các kỹ thuật dna markers

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BM. CÔNG NGHỆ SINH HỌC****

CÁC KỸ THU T DNAẬ MARKER

Môn h c: sinh h c phân tọ ọ ửGVHD: TS. Tr n Th Dungầ ị

Nhóm 10: 1, Thàm Lỷ Cúa 10172006

2, Trần Thị Minh Thư 10172057

Tháng 2/2012

Kỹ thuật DNA Marker 2

Nội dung 1. DNA marker. 2. Các kỹ thuật:1. Kỹ thuật RFLP (Restriction fragment length polymorphism).2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism).3. Kỹ thuật RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA).

1.DNA MARKER Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt hai cá thể, hai dòng hoặc hai

giống khác nhau đều có thể được xem như một DNA marker. Các DNA marker có thể chia thành hai nhóm:

-Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP, minisatellite. -Marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR, SSCP, RAPD.

Dựa trên kiểu hình có thể phân loại DNA marker thành 2 loại: -Marker đồng trội: là kiểu chỉ thị có biểu hiện khác biệt giữa các cặp allene. Là những marker có thể phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử, đó là các marker allozyme, microsatellite, PCR nhân RFLP. Trong trường hợp này tần số alen có thể được tính trực tiếp từ dữ liệu kiểu gen. -Marker trội: là kiểu chỉ thị có biểu hiện đồng nhất hoàn toàn giữa 1 cặp allene. Là những marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử. vd: RAPD marker

Marker Tên đầy đủ

RFLP Restriction fragment length polymorphismALP Amplicon length polymorphism AFLP Amplified freagment lenth polymorphismRAPD Random Amplification Polymorphic DNA

DAF DNA amplification fingerprintingSSR Single sequence repeat (microsatellite)AP-PCR Arbitrary primer-PCR SSCP Single strand conformation polymorphism

MRDHV-DNA Moderately repeated, dispersed and highly variable DNA (minisatellite)

2. MỘT SỐ KỸ THUẬT DNA MARKER2.1 Restriction fragment length polymorphism – đa hình

chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP)

Định nghĩa: Kỹ thuật phân tích RFLP (đọc là / ri-flip/- viết tắt của Restriction Fragment Length

Polymorphism)


RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác.

Nguyên tắc

Dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen.

DNA bộ gen sẽ được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt.

Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.


T-RFLP method


Ưu và nhược điểm

Ưu điểm : Là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp. Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều đủ

đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Hạn chế:

Do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu).

DNA yêu cầu có chất lượng cao.

Ứng dụng phân biệt giống, phân biệt cá thể phát hiện gen đã chuyển trong quá trình nghiên cứu chuyển gen

cây trồng lập bản đồ di truyền

1.Xác định thông tin di truyền:

Schematic for RFLP by cleavage site loss.

2.Phân tích cấu trúc di truyền DNA ứng dụng trong Y pháp nhận dạng :Từ những năm 30s dấu vân tay được đưa vào ứng dụng trong Y Pháp (Forensics) và trở

thành một công cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm của cảnh sát hình sự và thám tử để nhận dạng. Tuy nhiên dấu vân tay bộc lộ nhiều khiếm khuyết một khi áp dụng trong thực tế. Chẳng hạn, dấu vân tay thông thường chỉ có thể lấy mẫu được từ các đầu ngón tay mà thôi. Đã thế ngày nay nó không còn đặc hiệu cho từng cá thể nữa từ khi phẫu thuật chỉnh hình phát triển mạnh, người ta có thể chủ định thay đổi dấu vân tay qua phẫu thuật. Chỉ trong vòng trên dưới 50 năm từ khi cấu trúc chuỗi di truyền DNA được Watson và Crick công bố [1], ngành sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi. Một trong những ứng dụng quan trọng của sinh học phân tử là sử dụng đặc tính của cấu trúc chuỗi di truyền DNA của từng cá thể vào trong Y pháp để nhận dạng đối tượng coi như là một cuộc cách mạng trong Y học hình sự của nhân loại.

Tương tự như dấu vân tay, mỗi một con người đều có một đặc trưng riêng về cấu trúc di truyền của mình, được xác định bằng chuỗi di truyền DNA.

