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2 Biologia da Propagação Clonal
No processo evolutivo das técnicas de propagação de plantas, o
desenvolvimento da ciência, aliado ao processo produtivo, mostrou-se sempre
necessário para alcançar os objetivos almejados na multiplicação e preservação de
material genético selecionado. O conhecimento de algumas áreas da propagação de
plantas é considerado imprescindível ao bom desempenho no processo de
multiplicação destas. Hartmann et al. (2002), por exemplo, citam a arte da
propagação, a ciência da propagação e o conhecimento das plantas.
A arte da propagação: o sucesso da propagação de plantas requer domínio da técnica para manipulação adequada do seu crescimento. Características como habilidade, prática, dedicação e experiência pessoal na condução do processo de propagação das plantas são indispensáveis. A existência de informações científicas de determinadas técnicas e uma ampla aplicação das mesmas, para as mais variadas espécies e usos, facilitam a adoção de uma em detrimento da outra de forma mais racional e viável na propagação daquela planta.
A ciência da propagação: a propagação de plantas requer perspicácia e conhecimento quanto a morfogênese, desenvolvimento e crescimento, bem como, conhecimento básico de física, química, nutrição e aspectos de ecologia do ambiente de propagação. Estes conhecimentos podem ser obtidos empiricamente durante o processo de propagação das plantas e incrementados pelo conhecimento adquirido no ensino formal de química, física, botânica, genética e fisiologia de plantas, assim como das informações científicas advindas dos avanços obtidos na pesquisa científica.
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O conhecimento das plantas: no processo evolutivo das técnicas de propagação, as várias técnicas foram avaliadas, aperfeiçoadas e, ou, ajustadas às diferentes exigências fisiológicas e ambientais de cada espécie, em função dos objetivos desejados, das experiências adquiridas, avanços tecnológicos e da estrutura disponível. Assim, o sucesso da propagação está no conhecimento das plantas e das técnicas adequadas a ela em uma dada condição e necessidade.
As três áreas de conhecimento da propagação de plantas mencionadas são
complementares e necessárias, em que a teoria compartilhada com a prática, aliada
ao conhecimento da planta que está sendo multiplicada permitem alcançar os
objetivos com maior eficiência e qualidade.
A maioria das espécies lenhosas normalmente é de natureza heterozigótica,
imposta pela alogamia quase que obrigatória no processo de reprodução das
plantas e, na maioria das espécies, a forma principal e natural de propagação é por
via seminal. Diante disso, a alternativa utilizada no setor florestal para a obtenção de
materiais superiores, visando atingir determinados propósitos, foi a utilização da
propagação vegetativa no processo de produção de mudas clonais.
As expressões “propagação vegetativa”, “propagação assexuada” e
“propagação clonal” de plantas têm sido utilizadas rotineiramente para designar a
multiplicação e produção de novas plantas usando propágulos vegetativos de uma
planta ou clone específico. No entanto, em algumas situações, determinada
expressão pode ser preferida em função dos objetivos que esta busca enfocar;
assim, a expressão “propagação assexuada” tem sido utilizada, principalmente,
quando pretende-se referenciar o modo de reprodução de uma planta; a expressão
“propagação vegetativa” tem sido utilizada mais para referenciar a forma de
propagação de uma planta em um processo de produção de mudas; e quando se
tratar de produção de mudas de um determinado clone, a expressão “propagação
clonal” tem sido empregada. Logicamente que estas expressões têm sido utilizadas
de forma indiscriminada, e que em muitas das situações elas são formas alternativas
de expressar a forma de propagação de uma determinada planta. Outras
expressões como “propagação agâmica” e “propagação somática” também são
encontradas na literatura para referenciar este tipo de propagação de plantas. No
entanto, de forma geral, a expressão “propagação vegetativa” tem sido aquela com
maior difusão nas diversas áreas que atuam com a propagação de plantas.
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Princípios Biológicos da Propagação de Plantas
Na propagação vegetativa, a mitose é o processo responsável pelo controle,
desenvolvimento e crescimento das plantas, na qual é mantida a identidade genética
da planta matriz. Dessa forma, um propágulo constitui-se de parte de uma
determinada planta usada para produzir uma ou mais novas plantas. Entre os vários
tipos de propágulos incluem-se as sementes (propagação sexuada), estacas,
estruturas florais, segmentos vegetativos e vários tipos de estruturas especializadas
como gemas, calos, bulbos, estolões. O uso de um propágulo em detrimento de
outro está em função dos objetivos desejados, da espécie, disponibilidade de
material vegetativo e estrutura de propagação disponível.
A ciência da propagação vegetativa de plantas baseia-se em alguns dos
princípios básicos da biologia. Em um processo de organogênese in vitro, por
exemplo, segundo Peres (2002), várias são as etapas envolvidas na regeneração de
uma planta (Figura 1).
Figura 1 - Etapas envolvidas na regeneração de uma planta em um processo de propagação
por organogênese in vitro. Adaptado de Peres (2002).
“Organogênese” significa o processo de neoformação de partes aéreas,
raízes ou de outros tipos de explantes, na condição in vitro ou in vivo; contrastando
com a “embriogênese” na qual se forma uma estrutura semelhante ao embrião, com
eixo polar (radícula - parte aérea) completo. A condição in vitro indica, literalmente,
no vidro, termo aplicado para designar crescimento de células, tecidos ou órgãos
vegetais em meio de cultura, sob condições assépticas.
“Desdiferenciação” constitui-se no processo pelo qual uma célula
diferenciada perde suas características específicas, reassumindo atividades
meristemáticas, ou seja, processo de alcançar um estado meristemático não
diferenciado em células previamente diferenciadas.
Propágulo
Desdiferenciação
Aquisição de competência Indução
Determinação Diferenciação Regeneração Planta
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O termo “competência” é usado para descrever o potencial de uma
determinada célula ou tecido em se desenvolver em uma forma particular, como por
exemplo, a competência para iniciar enraizamento adventício, um embrião ou uma
flor. O desenvolvimento da competência por um tecido requer certa quantidade de
tempo e, ou exposição a um sinal endógeno ou exógeno.
