo nên. Các gốc amino aicd thường tham gia vào trung tâm hoạt động là Cys với nhóm –SH; Ser, Tyr, Tre với nhóm –OH; Lys, Arg với nhóm –NH2; Glu, Asp với nhóm –COOH ; His với nhóm imidazole. Khi enzyme có thêm nhóm ghép tức là coenzyme thì coenzyme phân bố ngay ở trung tâm hoạt động.

Cũng cần chú ý rằng có những enzyme có một trung tâm hoạt động, nhưng cũng có những enzyme có hai hoặc nhiều trung tâm hoạt động. Ví dụ enzyme dehydrogenase của gan có hai trung tâm hoạt động, còn enzyme dehydrogenase của nấm men có tới bốn trung tâm hoạt động.

108

Hình 2: Trung tâm hoạt động enzyme

Có thể coi trung tâm hoạt động là phần quyết định trong hoạt động của enzyme nên mọi tác động có ảnh hưởng tới enzyme trước hết là ảnh hưởng tới trung tâm hoạt động như hiện tượng ức chế, hoạt hóa…Các chất tác dụng có thể làm tăng cường độ hoạt hóa của enzyme thì người ta gọi là chất hoạt hóa, nếu làm giảm hoặc tê liệt hoạt hóa của enzyme thì gọi là chất ức chế. Những chất này có thể tác dụng thẳng vào trung tâm hoạt động của enzyme như một số ion kim loại: Cu2+, Zn2+, Mn2+, Co2+, Ca2+,… có tác dụng hoạt hóa enzyme do các ion này tham gia trực tiếp vào trung tâm hoạt động để vận chuyển điện tử hoặc cầu nối giữa cơ chất và enzyme. Một số chất có tác dụng ức chế enzyme như KCN, ditrec… chúng có thể bịt kín trung tâm hoạt động của enzyme.3.5.1.5. Tính chon loc của enzyme

Người ta chia tính đặc hiệu ra làm 3 kiểu:

Chon loc phản ứng Đó là biểu hiện của một enzyme chỉ thường xuyên xúc tác cho một kiểu phản ứng

nhất định. Ví dụ vận chuyển hydro từ chất cho (rượu bậc nhất hay rượu bậc hai) đến chất nhận (NAD+ hay NADP+); hay chuyển nhóm amino từ một amino acid đến một ceto acid…. Các phản ứng loại thứ nhất do dehydrogenase xúc tác, còn phản ứng loại thứ hai do aminotransferase xúc tác.

Chon loc cơ chất

Tuỳ mức độ người ta chia thành: đặc hiệu tương đối và đặc hiệu tuyệt đối+ Đặc hiệu tuyệt đối: Enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định. Một ví dụ có

tính chất kinh điển về chuyển hoá tuyệt đối là urease, enzyme chỉ phân giải ure. Hàng trăm thí nghiệm trên các dẫn xuất của ure đều cho thấy chúng không bị phân giải dưới tác động của urease. Thực ra người ta đã phát hiện khả năng phân giải cơ chất hydroxyure nhưng với tốc độ bé hơn khoảng 120 lần.

+ Chon loc nhóm tuyệt đối: Các enzyme này chỉ tác dụng lên những chất có cùng một kiểu cấu trúc phân tử, một liên kết và có những yêu cầu xác định đối với nhóm nguyên tử ở gần liên kết chịu tác dụng. Ví dụ maltase chỉ phân giải liên kết glucosidic được tạo thành từ glucoside của glucose với -OH của monose khác.

+ Chon loc nhóm tương đối: Các enzyme không có những yêu cầu đối với nhóm chức ở gần liên kết chịu tác dụng. Ví dụ lipase thuỷ phân lipid.

Chon loc không gian

Các enzyme chỉ xúc tác cho một dạng đồng phân nào đó như dạng L- hay dạng D-dạng cis- hay dạng trans- mà thôi.

3.5.1.6. Cơ chế xúc tác của enzyme Nguyên lý về cơ chế xúc tác của enzyme

Tính xúc tác sinh học của enzyme thể hiện chính ở chỗ với một nồng độ rất nhỏ enzyme cũng có khả năng làm tăng tốc độ phản ứng lên hàng ngàn vạn lần. Cũng như các chất xúc tác khác, enzyme không tham gia vào sản phẩm cuối cùng của phản ứng, nó chỉ làm cho phản ứng nhanh chóng đạt tới trạng thái cân bằng động. Để hiểu được cơ chế xúc tác của enzyme cần nhớ lại một số điều kiện nhiệt hóa động học để phản ứng tiến hành. Tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đó là:- Sự va chạm của các chất tham gia phản ứng nhất là các va chạm hữu hiệu, khả năng va chạm này phụ thuộc vào nồng độ của chúng và sự nhiễu động mạnh (tức là nội năng của chúng).

109

- Năng lượng hoạt hóa của chất tham gia phản ứng: tốc độ phản ứng hóa học nói chung được xác định bởi năng lượng hoạt hóa, tức là mức năng lượng các chất tham gia phản ứng phải đạt được, để cắt đứt các liên kết cần thiết và hình thành các liên kết mới. Năng lượng hoạt hóa càng lớn thì phản ứng càng chậm và ngược lại, năng lượng này càng thấp thì tốc độ phản ứng càng nhanh. Muốn đạt tới năng lượng hoạt hóa thì cần nạp cho phân tử chất một nguồn năng lượng từ bên ngoài dưới dạng nhiệt năng, quang năng hoặc điện năng….

Cơ chế xúc tác của enzymeVề cơ chế xúc tác của enzyme có nhiều giả thiết nhưng đều thống nhất ở chỗ là quá

trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzyme với cơ chất để tạo thành phức hợp trung gian, cơ chất kết hợp với enzyme ở phần trung tâm hoạt động, hiện tượng chọn lọc đặc hiệu được thực hiện ở giai đoạn này. Có các thuyết giải thích cơ chế hoạt động của enzyme như sau: Thuyết hợp chất trung gian: Do Nensky đề xướng và Langhenbec phát triển, thuyết này giải thích trường hợp enzyme và cơ chất là đồng pha. Theo thuyết này enzyme tạo với cơ chất thành những hợp chất trung gian không bền vững nhờ đó sản phẩm tạo ra với mức đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp hơn bình thường, ta có thể hình dung như sau:

Giả sử có phản ứng A + B AB tiến hành chậm. Khi có enzyme K thì quá trình diễn ra như sau: A + K AK với mức năng lượng thấp.

AK + B AB + K cũng với mức năng lượng thấp.Tóm lại là : A + B + K AK + B AB + KTốc độ phản ứng tăng vì nó đi theo con đường vòng để tránh mức năng lượng hoạt

hóa cao. Bằng cách đo mức năng lượng hoạt hóa, người ta cũng thấy được điều đó. Thí dụ phản ứng phân giải H2O2 → H2O + 1/2O2 có mức năng lượng hoạt hóa là 18 kcal/mol. Khi có peroxydase thì mức năng lượng hoạt hóa chỉ còn 2 kcal/mol. Bằng quang phổ hấp phụ đã cho thấy sự tồn tại của hợp chất trung gian. Thuyết hấp phụ: Do Bailixo đề xướng (1906) sau được nhiều tác giả bổ sung. Thuyết này giải thích hiện tượng enzyme với cơ chất là khác pha. Nhờ trạng thái phân tán cao mà diện tích hấp phụ của enzyme là rất lớn, làm chỗ thu hút cơ chất, cơ chất tập trung lại làm cho nồng độ tăng cao, các va chạm hữu hiệu tăng, nên tốc độ phản ứng tăng. Quá trình hấp phụ này không chỉ tuân theo các quy luât vật lý đơn thuần mà nó bị chi phối bởi các yếu tố hóa học phức tạp dẫn đến hiện tượng hấp phụ có chọn lọc giữa enzyme và cơ chất bằng những biến đổi trong những cấu trúc của các liên kết nguyên tử cơ chất dưới ảnh hưởng của lực từ các tương tác phân cực mà phân tử enzyme đem lại, cho nên chúng dễ phân hóa hoặc liên kết với nhau. Như vậy hấp phụ ở đây cũng có tính chọn lọc, chủ động và rất có thể vì những ảnh hưởng đó mà mức năng lượng hoạt hóa được hạ thấp tạo điều kiện cho phản ứng dễ thực hiện. Cơ chế xúc tác acid – base: Trong các phản ứng hóa sinh luôn luôn có sự hình thành các chất trung gian mang điện tích không bền, dễ dàng bị phân rả trở lại trạng thái ban đầu. Tuy nhiên chúng có thể được ổn định nhờ sự trao đổi proton với sự tham gia của H+ hay OH-. Trường hợp này gọi là xúc tác acid – base. Chúng xảy ra trong môi trường phản ứng

110

Hình 3: Một phản ứng trải qua hợp chất trung gian C.

ngoài nước còn có các chất cho và nhận proton khác. Một số amino aicd tham gia trung tâm xúc tác enzyme như Glu, Lys, Cys… đóng vai trò làm chất cho (ở dạng acid) hoặc chất nhận (ở dạng base). Xúc tác thông qua tạo liên kết hóa trị tạm thời: Các liên kết này tồn tại trong khoảng thời gian rất ngắn giữa cơ chất và enzyme, nó hoạt hóa phản ứng rất mạnh. Nhiều gốc amino aicd và cofactor của enzyme đóng vai trò là chất ưa nhân.3.5.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>>[E] thì tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [S], v= K[E] có dạng y = ax. Nhờ đó người ta đã đo [E] bằng cách đo vận tốc phản ứng do enzyme đó xúc tác.

Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hoá thì vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó.

Hình 4: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]

Ảnh hưởng của chất hoạt hóa (activator)

Chất hoạt hoá là chất làm tăng khả năng xúc tác nhằm chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm. Thông thường là những cation kim loại hay những hợp chất hữu cơ như các vitamine tan trong nước.