Cấu trúc của DNA [1], và"điểm chỉ" DNA:Đặc tính của tất cả các sinh vật, kể cả con người, đều được cấu tạo từ đơn vị căn bản nhất là tế bào, từ nguyên thuỷ là hợp tử được thụ tinh bởi trứng và tinh trùng. Về phương diện sinh học phân tử, mỗi tế bào của cơ thể (trừ hồng cầu) đều có nhân, trong nhân chứa các chất liệu di truyền, nhiễm sắc

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:RFLP_genotyping.gif


thể (chromosome) quyết định cấu trúc đặc tính cho mỗi cá thể. Con người có 23 bộ nhiễm sắc thể (22 đôi thường và một đôi xác định giới tính). Các nhiễm sắc thể này được tạo bởi các chuỗi chất liệu chứa đựng thông tin di truyền DNA (viết tắt của từ DeoxyriboNucleic Acid) thừa kế từ cha và mẹ. Mỗi cá thể sống nhận chất liệu DNA 50% từ cha và 50% từ mẹ.

Có thể hình tượng cấu trúc phân tử của một DNA như là một cái phéc-mơ-tuya (zip), mỗi răng kéo là một trong bốn khối chất liệu căn bản, viết tắt bằng các ký tự A (adenine), C (cytosine), G (guanine), và T (thymine), mà mỗi một ký tự đó gọi là một nucleotide, chúng cũng đứng song đôi như các răng kéo của phéc-mơ-tuya theo cặp cố định A-T hoặc G-C. Thông tin chứa đựng trong DNA được xác định cơ bản bằng chuỗi tiếp nối các ký tự này dọc theo cái "phéc-mơ-tuya" di truyền đó. Các 'ký tự' này đứng theo một thứ tự và một số lượng nhất định để tạo thành đơn vị lớn hơn gọi là gien. Nhiều gien nối lại với nhau tạo thành nhiễm sắc thể. Theo ước tính mới nhất, con người có khoảng 35000 bộ gien. Trong đó chỉ có 1% số lượng gien đóng vai trò chức năng (thí dụ như gien quy định màu da, tóc v.v..), 99% còn lại là những gien không có chức năng, các gien này rất đa dạng, khác nhau ở từng cá thể. Cho nên chẳng thể có người nào giống người nào về cấu trúc di truyền DNA cả, trừ đó là người sinh đôi cùng trứng. 'Hồ sơ' DNA (tạm dịch từ DNA profiling) là một phần nhỏ trích từ cấu trúc toàn bộ của chuỗi DNA (của một cá thể), tức là các bộ gien và thuộc phần gien không có chức năng, đủ để phản ánh đặc thù riêng nhất của mỗi cá thể không lẫn lộn với người khác. Và cũng từ đó mà thuật ngữ "Điểm chỉ" DNA (tạm dịch từ DNA fingerprint)- cũng chính là 'hồ sơ DNA', do một nhà Di truyền học người Anh, Alec Jeffreys đề xuất, để nói lên một đặc trưng duy nhất cho mỗi cá thể giống như là dấu vân tay (hay điểm chỉ). 'Điểm chỉ' DNA là hoàn toàn giống nhau ở tất cả các tế bào, tổ chức mô, tạng phủ trong một cơ thể; và điểm chỉ DNA không có thể thay đổi được bằng bất cứ hình thức nào với tri thức của nhân loại hiện nay.

Về nguyên lý nhận dạng cá thể sống bằng DNA rất đơn giản, đó là nguyên lý so sánh và ghép cặp. Đối với nhận dạng vết tích thì người ta đem mẫu DNA của vết tích so sánh với mẫu DNA dự trữ hoặc với các mẫu nghi ngờ. Đối với việc nhận dạng quan hệ huyết thống (cha mẹ chẳng hạn), người ta đem so sánh DNA của cha, mẹ với cá thể đó để xem có quan hệ di truyền hay không. Nói nôm na là như biển số đăng ký xe. Mỗi một chiếc xe có một biển số riêng, người ta có thể dựa vào hồ sơ đăng ký có thể xác định chính xác chủ nhân hiện thời của chiếc xe đó, tương tự mỗi chủ nhân có một thẻ đăng ký xe, khi mất xe họ có thể dùng số đăng ký đó đi truy tìm chiếc xe ở đâu. Kỹ thuật nhận dạng bằng DNA cũng y như vậy nhưng điều đặc biệt là DNA không thể thay đổi được, và nó 'ẩn' bên trong cơ thể, phải dùng các phương pháp kỹ thuật nhất định để có thể đọc được nó mà thôi.