A “indução” indica o que causa a iniciação ou desenvolvimento de uma
estrutura ou processo. O termo “determinação”, refere-se ao grau de
comprometimento que um grupo de células tem perante a um direcionamento
naquele momento. A “diferenciação” significa as mudanças fisiológicas, morfológicas
e anatômicas que ocorrem em uma célula, tecido, órgão ou planta, durante o
desenvolvimento do estado meristemático ou juvenil para o adulto.
Todo o processo de regeneração de uma planta pela propagação vegetativa
somente é possível dada a totipotencialidade das células vegetais em manifestar,
em momentos diferentes e sob estímulos apropriados, a potencialidade em iniciar
um novo indivíduo multicelular. Em vista da “totipotência” que toda célula viva
possui, esta tem potencial para reproduzir um organismo inteiro, desde que possua
informação genética para tal expressão gênica. O termo “expressão gênica” refere-
se aos padrões de desenvolvimento e crescimento das plantas, decorrente da
informação genética contida no genoma daquela planta, associada às condições
ambientais. Dessa forma, as variações fenotípicas observadas em plantas são
manifestações resultantes das informações genéticas para formação de suas
estruturas, padrões de crescimento e funções, exercendo controle primário no
processo de propagação.
Embora a organogênese seja um processo considerado empírico, segundo
Peres (2002), o desenvolvimento de um protocolo é facilitado se forem seguidos
alguns princípios e conhecimentos fisiológicos. De acordo com este autor,
normalmente o sucesso da propagação por organogênese in vitro é dependente
principalmente da etapa de aquisição de competência, pois quando um explante
falha em desenvolver organogênese in vitro, essa se dá normalmente na etapa de
aquisição de competência. Contudo, pouco se conhece, até o momento, sobre os
mecanismos envolvidos neste processo.
De acordo com o exposto, o conhecimento dos princípios básicos da biologia
ajuda a compreender melhor a propagação de uma planta, facilitando a sua
multiplicação clonal, assim como acompanhar a história do desenvolvimento do
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organismo durante o seu ciclo vital, ou seja, a “ontogenia” da planta.
Ação Hormonal nas Plantas
Hormônios vegetais são um grupo de substâncias orgânicas de ocorrência
natural que, em pequenas concentrações, influenciam os processos fisiológicos de
crescimento, diferenciação e desenvolvimento (DAVIES, 1995). São substâncias
conhecidas há muito tempo, entretanto, sua ação nas plantas foi melhor entendida
nos últimos anos.
Dentre os hormônios de plantas mais conhecidos e de interesse na
propagação de plantas destacam-se as auxinas, giberelinas, citocininas, etileno e
ácido abscísico. Em certas condições, essas substâncias possuem efeito quando
aplicadas nas plantas exogenamente, sendo denominadas de reguladores de
crescimento vegetal e, ou fitorreguladores.
Auxinas: São compostos com atividade biológica similar aquela do ácido indol-3-
acético (AIA), incluindo a capacidade de promover o alongamento de coleóptilos de
segmentos de caules, divisão celular em culturas de calos em presença de
citocininas, formação de raízes adventícias em folhas ou caules destacados e outros
fenômenos do desenvolvimento relacionados com a ação do AIA (TAIZ & ZEIGER,
2004).
Segundo Válio (1985), as auxinas são sintetizadas nas plantas,
principalmente, em regiões de crescimento ativo, como o meristema apical, gemas
axilares e folhas jovens, sendo translocadas para diferentes órgãos, segundo o
mecanismo de transporte polar e basípeto. O AIA é a principal auxina nos vegetais
superiores (TAIZ & ZEIGER, 2004) e, segundo os mesmos autores, embora quase
todos os tecidos vegetais sejam capazes de produzir baixos níveis de AIA, os
meristemas apicais, as folhas jovens, os frutos e as sementes em desenvolvimento
são os principais locais de síntese deste hormônio. A aplicação da auxina em órgãos isolados promove aumento da resposta,
paralelamente ao aumento da concentração até certo nível, após o qual ocorre um
efeito inibitório. Entretanto, a resposta da planta à auxina endógena ou exógena,
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varia tanto com a natureza do tecido, quanto com a concentração da substância
presente.
As principais aplicações das auxinas na propagação de plantas são a
indução de raízes adventícias em estacas e o controle da morfogênese na
micropropagação. Segundo Taiz & Zeiger (2004), as auxinas também promovem o
crescimento de caules e coleóptilos, inibem o crescimento de raízes, regulam a
dominância apical, retardam o início da abscisão foliar e regulam o desenvolvimento
das gemas florais e frutos.
Fisiologistas têm buscado definir o modo de ação química das auxinas nas
plantas. Acredita-se que a promoção de crescimento pelas auxinas ocorre por meio
de dois mecanismos: a) pela promoção de transporte de íons de H+
O equilíbrio entre a auxina e citocinina é uma das relações primárias na
propagação de plantas, em que uma alta relação auxina/citocinina favorece o
enraizamento; uma baixa relação favorece a formação de brotações e; um alto nível
de ambas favorece o desenvolvimento de calo. Vale salientar, também, que a
interação entre citocinina, ácido abcísico e giberelinas controla a dormência de
pelas paredes
celulares, aumentando sua extensão; e b) pela indução da transcrição de RNAm
específico necessário para promover o crescimento. Em morfogênese, a aplicação
de auxina parece capaz de apagar programas de diferenciação celular, revertendo
células em estado de diferenciação e reabilitando a divisão celular.
Dentro do grupo das auxinas, Taiz & Zeiger (2004) salientam que o AIA
ocorre em todos os vegetais, mas outros compostos relacionados apresentam
atividade auxínica; mostarda e milho contém ácido indol-3-butírico (AIB). Além do
AIA, várias outras substâncias com funções regulatórias de crescimento semelhante
e com aplicação na propagação das plantas são produzidas sinteticamente: ácido
indol-3-butírico (AIB), ácido naftalenoacético (ANA), o 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-
D), entre outros.
Citocininas: Constituem um grupo de hormônios de grande importância no
crescimento das plantas, visto os efeitos na divisão celular e diferenciação de
gemas. Os meristemas dos ápices radiculares são as regiões da planta de maior
síntese de citocininas livres, as quais parecem se mover pelo xilema até a parte
aérea, juntamente com a água e os sais minerais absorvidos pelas raízes (TAIZ &
ZEIGER, 2004).
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sementes.
