c1_metode de izolare
TRANSCRIPT
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
1/39
Procedee chimice, microbiologicei toxicolo ice avansatede control i analiz
. . . .
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
2/39
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
3/39
METODE MICROBIOLOGICE CLASICE VS. METODE RAPIDE
I AUTOMATIZATE.
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
4/39
IZOLAREA MICROORGANISMELOR N CULTURI
Tehnicile de izolare presupun o serie de operatii:
prelevare probe biologice din medii naturale
inoculare in medii de cultura specifice
studiul coloniilor izolate
repicare pentru obtinerea culturilor pure
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
5/39
Culturi pure de microorganismeCulturi pure de microorganisme
Cultur: populaie de microorganisme
cultivatn condi ii predefinite Culturpur culturalctuitdintr-un
singur tip e microorganism
Culturmixt culturformatdin maimu e un s ngur p e m croorgan sm
zo are a m croorgan sme ordin culturi mixte
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
6/39
Culturmixt Culturpur
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
7/39
Culturmixt
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
8/39
Cultura pura:
Biomasa de celule rezultata rin re roducerea unei sin ure celuleaflata ntr-unmediu nutritiv sterilcuvolum limitat.
O cultura ura contine celule a artinand unei sin ure s ecii
respectiv unei singure tulpini.
M t d l i
etode clasice:
I. Metode bazate pe separarea fizico chimica a celulelor
II. Metode biologice
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
9/39
I Procedee fizice de izolare
1. Metode prin raspandire
a. Metoda Koch specifica izolarii drojdiilor
Recoltarea microorganismelor din mediinaturale
Fixarea distantat a celulelor, prin
raspandire, in mediu nutritiv
Obtinerea coloniilor izolate prin
mu p carea ce u e or
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
10/39
a. Metoda Koch specifica izolarii drojdiilor
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
11/39
b. Metode scarificate
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
12/39
Tehnica striurilor
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
13/39
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
14/39
c. Metoda Drigalski
Metoda de raspandire
in placi
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
15/39
2. Metode de diluare
tehnica dilutiilor decimale
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
16/39
a Metoda Lindner
Izolarea drojdiilor
Metoda precisa Sub control microscopic
Se realizeaza dilutii cores unzatoare
Se plaseaz 9 picaturi pe o lamela sterila care se plaseaz cu picaturile in jospe o lama cu excavatie
Se identific pictura care conine o singura celula
Se absoarbe cu o hartie de filtru steril i se introduce ntr-o eprubeta cu
mediu steril; termostatare; cultura pura
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
17/39
a Metoda Naumov
Izolarea culturilor pure de mucegai
eto a spec c ;
e reco teaz o cantitate re usa e su strat io ogic; se rea izeaza i utiicorespunzatoare
Se plaseaz picaturi pe capacul interior al unei placi Petri; se adauga
mediu fluidificat si temperat; se termostateaz;
Se identific pictura de mediu care conine colonia dorit
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
18/39
II Metode biologice
a. Metoda Burri
e separa m croorgan sme e n unc e e necesaru e ox genSe inoculeazmicroorganismele n mediu cu agar(fluidificat i temperat)Mediul se transfern tub dre t si se solidificn ozi ie vertical
Medii recomandate: carne-ficat agar
Tripticaz- glucoz-extract de drojdie
Citirea rezultatelor
MO aerobe la suprafata mediului drept
MO facultativ aerobe pe toatnalimea tubului
MO microaerofile- pe ultima 1/3 din nalimea tubului
MO strict anaerobe pe 2/3 din inaltimea tubului
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
19/39
b. Folosirea mediilor selective
Favorizeaza dezvoltarea unui grup restrans
de microorganisme ce apartinSubstane cu efect antifungic: (actidiona,
aceleeasi speciinistatin), sau antibacterian ( polimixin,penicilin)
Se pot utiliza o serie de substante
chimice cu efect inhibitor fatde
celelalte microorganisme
Ex. pentru izolarea
sterptomicetelor: medii cu amidon
i licerol sursa de carbon i
argininsau azotati (sursa de azot)
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
20/39
MediMediii dede culturcultur selectivselectivee
Staphylococcus aureus
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
21/39