Tuy nhiên như đã trình bày vì cấu trúc di truyền DNA đầy đủ của mỗi một cá thể rất phức tạp, người ta không thể và không cần thiết phải sử dụng toàn bộ 35 nghìn bộ gien để đi phân tích, so sánh. Do đó chỉ sử dụng những bộ gien (khoảng chừng 12 gien hoặc ít hơn) hoặc các marker (đoạn đặc trưng) của các gien (không có chức năng) sao cho đủ để đặc trưng cho mỗi cá thể để phân tích mà thôi.Ứng dụng thực tế của công nghệ điểm chỉ DNA:

Điểm chỉ DNA được ứng dụng trong cuộc sống hàng ngày với mục đích: (a) Trong Y pháp, hình sự : để xác định quan hệ phụ hoặc mẫu hệ; để nhận dạng tội phạm cũng như loại trừ nghi can thông qua dấu vết của cơ thể để lại hiện trường; nhận dạng cá nhân, nạn nhân vô thừa nhận. (b) Trong Y học điều trị: để chẩn đoán các bệnh về di truyền; phát triển các phương pháp để chữa các rối loạn về di truyền. (c) Trong các ngành khoa học khác: Như trong khảo cổ học; hoặc trong nông-lâm-ngư nghiệp dùng để vẽ bản đồ gien (mapping), tạp giao, lai giống, chuyển gien, để nhận dạng dấu vết các loài thú quý hiếm. Một trong ứng dụng mới nhất của công nghệ phân tích điểm chỉ DNA trong nông nghiệp là để bảo vệ tác quyền thương mại các sản phẩm, hay giống lai tạo mới.

Tuỳ theo các mục đích khác nhau mà người ta tiến hành cách thức thu thập mẫu để có được chuỗi DNA cơ bản đầu tiên để phân tích khác nhau. Trong ứng dụng nhận dạng con người các mẫu


thu thập cũng tuỳ theo yêu cầu mà có thể lấy mẫu máu, tóc, lông, da v..v đặc biệt trong nhận dạng tội phạm hình sự, mẫu thu thập rất đa dạng tuỳ theo tính chất sự kiện các dấu vết được để lại hiện trường.

Các kỹ thuật phân tích điểm chỉ DNA hiện hành [2]:Có nhiều kỹ thuật phân tích nhưng hai kỹ thuật thông dụng nhất hiện nay là:

Kỹ thuật phân tích RFLP (đọc là / ri-flip/- viết tắt của Restriction Fragment Length Polymorphism) (tạm dịch là các đoạn gien có độ dài giới hạn đa hình thái). Xuất phát từ thực tế là các đoạn DNA chức năng và các đoạn DNA không chức năng có thể tồn tại dưới nhiều hình thái khác nhau. Bằng cách sử dụng các enzyme đặc hiệu, chẳng hạn Restriction enzyme, có thể cắt ra các đoạn gien RFLP. Người ta đã có thể nhận dạng được đến vài nghìn loại RFLP, rất đặc hiệu cho cơ thể.

Kỹ thuật phân tích PCR/STR (Polymerase chain reaction/Short Tandem Repeat)Tức là kỹ thuật dùng phản ứng chuỗi enzyme đa phân để 'khuếch đại' các đoạn gien ngắn có độ lặp ngắn theo thứ tự (Short Tandem Repeat, STR). Ở đây polymesase tức là một loại enzyme có thể cho phản ứng tạo ra nhiều bản copy của một đoạn DNA nào đó; phản ứng chuỗi tức là một phản ứng diễn ra liên tục. Như vậy bằng kỹ thuật PCR có thể trong một thời gian ngắn tạo ra hàng triệu triệu đến hàng tỷ bản copy của một STR. Kỹ thuật này còn được gọi là kỹ thuật "khuếch đại DNA" hay "Photocopy phân tử" trong một lối nói rộng rãi hơn.

Đây là một kỹ thuật hiện đại nhất hiện nay được dùng trong Y pháp DNA. Về mặt cơ bản kỹ thuật này cũng tiến hành tương tự như kỹ thuật RFLPs. Lợi điểm của kỹ thuật này so với RFLP là:- Mẫu thu thập không nhất thiết phải đạt tiêu chuẩn cao, những mẫu lấy từ các mô bị huỷ hoại hoặc cháy bỏng nặng, xác thối rữa do chôn lâu đều có thể dùng được, hoặc chỉ lấy các 'vi vết' như tàn thuốc lá, vết dính nước bọt, những mẫu bệnh phẩm bị trộn lẫn như máu của nạn nhân lẫn với máu hay dịch của phạm nhân.