Além dos efeitos na divisão celular, as citocininas também são importantes
na morfogênese in vitro pela indução do caule, no crescimento de caules e raízes,
na expansão foliar, no movimento dos nutrientes, no retardamento da senescência
foliar, entre outros (DAVIES, 1995; TAIZ & ZEIGER, 2004).
As citocininas de maior interesse na propagação de plantas e de ocorrência
natural são a Zeatina (ZEA) e a Isopenteniladenina (2iP). Quanto às citocininas
produzidas sinteticamente, além das citadas anteriormente, existem a 6-
benzilaminopurina (BAP), Cinetina (KIN) e o Thidiazuron (TDZ).
Giberelinas, Ácido Abscísico e Etileno: As giberelinas ocorrem em altas
concentrações nas sementes imaturas e nos frutos em desenvolvimento e possuem
importante função na germinação e no controle da dormência. Ocorrem também em
altas concentrações em ápices caulinares, sendo transportadas no interior da planta
pelo xilema e floema (DAVIES, 1995). Entre as funções nas plantas estão aquelas
relacionadas com a promoção do alongamento de brotações por meio da divisão
celular e alongamento, além da regulação da transição da fase juvenil para a adulta
em muitas plantas lenhosas. Mais de 125 formas de giberelinas foram encontradas
nas plantas, embora somente algumas se apresentam fisiologicamente ativas e, em
particular GA1 e GA4, são responsáveis pelos efeitos nas plantas, sendo as demais
precursores ou metabólitos (TAIZ & ZEIGER, 2004). O ácido giberélico (GA3
Na Tabela 1 é apresentado um resumo das principais classes de
) é uma
das mais importantes como produto comercial.
O ácido abscísico enquadra-se na classe de inibidores de crescimento e é
considerado importante em muitas atividades das plantas. Na propagação de
plantas, este inibidor está envolvido na germinação e dormência, bem como, na
embriogênese e produção das sementes (HARTMANN et al., 2002).
O etileno é um regulador de crescimento gasoso com estrutura química
muito simples e que, segundo Hartmann et al. (2002), pode ter efeitos profundos no
crescimento das plantas, incluindo a epinastia quando em altas concentrações,
senescência e abscisão de folhas e frutos, promoção do florescimento, estimulação
das gemas laterais e estimulação da produção do látex. Na propagação, o etileno
pode induzir enraizamento adventício, estimular a germinação em algumas
sementes e superar dormência.
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reguladores de crescimento e os respectivos componentes mais aplicados na
propagação das plantas. Salienta-se que as concentrações de uso e formas de
preparo variam muito em função da técnica de propagação adotada, do tipo de
material e da espécie utilizada.
Tabela 1 - Classes de reguladores de crescimento e respectivos componentes mais
aplicados na propagação das plantas.
Classes de Reguladores
Abreviatura Massa Molar (g mol-1
Nome Químico )
AUXINAS
AIA 175,2 Ácido indol-3-acético AIB 203,2 Ácido indol-3-butírico ANA 186,2 Ácido naftalenoacético 2,4-D 221,0 Ácido 2,4-diclorofenoxiacético
CITOCININAS
Zea 219,2 N6
2iP -(4-hidroxi-3-metilbut-2 enil) aminopurina (zeatina)
203,2 Isopenteniladenina BAP 225,3 6-benzilaminopurina TDZ 220,2 Thidiazuron KIN 215,2 6-furfuriloamino-purina
GIBERELINAS GA 346,4 3 Ácido giberélico
INIBIDORES ABA 264,3 Ácido abscísico
Outros hormônios: além das substâncias citadas, outros compostos químicos
naturais ocorrem em plantas e são considerados como hormônios. Incluem-se nesta
classe as poliaminas, os brassinoesteróides, os jasmonatos, os salicilatos, alguns
complexos oligossacarídeos e inositol trifosfato.
Juvenilidade e Maturação em Plantas Lenhosas
As plantas apresentam ao longo de sua vida consecutivos períodos de
crescimento vegetativo (formação de caule, folhas e raízes) e de desenvolvimento
reprodutivo (formação de flores, frutos e sementes), determinados por padrões
sazonais baseados em mudanças climáticas (temperatura, luz e/ou precipitação) e
pela resposta às mudanças durante o ciclo de vida.
Ciclos de vida superiores a dois anos caracterizam as plantas perenes, as
quais apresentam repetidos ciclos vegetativo-reprodutivos, anualmente,
bianualmente ou em períodos mais longos. Em geral, arbustos têm maior período de
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juvenilidade em relação às árvores e, embora a fase madura ocorra em plantas
herbáceas anuais e perenes, esta é geralmente menor quanto à duração e, as
mudanças nas características morfo-fisiológicas associadas às trocas de fase, são
menos distintas do que em outras plantas (HACKETT, 1987). As mudanças
ocorridas durante estes ciclos apresentam grande importância no processo de
propagação de plantas, em que pode-se caracterizar as seguintes fases (Figura 2):
Fase juvenil: caracterizada pela predominância de características juvenis; correspondente ao estádio inicial de crescimento vegetativo das plantas após a germinação e, em algumas plantas, pela incapacidade dos meristemas apicais em induzir florescimento, mesmo que condições favoráveis para tal existam. Fase de transição juvenil/adulta: caracteriza-se pela transição entre a fase vegetativa e reprodutiva, ou seja, pela passagem da planta da fase juvenil para uma condição madura. Fase adulta: corresponde àquela fase com predominância de características maduras em relação às juvenis. É caracterizada, principalmente, pela fase reprodutiva das plantas, ou seja, pela fase em que ocorre o florescimento e frutificação da planta.
Figura 2 – Fases do ciclo de vida das plantas perenes.
O ciclo de vida de muitas espécies refere-se às fases juvenil e adulta, nas
quais as características morfológicas e fisiológicas são diferentes. Após a
germinação da semente, a planta inicia uma fase de crescimento vegetativo muito
vigoroso, durante a qual a floração não pode ser induzida, mesmo que as condições
Fase juvenil Fase de transição Fase adulta
Semente Senescência
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externas sejam favoráveis (SALISBURY & ROSS, 1978). Assim, a fase juvenil de
algumas plantas é caracterizada pelo não florescimento, grande vigor e presença de
espinhos; a fase adulta pelo florescimento e frutificação, reduzido vigor e ausência
de espinhos (HARTMANN et al., 2002).