Ví dụ: Mg2+ hoạt hóa các enzyme mà cơ chất đã được phosphoryl hóa như pyrophosphatase (cơ chất là pyrophosphate), adenosinetriphosphatase (cơ chất là ATP). Các cation kim loại có thể có tính đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng còn tuỳ thuộc vào nồng độ.

Ảnh hưởng cuả nhiệt độTa có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ môi trường, hiện tượng này tuân theo quy luật Vant’-Hoff. Điều này có nghĩa khi tăng nhiệt độ lên 100C thì tốc độ phản ứng tăng lên khoảng 2 lần.

Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định,vì bản chất enzyme là protein. Khi ta tăng nhiệt độ lên trên 40-500C xảy ra quá trình phá huỷ chất xúc tác. Sau nhiệt độ tối ưu tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ giảm. Nhờ tồn tại nhiệt độ tối ưu người ta phân biệt phản ứng hoá sinh với các phản ứng vô cơ thông thường.

Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối ưu khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấp enzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40-600C , cũng có enzyme có nhiệt độ tối ưu rất cao như các enzyme của những chủng ưa nhiệt. Các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, đăc biệt các vi khuẩn chịu nhiệt có chứa enzyme chịu nhiệt cao.

111

Hình 13. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên họat độ enzyme

Ảnh hưởng của pH

Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết với cơ chất và tính chất hoạt động của phân tử enzyme. Điều này dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH. Mỗi enzyme có một pH tối ưu, mỗi enzyme có đường biểu diễn ảnh hưởng pH lên vận tốc phản ứng do chúng xúc tác. Đường biểu diễn có dạng như hình sau:

3.5.1.8.Ứng dụng enzyme

Enzyme trong sản xuất biaĐể thực hiện đường hóa trong quy trình sản xuất bia, người ta dùng α,β-amylase cắt

liên kết α (1-4) amylose của tinh bột tạo thành dextrin, rồi thành maltose. Sau đó dùng maltase tiếp tục cắt liên kết α (1-4) của maltose để tạo thành glucose.

Để bảo quản bia, papain được dùng làm chất ổn định, nhất là khi pha bia có glutathiol và acid ascobic. Papain còn làm trong bia và nước giải khát lên men. Ứng dụng enzyme để tạo ra những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao

Papain mang tính chất như một endopeptidase, đồng thời cũng như một exopeptidase, thủy phân protein thành polypeptid, oligopeptid và các aminoacid. Tính chất đặc hiệu của papain đối với cơ chất rất lớn. Papain có khả năng thủy phân tất cả các liên kết peptid, trừ các liên kết của prolin và acid glutamic. Papain từ nhựa quả đu đủ xanh có hoạt lực thủy phân mạnh ngang với chế phẩm Substilizin Bungary và mạnh hơn chế phẩm Neutrase của hãng Novo Đan Mạch.

112

Một số loại tảo như: Spirulina, Chlorella có hàm lượng protein dự trữ rất cao (từ 55 – 65 % trọng lượng khô), nhưng hệ tiêu hóa của con người không thể sử dụng trực tiếp các loại tảo này được. Vì vậy khi dùng tảo để sản xuất những loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, phải thủy phân chúng. Quá trình thủy phân này được papain, với tính chất như trên, xúa tác một cách hiệu quả. Ezyme trong phân tích (đặc biệt là phân tích chất độc hóa học)

Acetylcholinesterase là một ứng dụng quan trọng của enzyme trong quân sự để phát hiện các chất độc thần kinh có chứa cơ phospho hóa trị 5 như zoman, zarin. Phương pháp hóa học chỉ có thể phát hiện được những chất độc này ở nồng độ lớn gấp 10.000 lần so với liều chiết. Phương pháp enzyme có độ nhạy lớn gấp 106 lần so với phương pháp hóa học.

Dùng urease hoặc peroxidase cho phép đo Hg2+ ở nồng độ 10-6 mg/ml. Dùng alcolholdehydrogenase phát hiện Ag+ ở nồng độ 2.10-4 µg/ml. Ứng dụng enzyme để tạo các dược phẩm

Ứng dụng tính đặc hiệu lập thể tuyệt đối nghiêm ngạt của enzyme, chỉ tác động tới đồng phân quang học, cho phép tách đồng phân mong muốn, mà các phương pháp hóa học không thực hiện được. Dựa vào tính chất này của enzyme cho phép thu nhận đồng phân quang học của hợp chất hữu cơ để làm dược phẩm.

Lactatdehydrogenase chỉ làm biến đổi dạng L không tác động tới dạng D của acid lactic. Aminoacylase cũng chỉ làm biến đổi dạng L của aminoacid.

Ribonuclease là enzyme thủy phân, được tách ra từ nguồn động vật như tụy bò, nọc rắn, ếch Châu Phi…. Hiện nay, ribonuclease từ nọc rắn độc được sử dụng nhiều trong y học như một dược phẩm điều trị một số bệnh nhiẽm trùng virut. Thí dụ: các ribonuclease tụy từ lâu đã được sử dụng để chữa bệnh viêm não. Gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu chỉ rằng ribonuclease ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư, và có thể là vũ khí mới để chống ung thư. Vi sinh và enzyme đối với sản xuất và định lượng chất kháng sinh

Vi sinh và enzyme giữ vai trò không thể thay thế được trong sản xuất chất kháng sinh:

Các chất kháng sinh bán tổng hợp, hoặc các dẫn xuất của các chất kháng sinh thường có ưu điểm hỏn hẳn các chất kháng sinh ở chõ bền vững, ít độc hơn, hoạt tính kháng sinh mạnh hơn, đặc biệt là không gây dị ứng.Vì vậy, sau khi đã thu nhận được các chất kháng sinh do các chủng vi sinh tổng hợp, cần tiến hành các phản ứng tiếp theo để sản xuất các dẫn xuất của các chất kháng sinh này hoặc là các chất kháng sinh bán tổng hợp. Trong các phản ứng tiếp theo ấy thì enzyme giữ vai trò không thể thay thế được.

Thí dụ: penicilline do chủng vi sinh penicillinum chrysogenum tổng hợp. Để chuyển penicilline thành amino penicillinic acid (6-APA), người ta dùng c cố định trên chất mang, sau đó acylase để chuyển amino penicillinic acid (6-APA) thành ampicilline (D- α- aminobenzen penicilline).

Enzyme trong định lượng chất kháng sinh: Định lượng chất kháng sinh là vấn đề khó khăn đối với phương pháp hóa học. Tuy nhiên vấn đề này có thể dễ dàng giải quyết nhờ phương pháp enzyme. Thí dụ: để định lượng penicillin, người ta dùng penicillinamidase cố định trên thủy tinh lỗ xốp. Phương pháp này cho phép định lượng penicilline trong nồng độ 5-10 mM, hoặc dùng điện cực enzyme cho phép định lượng penicilline với nồng độ nhạy tới 0,01 mM. Sử dụng enzyme để giải quyết vấn đề năng lượng

Hydrogenase để giải quyết vấn đề năng lượngTrước tình hình khủng hoảng năng lượng trên thế giới ngày càng trầm trọng, các nhà

khoa học đã có nhiều phương pháp tìm kiếm nguồn năng lượng cho tương lai. Những

113

nguồn năng lượng có triển vọng nhất có thể kể đến là năng lượng mặt trời và năng lượng nhiệt hạch. Nhưng từ năm 1975, năng lượng mặt trời là nguồn năng lượng đã được chọn dứt khoát cho tương lai.

Đã 3 tỷ năm qua và 3 tỷ năm tới, hằng năm mặt trời cho trái đất một khối lượng năng lượng khổng lồ không đổi là 3.1024 J, tương đương với 64 nghìn tỷ tấn dầu mỏ, gấp 5.000 tất cả các nguồn năng lượng mà trái đất có. Năng lượng mặt trời cho trái đất lớn như vậy, nhưng con người mới chỉ sử dụng được khoảng 0,01%, số còn lại tán xạ ra ngoài khí quyển. Do đó nếu có phương án nào sử dụng hiệu quả hơn nguồn năng lượng khổng lồ ấy, thì con người sẽ vĩnh viễn thoát khỏi tình hình khủng hoảng năng lượng.3.5.2. Thực hành thí nghiệm3.5.2.1. Định tính succinat hidrogenase- Nguyên tắc

Các succinal hidrogenaz có thể được định tính dựa vào phản ứng sau:

- Hóa chất + Cơ tươi nghiền nhỏ với nước cất.

+ Dung dịch đệm phosphate có PH=6,8: Gồm có hai dung dịch • Dung dịch NaH2PO4.2H2O (M/15): 11,876 g/l.• Dung dịch K2HPO4 (M/15): 0,078 gam/l.

Khi sử dụng trộn 2 dung dịch theo tỉ lệ thể tích 1:1. Để chính xác ta dùng máy đo PH đo để chỉnh lại.

+ Acid succinic 1%: Cân 1 gam acid succinic hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cho đủ 100 gam.

+ Xanh metilen (hòa tan trong cồn).- Thực hành

Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 5ml hỗn hợp cơ tươi đã nghiền nhỏ với nước cất, lắc và trộn đều. Lấy ống 1 đem đun sôi, để nguội hoàn toàn rồi cho vào mỗi ống 1ml dung dịch đệm phosphate pH = 6,8; lắc đều. Thêm vào mỗi ống nghiệm 2ml acid succinic 1% và 3 giọt xanh metilen, lắc đều, cho vào mỗi ống vài giọt dầu thực vật. Đặt cả 2 ống nghiệm vào tủ ấm 370C trong 1 giờ. Lấy ra quan sự biến đổi màu xanh metilen trong ống nghiệm 2, giải thích kết quả.- Kết quả và giải thích: Sau khi đặt 2 ống nghiệm trong tủ ấm 370 lấy ra quan sát ta thấy ở ống 1 màu xanh của xanh metilen không đổi. Còn ở ống 2 màu xanh của xanh metilen bị nhạt. Do ở ống 2 là cơ tươi nên có enzyme succinatdehyrogenaz (FAD) xúc tác cho quá trình khử hiđro của acid succinic biến thành acid fumaric và enzyme ở dạng FADH2, sau đó là sự cộng hiđro vào bleu metylen(có màu xanh) biến thành leuco bleu metylen (không

114

3 Cl

Bleu metylenLeuco bleu metylen

Acid Succinic

CH -COOH

CH -COOH

2

2

N

SN

CH3

H C3

N-CH

CH3

N

SN

CH3

H C3

N-CH

CH3

3

H

HC

COOH

CHHOOC

Acid FurmaricFADH FAD

2

+HCl

Succinatdehyrogenaz

màu), nên làm nhạt màu ở ống 2. Còn ở ống 1 cơ đã bị nung nóng nên enzyme succinatdehyrogenaz (FAD) đã mất hoạt tính không có khả năng thực hiện quá trình trên nên màu ở ống 1 không đổi.3.5.2.2. Định tính lipase- Nguyên tắc

Dầu mỡ dưới sự hiện diện của lipaz và đun nóng bị thủy giải cho ra glycerin và acid béo hoặc muối.