Các đặc điểm khác nhau về kỹ thuật cơ bản giữa PCR/STR vơi RFLP là: (a) Trong nhận dạng quan hệ huyết thống, nếu phân tích một gien bằng kỹ thuật RFLP chỉ có thể cho ra tối đa hai dị hợp tử (allele) và ba kiểu gien (genotype), trong khi đó dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại số lượng gien này lên, thì có thể cho ra đến 20 dị hợp tử và đến (20x21)/2 kiểu gien, và vì thế kỹ thuật này cho phép đánh giá chính xác hơn, (b) kỹ thuật PCR/STR gắn huỳnh quang rất tốt, nên rất dễ phát hiện tự động, thuận lợi cho phân tích pháp y, bảo quản và dễ phục hồi số liệu.

Sau khi có các đoạn gien cần thiết được cắt đoạn, xếp theo kích thước, phân loại, thông qua hai kỹ thuật trên, các đoạn DNA này được chuyển dạng, nhuộm màu hoặc gắn huỳnh quang và tạo thành các thanh (như các thanh mã (bar codes) trong các gói hàng bán trong siêu thị), và dùng để so sánh đối chiếu.

2.2 Random Amplification Polymorphic DNA – đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên (RAPD)

Khái niệm: RAPD (đọc là "rapid") là chữ viết tắt của Random Amplification of Polymorphic DNA nghĩa

là đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên do William (1990), Welsh và cộng sự (1991) phát minh.

Là phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm đánh giá tính đa hình của các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên.

Nguyên tắc


Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng như nguyên tắc phản ứng PCR thông thường. Tuy nhiên, vì sử dụng mồi ngẫu nhiên nên nhiệt độ bắt cặp của mồi thấp để tạo điều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt.

Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng là 30oC-36

oC.

RAPD chỉ sử dụng các mồi oligonucleotide được tổng hợp ngẫu nhiên từ 9-12 base nên dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA bộ gen . Các đoạn mồi nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách có thể khuếch đại được (dưới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn DNA có kích thước khác nhau sau khi khuếch đại. Tính đa dạng thu được nhờ RAPD là đáng tin cậy, vì khi có sự thay đổi một base nitơ nào đó thì nó sẽ ngăn cản việc tiếp hợp giữa mồi và DNA mạch khuôn. Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng như sự xen vào của một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thước đoạn DNA được khuếch đại. Tuỳ vào từng nhóm loài thực vật hay vi sinh vật mà các đoạn mồi ngẫu nhiên được thiết kế đặc dụng. Sản phẩm của PCR gồm nhiều đoạn DNA có kích thước từ 2-100 bp.Kết quả sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện được sự khác nhau trong phổ các đoạn DNA được nhân bản.Sự khác nhau này được gọi là tính đa hình.Tính đa hình của các đoạn DNA được phát hiện khi điện di sản phẩm PCR trên gel agarose hay polyacrilamid, sau đó nhuộm ethidium và soi dưới đèn tử ngoại.Tính đa hình của các mẫu RAPD-PCR là do sự thay đổi một hoặc cả hai vùng gắn primer (ví dụ đột biến điểm) hay là do những thay đổi (thêm đoạn, mất đoạn, đảo đoạn) trong đoạn DNA được nhân lên, gây ra sự thay đổi về kích thước hay cản trở quá trình nhân lên của DNA này. Tính đa hình sẽ thể hiện thông qua sự có hay vắng mặt của vạch điện di tương ứng.Tính đa hình được nhận ra do: khi phân tích đa hình di truyền bằng kỹ thuật RAPD, nếu 2 cá thể có genome hoàn toàn giống nhau thì khi làm phản ứng PCR-RAPD với bất kỳ mồi nào cũng cho các băng giống nhau.Đoạn mồi ngẫu nhiên có thể bám vào bất cứ vị trí nào có trình tự nucleotide bổ sung trên phân tử DNA genome. Với đặc điểm là ngắn nên xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử DNA khuôn là khá lớn.Theo tính toán, một mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotide thì xác suất bắt cặp của nó là 1x410 = 1.048.576. Ở lúa, bộ DNA nhân đơn bội có khoảng 550.000kb =550.000.000 bp.Như vậy, với một mồi ngẫu nhiên có thể có 524 vị trí bắt cặp với mồi nghĩa là có thể có 262 đoạn DNA được nhân bội.Do kỹ thuật RAPD chỉ sử dụng một loại mồi đồng nhất cho cả 2 đầu đoạn DNA cần nhân bản, ngoài ra hai đoạn mồi này phải kết cặp trên 2 sợi đơn khác nhau của chuỗi DNA và phải “đi” theo chiều hướng vào nhau nên xác suất trên sẽ phải nhỏ đi nhiều. Xác suất này sẽ còn nhỏ hơn nữa do trong điều kiện thông thường kỹ thuật PCR chỉ tổng hợp được một đoạn DNA không dài quá 5000 nucleotide dẫn đến việc phản ứng PCR chỉ hiệu quả khi hai đoạn mồi kết cặp với DNA genome ở vị trí không xa quá 5000 bp. Trong thực tế, số lượng này nhỏ hơn nhiều vì còn phụ thuộc vào độ dài của đoạn được nhân bội và sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi trên DNA genome của lúa.

