by with molecular markers contents of oryzaoryza sativa sativa l.) › doc › 01003579 ›...

เอกสารประกอบการสอนวิชา 01554691 1

Breeding by Design with molecular markersBreeding by Design with molecular markers

Case study of rice (Case study of rice (OryzaOryza sativa sativa L.)L.)

ธาน ี ศรวีงศชยั ([email protected])

ภาควชิาพชืไรนา คณะเกษตร มหาวทิยาลัยเกษตรศาตร

Source: www.irri.org

Contents

• ความมัน่คงทางอาหารกบัการปรบัปรุงพนัธุขาว• การหาตาํแหนงยนี (gene mapping) QTL analysis Bulk segregant analysis

• การใชเครื่องหมายดเีอน็ชวยปรบัปรงพนัธ• การใชเครองหมายดเอนชวยปรบปรุงพนธ ุ(marker assised selection; MAS) พืน้ฐานของการปรบัปรุงพนัธุพชื MAS MAB MAP

•บทสรปุ

ลาน

(คน)

World population

http://en.wikipedia.org

600

800

1000

1200

Thailand

Viet Nam

China

Kg/Rai

IR8H3 H3

H3

H2

0

200

400

1961

1963

1965

1967

1969

1971

1973

1975

1977

1979

1981

1983

1985

1987

1989

1991

1993

1995

1997

1999

2001

2003

2005

2007

2009

Year

RD1 CNT1SPR1

http://faostat.fao.org

ผลกระทบจากการพฒันาเทคโนโลยีการผลติขาวผลกระทบจากการพฒันาเทคโนโลยีการผลติขาว

300275250225200

Area (million Ha)

Area saved

1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000

175150125100

7550250

Year

Actual area planted

www.irri.org

วิธีการปรับปรงุพันธุขาว

พันธุพ้ืนเมือง

V1 V2 V3

V4 V5 V6

พันธุตางประเทศV11 V12 V13

V14 V15 V16

ผสมพันธุ

X

V1 V18

กลายพันธุV1

พืชพันธุใหม 6

V7

V8

V9

V17 V18 V19

พันธวุิศวกรรมV1


F1 AaAA aaP

AA 25% Aa 50% aa 25%F2

AA 12 5% aa 12 5%

การเปลี่ยนแปลงภายหลงัการผสมตัวเอง

7

AA 25%AA 12.5%

Aa 25%AA 37.5%

aa 25%

aa 37.5%

aa 12.5%

F3

Aa 12.5%

AA 6.25%

AA 43.75% aa 43.75%

aa 6.25%

F4

การเปลี่ยนแปลงภายหลงัการผสมตัวเอง

m % Homozygosity (เชน AA + aa) เมื่อมียีน 1 คู1 F2 502 F3 75

3 F 87 53 F4 87.54 F5 93.755 F6 96.8756 F7 98.43757 F8 99.218758 F9 99.609389 F10 99.80469

m = จาํนวนครัง้ทีผ่สมตวัเอง

n = จาํนวนคูหรอืตาํแหนงของยนี

8

No. Heterozygous

loci of F1

Different gamete in

F1

Possible F2 genotype

Possible F2 combination

Kinds of F2 phenotype

Dominance Additive

1 2 3 4 2 3

2 4 9 16 4 9

ตารางความสมัพนัธระหวางจาํนวน heterozygous loci และ genotype

3 8 27 64 8 27

4 16 81 256 16 81

10 1,024 95,049 1,084,576 ‐ ‐

21 2,097,152 10,460,353,203 4,398,046,511,104 ‐ ‐

nn 22nn 33nn 44nn 22nn 2n+12n+1

9

Random markers

Specific location markers

การหาตาํแหนงยีน

Target geneQTL location

Marker A

Marker B

Linked marker

Functional marker

Marker A

Marker B

การหาตาํแหนงยีน (gene mapping)