- Hóa chất+ Sữa tươi.

+ Phenolphtalein (hòa tan trong cồn).+ Na2CO3 1%: Cân 1 gam Na2CO3 hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cho đủ 100

gam.+ Dung dịch lipase: Ủ đậu nành cho nảy mầm, xoay nhuyễn và trộn với nước cất, sau

đó lọc ta thu được dung dịch lipase.- Thực hành

Lấy 2 ống nghiệm cho vào mỗi ống 1ml sữa tươi, 1 giọt Phenolphtalein và từng giọt Na2CO3 1% đến khi dung dịch trong ống nghiệm có màu hồng. Sau đó thêm vào:

-Ống 1: 5 giọt nước cất-Ống 2: 5 giọt lipase. Quan sát sự thay đổi màu trong 2 ống nghiệm, giải thích.

- Kết quả và giải thích: Quan sát màu của dung dịch sau khi thêm Na2CO3 ta thấy ở ống 2 màu hồng bị nhạt đi rất nhiều, còn ở ống 1 không nhạt màu. Trong môi trường dung dịch Na2CO3 có tính kiềm nên làm phenolphtalein chuyển sang màu hồng. Ở ống 2 dưới tác dụng của enzyme lipase chất béo (trong sữa) bị thủy phân tạo các acid béo, các acid béo này trung hòa môi trường kiềm nên làm nhạt màu hồng của phenolphtalein. Còn ở ống 1 chất béo không bị thủy phân nên không làm nhạt màu.3.5.2.3. So sánh xúc tác vô cơ và xúc tác enzyme trong phản ứng thủy phân tinh bột- Phương pháp

Trong những điều kiện như nhau (nhiệt độ, thời gian xúc tác), thì tốc độ phản ứng thủy phân tinh bột sẽ khác nhau và tùy thuộc vào xúc tác là HCl hay amylase

Theo dõi tốc độ thủy phân tinh bột bằng sự quan sát phản ứng màu của của tinh bột với Iod. - Hóa chất

+ HCl 10%: Cân 37,04 gam HCl đậm đặc hòa tan trong 100 gam nước ta sẽ thu được dung dịch HCl 10%.

+ Dung dịch amylase: Ủ lúa cho lên mầm, sau đó đem xoay nhiễn với nước cất và lọc lấy dung dịch.

+ Dung dịch đệm phosphate-xitrat PH=5: Gồm hai dung dịch Dung dịch Na2HPO4.12H2O 0,2M (71,6 g/l). Dung dịch acid xitric C6H8O7.H2O 0,1M (21 g/l)

115

2

CH OCOR2

CH OCOR

CH OCOR2

+ 3H O 2 3RCOOH +

CH OH

CH OH

CH OH 2

Lipase

Khi sử dụng trộn hai dung dịch theo tỷ lệ thể tích 7,9:3,10:42

=−xitricacidHPONa VV . Để chính xác ta dùng máy đo PH để chỉnh lại.

+ Hồ tinh bột 1%: Cân 1 gam tinh bột hòa tan trong nước nóng cho tinh bột tan hết, sau đó thêm nước nóng cho đủ 100 gam.

+ Dung dịch Iod: Hòa tan 2,5 gam KI trong 10 ml nước cất, sau đó cho 1 gam I2 vào dung dịch KI, khuấy đều cho đến khi I2 tan hoàn toàn. Dùng nước cất dẫn đến mức 100 ml và bảo quản trong lọ màu.

+ NaOH 10%: Cân 10 gam NaOH hòa tan trong 90 gam nước.+ CuSO4 3%: Cân 4,69 gam CuSO4.5H2O hòa tan trong nước, sau đó thêm nước cho

đủ 100 gam.- Thực hành

Lấy 3 ống nghiệm, cho vào ống 1: 1ml nước cất, ống 2: 1ml HCl 10% và ống 3: 1ml amylase và 1ml dung dịch đệm pH=5. Cùng một lúc đặt cả 3 ống vào cốc nước ấm 50oC trong 3 phút, rồi lần lượt thêm vào mỗi ống 5ml hồ tinh bột 1% và lắc đều 1 phút.-Thử phản ứng với Iod: lấy 0,5ml dung dịch trong mỗi ống nghiệm trên lần lượt cho vào 3 ống nghiệm nhỏ 1’, 2’, 3’, để trong 5 phút. Cho tiếp vào mỗi ống vài giọt Iod, lắc đều. Quan sát màu và đánh giá mức độ thủy phân trong các ống nghiệm 1’, 2’, 3’.- Kết quả và giải thích: Quan sát 3 ống nghiệm 1’, 2’, 3’ ta thấy ống 1’ màu xanh rất đậm, chứng tỏ tinh bột không bị thủy phân. Còn ở ống 2’ có màu xanh nhạt chứng tỏ tinh bột bị thủy phân một phần dưới tác dụng của acid HCl nhưng không hoàn toàn. Còn ở ống 3’ không có màu xanh chứng tỏ tinh bột đã bị thủy phân gần như hoàn toàn dưới tác dụng của enzyme amylasea(dung dịch mầm lúa). -Thử phản ứng Trome: lấy 3ml dung dịch trong mỗi ống nghiệm 1, 2, 3 lần lượt cho vào 3 ống nghiệm nhỏ 1”, 2”, 3”. Cho tiếp vào mỗi ống 1ml NaOH 10%, lắc đều, thêm vào tiếp vài giọt CuSO4 3%. Đun nhẹ trong vài phút và quan sát, so sánh, đánh giá mức độ thủy phân trong các ống nghiệm 1, 2, 3.- Kết quả và giải thích: Đun nhẹ các ống nghiệm 1’’, 2’’, 3’’ ta thấy ở ống 1’’ không xuất hiện kết tủa đỏ, chứng tỏ tinh bột ở ống 1 không bị thủy phân. Còn ở ống 2’’, 3’’ xuất hiện kết tủa đỏ nhưng ở ống 3’’ kết tủa đỏ nhiều hơn và màu đậm hơn so với ống 2’’. Chứng tỏ ở ống 3 tinh bột bị thủy phân nhiều hơn so với ống 2. Tinh bột thủy phân tạo ra α-glucose tham gia phản ứng Trome cho kết tủa đỏ (Cu2O).3.5.2.4. Tính chon loc của enzyme- Nguyên tắc

Urea cho phản ứng thủy phân với xúc tác urease tạo thành CO2 và NH3.

NH3 sinh ra được nhận biết bằng giấy quỳ đỏ.- Hóa chất

+ Urea 5%: Cân 5 gam tinh thể urea hòa tan trong 95 gam nước.+Acetamide 5%: Cân 5 gam acetamide hòa tan trong 95 gam nước.+ Bột đậu nành, giấy quỳ đỏ.

- Thực hànhLấy 2 ống nghiệm sạch, lần lượt cho vào:

-Ống 1: 4ml urea 5%-Ống 2: 4ml acetamide 5%

116

O CNH

NH2

2+ H O

2Urease

CO + NH2 3

Thêm vào mỗi ống 1g bột đậu nành, lắc đều. Cho giấy quỳ đỏ vào miệng ống nghiệm và đậy kín bằng nút cao su. Sau một lúc quan sát hiện tượng và giải thích.- Kết quả và giải thích: Sau một thời gian ta thấy ống 1 giấy quỳ đỏ hóa xanh, còn ống 2 giấy quỳ không đổi màu. Do ở ống 1 dưới tác dụng của enzyme urease thì urea bị thủy phân tạo thành NH3 làm xanh giấy quỳ đỏ. Còn ở ống 2 acetamide không bị thủy phân bởi enzyme urease nên không có khí NH3 thoát ra, vì thế không làm đổi màu giấy quỳ.3.5.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của amylase- Phương pháp

Cho amylase của mầm lúa thủy phân tinh bột ở các nhiệt độ khác nhau, đánh giá hoạt tính của amylase bằng phản ứng màu của tinh bột sau thủy phân với Iod.

- Hóa chất+ Tinh bột 1%.+ Dung dịch mầm lúa.+ Thuốc thử Lugol: Hòa tan 2,5 gam KI trong 10 ml nước cất, sau đó cho 1 gam I2

vào dung dịch KI, khuấy đều, cho I2 tan hoàn toàn. Dùng nước cất dẫn đến mức 100 ml. Bảo quản trong lọ màu. - Thực hành

Lấy 3 ống nghiệm đánh số 1, 2, 3, cho vào mỗi ống 2ml tinh bột 1%. Đặt ống 1 vào bếp đun cách thủy, ống 2 vào cốc nước ấm 500C, ống 3 vào chậu nước đá. Sau 10 phút khi nhiệt độ trong các ống nghiệm cân bằng, cho vào mỗi ống 1ml dung dịch mầm lúa, tiếp tục giữ nhiệt độ như vậy . Lấy từ mỗi ống nghiệm một vài giọt dung dịch nhỏ lên gạch men trắng ở các vị trí đánh số theo số ống nghiệm 1, 2, 3. Để một lúc cho 3 ống đạt nhiệt độ phòng, thêm vào mỗi ống 1 giọt thuốc thử Lugol (hay Iod). Quan sát màu, giải thích sự khác nhau giữa các mẫu thử.- Kết quả và giải thích: Khi thêm thuốc thử Lugol vào mỗi vị trí quan sát ta thấy ở vị trí 1 và 3 có màu xanh đậm (ở vị trí 3 màu xanh đậm hơn). Còn ở vị trí 2 không có màu xanh. Điều đó chứng tỏ rằng enzyme amylase hoạt động tốt ở 500C nên thủy phân tinh bột gần như hoàn toàn nên khi nhỏ thuốc thử Lugol vào không xuất hiện màu xanh. Còn ở vị trí 1 và 3 không thích hợp cho enzyme amylase hoạt động nên tinh bột bị thủy phân rất ít. Do đó khi nhỏ thuốc thử Lugol vào xuất hiện màu xanh.