Quanto à regulação da troca de fase, evidências predominantes sugerem
que a planta necessita ter um determinado tamanho antes de entrar na fase adulta
(HACKETT, 1987). Além disso, segundo Hackett & Murray (1993), as mudanças
ocorridas em função da troca de fase com o desenvolvimento da planta variam de
espécie para espécie, sendo que as maiores alterações ocorrem no período
precedente à maturação, resultando em formas transicionais. Segundo estes
autores, as características relacionadas à maturação são estáveis, porém reversíveis
para determinadas características, variando em decorrência do tempo de
desenvolvimento. Para Greenwood (1992), a maturação é uma determinação celular
regulada por fatores intrínsecos e extrínsecos das células do meristema apical.
A maturação freqüentemente é confundida com a idade cronológica, embora
a maturação seja reversível sob certas condições e a idade provavelmente não. De
forma geral, com o avanço da idade, a planta ou órgão tende à senescência e morte,
enquanto o meristema apical adulto de plantas pode ter sua juvenilidade restaurada,
ou seja, rejuvenescida (HUANG et al., 1990). Segundo Hackett & Murray (1993),
as características de maturação se arquivam em função da sua relativa
estabilidade e são transmitidas por meio das divisões celulares de uma
geração somática para a próxima. Com base na conceituação de maturação apresentada por Fortanier &
Jonkers (1976), pode-se descrever três tipos de idade em uma planta:
Idade cronológica: refere-se ao tempo decorrido desde a germinação da semente até a data de observação da planta, ou seja, é a idade registrada do tempo de vida de uma planta ou propágulo. Idade ontogenética: refere-se a passagem da planta por sucessivas fases de desenvolvimento, as quais incluem a embriogênese, germinação, crescimento vegetativo e reprodutivo. Corresponde a maturação da planta, passando pela fase juvenil, de transição juvenil-adulta e adulta. Idade fisiológica: corresponde ao aspecto de vigor fisiológico da planta, como sanidade e status nutricional e hídrico. Refere-se aos aspectos negativos da idade, tais como a perda de vigor, aumento da susceptibilidade às condições adversas ou a deterioração em geral.
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De modo geral, em algumas espécies florestais, há um gradiente de
juvenilidade ontogenética em direção à base da árvore, sendo este variável entre
espécies (HACKETT, 1987), o que promove um aumento da maturação em função
da maior proximidade com o meristema apical (GREENWOOD & HUTCHISON,
1993). A maior juvenilidade da região basal das plantas se deve ao fato de que os
meristemas mais próximos da base foram formados em uma fase com maior grau de
juvenilidade, dada a proximidade com a fase de germinação, do que os das regiões
terminais que possuem maior grau de maturação (Figura 3).
O conhecimento do gradiente de juvenilidade em plantas lenhosas é de
grande importância em um processo de propagação clonal, uma vez que a origem
dos propágulos vegetativos utilizados possui efeito marcante na produção de mudas
e no comportamento da futura planta. Os propágulos vegetativos de diferentes
posições da planta retêm os níveis específicos de juvenilidade (ou maturidade)
quando são retirados da planta e propagados vegetativamente. Como resultado, a
morfologia e a fisiologia das plantas resultantes dos propágulos oriundos das
diferentes partes da planta matriz podem apresentar diferenças significativas dentro
das três categorias de fase juvenil, juvenil/adulta e adulta.
O conhecimento da espécie, a definição dos objetivos a serem alcançados
com determinada técnica de propagação vegetativa, a escolha e o uso correto dos
propágulos vegetativos é de extrema importância. Quando desejado um
comportamento mais juvenil da planta a ser propagada, deve-se utilizar propágulos
oriundos das partes mais juvenis (fase juvenil) da planta matriz. Por outro lado,
Figura 3 – Gradiente de juvenilidade em plantas lenhosas. (A): região com maior grau de juvenilidade ontogenética. (B): região com maior grau de maturidade ontogenética. A
B
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quando se deseja uma planta com comportamento maduro, tal como a manifestação
do florescimento precoce e porte reduzido, deve-se preferir propágulos oriundos das
partes mais adultas (fase adulta) da planta matriz.
Na propagação vegetativa das plantas, os conceitos apresentados
anteriormente são de grande importância em função dos diferentes tipos de
propagação de plantas e dos objetivos almejados. A compreensão do ciclo de vida
das plantas facilita o entendimento da biologia da propagação e serve como suporte
nas atividades de multiplicação clonal em espécies florestais. O entendimento da
troca da fase juvenil para a adulta permite conduzir com maior sucesso o processo
de clonagem de árvores selecionadas, resultando em maior eficiência da etapa de
seleção, melhoramento e clonagem e, conseqüentemente, em uma silvicultura clonal
intensiva mais eficiente.
Efeitos da Maturação
Na propagação clonal em espécies florestais, as principais conseqüências
da mudança da fase juvenil para a adulta de uma planta, estão relacionadas aos
efeitos no crescimento, efeito topófise e ciclófise, mudanças nas características
foliares e caulinares, capacidade de enraizamento, competência reprodutiva,
alterações bioquímicas e expressão gênica.
A mudança de fase em espécies florestais é um fenômeno bem mais
complexo, onde estão envolvidos um número bem maior de alterações do que as
aqui apresentadas, as quais, na sua maioria, ainda não são bem conhecidas e
entendidas.
Hábito e Vigor de Crescimento das Plantas Entre os principais efeitos da maturação relacionados ao crescimento de
espécies florestais estão aqueles relacionados com o hábito de crescimento e os
efeitos no crescimento em altura e diâmetro das plantas.
O crescimento das brotações das plantas pode variar em função da
maturidade dos propágulos que as originaram. Segundo Greenwood & Hutchison
(1993), na propagação vegetativa pela enxertia ou estaquia, por exemplo, as plantas
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originadas de propágulos juvenis possuem maior tendência em apresentar hábito de
crescimento ortotrópico do que aquelas plantas originadas de propágulos mais
maduros. Dependendo da espécie, pode-se observar plantas com nítido hábito de
crescimento plagiotrópico quando esta origina-se de propágulo vegetativo maduro
na propagação clonal. O crescimento plagiotrópico refere-se à situação em que
algumas plantas propagadas vegetativamente assumem um crescimento desviado
da posição vertical (ortotropia) e continuam seu crescimento de forma similar a uma
ramificação lateral (crescimento plagiotrópico).