• การพัฒนาเคร่ืองหมายดีเอ็นเอ (DNA markers) ที่สัมพันธกับลักษณะที่สนใจจะชวยใหแนวทางในการปรับปรุงพันธุพืชมีประสิทธิภาพมากยิ่งข้ึน

• การใชเคร่ืองหมายดีเอ็นเอ ชวยในการปรับปรงพันธการใชเครองหมายดเอนเอ ชวยในการปรบปรุงพนธุ (Marker assisted selection, MAS) เปนหน่ึงในวิธีการใชประโยชนจากเคร่ืองหมายดีเอ็นเอ

• MAS เปนการใช DNA markers ที่สัมพันธ (tightly-linked หรือ functional detection) กับตําแหนงของยีนที่ตองการเพื่อชวยคัดเลือกตนพืชที่มีลักษณะที่ตองการ

1. QTL analysis

1. Development of mapping population


2. Trait evaluation (P = G + E + GxE)

3. Genotyping (G)

4. Phenotype & Genotype combination (QTL analysis)

• Linkage map construction

• QTL analysis



1. QTL analysis


ชนิดของประชากรผสมระหวางพอแมท่ีมีพันธุกรรมแบบ heterozygous • F1 ผสมระหวางพอแมท่ีมีพันธุกรรมแบบ homozygous • F2• Backcross• Double haploid• Recombinant Inbred line

F2

F1

Parent 1 Parent 2

x

aaAA

(Aa)

F2(AA : Aa : aa)

1 2 1

RIL/ DH

F1

Parent 1 Parent 2

x

aaAA

(Aa)

F2(AA : Aa : aa)

1 2 1


Backcross

F1

Parent 1 Parent 2

x

BC1F1

x KDML105

%Similarity : 100%Similarity : 0

x KDML105

aaAA

(Aa) (aa)

(Aa : aa)1 : 1

GenotypeAA : Aa : aa(1 : 2 : 1)

x1 : 2 : 1

F3

GenotypeAA : aa

x1 : 2 : 1

F3x

F4

F5

F6

x

x

KDML105

BC4F1 x KDML105

BC2F1

x KDML105

BC3F1 x KDML105

(Aa : aa)1 : 1

(aa)

(aa)

(aa)

(aa)

GenotypeAa : aa

Phenotype evaluation on Mapping population

Submergence Drought

Yield components

2. Trait evaluation

Disease resistance

Insect resistance

Yield components

Cooking quality

3. Genotyping

Source: Collard et.al., 2005

1-87

48 76 47 75 25 74 24 52 23 51 1 50 TH

16

28 BF

27

2-305

BF

27 48 76 47 75 25 74 24 52 23 51 1 50 TH

16

28 BF

27

Agarose gel

3. Genotyping

311

249

Pyms267-268

TH16

B1-2

Polyacrylamide gel P1

P2

Mapping population

Mapping population

y

TH16

B1-2

P1

P2

Scoring (Convert band to computer data)3. Genotyping


4.1. Linkage map construction


4.1. Linkage map construction

Linkage Map

2. Simple interval mapping analysis

1. Single - maker analysis

4.2. QTL analysis

3. Simplified composite interval mapping analysis

M1

M2

M3

QTL1M1

M2

M3

QTL1M4

M5M6

QTL2

QTL for Submergence tolerance

4.2. QTL analysis

1.2 Bulk segregant

1. QTL analysis


analysis


1.2 Bulk segregant analysis



1.2 Bulk segregant analysis


ประโยชนของ Gene mapping

• การปรบัปรุงพนัธุ • ใชเครื่องหมายดเีอ็นเอชวยคดัเลือกตนทีม่ีพนัธกุรรมทีต่องการ (marker assisted selection; MAS)selection; MAS)

•รวมยอดยนี/ QTLs (Pyramiding genes/ QTLs)