3.5.2.6. Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính của enzyme- Nguyên tắc

Mỗi enzyme có hoạt tính xúc tác tốt nhất ở một pH nhất định, khi pH thay đổi thì hoạt tính cũng thay đổi.

- Hóa chất+ Na2HPO4 0,2M: Cân 71,6 gam Na2HPO4.12H2O hòa tan vào nước, sau đó thêm

nước cho đủ 1 lít.+ Acid citric 0,1M: Cân 21 gam C6H8O7.H2O hòa tan trong nước, sau đó thêm nước

cho đủ 1 lít.+ Dung dịch amylase.+ Tinh bột 1% có NaCl: Cân 1 gam tinh bột hòa tan trong 99 gam nước và cho thêm

một chút muối ăn. Sau đó đem đun đến khi dung dịch trong là được.+ Thuốc thử Lugol.

- Thực hànhLấy 5 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 5, cho vào mỗi ống dung dịch Na2HPO4 0,2M và

dung dịch acid citric 0,1M theo thể tích ghi trong bản sau:

117

Ống số 1 2 3 4 5Dung dịch Na2HPO4 0,2M (ml) 4,1 7,7 10,3 12,6 16,5dung dịch acid citric 0,1M (ml) 16,3 12,7 10,1 7,8 3,9pH 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0

Lắc đều, cho vào mỗi ống 5ml tinh bột 0,1% trong NaCl 1%, lắc đều. Ngâm các ống vào nước ấm khoảng 500C. Lần lượt thêm vào từ ống 1 đến ống 5 mỗi ống 1ml dung dịch amylase (dung dịch mầm lúa), lắc đều. Lập tức thử ngay với thuốc thử lugol (cách làm tương tự như thí nghiệm trên). Sau đó cứ 1 phút lập lại với thuốc thử lugol cho đến khi có 1 trong 5 ống nghiệm trên cho phản ứng âm tính với thuốc thử lugol (không có màu xanh tím) thì không lặp lại việc thử màu trên gạch men nữa. Cho vào mỗi ống nghiệm 1 giọt thuốc thử lugol, lắc đều, quan sát màu trong mỗi ống nghiệm, kết luận pH nào thì enzyme amylase hoạt động tốt nhất ?- Kết quả và giải thích: Sau khi cho mỗi ống một giọt thuốc thử Lugol, lắc đều, quan sát ta thấy ở ống 1, 2, 3, 4 đều có màu xanh chứng tỏ tinh bột chưa bị thủy phân hoàn toàn hay ở các ống nghiệm 1, 2, 3, 4 PH không thích hợp để enzyme amylase hoạt động tốt nhất. Còn ở ống 5 không có màu xanh khi thêm thuốc thử Lugol chứng tỏ tinh bột đã bị thủy phân hoàn toàn hay ở PH= 7 enzyme amylase hoạt động tốt nhất. 3.6. Bài 6: Acid Nucleic3.6.1. Tính chất

Acid nucleic là các polinucleotide được tạo thành từ các mononucleotide liên kết với nhau bằng liên kết photphodieste.

Acid nucleic tham gia vào nhiều hoạt động sống của tế bào, cơ thể, giữ vai trò chủ đạo bảo đảm khả năng sinh tồn của nòi giống, mang vật chất, thông tin di truyền cho các thế hệ sau.

Acid nucleic được Miescher tách chiết đầu tiên năm 1868 từ nhân tế bào tinh dịch cá trích gọi là nuclein (bắt nguồn từ chữ nucleus-nhân). Sau đó Pal Plozz tách hợp chất nuclein từ nhân tế bào mủ, phát hiện trong thành phần cấu tạo có acid photphoric, nên gọi là acid nucleic.

Những dấu hiệu đầu tiên về vai trò mang chất liệu thông tin di truyền của acid nucleic được Fredrich Griffith phát hiện năm 1928, dựa trên cơ sở thí nghiệm đối với chủng vi khuẩn streptococcus pneumoniae gây bệnh viêm phổi ở chuột. Sau đó năm 1944 Avery và cộng sự dựa vào kết quả sử dụng ADN-ase tách chiết ADN ở vi khuẩn diploccus pneumoniae chủng S, đã chứng minh ADN là nhân tố có tính di truyền. Năm 1952 Alfred Hershey và Marth Chase dựa vào kết quả thí nghiệm sao chép thông tin di truyền của thực khuẩn thể T2 trong tế bào chủ E.coli đã khẳng định ADN là chất liệu mang thông tin di truyền.

ADN được phát hiện đầu tiên trong nhân tế bào sau đó tìm thấy trong ti thể, lạp thể và tế bào chất.3.6.1.1. Cấu tạo hóa học của acid nucleic Acid nucleic gồm các nguyên tố hóa học cơ bản như: C, H, O, N, P trong đó Polinucleotide có hàm lượng tương đối ổn định (8-10%), đặc trưng đối với acid nucleic.

Acid nucleic có bản chất là polinucleotide, gồm các đơn vị cấu tạo là các mononucleotide. Mỗi nucleotide có 3 thành phần: base nitơ, đường pentose và acid photphoric. Base nitơ

118

Đặc trưng cho các nucleotide, là một trong những đặc điểm phân loại acid nucleic. Base nitơ gồm các dẫn xuất của vòng purine hoặc pirimidine.

N

HCN

C

CC

H

N

NCH

H

16 5

432

7

89

Purine

CHC

N

HCN

CH

H

12

3 4 5

6

Pirimidine

Base nitơ tồn tại dưới 2 dạng ceto và enol, có thể biến đổi tương hỗ lẫn nhau không phụ thuộc vào PH của môi trường:

C O C OH

CetoEnol

Ở môi trường PH sinh lí, các base nitơ của acid nucleic thường tồn tại dưới dạng ceto. Base purine: phổ biến nhất là adenine (Acid nucleic) và guanine (G) ngoài ra còn có một số base nitơ thứ yếu như xantine, hipoxantine.

N

CN

C

CC

NH2

H

N

N

H

C H12

3 4

56 7

89

N

CN

C

CC N

NH2N

H

O

H

C H

Adenine Guanine

Base pirimidine: Phổ biến là xitozine (X), uraxine (U), và timine (T), timine là dẫn xuất 5 metyluraxine.

CN

CN

C

C

O

H

H

CH3

O

H

Timine

CN

CN

C

C

NH2

H

H

H

O

Xitozine

CN

CN

C

C

O

H

H

H

O

H

Uraxine

Xitozine phổ biến trong thành phần cấu tạo của acid nucleic; Uraxine đặc trưng cho acid ribonucleic ARN, Timine đặc trưng đối với aicd deoxiribonucleic ADN. Các base nitơ pirimidine thứ yếu là 5-metylxitozine và 1-metyluraxine. Đường pentose

Là ribose và deoxiribose có cấu hình không gian β-D-furanose.O OH

HH

H

H

OH

CH2

H

HO O OH

HH

OH

H

OH

CH2

H

HO

Deoxiribose Ribose

Cấu hình vòng furanose linh hoạt, đóng vai trò cấu trúc, tham gia tích cực trong quá trình sao chép, tích lũy thông tin di truyền của ADN, ARN.

Đường ribose và deoxiribose là một trong những đặc điểm phân loại các nucleotide, nucleozide và acid nucleic. Nucleozide

Gồm base nitơ kết hợp với đường pentose qua liên kết N- glicozide. Liên kết N-glicozide có cấu hình β nên các base nitơ nằm phía trên mặt phẳng

119

N

NN

N

NH2

O

HOH

HH

HH

HO

1

9

pentose. Liên kết N-glicozide giữa N-9 của vòng purine hoặc N-1 của vòng pirimidine với C-1 của đường pentose.

Cách gọi tên: các nucleozide được gọi tên bằng tên gọi các base nitơ đổi đuôi thành “ozine” hoặc “idine”. nếu thành phần đường pentose là desoxiribose thì thêm đầu âm “desoxi”. (bản)

Tên gọi các nucleozide:Base nitơ Ribonucleozide DesoxiribonucleozidePurine Adenine(A)

Guanine(G)AdenozineGuanozine

DesoxidenozineDesoxiguanozine

Pirimidine Xitozine(X)Uraxine(U)Timine(T)

XitidineUridineTimidine

DesoxixitidineDesoxiuridineDesoxitimidine

NucleotideLà este photphat của nucleozide. Liên kết este photphat được hình thành giữa acid

photphoric với nhóm OH ở vị trí C5, C3, C2 của đường ribose và C5, C3 của đường desoxiribose. Các nucleotide phổ biến là các nucleozide-5-photphat hoặc gọi là 5-nucleotide. Cách gọi tên: tên gọi các nucleotide theo thành phần cấu tạo hoặc dựa theo tính acid của các nucleotide.