Segundo dados experimentais de Greenwood & Hutchison (1993) e Parker
et al. (1998), árvores originadas por enxertia ou enraizamento de estacas de
propágulos juvenis de Tsugar canadensis e Pinus taeda tendem a exibir maior
número de brotações por unidade de área, bem como maior tendência ao
crescimento ortotrópico, em comparação com aquelas de propágulos maduros.
Em Araucaria angustifolia e Coffea arabica, mudas produzidas por
enraizamento de estacas coletadas de brotações laterais continuam tendo
crescimento plagiotrópico, enquanto estacas coletadas de brotações da parte apical
se desenvolvem normalmente (HARTMANN et al., 2002), sendo a mesma resposta
encontrada em Platanus occidentalis (LAND et al., 1995).
Para espécies do gênero Eucalyptus, não foram encontrados estudos
referentes aos efeitos de gradientes de maturidade dos propágulos utilizados na
propagação. Porém, em níveis de viveiro e campo, podem-se observar plantas com
características que lembram o crescimento plagiotrópico (Figura 4).
Figura 4 – Hábito de crescimento em mudas. (A): Eucalyptus sp.; (B): Grevillea robusta. Crescimento ortotrópico à esquerda e plagiotrópico à direita, respectivamente.
Na literatura têm sido amplamente abordados os conceitos de topósise e
ciclófise, embora estes ainda não sejam bem compreendidos. Em espécies
florestais, estes efeitos possuem especial importância, visto as dificuldades
A B
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encontradas na propagação vegetativa em várias situações na produção de mudas.
Para o presente caso, topófise refere-se ao efeito na propagação clonal resultante
da diferença de estágio de desenvolvimento potencial fisiológico do meristema
apical, quando comparado com outras áreas meristemáticas da planta,
independentemente do processo de maturação do meristema apical (DODD &
POWER, 1988). Em outras palavras, o fenômeno de topófise pode ser entendido
como um efeito da origem do propágulo vegetativo que se manifesta nos processos
assexuados de reprodução, através da menor ou maior performance na propagação
vegetativa. A ciclófise refere-se ao efeito na propagação clonal decorrente do
processo de maturação do meristema apical. É o estádio em que se encontram as
regiões meristemáticas da planta no momento da seleção do propágulo vegetativo
(DODD & POWER, 1988). Pode-se dizer que o efeito topófise relaciona-se com a
idade fisiológica e o efeito ciclófise relaciona-se com a idade ontogenética.
Os termos topósise e ciclófise podem se confundir quando analisados
quanto à morfologia dos propágulos vegetativos envolvidos no processo de
propagação clonal. Nesse processo, a minimização destes efeitos está na utilização
de propágulos vegetativos fisiologicamente mais novos e em idade ontogenética
mais juvenil quanto possível. Exceções são apresentadas em algumas coníferas
florestais, como a Araucaria angustifólia, na qual pode ser observado que os
propágulos vegetativos provenientes das brotações apicais (ortotrópicas) originam
plantas com crescimento tipicamente na vertical, enquanto que propágulos
provenientes das brotações laterais (plagiotrópicas) resultam em plantas com
crescimento na horizontal, independentemente da idade dos propágulos vegetativos.
Crescimento em Altura e Diâmetro das Plantas Informações científicas contemplando a influência do grau de maturação do
propágulo vegetativo no crescimento em altura e diâmetro das plantas propagadas
vegetativamente, são pouco conhecidas e compreendidas. No entanto, segundo
Greenwood & Hutchison (1993), a capacidade de crescimento em altura e diâmetro
de uma planta pode ser afetada pelo uso de propágulos vegetativos provenientes de
árvores de diferentes idades. Segundo estes autores, pesquisas demonstram a
redução na capacidade de crescimento em altura e diâmetro, com o envelhecimento
ontogenético, na propagação clonal por enxertia e/ou por estaquia a partir de
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propágulos com diferentes idades. Salientam, ainda, que isto pode ser decorrente do
decréscimo da capacidade de enraizamento com o aumento da maturação, onde
menores crescimentos em altura e diâmetro podem ser função de um menor vigor do
sistema radicial em propágulos mais maduros utilizados em um processo de
propagação clonal. Propágulos vegetativos mais juvenis não somente produzem
maior crescimento do caule, mas também sustentam maior produção de folhas e
biomassa (GREENWOOD, 1992).
O estádio juvenil possibilita o maior crescimento vegetativo da planta e a
produção de grande área foliar, como também a produção de fotoassimilados a
serem, posteriormente, utilizados no desenvolvimento dos frutos e do sistema
radicular, facilitando a absorção de água e íons do solo (BOLIANI, 1986).
Alguns autores têm sustentado que o reduzido crescimento em diâmetro e
altura em árvores mais velhas é devido ao aumento da complexidade e tamanho da
árvore, isto é, à idade e não à maturação (HACKETT, 1987; ZIMMERMANN et al.,
1985, citados por GREENWOOD & HUTCHISON, 1993). Mas, de acordo com
estes, o fato de enxertos de mesmo tamanho inicial, de árvores com diferentes
idades, apresentarem taxas de crescimento diferenciadas indica que o decréscimo
do potencial de crescimento é também relacionado às características de maturação.
A mesma conclusão pode ser extraída de pesquisa realizada por Parker et al.
(1998), que, avaliando mudas originárias de enxertia em plantas de Pinus elliottii,
após seis anos no campo, observaram crescimentos em altura e diâmetro
significativamente superiores em mudas resultantes de enxertos com idade de 6 a 9
anos (juvenis), em comparação com aquelas de enxertos com idades acima de 40
anos. Enfim, as informações científicas indicam que menor vigor pode ser
decorrente do envelhecimento, maturação ou ambos.
Anatomia Foliar e Caulinar Durante o desenvolvimento ontogenético, a planta apresenta uma série de
alterações morfológicas e fisiológicas relacionadas com partes foliares e caulinares,
tais como mudanças de forma (Figura 4), dimensão, pigmentação (clorofila e
antocianina), atividade fotossintética, entre outras. Segundo vários autores
(BOLIANI, 1986; HACKETT, 1987; FOUDA, 1996; HARTMANN et al., 2002), estas
mudanças decorrem da troca da fase juvenil para a adulta, afetando sensivelmente a
26
propagação vegetativa das plantas. Em Eucalyptus, por exemplo, na fase juvenil as
folhas são largas, extensas e sem pecíolo, enquanto na fase adulta são alongadas e
apresentam um pecíolo distinto (Figura 5A e 5C). Diferenças similares podem ser
observadas para algumas espécies do gênero Pinus (Figura 5B).