• การตรวจหายีน• Gene expression• Gene cloning• Function of gene

การใชเครือ่งหมายดเีอน็เอชวยปรบัปรงุพันธุพชื

การใชเคร่ืองหมายดีเอ็นชวยปรับปรุงพันธุ

พื้นฐานของการปรับปรุงพันธุพืช

(Marker Assisted Selection; MAS)

MAS

MAB

MAP

• Mass selection

• Introduction

วธิกีารพืน้ฐานในการปรบัปรุงพนัธุขาวConventional Breeding Methods

Non crossing• Mutation

• Genetic engineering• Pure line selection

• Pedigree selection

• Bulk method

• Single seed decent

• Backcross method

Crossing

28

วิธีการปรับปรงุพันธุพืชผสมตัวเอง

พันธุพ้ืนเมือง

V1 V2 V3

V4 V5 V6

พันธุตางประเทศV11 V12 V13

V14 V15 V16

ผสมพันธุ

X

V1 V18

กลายพันธุV1

พืชพันธุใหม 29

V7

V8

V9

V17 V18 V19

พันธวุิศวกรรมV1

F2

P2

F1

P1 x

large populations consisting of thousands of plants

PHENOTYPIC SELECTION

DonorRecipient

CONVENTIONAL PLANT BREEDINGCONVENTIONAL PLANT BREEDING

Field trialsGlasshouse trialsSalinity screening in phytotron Bacterial blight screening Phosphorus deficiency plot



F2

P2

F1

P1 x

large populations consisting of thousands of plants

ResistantSusceptible

MARKERMARKER‐‐ASSISTED ASSISTED SELECTIONSELECTION

MARKER-ASSISTED SELECTION (MAS)

Method whereby phenotypic selection is based on DNA markers


ขอดีของ MAS

Marker-assisted selection ชวยเพิม่ประสทิธภิาพการปรบัปรงุพนัธุพชืเมื่อเปรยีบเทยีบกบัวิธปีกต ิ(Conventional breeding) ทีค่ดัเลือกจากลกัษณะการแสดงออก ดวยเหตผุลดังนี้

• เปนวิธทีี่งายเปนวธทงาย• การคดัเลือกทาํในระยะตนกลา• เปนการคดัเลือกแบบรายตน

ประหยดัเวลาและแรงงาน ในลกัษณะทีป่ระเมนิยาก หรอืใชเวลานาน เชน การคดัเลือกทีต่องทาํในเวลาทีเ่ฉพาะของป หรือเฉพาะสถานที ่หรอืวิธกีารประเมนิยุงยาก


การคดัเลือกดวย DNA markers มคีวามนาเชื่อถือมากกวาการทดสอบในแปลงทีม่อีิทธิพลจากสภาพแวดลอม ประหยดัคาใชจายมากกวาการประเมนิบางลกัษณะทีม่ีคาใชจายสูง เชน ปรมิาณน้ํามนั ลดจํานวนสายพนัธทดสอบลดลง หรือคดัทิ้งตนที่ไม

ขอดีของ MAS (ตอ)

ลดจานวนสายพนธทุดสอบลดลง หรอคดทงตนทไมตองการในระยะแรกไดทนัที การคดัเลอืกแบบไมทําลายตน คดัเลือกแบบ ‘fast-tracked’ เพือ่หาตนทีม่ ีgenotypes ทีต่องการ หรือใช ‘background’ markers ชวยเพิม่พนัธกุรรมของ recurrent parents ใน marker-assisted backcrossing

การใช MAS ในการปรบัปรงุพันธุพชื

1 Marker assisted backcrossing (MAB)

Foreground selection

1 2 3 4

Recombinant selection

1 2 3 4

Background selection1 2 3 4

Target locus

TARGET LOCUS SELECTION

FOREGROUND SELECTIONSource: www.irri.org

RECOMBINANT SELECTION BACKGROUND SELECTION

Conventional backcrossingx P2P1

DonorElite cultivarDesirable trait

e.g. disease resistance

• High yielding

• Susceptible for 1 trait

• Called recurrent parent (RP)