Tên gọi các ribonucleotideBase nitơ Ribonucleotide

Ribonucleotide-5-monophotphat Acid RibonucleotidePurine Adenine(A)

Guanine(G)Adenozine-5-monophotphat(AMP)Guanozine-5-monophotphat(GMP)

Acid AdenilicAcid Guanilic

Pirimidine Xitozine(X)Uraxine(U)Timine(T)

Xitidine-5-monophotphat (XMP)Uridine-5-monophotphat (UMP)Timidine-5-monophotphat (TMP)

Acid XitidilicAcid UridilicAcid Timidilic

Cách gọi tên các dezoxiribonucleotide tương tự như các ribonucleotide nhưng thêm vần “desoxi” viết tắt “d”. Ví dụ: desoxiadenozine-5-monophotphat (d-AMP) hoặc acid desoxiadenilic, hoặc desoxiadenilat. Desoxixitidin-5-monophotphat (dxMP) hoặc acid desoxixitidilic hoặc desoxixitidilat.

Ngoài các dạng 5-nucleotide còn phổ biến các nucleotide vòng. Nucleotide vòng được hình thành giữa gốc photphat của acid photphoric với 2 nhóm OH ở vị trí C2, C3 hoặc C3 và C5. Công thức cấu tạo của acid vòng như sau:

120

Desoxiadenozine(Nucleoside adenine)

O

OO

Pirimidine

H

HOCH2

H

PO O

3 2

Nucleotide vòng đặc trưng là AMP vòng (viết tắt là AMPv) có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình điều hòa trao đổi chất của tế bào như điều hòa hoạt động của hocmon. (AMPv là chất truyền tin thứ 2), chỉ xuất hiện khi thủy phân ARN. Tùy thuộc vào số lượng gốc photphat có trong thành phần cấu tạo của nucleotide, có nucleotide mono, đi hay tri photphat. Các gốc photphat liên kết với nhau bằng liên kết anhidricphotphoric. Liên kết anhidricphotphoric có mức năng lượng lớn (khoảng trên 7Kcal/mol) gấp hơn 2 lần liên kết photphodieste nên gọi là liên kết cao năng. Các nucleotide diphotphat có 1 liên kết cao năng. Các nucleotide di, triphotphat điển hình như: ADP, ATP, GDP, GTP, XDP, XTP, UDP, UTP. Các nucleotide di, triphotphat có một số chức năng sinh học sau:

+ Là các chất dự trữ và vận chuyển năng lượng trong mọi quá trình trâo đổi chất của tế bào và cơ thể sống, đặc biệt ATP được coi là “đồng tiền năng lượng của tế bào”.

+ Là thành phần cấu tạo của một số coenzyme quan trọng tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử, hoạt hóa, vận chuyển các chất chuyển hóa. Thí dụ: NAD+ (nicotinamide adenine dinucleotide), FDA (Flavine adenine dinucleotide), FMN ( Flavine mono nucleotide), CoA (Coenzyme A).

+ Là tiền chất hoạt hóa tổng hợp ADN, ARN.3.6.1.2. Cấu trúc, tính chất hóa học của acid nucleic

Acid nucleic gồm 2 loại chính: acid desoxiribonucleic (ADN) và acid ribonucleic (ARN). ADN và ARN khác nhau về thành phần cấu tạo, chức năng sinh học và khu trú trong tế bào. Acid desoxiribonucleic (ADN)

Hầu hết ADN có cấu trúc xoắn đôi (trừ virus và một số vi khuẩn) gồm 2 chuỗi polinucleotide. Mỗi chuỗi polinucleotide do nhiều phân tử desoxiribonucleotide mono-photphat kết hợp với nhau (dNMP)n. Mỗi phân tử desoxiribonucleotide có thành phần cấu tạo gồm: base nitơ (A, T, G, X) đường β-D- Desoxiribose và H3PO4. Khối lượng phân tử ADN lớn, chứa lượng thông tin khổng lồ nhưng cấu trúc phân tử gọn, nhỏ, linh hoạt được đảm bảo do các mức cấu trúc bậc một, hai, ba. Cấu trúc bậc 1

Là trình tự sắp xếp các desoxiribonucleotide trên chuỗi polidesoxiribonucleotide bằng mối liên kết photphodieste. Liên kết photphodieste được hình thành giữa nhóm OH ở vị trí C3 của mononucleotide này với nhóm photphat ở C5 của mononucleotide khác. Chuỗi polinucleotide phân cực, đầu 5 có nhóm photphat, còn đầu 3 có nhóm OH tự do, hướng phân cực theo chiều 5h3. Cách biểu diễn một đoạn oligonucleotide của chuỗi polinucleotide: (hình bên)Trình tự sắp xếp các base nitơ trên chuỗi polinucleotide xác định thông tin di truyền của ADN. Nghiên cứu tỉ lệ số lượng các base nitơ của phân tử ADN ở một số loài sinh vật khác nhau. Erewin Chargafe đã phát hiện thấy mtj số qui luật chung sau: - Tổng số base nitơ Adenine luôn bằng Timine; guanine bằng Xitozine (ΣA=ΣT; ΣG=ΣX)

121

OBase

H

H

HOH

CH2

O

P O-O

O

OBase

H

H

HH

CH2

O

P O-O

O

OBase

H

H

HH

CH2

O

P O-O

5,

3,

5,

3,

5,

1=∑∑

T

A ; 1=

∑∑

X

G

Tỉ lệ base purine so với pirimidine gần bằng 1, giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành xoắn đôi Acid nucleic ADN.- Tổng số các base purine luôn bằng tổng số các base pirimidine ∑ ∑ +=+ )()( TXGA - Tổng số các base nitơ có nhóm amino bằng với các base nitơ có nhóm xeto: A +X=G +T.Qui luật về tỉ lệ số lượng các base nitơ do Erwin Chargafe phát hiện năm 1950 đã được ứng dụng trong công trình nghiên cứu cấu trúc xoắn đôi ADN của James Watson và Francis 1953. Cấu trúc bậc 2

Watson Crick đã đưa ra giả thiết về mô hình cấu trúc xoắn đôi của ADN, dựa trên cở sở phân tích các ảnh nhiễu xạ rơnghen về cấu trúc tinh thể phân tử ADN của Rosalin Franklin, Maurice Wilkins và qui luật về thành phần số lượng các base nitơ của Chargafe. Mô hình cấu trúc xoắn đôi ADN gồm một số đặc điểm chính sau:- Phân tử ADN có 2 chuỗi polinucleotide xoắn quanh một trục chung theo hướng đối song song.- Các base nitơ purine và pirimidine ở phía trong vòng xoắn, các gốc đường, photphat ở phía ngoài vòng xoắn.- Mặt phẳng base nitơ purine và pirimidine xếp chồng khít lên nhau, vuông góc với trục của vòng xoắn, mặt phẳng của đường ở gần phía phải của base nitơ. - Mỗi vòng xoắn có đường kính 20A0, chiều cao 34A0, gồm 10 bậc mỗi bậc tương ứng với 1 nucleotide có khoảng cách 3,4A0, nghiêng với mặt phẳng vuông góc với trục của vòng xoắn 1 góc 360. Cấu trúc bậc 3

Là sự cuộn, uốn cong phân tử ADN xoắn đôi hoặc đơn tạo tạo nên cấu trúc ADN gọn nhỏ trong tế bào. Các dạng cấu trúc bậc 3 như sau:- Phân tử ADN liên kết với protein tạo nên cấu trúc cuộn xoắn nhờ liên kết ion. Liên kết ion hình thành giữa các nhóm photphat mang điện tích (-) của ADN với nhánh mang điện tích dương của protein. Hầu hết các phân tử ADN của nhân tế bào Eucaryota có cấu trúc xoắn đôi, sợi dài, cuộn chặt quanh lõi protein kiềm(histone) hoặc protein acid (photphoproteit). Tạo nên cấu trúc rất gọn, chiếm khoảng 1/5 thể tích tế bào. Ví dụ: chiều dài phân tử ADN của chromoson người là 8cm, nhưng khi cuộn chặt trong nhân tế bào dài 5 nm. Khi phân tử ADN cuộn quanh lõi protein histon, bề mặt phân tử ADN quay ra phía ngoài, dễ dàng tiếp xúc với các phân tử protein có chức năng điều hòa hoạt động gen.- Phân tử ADN ở trạng thái tự do không liên kết với protein, có cấu trúc vòng đơn hoặc kép, đặc trưng đối với tế bào procaryota, ti thể, lạp thể, một vài loại vi khuẩn, virus.

+ ADN ti thể có cấu trúc vòng xoắn kép, không liên kết với protein.+ ADN thực khuẩn thể T7 có dạng xoắn kép, sợi thẳng có các đầu 3,5 tự do. ADN

của thực khuẩn thể λ dạng thẳng, vòng khi ở tế bào chủ ADN có dạng vòng.+ ADN siêu xoắn: là dạng vòng “thả lỏng” của phân tử ADN vặn xoắn theo mắt xích

vặn xoắn tam cấp tạo nên dạng siêu xoắn như ADN của ti thể. Dạng siêu xoắn giúp cho phân tử ADN có cấu trúc cuộn chặt, gọn, chiếm thể tích nhỏ hơn trong tế bào. Cấu trúc siêu xoắn ADN có ý nghĩa quan trọng giúp cho các phân tử protein, enzyme liên kết với ADN.