Figura 5 - Diferenças morfológicas entre brotos na fase juvenil e adulta de algumas plantas lenhosas. (A): Eucalyptus benthamii, (B): Pinus canariensis; (C): Eucalyptus globulus. Brotos adultos à esquerda e juvenis à direita, respectivamente.
Em algumas situações tem sido relatada a maior resistência foliar a doenças
com o envelhecimento ontogenético e, segundo Greenwood & Hutchison (1993),
especula-se que seja devido a maior resistência a penetração do fungo. Segundo
FOUDA (1996), folhas de ramos juvenis apresentam forma mais cônica, a epiderme
recoberta por uma fina camada de cutícula com alta densidade estomatal, mesófilo
espesso com ductos de resina menores e em menor concentração do que em folhas
adultas; ramos juvenis apresentam córtex, floema, zona cambial, medula e raios do
xilema e floema mais espessos do que adultos.
Em Tectona grandis, o número de elementos de vaso, comprimento e
largura dos elementos de vaso e de fibra foram menores em estacas caulinares
oriundas de plantas juvenis, com dois meses de idade (HUSEN & PAL, 2006). Estes
valores cresceram com o aumento da idade da planta matriz, sendo maiores
naquelas de 30 anos. Segundo os autores, as referidas características anatômicas
podem ser usadas como marcadores confiáveis do grau de maturação na espécie
estudada e, talvez, para outras espécies.
Capacidade de Enraizamento Adventício Uma das mais consistentes expressões da maturação em plantas lenhosas
A B
C
27
refere-se ao potencial de regeneração, em que a redução da capacidade do
enraizamento de propágulos vegetativos, com o envelhecimento ontogenético, tem
sido considerado como um dos principais efeitos na propagação clonal.
Vários estudos indicam que o potencial de enraizamento de propágulos
vegetativos, obtidos em diferentes alturas da planta matriz, varia com o gradiente de
maturação. Assim, propágulos coletados do ápice e dos ramos laterais das plantas
geralmente apresentam menor potencial de enraizamento do que aqueles coletados
das regiões mais próximas à base da árvore, embora ocorram grandes variações em
termos de espécies.
Para a maioria das espécies lenhosas, estacas de mudas juvenis,
provenientes de sementes, enraízam facilmente, enquanto outras provenientes de
plantas mais velhas o fazem com maiores dificuldades, ou definitivamente não
enraízam. Vale salientar que a juvenilidade muitas vezes se perde antes mesmo da
planta alcançar a maturação reprodutiva.
Estudos em plantas de Tsugar heterophylla têm indicado que o potencial de
enraizamento de propágulos coletados de diferentes alturas da árvore matriz trazem
evidências da existência de um gradiente de maturação, com o grau de maturação
aumentando à medida que se aproxima do ápice da planta (GREENWOOD &
HUTCHISON, 1993).
O gradiente de maturação e seus efeitos no enraizamento podem variar
entre as diferentes espécies. Para Eucalyptus grandis, por exemplo, trabalhos têm
evidenciado que estacas cotiledonares têm alto potencial de enraizamento,
enquanto estacas coletadas acima do 150 nó apresentam baixo enraizamento ou
não enraízam (HACKETT, 1987). Para Eucalyptus viminalis e Eucalyptus pauciflora,
Hackett (1987), relata que o alto potencial de enraizamento é perdido
completamente após o 4o nó. Em Eucalyptus camaldulensis, esse mesmo autor
relata enraizamento de 40-50% em estacas do 100o nó e em Eucalyptus deglupta,
100% de enraizamento em estacas coletadas acima do 100o
Há várias décadas tem sido estudado o efeito da idade sobre o
enraizamento de estacas de Hevea brasiliensis (seringueira). Gregory (1951) cita
que além da diminuição dos índices de enraizamento com o aumento da idade da
planta fornecedora de propágulos, o tempo de enraizamento também é bastante
influenciado. Segundo este autor, nesta época dados experimentais com matrizes de
Hevea brasiliensis indicaram que estacas obtidas com plantas de 1 mês de idade
nó.
28
apresentaram 95% de enraizamento aos 28 dias, sendo observado a redução
gradual do percentual de enraizamento e aumento do tempo de resposta ao
enraizamento a medida que as estacas foram obtidas de matrizes mais velhas.
Estas resultaram em apenas 7,5% de enraizamento aos 65 dias em plantas com 13
meses de idade e nenhuma resposta a partir de 24 meses de idade nas condições
experimentais adotadas. Também, Stahel (1947) cita que a propagação de Hevea
brasiliensis por estacas é bem sucedida somente quando estacas são coletadas de
plantas muito novas ou de partes basais do caule de plantas mais velhas.
Para Ilex paraguariensis (erva-mate), Sand (1989) obteve enraizamento de
91,7% e 39,4% em estacas caulinares e foliares, respectivamente, provenientes de
plantas matrizes de um ano de idade, enquanto que apenas 6,8% e 2,6% para
aquelas oriundas de plantas de 60 anos. Estes resultados indicam que o fator
juvenilidade se perde após três anos de idade, sem, no entanto, terem ainda
alcançada a maturação reprodutiva, a qual iniciaria após o quinto e sexto ano de
vida.
Além do aumento dos percentuais de enraizamento em propágulos mais
juvenis, a melhor qualidade e a maior rapidez de formação do sistema radicial
também têm sido citadas (GOMES, 1987), denotada pelo aumento no vigor radicial
(número e comprimento de raízes) relatado por Schneck (1996). Sand (1989) avaliou
o comprimento médio das maiores raízes de estacas oriundas de plantas de erva-
mate com seis meses, 18 meses e 60 anos de idade em comparação com estacas
oriundas de rebrotes de plantas de 60 anos. Obteve 11,5; 10,6; 8,4; e 5,8 cm,
respectivamente, para os quatro tratamentos, ressaltando a importância do fator
juvenilidade dos propágulos no vigor do sistema radicial.