P1 x F1

P1 x BC1

P1 x BC2

Visually select BC1 progeny that resemble RP

Discard ~50% BC1

Repeat process until BC6

P1 x BC3

P1 x BC4

P1 x BC5

P1 x BC6

BC6F2

Recurrent parent genome recovered

Additional backcrosses may be required due to linkage drag


P1 x F1

P1 x P2

CONVENTIONAL BACKCROSSING

BC1

VISUAL SELECTION OF BC1 PLANTS THAT MOST CLOSELY RESEMBLE RECURRENT PARENT

MARKER‐ASSISTED BACKCROSSING

P1 x F1

P1 x P2

BC1USE ‘BACKGROUND’ MARKERS TO SELECT PLANTS THAT HAVE MOST RP MARKERS AND SMALLEST % OF DONOR GENOME

BC2BC2



2 Marker assisted pyramiding (MAP)การรวมยอด (pyramiding) คือการรวมหลายยนีหรือ QTL เปาหมายใหอยูในตนเดยีวกัน ซึ่งสามารถทําไดในการปรบัปรงุพนัธุปกตเิชนกนั แตจะยุงอยากและใชเวลานาน โดยเฉพาะการประเมนิทีม่กีารทําลายตนพชืในประกร F

การใช MAS ในการปรบัปรงุพันธุพชื (ตอ)

โดยเฉพาะการประเมนทมการทาลายตนพชในประกร F2• DNA markers จะมปีระสทิธภิาพเนื่องจากเปนการ

ประเมนิที่ไมทาํลายตน การคดัเลือกยีนหรอื QTL เปาหมายสามารถทําไดจากการสะกดัดเีอน็เอ โดยไมจําเปนตองประเมนิ phenotype

• การรวมยอดมกันยิมทําในลกัษณะความตานทานตอโรคเพื่อพฒันาความตานทานแบบยั่งยนื (durable disease resistance)

F1Gene A + B

P1Gene A

x P1Gene B

Genotypes

P1: AAbb P2: aaBB

F1: AaBb

• Process of combining several genes, usually from 2 different parents, together into a single genotype

x

Breeding plan

F2

MAS

Select F2 plants that have Gene A and Gene B

F2AB Ab aB ab

AB AABB AABb AaBB AaBb

Ab AABb AAbb AaBb Aabb

aB AaBB AaBb aaBB aaBb

ab AaBb Aabb aaBb aabb


F2

P2

F1

P1 x

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

R S R R S R R S R R R R S R R R R R S R

S R S R R R R S R S R R R R R S S R R R

Line number

Phenotype Race 1

Phenotype Race 2

Resistant to Race 1

Susceptible to Race 2

Susceptible to Race 1

Resistant to Race 2

P1 P2 F1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

P1 P2 F1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

R1

R2

S

S

MARKER 1

MARKER 2

Figure Marker assisted pyramiding of two disease resistance genes. Note that homozygotes can be selected from the F2 population.


Rice MAS in Thailand

sub1

ขาวหอมชลสทิธิ์(IR57514/KDML105

frg

waxy

Bph3

Pi‐IR64saltT

Xa21

xa5

ขาวธญัสรินิ(RD6*6/JHN)

Pi‐JHN

Pi‐JHN

Pi‐IR64

Xa21

ความทาทายในการนาํไปใช

• ลดคาใชจาย– คุมทุน, วิธีการที่งาย และมีนวัตกรรม

ใหมๆ• การพัฒนาวิธีการและเทคนิคการจําแนกหา

marker ที่สัมพันธกับยีนเปาหมาย– Functional

marker, eQTL, CSSL, gene cloning • การพัฒนาและปรับปรุงประสิทธิภาพของ

MAS • การบูรณาการระหวาง molecular

genetics และ plant breeding เขาดวยกัน• การจัดการขอมูลที่มีประสิทธิภาพ

by with molecular markers contents of oryzaoryza sativa sativa l.) › doc › 01003579 ›...

Documents