MediMediii dede culturcultur selectivselectiveePrezenta/Absenta E.coli si coliformilor inprobe de 100mL apa
AquaCHROM ECC
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
22/39
MediMediii dede culturcultur pentrupentru diferentiereadiferentierea tulpinilortulpinilor
ChromA ar
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
23/39
MediMediii dede culturcultur selectivselective si diferentialee si diferentiale
EMB - Eosin meth lene blue a ar
Coloranti- eozina si albastru de metil, ce inhiba dezvoltarea
bacteriilor G(+)
La tulpinile care pot fermenta lactoza se observo
modificare a culorii coloniilor
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
24/39
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
25/39
Verificarea purittii culturilor izolate
Studiul caracterelor macroscopice
Studiul caracterelor microscopice
Probleme la aplicarea tehnicii striurilor
Neomo enizarea e rubetei cu biomasa inainte de recoltare nu este
prelevata biomasa
Utilizarea ansei neracite la prelevarea biomasei sunt omorate
microorganisme e
Nesterilizarea ansei intre etapele de efectuare a striilor nu se vor forma
colonii
Efectuarea unui numar mic de striuri nu se vor forma colonii
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
26/39
Probleme de izolare manual
Contaminarea placiiprin scoaterea completa a capacului, apropierea fetei
e p aca pentru a ve ea cum au ost rea izate striuri e
coloniicontaminarea culturii
Tehnica de recoltare deficitara din partea operatorului contaminarea
culturii
Expunerea biomasei la mediul inconjurator contaminarea culturii
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
27/39
PrelevatorPrelevator dede coloniicolonii Colony PickierColony Pickier
PMPM--1s1s MicrotecMicrotec Sistem de banc compact
s em comp e au oma za eprelevare a coloniilor
Sistem automat de schimbare a acului(ANCS)
de pixeli)
Sistem automat de trasabilitate pentrucolonii (transfer in format Excel)
Transfer automat de colonii lipsit decontaminare
Imbunatateste eficienta in laborator
Reduce cheltuielile de munca pentrusarcini de rutina si stress-ul de efectuare aunei munci repetitive
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
28/39
SetariSetari inin programulprogramul dede prelevareprelevare aa
coloniilorcoloniilor
Numar de godeuri
utilizate (96, 384) Numar de oscilatii ale
acului
Conditii de prelevare
Stabilirea pozitiei de
start si a godeurilorcu pro e oar e(blank wells)
Parametrii desterilizare a acului
Adancimea depatrundere a acului
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
29/39
Sistem de schimbare automata a aculuiSistem de schimbare automata a acului
- periere
- c at re cu etano
- incalzire la 400C
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
30/39
SistemulSistemul PickoloPickolo dede prelevareprelevare
. -
http://www.youtube.com/watch?v=iK65vJyvmJc2. Robot Bacteria Colony Picking
http://www.youtube.com/watch?v=WJ-qVBjVDB8
.
http://www.youtube.com/watch?v=udx6eQKdJHk&feature=related
4. SciRobotics Pickolo: Colony-picker for Tecan robots by Robiotec Ltd.http://www.youtube.com/watch?v=oI5ws2xP6ig&feature=related
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
31/39
Se ia in considerare:
-forma coloniilor,- marimea coloniilor
- distanta dintre colonii
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
32/39
SistemulSistemul PickoloPickolo de prelevare automata ade prelevare automata a
coloniilorcoloniilor -- Analiza imaginiiAnaliza imaginii
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
33/39
Tehnici indirecte de evaluare a numarului de microorganisme
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
34/39
Numararea cu citometre
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
35/39
Metode directe de numarare a bacteriilor
Se calculeaza :
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
36/39
Diluare/numarare prin intermediul inoculatorului spiralDiluare/numarare prin intermediul inoculatorului spiral
Inoculator Spiral
(Interscience)
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
37/39
DiluareDiluare clasicaclasica vs.vs. diluarediluare automataautomata
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
38/39
-
7/21/2019 C1_Metode de Izolare
39/39
NumarareaNumararea microorganismelormicroorganismelor cucu inoculatorulinoculatorul spiralspiral
Aplicatiregula lui 20.
Numarati coloniile din sectoare situate diametral
opuspentru a minimiza erorile de numarare.
Calculati numarul de microorganisme cuformula:
VCCN :)21( +=