+ ADN xoắn đơn: phổ biến ở một vài loại vi khuẩn như thực khuẩn thể øX174, S13.Tóm lại: ADN ở hầu hết vi khuẩn, các tế bào procaryota, eucaryota có cấu trúc xoắn đôi, trừ một số vi khuẩn, ADN sợi đơn, dạng vòng. Kích thước phân tử

122

ADN có kích thước phân tử rất lớn dao động giữa các loài sinh vật. Kích thước phân tử được xác định bằng khối lượng phân tử, chiều dài chuỗi polinucleotide và số cặp nucleotide. Thí dụ phân tử ADN của virus polyoma (SV40) có chiều dài polinucleotide là 17000 A0, gấp 5 lần phân tử colagen là protein có chuỗi polinucleotide dài nhất 3000 A0. Chromosom của drosophila melanogaster có phân tử ADN dài 2,1 cm gồm 6,2x10^7 cặp nucleotide, chromosom lớn nhất của người chuỗi polinucleotide dài hơn 8 cm. Số lượng cặp nucleotide trên chuỗi polinucleotide của phân tử ADN rất đa dạng và đặc trưng đối với các loài sinh vật. Như số lượng cặp nucleotide dao động trong phạm vi từ 10^3 đến 10^7 trong một số loài sinh vật. Tính chất- Phân tử ADN có khả năng phản ứng cao, tham gia vào các phản ứng tạo muối với protein kiềm (protamino, histon), tạo phức hợp kim loại…- Khả năng hấp thụ ánh sáng của phân tử ADN ở vùng tử ngoại, với bước sóng từ 260 đến 280 nm, cực đại ở bước sóng λ=260 nm.- Tính hoạt quang của phân tử ADN được biểu hiện do sự tồn tại của cấu trúc xoắn, khi cấu trúc xoắn bị khử khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực cũng bị mất.- Độ nhớt của dung dịch ADN cao phụ thuộc vào tính đàn hồi của xoắn đôi phân tử ADN, chiều dài chuỗi polinucleotide mức độ trùng hợp (polyme) của phân tử. Khi liên kết hiđro bị đứt, cấu trúc xoắn đôi của ADN bị phá vỡ, độ nhớt dung dịch giảm rõ rệt.- Tính chất biến tính và phục hồi biến tính: một số nhân tố hóa học, vật lý như: kiềm, urea, thuốc thử fomaldehyde, ion kim loại, độ PH của môi trường, nhiệt độ cao…có tác dụng làm đứt liên kết hyđro, phá vỡ cấu trúc ADN xoắn đôi làm mất hoạt tính sinh học của ADN. Trong các nhân tố gây biến tính, nhân tố nhiệt độ thường được sử dụng gây biến tính ADN. Nhiệt độ nóng chảy là tại điểm nhiệt độ gây phá vỡ một nữa cấu trúc xoắn đôi của phân tử ADN, tăng độ hấp thụ ánh sáng. Nhiệt đọ nóng chảy dao động trong khoảng 850C đến 950C, đặc trưng cho các loại ADN.

Nhiệt độ nóng chảy phụ thuộc vào số lượng các cặp base nitơ G+X trong thành phần cấu tạo của phân tử ADN. Khi loại trừ các nhân tố gây biến tính liên kết hiđro hình thành, cấu trúc xoắn đôi ADN được phục hồi, phân tử ADN trở nên có hoạt tính sinh học. Quá trình như vậy gọi là loại biến tính. Tính chất biến tính và loại biến tính được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật lai phân tử, xác định thành phần cấu tạo nucleotide của ADN. Acid ribonucleic (ARN)

Là hợp chất trùng hợp (polymer) của các ribonucleozide monophotphat (NMP)n. Thành phần cấu tạo của ribonucleotide gồm: đường ribose thay cho đường deoxiribose, base nitơ uraxine(U) thay cho timine T.ARN có cấu tạo một chuỗi polinucleotide, trừ một số virus có cấu tạo 2 chuỗi: Cấu trúc phân tử ARN được đảm bảo do các mức cấu trúc 1, 2, 3. ARN có cấu trúc một chuỗi polinucleotide cuộn lại tạo thành vòng xoắn không lớn, các cặp base nitơ hình thành theo nguyên tắc bổ sung A với U và G với X.ARN hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng λ=260 nm, có tính hoạt quang, hiệu ứng hipecrom đặc trưng, tính chất biến tính và loại biến tính có biên độ dao động rộng, nhiệt độ nóng chảy cao. ARN rất đa dạng về kích thước phân tử, thành phần, số lượng các nucleotide. Vị trí khu trú trong tế bào và chức năng sinh học. Cụ thể:- ARN tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein (ARN vận chuyển tARN, ARN thông tin vận chuyển mARN, ARN ribosom vận chuyển rARN).- ARN là khuôn mẫu tổng hợp ADN, dưới tác dụng của enzyme phiên mã ngược transcriptaza.

123

- ARN có hoạt tính enzyme gọi là ribozim. Ribozim xúc tác cho phản ứng loại bỏ các đoạn nucleotide không mang mã (intron) của mARN chưa hoạt động tiền mARN) nối các đoạn nucleotide mang mã với nhau (exon), tạo nên mARN hoạt động, sơ đồ phản ứng như sau:

m ARN m ARN

intron

Ribozim

- ARN tham gia vào thành phần cấu tạo của các coenzyme (NAD+, FAD…) thực hiện các phản ứng oxi hóa chuyển hóa các chất.Vai trò, chức năng sinh học của ARN rất quan trọng và đa dạng, nên giả thiết cho rằng trong quá trình hình thành sự sống, ARN xuất hiện trước phân tử protein, ADN. Một số ARN tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein như sau: mARN, tARN và rARN. ARN thông tin (mARN: messenger ARN) ARN có cấu tạo một chuỗi polinucleotide chứa thông tin di truyền, được sao chép từ ADN là khuôn mẫu tổng hợp protein, mARN có một số đặc điểm sau:- mARN chiếm khoảng 2-5% tổng số ARN, được tổng hợp trong nhân, hoạt động trong tế bào chất.- Khối lượng phân tử của mARN dao động trong phạm vi rộng từ 25.103 đến 1.106, hằng số lắng 6-25S vì vậy quyết định tính đa dạng của phân tử protein.- mARN có đời sống ngắn, một vài phút đối với tế bào procaryota, một vài giờ đến một vài ngày đối với tế bào Eucaryota.- Mỗi tế bào có hàng trăm mARN khác nhau, mỗi mARN mã hóa cho một chuỗi polipeptide hoặc một số chuỗi polipeptide.- Hầu hết mARN có cấu trúc mạch đơn, trừ một số virus như virus ung thư, retrovirus có cấu trúc xoắn đôi, chứa vật chất thông tin di truyền từ ARN đến ADN. mARN virus khảm thuốc lá có cấu trúc mạch đơn điển hình, gồm 6390 nucleotide và vỏ protein có 2130 đơn vị bao quanh.- mARN* của tế bào Eucaryota có 1 đầu 5 Cap và 1 đầu 3 poly Acid nucleic, không có nhiệm vụ mã hóa, có tác dụng ổn định cấu hình mARN, bảo vệ mARN không bị tác dụng phân giải của nuclease và điều hòa quá trình dịch thông tin di truyền. ARN vận chuyển (tARN: transfer ARN)

ARN vận chuyển có cấu tạo một chuỗi đơn polinucleotide gồm từ 70 đến 90 nucleotide có chức năng vận chuyển amino aicd hoạt hóa đến mARN ở riboxom, cung cấp cho quá trình sinh tổng hợp chuỗi polinucleotide. Một số đặc điểm của tARN như sau:- Khối lượng phân tử khoảng từ 23 KD đến 28 KD, chiếm 10-20% ARN tế bào.- tARN chứa nhiều base nitơ thứ yếu (khoảng từ 7 đến 15 base nitơ). Số lượng base nitơ thứ yếu tăng theo mức độ tiêu hóa của sinh vật. Thí dụ: tARN-phenilalanine có 76 nucleotide, trong đó có 12 nucleotide chứa base nitơ thứ yếu. Các base nitơ thứ yếu điển hình là Psevdouridin, 5-metilxitozin, 6-thiouraxin. Chức năng sinh học của các base nitơ thứ yếu chưa được giải thích đầy đủ, nhưng có thể có tác dụng duy trì cấu hình không gian, bảo vệ phân tử tARN khỏi tác dụng phân giải của nuclease. Cấu hình không gian của tARN có cấu hình lá chẻ 3 gồm các vùng nhận acid amino hoạt hóa, vùng đối mã có bộ 3 nucleotide, đầu 5 có gốc photphat gắn với base nitơ. Guanine vùng chứa các base thứ yếu. Một nửa số gốc nucleotide của t ARN cặp đôi với nhau tạo nên những đoạn xoắn kép trên phân tử tARN.

124

(Không hoạt động) (hoạt động)

(Những đoạn nucleotide không mang mã)

ARN ribosom (rARN: ribosomal ARN): chiếm khoảng 80-90% ARN tế bào, tham gia vào thành phần cấu tạo của ribosom. Có nhiều loại rARN, đặc trưng cho nhiều kiểu tế bào và khác nhau về hằng số lắng. Tế bào Procaryota có 3 loại rARN với hằng số lắng 16S, 23S và 5S: tế bào Eucaryota có 4 loại rARN với hằng số lắng 28S, 18S, 5,8S và 5S.3.6.1.3. Acid nucleic với công nghệ sinh học

Là sự khai thác các cơ thể sinh vật hoặc các sản phẩm sinh học trên quy mô lớn. Công nghệ sinh học đã xuất hiện từ thời cổ xưa, khi con người biết sử dụng các quá trình lên men, làm dấm, nấu rượu, làm phomát nhưng mãi đến năm 70 của thế kỷ XX các nhà sinh học dựa trên cơ sở những hiểu biết thấu đáo về cấu trúc, chức năng của acid nucleic, hình thành kỹ thuật tái tổ hợp ADN, ứng dụng kỹ thuật gen vào công nghệ vi sinh, tế bào thực vật, động vật và các vi sinh vật chuyển gen, tạo nên một lĩnh vực khoa học được coi là rất mới mẻ và có triển vọng vô cùng to lớn trong thực tế sản xuất và đời sống được gọi là công nghệ sinh học. Bởi vậy, công nghệ sinh học hiện đại đó là những ứng dụng của sinh học phân tử trong đó chủ yếu là các ứng dụng của kỹ thuật gen. Kỹ thuật gen được ứng dụng trong mọi lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, y học, dược học,…3.6.2. Thực hành thí nghiệm 3.6.2.1.Tính hòa tan

Nucleic acid dễ hoà tan trong dung dịch kiềm, khó tan trong acid loãng, tạo thành dung dich keo trong nước, dễ bị kết tủa dưới tác dụng của chất khử nước. Dựa vào tính tan của nucleic acid để tách chiết chúng ra khỏi nguyên liệu. Tách nucleoproteid từ tế bào nấm men

Trong thành phần của tế bào nấm men rất giàu hợp chất nucleoproteid. Dựa vào tính tan của các nucleoproteid trong dung dịch kiềm loãng và kết tủa trong acid để tách chúng khỏi hỗn hợp các chất đồng thể.