Quy trình thực hiện Kỹ thuật RAPD được thực hiện theo các bước cơ bản sau: - Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR.- Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.


- Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-PC, GELCOMPAR, …). Các số liệu cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.

Ưu và nhược điểmƯu điểm

Đơn giản, dễ thực hiện RAPD là phương pháp phân tích nhanh, rẻ tiền hơn RFLP và chỉ sử dụng một lượng

mẫu DNA rất nhỏ (25ng). Phương pháp này không đòi hỏi việc phân lập và đọc trình tự, cho phép phát hiện nhiều locus cùng một lúc.

Không cần biết thông tin đoạn gene cần khuếch đại RAPD marker tỏ ra rất hiệu quả trong việc thiết lập bản đồ gen của các cây họ tùng

bách trong khi các RFLP marker không thể dùng cho mục đích này bởi vì hàm lượng DNA trong các mô của các giao tử lớn rất thấp và sự đòi hỏi thời gian dài để thu được quần thể F2.

Thích hợp với phòng thí nghiệm có đầu tư vừa phải, nhân sự ít kinh nghiệm

Nhược điểm:• Độ tin cậy, độ lặp lại không cao• Không phân biệt được đồng hợp tử và dị hợp tử• Không chắc chắn được cung một band sản phẩm là 1 hay nhiều sản phẩm• Các đoạn mồi ngắn dùng để xác định các RAPD marker cũng nhân lên một vài trình tự từ các

vùng không liên kết. Vì vậy các marker như vậy không thể sử dụng để đánh giá các dòng từ các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men hay một thư viện mẫu thậm chí khi có sự liên kết gần gũi của chúng với gen đã biết.


• Hiện tượng phát sinh tính đa hình giả đôi khi cũng thấy khi phân tích RAPD do không chắc chắn các đạon cùng kích thước từ hai mẫu DNA khác nhau có thực sự được tạo ra từ cùng một vị trí trên DNA của genome hay không.

• Sự di truyền tính trội và số lượng allele thấp cũng là những hạn chế của RAPD marker. => Mặc dầu có các hạn chế, nhiều nghiên cứu đã khẳng định RAPD là phương pháp hữu hiệu để xác định kiểu gen, phân tích quần thể và phả hệ, nghiên cứư sự phát sinh loài và lập bản đồ di truyền ở nhiều loài khác nhau như lúa, đậu tương, lúa mạch đen, đại mạch, đậu hà lan, hoa hồng, v.v.

Ứng dụng

Sử dụng phương pháp này để nhận dạng ở mức độ phân tử, khảo sát đa dạng sinh học, phân lập gen đột biến, xác định các tính trạng liên kết hay di truyền, chẩn đoán bệnh.

Phân biệt giống, phân biệt cá thể Lập bản đồ di truyền Ứng dụng cụ thể: nghiên cứu đa hình một số giống dâu tằm.