De maneira geral, pode-se admitir que quanto mais juvenil for o propágulo
vegetativo a ser propagado, maior é a chance de sucesso de enraizamento quer em
termos de percentual, rapidez de formação e qualidade das raízes, quer pela
capacidade de crescimento da nova planta.
Competência Reprodutiva A competência reprodutiva, definida como a capacidade das plantas para a
formação de estruturas reprodutivas sob condições naturais ou induzidas, tem sido
utilizada tradicionalmente como critério para caracterizar a fase adulta da planta, ou
29
seja, a mudança da fase juvenil para adulta (HACKETT & MURRAY,1993;
HARTMANN et al., 2002). Na maioria dos casos, a produção regular de flores é o
único critério prático para identificação do final da fase juvenil em uma planta
(HACKETT, 1987).
Entretanto, recentemente este critério de troca de fase tem sido bastante
questionado, uma vez que a inaptidão de plantas jovens em florescer não
necessariamente indica incompetência reprodutiva, visto que a manipulação das
condições ambientais ou tratamentos hormonais pode induzir a floração
repetidamente nestas plantas (GREENWOOD & HUTCHISON, 1993). Na grande
maioria dos casos, porém, a competência reprodutiva se manifesta quando a planta
apresenta um tamanho mínimo e entra no estado maduro.
Na maioria das coníferas, características como a relação de estróbilos
masculinos e femininos produzidos têm sido usada como melhor indicador do estado
de maturação quando comparado à competência reprodutiva. De modo geral,
quanto maior a idade destas plantas, maior a produção de estróbilos masculinos em
relação aos femininos (GREENWOOD & HUTCHISON, 1993).
Alterações Bioquímicas Uma série de estudos têm sido conduzidos em espécies lenhosas visando a
identificação de marcadores bioquímicos de juvenilidade dos propágulos. Em
Castanea sativa, Vazquez & Gesto (1982) encontraram maiores teores endógenos
de substâncias promotoras de enraizamento em propágulos juvenis. Garcia et al.
(2000) avaliaram possíveis diferenças na composição protéica de vários órgãos
juvenis e adultos de plantas de oliveira (Olea europeae). Concluíram que a
composição protéica de órgãos adultos e juvenis de uma mesma planta ou de
plantas diferentes foi qualitativamente similar, porém, pelo menos um grupo de
polipeptídeos de 29 kDa foi mais fortemente expresso em tecidos adultos. Relações
similares também foram obtidas em vários cultivares de diferentes origens genéticas.
Níveis endógenos de reguladores de crescimento têm sido medidos em
tecidos juvenis e maduros de várias espécies por diferentes autores. Segundo
extensa revisão realizada por Hackett (1987), há diferenças dos conteúdos
endógenos de auxinas e outros promotores entre tecidos juvenis e adultos, os
maiores teores foram encontrados em propágulos juvenis em relação aos maduros.
30
Estudos realizados por Mullins (1985), Fouret et al. (1986), Moncalén et al (2001)
resultaram na conclusão de que propágulos maduros apresentaram maior conteúdo
de ABA, quando comparado aos juvenis. Resultados similares foram encontrados
para cultivares de macieira. Moncalén et al (2001) e Andrés et al. (2002) concluíram
que a relação citocinina / IAA decresce com o decorrer da maturação dos
propágulos. Day et al. (1995) concluíram que folhas juvenis continham mais
citocininas ativas do que folhas adolescentes ou adultas. Geneve (1985), citado por
Hackett (1987), encontrou diferenças significativas entre conteúdo de etileno em
tecidos maduros e juvenis, porém, estas diferenças não afetaram o percentual de
enraizamento.
Em estudo com Pinus radiata, Fraga et al. (2002) concluíram que indivíduos
juvenis foram caracterizados por um menor grau de metilação de DNA e uma alta
relação de poliaminas livres e poliaminas solúveis conjugadas com ácido perclórico,
enquanto que árvores adultas mostraram maior grau de metilação no DNA e uma
baixa relação de poliaminas livres e poliaminas solúveis conjugadas com ácido
perclórico. Baseados nestes resultados, os autores propuseram que ambos os
indicadores estariam relacionados com a perda da habilidade morfogênica com o
avanço da maturação e, conseqüentemente, com a não-aptidão de estabelecimento
in vitro de propágulos adultos de Pinus radiata.
Além das variações entre tecidos juvenis e adultos citadas anteriormente,
outras têm sido relatadas, como a concentração de proteínas solúveis em tecidos,
concentração de DNA em folhas (ALI & WESTWOOD, 1966), teor de poliaminas
(REY et al., 1994), conteúdo de clorofila (HUANG et al., 2003) e de antocianina nas
folhas (GREENWOOD, 1992; HACKETT & MURRAY, 1993).
Expressão Gênica A expressão gênica também é influenciada pelos efeitos da maturação dos
tecidos vegetais, pois a ativação ou supressão gênica transcricional ocorre de forma
diferenciada ao longo do desenvolvimento das plantas. Pesquisas têm reportado o
efeito da idade ontogenética dos propágulos na expressão gênica, principalmente
dos genes relacionados à fotossíntese. Hutchison et al. (1990) mostraram que a
família do gene CAB é mais fortemente expressada em propágulos juvenis de
plantas de Larix SP crescendo sob condições de luz em relação a propágulos
31
adultos. Os mesmos autores não encontraram diferenças na expressão dos genes
rbc S com a idade. Woo et al. (1994) demonstraram que os pecíolos juvenis e
adultos de Hedera helix crescidos in vitro responderam diferentemente a expressão
de HW 101 e HW 103 mRNA. Na seqüência, Kuo et al. (1995) descreveram um
sistema de fosforilação em Sequoia no qual uma proteína de 32 kDa pode ser
fosforilada somente em tecidos adultos enquanto que naqueles juvenis uma proteína
de 31 kDa foi fosforilada.
De modo geral, existem poucas informações disponíveis quanto ao
relacionamento entre a expressão gênica e a mudança de fase (maturação) em
plantas lenhosas. Os modelos buscando explicar a regulação da expressão gênica
na maturação são mais especulativos do que preditivos.
Rejuvenescimento e Revigoramento
Na silvicultura clonal, a seleção dos clones ocorre normalmente na fase
adulta da árvore devido a maior confiança no processo seletivo, visto a árvore
expressar o seu máximo potencial silvicultural, tecnológico, adaptação a sítios
específicos, entre outras, na idade de rotação desejada, para determinada
finalidade.