Nguyên liệu và hoá chất- Nấm men rượu hoặc nấm men bánh mì - Bột thủy tinh

- Ete etylic - NaOH 0,4%

Cách tiến hànhCho vào cối sứ (hoặc cối thủy tinh) 5g nấm men, một vài giọt ete etylic và vài giọt

nước cất để làm ẩm tế bào nấm men, sau đó cho thêm một ít bột thủy tinh, 10 ml NaOH 0,4%, nghiền nhỏ tế bào nấm men. Thêm vào cối 15 ml NaOH 0,4%, tiếp tục nghiền trong 5 phút, tạo thành chất đồng thể.Chuyển chất đồng thể sang ống li tâm, dùng NaOH 0,4% tráng lại cối chày sứ, dùng dũa thủy tinh khuấy đều dung dịch. Quá trình chiết rút trong khoảng 15 phút với 50 ml NaOH 0,4%. Li tâm dung dịch chất đồng thể trong 15 phút với vận tốc 2500 vòng/phút (hoặc lọc). Gạn dịch trong trên tủa sang cốc, thêm từ từ từng giọt CH3COOH 5% cho đến khi hợp chất nucleoproteid trong dung dịch tạo thành kết tủa hoàn toàn (thường khoảng 15 ml CH3COOH 5%). Chuyển dung dịch sang ống li tâm, tiếp tục li tâm trong 15 phút với vân tốc 2.500 vòng/phút, thu được kết tủa nucleoproteid. Hoà tan tủa trong NaOH 0,4% (khoảng 3 ml) được dung dịch nucleoproteid. Tách desoxiribonucleoproteid từ mô động vật Dựa vào tính tan của desoxiribonucleoproteid trong dung dịch muối để tách chúng ra khỏi hỗn hợp chất đồng thể. Nguyên liệu và hoá chất - Gan (thận hoặc tụy tươi) -NaCl 5% - Bột thủy tinh -NaOH 0,4%

125

Cách tiến hành Cân 5g gan cắt nhỏ cho vào cối sứ, thêm vào đó 15 ml NaCl 5% và một ít bột thủy tinh, nghiền nhỏ gan trong 15 phút thành dạng chất đồng thể. Sau đó tiếp tục cho thêm 20 ml dung dịch NaCl 5%, khuấy đều, chuyển sang ống li tâm, li tâm trong 20 phút với vận tốc 2500 vòng/phút. Gạn nước trong sang ống đong, đo dung tích. Sau đó rót từ từ nước cất vào ống đong, vừa rót vưa khuấy nhẹ bằng đũa gỗ có khía. Khi lượng nước cất thêm vào gấp 6 lần dung dịch nước chiết gan đã li tâm là đủ. Tiếp tục khuấy nhẹ dung dịch được tủa desoxiribonucleoproteid dưới dạng sợi quấn quanh đũa gỗ, hoặc li tâm được tủa. Hoà tan tủa trong NaOH 0,4% (khoảng 2 ml) được dung dịch desoxiribonucleoproteid. Tách nucleic acid (ADN – ARN) Dựa vào tính hoà tan và khả năng tác dụng thủy phân của kiềm, acid đối với ADN, ARN khác nhau để tách chiết chúng ra khỏi nguyên liệu.

Nguyên liệu và hoá chất- Gan hoặc tụy, thận- Tricloacetic acid 5%, 10%- CH3COOH 10%- Cồn 96%V- Hỗn hợp cồn với cloroform theo tỉ lệ 3/1- Hỗn hợp cồn với ete theo tỉ lệ 3/1- Ete- KOH 0,5N- HClO4 5N

Cách thực hiện Cho 5g gan vào cối sứ và 5 ml tricloacetic acid 5% lạnh, nghiền nhỏ thành chất đồng thể.Thêm vào đó khoảng 10 ml tricloacetic acid 5% dùng đũa thủy tinh khuấy đều chuyển sang ống li tâm. Tráng lại cối chày sứ bằng CH3COOH 10% và cho vào ống li tâm (khoảng 10 ml). Khuấy đều, li tâm trong 10 phút với vận tốc 3000 đến 4000 vòng/phút. Gạn dịch trong sang cốc, cho vào tủa 10 ml tricloacetic acid 10% dùng đũa thủy tinh khuấy kỹ, li tâm, gạn dung dịch trong vào cốc. Lặp lại quá trình tách tủa ba lần. Toàn bộ dung dịch trong trên tủa được dồn vào cốc và bảo quản trong tủ lạnh, tủa còn lại tiếp tục tách chiết. Tách lipid khỏi tủa: dùng dung môi hữu cơ để loại bỏ lipid khỏi tủa. Cho 10 ml cồn 96%V vào tủa, dùng đũa thủy tinh khuấy kỹ, li tâm, gạn dịch trong, được tủa. Tiếp tục rửa tủa hai lần bằnh hỗn hợp cồn và ete; cuối cùng rửa bằng ete. Quá trình rửa tủa tiến hành tương tự như rửa tủa bằng cồn. Kết thúc quá trình rửa tủa, còn lại nucleic acid và protein. Sấy khô tủa trong không khí. Tách ARN khỏi tủa: dưới tác dụng của kiềm loãng, ARN bị thủy phân thành các nucleotide, ADN tồn tại dưới dạng polyme và tạo thành kết tủa khi cho thêm HClO4 hoặc tricloacetic acid. Sử dụng tính chất này để tách ARN ra khỏi tủa. Cho vào tủa 10 ml KOH 0,5N, khuấy đều, sau đó để yên trong khoảng từ 15 đến 18 giờ ở nhiệt độ tủ ấm 370C, làm lạnh dung dịch đến 00C, li tâm. Gạn dịch trong trên tủa và dồn vào cốc chứa dung dịch tách chiết bằng tricloacetic acid 5%, 10%. Toàn bộ dung dịch này để xác định ARN có trong nguyên liệu. Xác định dung dịch ARN (ml). Tách ADN ra khỏi tủa: tủa còn lại gồm ADN, protein, hoà tan tủa bằng KOH 0,5N ở nhiệt độ 370C, sau đó làm lạnh dung dịch ở 00C, li tâm được dung dịch trong trên tủa để xác định khối lượng ADN. Xác định dung tích ADN (ml).3.6.2.2. Các phản ứng màu Phản ứng Feugel

126

Desoxiribose có trong thành phần cấu tạo của ADN hoặc desoxiribonucleoproteid phản ứng với thuốc thử fucsine tạo thành hợp chất màu đặc trưng. Phản ứng này được sử dụng để phát hiện ADN.

Nguyên liệu và hoá chất- Desoxiribose 0,1%- Dung dịch desoxiribonucleoproteid (phần trên)- HCl 1N- NaOH 0,1N- Thuốc thử SchiffCách tiến hành

Lấy hai ống nghiệm, cho vào ống 1: 1 ml dung dịch desoxiribonucleoproteid hoặc ADN 0,1% và 5 giọt HCl 1N, đun lên nồi cách thủy sôi trong 45 phút. Để nguội, sau đó dùng NaOH 0,1N để điều chỉnh dung dịch thủy phân đến pH = 5. Cho vào ống 2: 1 ml desoxiribose 0,1% hoặc 1 ml dung dịch men bia đã thủy phân, thêm vào mỗi ống 2 ml thuốc thử Shiff. Quan sát, so sánh sự xuất hiện màu trong hai ống nghiệm.

Phản ứng với diphenilamino Desoxiribose có trong thành phần cấu tạo của ADN hoặc desoxiribonucleoproteid tác dung với thuốc thử diphenilamino tạo thành hợp chất màu đặc trưng. Phản ứng này là cơ sở của phương pháp định lượng ADN bằng phương pháp so màu. Nguyên liệu và hoá chất - Desoxiribose 0,1% - ADN 0,1% - Desoxiribonucleoproteid - Thuốc thử diphenilamino. Cách thực hiện Lấy ba ống nghiệm, cho vào: Ống 1: 1 ml desoxiribose 0,1% Ống 2:1 ml ADN 0,1% Ống 3: nấm men đã thủy phân. Thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử diphenilamino, đun trên nồi cách thủy 45 phút. Quan sát, so sánh màu trong ba ống nghiệm, giải thích kết quả?

Phản ứng với thuốc thử oocin Ribose có trong thành phần cấu tạo của ARN hoặc ribonucleoproteid, tác dụng với thuốc thử oocin cho màu xanh lục. Sử dụng phản ứng này để nhận biết ARN. Nguyên liệu và hoá chất: -Ribose 0,1% - Dung dịch thủy phân ribonucleoproteid hoặc men rượu - Thuốc thử oocin Cách thực hiện: Lấy hai ống nghiệm, cho vào: Ống 1:1 ml ribose 0,1% Ống 2: 1 ml dung dịch thủy phân ribonucleoproteid Thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc tử oocin, lắc đều, đun trên nồi cách thủy đang sôi trong 15 phút. Quan sát, so sánh màu trong hai ống nghiệm,giải thích. Phản ứng màu của nucleic acid với xanh methylen Trong môi trường acid, nucleic acid tác dụng với xanh methylen tạo thành kết tủa màu xanh.