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH MỘT SỐ GIỐNG TẰM DÂU BẰNG KỸ THUẬT RAPDNguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng, Nông Văn HảiViện Công nghệ Sinh họcI. MỞ ĐẦU

Ngày nay, việc sử dụng các chỉ thị phân tử DNA về đa hình các đoạn DNA nhân ngẫu nhiên-RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), sự lặp lại các chuỗi đơn giản-SSR (Simple Sequence Repeats) hay còn gọi là tiểu vệ tinh (Microsatellite) để phân loại, nghiên cứu đa dạng sinh học của động vật, thực vật và vi sinh vật ngày càng phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam [4, 5, 7, 8]. So sánh với phương pháp truyền thống, phân loại và nghiên cứu đa hình bằng chỉ thị phân tử cho kết quả có độ tin cậy cao [2].Kỹ thuật RAPD do William và cs, 1990 [8] phát triển trên cơ sở PCR sử dụng một số đoạn mồi ngẫu nhiên. Kỹ thuật này đã được ứng dụng kết hợp cùng với một số kỹ thuật khác để phân loại, nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các cá thể tằm dâu [1, 2, 5, 10,11]. Ở Việt Nam chưa có công trình nào đề cập tới vấn đề này, mặc dù nghề nuôi tằm là một trong những nghề truyền thống của đất nước, hiện đang được đẩy mạnh phát triển, việc phân loại đánh giá đa hình vẫn dựa vào các đặc điểm sinh học và hình thái, cho nên còn có những hạn chế nhất định.Trong bài báo này chúng tôi xin trình bày một số kết quả về sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đa hình một số giống tằm dâu nuôi tại Việt Nam.

II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Nguyên liệu

Mẫu nghiên cứu gồm tám giống tằm đang được dùng tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam: TTB, TML, VC, ĐS 1, ĐS 2, BM, THT, VYD, trong đó có bốn giống được sử dụng nhiều trong vài năm gần đây, đó là hai giống địa phương thuộc tập đoàn gốc đa hệ: vàng chấm [VC] và Đồ Sơn [ĐS] hai giống tằm lưỡng hệ trắng Thái Bình [TTB] và trắng Mai Lĩnh [TML]. Tất cả các giống tằm trên do Trung Tâm Nghiên cứu Dâu Tằm Tơ Trung Ương, Xí nghiệp Giống Tằm Cấp I Mai Lĩnh và Xí nghiệp Giống tằm Thái Bình cung cấp.

Hoá chất : EDTA, Tris-HCl, SDS, Proteaza K, RNaza, chloroform, phenol, NaCl, agaroza của các hãng Sigma, Merck, Amersham Phamacia Biotech, Fermentas...Các loại máy móc chuyên dụng thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen đặt tại Viện Công nghệ Sinh học.


2. Phương pháp nghiên cứu

Tách chiết DNA theo Wiliam và cộng sự, tham khảo thêm tài liệu của một số tác giả khác [ 8, 9, 10] và cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.Xác định nồng độ DNA bằng phương pháp đo quang phổ, kiểm tra DNA trên gel agaroza 0,8% và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại, chụp ảnh ở máy Geldoc hoặc Polaroid.Nhân gen bằng kỹ thuật PCR với các đoạn mồi do hãng Genset Singapore Biotech tổng hợp. Tổng thể tích dùng cho một mẫu là 25 ml. Chu trình nhiệt theo tài liệu của Zhou Zheyang và cộng sự [6]. Sản phẩm PCR kiểm tra trên gel agaroza 0,8% và 1,3%.------------------------------------------------------------------------Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của nhiệm vụ thường xuyên: đề tài cấp Viện Công nghệ Sinh họcPhân tích kết quả bằng chương trình phần mềm NTSYS phiên bản 2.0. Hệ số đồng dạng di truyền được tính theo công thức của Nei và Li năm 1979 [3].

III. KẾT QUẢ

1. Tách chiết và làm sạch DNA từ mẫu tằm

Mẫu nghiền mịn và hoà tan trong dung dịch đệm, thành tế bào và màng nhân được phá vỡ, giải phóng DNA. Tiếp theo bổ sung proteinaza K để phân huỷ hoàn toàn các protein liên kết . Sau đó, dùng hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol loại bỏ các tạp chất và ly tâm thu DNA. Loại ARN bằng RNaza ở 37oC. Sản phẩm DNA được chạy điện di kiểm tra, đánh giá trên gel agaroza 0,8% và đo OD trên máy đo quang phổ, bảng 1 và hình 1 là kết quả thu được. Kết quả cho thấy, sản phẩm nhận được cho vạch gọn và có trọng lượng phân tử lớn hơn 21,6 kb, tỉ lệ OD260 nm/OD280 nm dao động từ 1,781 đến 2,025 cho biết DNA thu được có đủ độ sạch để làm nguyên liệu cho PCR hoặc các nghiên cứu tiếp theo. DNA được bảo quản lạnh trong dung dịch TE.

Ảnh 1. Điện di DNA 1-5 : DNA của mẫu.

M : DNA l/EcoRI+HindIIIBảng 1. Tỷ số OD260 nm/OD280 nm và nồng độ của DNA

2. PCR với DNA cuả tằm dâu

Chúng tôi đã tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng nhân gen đối với các mồi nghiên cứu [6 ], sàng lọc từ 20 đoạn


mồi ngẫu nhiên để chọn ra 5 đoạn phù hợp cho tằm. Tiếp theo thực hiện PCR với các giống tằm, kết quả nhận được trình bày ở bảng 2.

Bảng 2: Kết quả RAPD của các giống tằm nghiên cứu[ Cột chỉ thị RAPD: chữ cái và số là ký hiệu của đoạn mồi, tiếp theo là kích thước của băng. Số 1:phân đoạn DNA được nhân. Số 0: phân đoạn DNA không được nhân. Giống tằm 1: TTB, 2: TML, 3: VC, 4: ĐS1, 5:ĐS2, 6: BM, 7: THT, 8: VYD]

Các băng nhân bản được sử dụng như là các chỉ thị RAPD bao gồm hai loại đơn hình và đa hình. Băng đơn hình có mặt trong tất cả các giống nghiên cứu, còn băng đa hình xuất hiện ở giống này nhưng lại vắng mặt ở giống khác. Trong tổng số 67 băng nhận được có 26 băng đơn hình, chiếm 38,81% và 41 băng đa hình, chiếm 66,19%, kích cỡ của các băng từ 100bp đến 3500bp. Trong 8 giống tằm nghiên cứu có 2 giống lưỡng hệ tương đối xa nhau về quan hệ di truyền, còn 6 giống đa hệ địa phương có họ hàng khá gần gũi với nhau, do đó


tỷ lệ băng đơn hình ở mức trung bình thấp, tỷ lệ băng đa hình đạt mức trung bình cao hơn. Các băng đa hình là cơ sở phân biệt giữa các giống với nhau, có băng đa hình chỉ xuất hiện ở một giống mà không xuất hiện ở các giống khác như băng 0P019-1200bp và 0P019-1000bp chỉ thấy ở giống TML, băng 0P019-800bp ở giống TTB và trong nhóm đa hệ chỉ xuất hiện ở giống BM. Với mồi 0P016, băng 300bp quan sát thấy ở giống TTB, còn băng 400bp có ở giống TML và duy nhất ở VC trong

Hình 2: Sản phẩm PCR mồi OP 13 của các giống tằm nghiên cứu

Giếng M: DNA l/EcoRI+HindIIICác giếng khác: mẫu của các giống tương

ứng. 1-TTB 5-TML 6-VC 8-ĐS 1

9-ĐS 2 10-BM 11- THT 13- VYD

Từ các số liệu thu được, chúng tôi phân tích mối tuơng quan di truyền giữa các giống tằm nghiên cứu bằng chương trình phần mềm NTSYS phiên bản 2.0 và trình bày ở bảng 3.Bảng 3 cho thấy, giống TTB có hệ số đồng dạng di truyền dao động trong khoảng 0,547 đến 0,703, thấp nhất trong các giống nghiên cứu, còn ở giống TML chỉ số này cao hơn, biến đổi từ 0,766 đến 0,906. Các giống trong nhóm đa hệ có hệ số đồng dạng di truyền thay đổi từ 0,766 đến 0,984. Giống ĐS1 và ĐS2 có chỉ số cao nhất 0,984, có khả năng đây chỉ là một giống nhưng nuôi ở hai địa phương khác nhau.Bảng 3. Hệ số đồng dạng di truyền giữa các giống tằm nghiên cứu

Từ bảng hệ số đồng dạng di truyền, chúng tôi xây dựng cây phân loại của các giống tằm và biểu diễn bằng hình 3. Dựa trên sơ đồ hình cây biểu thị đa hình DNA giữa 8 giống tằm nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy các giống tằm khảo sát được chia thành hai nhóm lớn, cụm lại ở mức độ 0,54, nhóm thứ nhất chỉ có 1 giống TTB, còn nhóm thứ hai là các giống còn lại, cụm ở mức độ 0,79 và chia thành hai phân nhóm bậc I. Phân nhóm bậc I thứ nhất gồm hai giống TML và VC, cụm lại ở mức 0,90. Phân nhóm bậc I thứ hai là 5 giống thuộc đa hệ và lại chia thành phân nhóm bậc hai.... Riêng ĐS1 và ĐS2 ở phân nhóm bậc cao nhất.