127

Nguyên liệu và hoá chất - ADN 0,1% (hoặc desoxiribonucleoproteid) - ARN 0,1% (hoặc nucleoproteid) - Xanh methylen 0,1% trong cồn 96%V. Cách tiến hành Lấy hai ống nghiệm, cho vào:

Ống 1: 1 ml ADN 0,1% (hoặc desoxiribonucleoproteid) Ống 2: 1 ml ARN 0,1% (hoặc ribonucleoproteid) Thêm từ từ CH3COOH cho đến khi dung dịch trong ống nghiệm tạo thành vẩn đục. Sau đó, cho thêm 5-6 giọt xanh methylen 0,1%, quan sát kết tủa trong ống nghiệm, giải thích?3.6.2.3. Phản ứng thủy phân Dưới tác dụng của acid hoặc kiềm ở nhiệt độ cao với thời gian thích hợp, nucleic acid bị thủy phân tạo thành các base nitơ, H3PO4 và đường ribose hoặc desoxiribose. Sơ đồ phản ứng như sau:

Nucleic acid{H+}

mononucleoproteid {H+}to cao

H3PO4

mononucleozide

Nguyên liệu và hoá chất - Nấm men rượu (hoặc men bánh mì) - Tủa nucleoproteid - H2SO4 10% Cách thực hiện Cho vào bình cầu 5g nấm men (hoặc tủa nucleoproteid) và 50 ml H2SO4 10%. Lắp ống sinh hàn, đun sôi trên nồi cách thủy từ 1,5 giờ đến 2 giờ. Để nguội, lọc lấy dịch trong để tiến hành các phản ứng xác định thành phần cấu tạo của nucleic acid. Phản ứng phát hiện base nitơ Trông môi trường kiềm, các base nitơ của nucleic acid tác dụng với bạc nitrat tạo thành muối bạc. Phản ứng như sau:

N

N

NH2

N

NH

AgNO3 NH4OH

NH4NO3 H2O

N

N

NH2

N

N Ag

Nguyên liệu và hoá chất - Dung dịch thủy phân của men rượu (tủa nucleoproteid) - NH4OH đậm đặc - AgNO3 0,1% Cách thực hiện Cho vào ống nghiện 1 ml dịch thủy phân men rượu và hai giọt NH4OH đặc để trung hòa môi trường acid của dịch thủy phân. Sau đó cho 10 giọt AgNO3, để yên vài phút, quan sát sự tạo thành kết tủa, giải thích? Phản ứng phát hiện H3PO4

Trong môi trường acid mạnh, nhiêt độ cao, phosphoric acid tác dụng tương hỗ với amonimolipden acid tạo thành phức hợp amonphosphatmolipden acid. Nguyên liệu và hoá chất

128

Base nitơ

Ribose hoặc desoxiribose

- Dung dịch thủy phân của men rượu (hoặc tủa nucleoproteid) - Thuốc thử amonimolipden acid Cách thực hiện Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch thủy phân của men rượu và 1 ml thuốc thử amonimolipden acid, đun sôi vài phút, quan sát sự tạo thành kết tủa, giải thích? Phản ứng phát hiện pentose Dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc, các ribose hoặc dezoxiribose bị khử nước tạo thành fucfurol. Các fucfurol tác dụng với timol hoặc α-naphtol tạo thành các sản phẩm ngưng tụ có màu đặc trưng. Phản ứng như sau:

(HCOH)3

C

O

CHOH

Ribose

H2SO4

3H2O

CO CHO

Fucfurol

OH

α- Naphtol

OH

OCH

Nguyên liệu và hoá chất - Dung dịch thủy phân của men rượu (hoặc tủa nucleoproteid) - H2SO4 đậm dặc - Timol 1% - α-naphtol 1% (trong cồn 96%V) Cách thực hiện Lấy hai ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1 ml dung dịch thủy phân, sau đó cho từ từ theo thành ống nghiệm 1 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, để yên 3 phút.Tiếp tục cho vào ống 1: 3 giọt timol 1%; ống 2: 3 giọt α-naphtol 1%. Quan sát sự tạo thành vòng có màu, ngăn cách giữa hai lớp dung dịch thủy phân với H2SO4 đậm đặc, giải thích kết quả?

KẾT LUẬN1. KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC CỦA ĐỀ TÀI

Qua quá trình tổng hợp lý thuyết và tiến hành thực nghiệm, đề tài đã đạt được những kết quả khả quan nhất định và đạt được mục tiêu đề ra. Đề tài đã thiết kế và tiến hành thí nghiệm thành công 5 bài định tính, kết quả là có nhiều thí nghiệm cho hiện tượng rất rõ và giải thích được những vấn đề liên quan đến thí nghiệm. Ngoài ra với hóa chất và dụng cụ sẵn có của phòng thí nghiệm nhiều phản ứng định tính được tiến hành đúng yêu cầu về mặt thời gian, có thể lựa chọn để đưa vào chương trình thực tập của sinh viên.

Bằng việc tổng hợp xây dựng lý thuyết trước, sau đó mới tiến hành các thí nghiệm, tôi có thể kiện toàn lý thuyết cho từng bài, tiến hành các thí nghiệm và chọn ra những thí nghiệm tiêu biểu nhất cho đề tài. Tôi đã đề ra được cách tiến hành phản ứng, các thao tác thực nghiệm, cách pha chế hóa chất, thuốc thử và giải thích được các hiện tượng xảy ra cho từng thí nghiệm. Qua quá trình tiến hành và theo dõi thí nghiệm, tôi đã ghi nhận lại tuần tự các bước làm, quan sát các hiện tượng xảy ra, thay đổi nồng độ, thể tích của các chất và nhiệt độ phản ứng sao cho thu được hiện tượng rõ nhất. Qua đó tự đánh giá, rút ra kinh nghiệm cho từng phản ứng.

Đề tài đã thiết kế hoàn chỉnh được 5 bài thí nghiệm định tính với 44 thí nghiệm. Trong đó mỗi thí nghiệm đã được tiến hành nhiều lần để lựa chọn ra thí nghiệm có hiện

129

Sản phẩm ngưng tụ

tượng rõ nhất. Riêng bài số 6, tôi chỉ thiết kế các thí nghiệm trên lý thuyết mà chưa có điều kiện làm thực nghiệm.2. Ý NGHĨA THỰC TIỄN

Qua quá trình tiến hành thực nghiệm với các kết quả đạt được của những thí nghiệm, phù hợp với thời gian và đáp ứng được yêu cầu về hóa chất và dụng cụ sẵn có của phòng thí nghiệm. Tôi đánh giá 5 bài thí nghiệm định tính có thể áp dụng cho chương trình thực tập hóa sinh của sinh viên sư phạm hóa. Cụ thể là:

Bài 1: GlucidBài 2: Amino acid và ProteinBài 3: LipidBài 4: VitamineBài 5: EnzymeTuy nhiên, tùy theo tình hình thực tế của chương trình thực tập hóa sinh mà có thể lựa

chọn ra từ 5 bài trên những thí nghiệm phù hợp nhất. Ngoài ra, các hóa chất ở một số thí nghiệm cần phải được chuẩn bị trước như: thí nghiệm với dung dịch amylase, sắc ký định tính amino acid … 3. NHỮNG HẠN CHẾ VÀ KHÓ KHĂN CỦA ĐỀ TÀI

Nhìn chung đề tài còn có nhiều hạn chế và chưa được hoàn chỉnh. Do thời gian thực hiện có hạn, nên các thí nghiệm nghiên cứu ít và số lần thực nghiệm chưa nhiều. Đề tài dự kiến thiết kế 6 bài thí nghiệm định tính, nhưng chỉ hoàn thành được 5 bài. Còn bài số 6 do điều kiện và hóa chất của phòng thí nghiệm không đủ để thực hiện. Nên tôi chỉ thiết kế trên lý thuyết mà chưa có điều kiện để làm thực nghiệm.

Ngoài ra, việc chuẩn bị hóa chất, pha chế các thuốc thử rất công phu và chiếm một thời gian khá lớn. Đặc biệt là phần sắc ký định tính amino acid tốn rất nhiều thời gian để tìm dung môi giải ly. Phần xác định các chỉ số của chất béo phải tốn nhiều thời gian và phải thực hiện nhiều lần. Bên cạnh đó các hợp chất hóa sinh rất phức tạp, nên các phản ứng của chúng cần tốn nhiều thời gian để tìm hiểu và giải thích. Tuy nhiên, các hợp chất hóa sinh là rất phong phú và đa dạng, do đó hướng phát triển trong tương lai của đề tài này là có thể thiết kế các bài thí nghiệm có nội dung phong phú, mang tính chất định tính đại cương, kiểm tra được nhiều kiến thức liên quan đến hóa sinh, giúp sinh viên hiểu kỹ thêm phần lý thuyết đã được học.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Lê Ngọc Tú – Phạm Quốc Thăng- Lê Doãn Diện-Bùi Đức Hợi-La Văn Chứ-Nguyễn Thị Thịnh, Hóa sinh công nghiệp, NXBĐH và THCN Hà Nội, 1997.2. Cao Cự Giác, Bài tập lý thuyết và thực nghiệm hóa học-Tập 2-Hóa học hữu cơ, NXB Giáo Dục.3. PGS.TS.Nguyễn Nghiêm Luật, Thực Tập Hóa Sinh, NXB Y Học Hà Nội, 2003.4. Thái Thị Tuyết Nhung, Bài Giảng Sinh Hoá-SP Hoá, Đại Học Cần Thơ.5. Ngô Xuân Mạnh, Vũ Kim Bản, Nguyễn Đặng Hùng, Vũ Thy Thư, Giáo Trình Hóa Sinh Thực Vật-NXB Nông Nghiệp.6. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, 1999. Hóa sinh học. NXB Giáo dục, trang 62-76.7. Nguyễn Thị Hảo, 2005. Hóa học glucid. Trong: Hóa sinh y học; biên soạn bởi Đỗ Đình Hồ (chủ biên), Đông Thị Hoài An, Nguyễn Thị Hảo, Đỗ Đình Hồ, Phạm Thị Mai, Trần Thanh Lan Phương, Đỗ Thị Thanh Thủy, Lê Xuân Trường; trang 17-34. NXB Y học, Tp. Hồ Chí Minh.

130

8. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường, Thực Hành Hóa Sinh Học, NXB Giáo dục.

9. Nguyễn Trọng Biểu, Từ Văn Mặc, Thuốc Thử Hữu Cơ, NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật.10. Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Thí Nghiệm Hóa Sinh Học, NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh, 2003.11. http://www.hoahoc.org

12. http://www.hoahocvietnam.com13. http://www.diendanhoahoc.com.vn

14. http://en.wikipedia.org

131