Hình 1. Cây phát sinh chủng loại của các giống tằm

IV. KẾT LUẬN

1. Đã phân tích tính đa dạng di truyền của 8 giống tằm dâu nuôi ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD với 5 đoạn mồi, kết quả nhận được 67 băng DNA nhân bản trong đó có 26 (38,8%) băng đơn hình và 41 (61,2%) băng đa hình. Đoạn mồi 0P016 cho số băng đa hình phong phú nhất, mồi 101 có tỷ lệ băng đa hình thấp nhất.

2. Kết quả phân tích NTSYS-SIMUAL cho thấy các giống tằm nghiên cứu có mối tương đồng di truyền trong khoảng 0,547 đến 0,984.

2.3 Amplified Fragment Length Polimorphism – Đa hình chiều dài các đoạn nhân bản chọn lọc (AFLP)

Khái niệm AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism) là sự đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. 1975 Vos và cộng sự đã phát minh ra kỹ thuật này. 1993 Vos và Zabeau cho ra protocol đầu tiên cho kỹ thuật AFLP nhấn mạnh sự quan trọng của việc làm thuần khiết hai enzyme sử dụng (EcoRI và MseI), sau đó là chuẩn bị adapter và thiết kế primer một cách thận trọng. Ngày nay nó được cải tiến khá nhiều với những công dụng như sau:

Công cụ có hiệu quả phát hiện tính chất đa hình. Xây dựng bản đồ di truyền có mật độ cao của genome. Xây dựng bản đồ DNA marker có hiệu quả nhất so với những marker khác (Vos và cộng tác viên. 1995). Khám phá ra những clone genome, vd YAC. Fingerprinting các đoạn DNA đã được cloned như cosmid, P1, BAC, YAC (Vos và cộng tác viên. 1995)

AFLP marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR. AFLP là một marker trội. -Marker trội: marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử.

Kỹ thuật AFLPNguyên tắc của kỹ thuật AFLP giống như RFLP, điểm khác biệt cơ bản là AFLP không cần tiến hành lai phân tử (lai Southern blot), do vậy thực hành nhanh.

1. NÔI DUNG CƠ BẢN CỦA PHƯƠNG PHÁP 1.1. Cắt DNA bằng RE có bổ sung các adaptor đặc hiệu tạo nên các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trưng cho các mồi đã chọn trước.1.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR ngắt quãng với hai loại mồi khác nhau.


2. QUI TRÌNH THỰC HIỆN AFLP : 4 bước

1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA.1.2. Cắt các mẫu DNA nghiên cứu bằng cặp RE chọn lọc có bổ sung các adaptor (trình tự nối mạch đôi- Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. ) phù hợp.1.3. Tiến hành PCR ngắt quãng với hai loại mồi đặc hiệu primer 1+1 nucleotid và primer 2+ 2 nucleotid.1.4. Phân tích kết quả bằng các phần mềm thông dụng, lập dendrogram để xác định sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học các mẫu nghiên cứu.


Ứng dụng Nghiên cứu đa dạng và quan hệ di truyền

nghiên cứu quần thể, phả hệ, phát sinh chủng loại

Lập bản đồ, xác định QTL

Ưu và nhược điểmƯu điểm.

Phát hiện thay đổi trên toàn bộ gene, cho đa hình cao AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen

(kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài (các mồi thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài).

Nhược điểm AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp. C và G trong primer càng nhiều, thì các DNA fragment được khuếch đại càng ít. Khích thước genome càng nhỏ, số fragment được khuếch đại càng ít Giá thành cao hơn RAPD


Tài liệu tham khảo

PGS.TS.Khuất Hữu Thanh-Đại học Bách Khoa Hà Nội – Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen – Trang 151 – NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội.

Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang – Di truyền phân tử.Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng – Trang 93 – NXB Nông nghiệp.

các kỹ thuật dna markers

Documents