Em geral, a eficiência do processo seletivo dos clones é inversamente
relacionada com a facilidade de propagação vegetativa. Dessa forma, para obtenção
de sucesso na multiplicação de plantas adultas, é necessário explorar a maior
capacidade de propagação de material juvenil, seja pela utilização de propágulos
provenientes de partes juvenis da planta, seja pela promoção do rejuvenescimento
de partes da planta adulta.
Rejuvenescimento pode ser considerado como uma forma de reverter a
planta do estádio adulto para o juvenil, recuperando a competência da totipotência.
Em geral, algumas características relacionadas à maturação mostram-se mais fáceis
de serem revertidas do que outras e os respectivos tratamentos para promoção do
rejuvenescimento influenciam de forma diferenciada, sugerindo que o
rejuvenescimento ocorre em termos relativos e não absolutos (HACKETT &
MURRAY, 1993). De forma geral, pode-se dizer que a maturação é estável, mas
32
reversível ou manipulável em certas condições, e que o rejuvenescimento pode
ocorrer de forma total, parcial ou progressiva.
Uma série de métodos para reverter ou manter a juvenilidade das plantas
tem sido descritos: aplicação de ácido giberélico; propagação vegetativa seriada;
poda drástica ou poda de gemas apicais; neodiferenciação de gemas; apomixia,
meiose para células, indução de ramos adventícios em porções de raízes, utilização
do crescimento juvenil originado dos esferoblastos (crescimento em forma de
“verrugas” que às vezes são encontradas no caule), entre outros. Hackett (1987) cita
a propagação sexuada natural como sendo o método mais eficiente em promover o
rejuvenescimento de partes adultas de uma planta, uma vez que se origina a parte
mais juvenil da planta (embrião) a partir da parte mais madura (órgão frutífero).
Entretanto, entre os métodos de rejuvenescimento mais utilizados na área
florestal, relacionam-se à propagação vegetativa seriada pela enxertia, pela estaquia
e pela micropropagação, sendo os demais menos estudados e relatados, resultando
em menores conhecimentos dos seus efeitos sobre o rejuvenescimento ou
manutenção da juvenilidade.
Com relação ao revigoramento, esta metodologia consiste em adotar
práticas culturais que propiciem maior vigor fisiológico à planta de tal forma que
origine propágulos vegetativos com melhor performance na propagação clonal.
Dessa forma, a adoção de manejo nutricional e hídrico buscam uma melhoria na
condição fisiológica da planta, assim como o uso da poda drástica visa a indução de
brotações dormentes em regiões mais juvenis, constituindo-se em um método de
revigoramento eficiente em um processo de propagação clonal.
Rejuvenescimento por Enxertia Seriada
Neste processo, propágulos maduros são enxertados em partes juvenis de
um porta-enxerto e, a partir de sua brotação, são coletados novos propágulos os
quais são novamente enxertados em um novo porta-enxerto juvenil, e assim
seriadamente até obter os resultados desejados (Figura 6). Dessa forma, o
rejuvenescimento pela enxertia seriada consiste em enxertar em série propágulos
vegetativos do clone desejado.
A enxertia seriada é um método de rejuvenescimento que demanda muito
tempo (ELDRIDGE et al., 1994), podendo ainda apresentar problemas de
33
incompatibilidade (KIM et al., 1993) em algumas espécies florestais. Para Eucalyptus
e Pinus este método de rejuvenescimento tem sido aplicado em algumas
circunstâncias nos programas de silvicultura clonal.
Figura 6 - Esquema para rejuvenescimento pela técnica da enxertia seriada visando a restauração da competência ao enraizamento adventício de estaca de Pinus taeda.
O grau de rejuvenescimento obtido depende do número de re-enxertias do
enxerto no porta-enxerto juvenil, bem como da espécie/clone envolvido (HUANG et
al., 1990). Resultados experimentais têm mostrado que duas (KIM et al., 1993),
quatro (KAO & HUANG, 1993; ASSIS, 1996) ou quatro a seis (ELDRIDGE et al.,
1994) re-enxertias são suficientes para rejuvenescer o material até o ponto deste
enraizar facilmente, tendo-se suas variações em termos de espécie/clone.
A técnica de rejuvenescimento por enxertia seriada foi empregada com
sucesso na obtenção de material juvenil satisfatório para o enraizamento de estacas
de matrizes selecionadas de Pinus oocarpa e Pinus caribaea var. hondurensis, após
a terceira enxertia seriada (MURAYAMA & FERRARI, 1988). Em experimentos de
enxertia seriada com Eucalyptus x trabuti, Siniscalco e Pavolettoni (1988) concluíram
que propágulos adultos foram revertidos a condições juvenis, de forma gradual
1a Enxertia
Árvore
Selecionada
Obtenção de resposta ao Enraizamento
2a Enxertia
Enxertia “n”
34
conforme os sucessivos ciclos de enxertia. Nas seis re-enxertias feitas, os resultados
de sobrevivência dos enxertos encontrados foram: 52%, 69%, 78%, 71%, 57% e
76%, respectivamente, da primeira até a sexta re-enxertia.
Para seringueira (Hevea brasiliensis), Muzik & Cruzado (1958) testando o
enraizamento de propágulos oriundos de plantas com uma a cinco enxertias
seriadas (matrizes de 8 a 10 anos de idade), obtiveram em torno de 30% de
enraizamento em oito semanas com estacas coletadas de plantas com a quarta e
quinta re-enxertia. Segundo os mesmos autores, estacas coletadas do clone original
e da primeira, segunda e terceira enxertias, não obtiveram nenhuma resposta para
enraizamento.
O fato de enxertar propágulos adultos de uma planta em porta-enxertos
juvenis promover o rejuvenescimento evidencia a translocação de substâncias da
parte juvenil (porta-enxerto) para a parte adulta (enxerto), induzindo um estádio mais
juvenil nesta última. No entanto, Hackett (1987) salienta que o potencial de
enraizamento (que atualmente ainda é a maior expressão de maturidade ou
juvenilidade) de tecidos juvenis e adultos é uma característica das células do sítio de
iniciação radicial, não sendo, portanto, relacionado à translocação de promotores ou
inibidores.
Alternativamente, o rejuvenescimento pela enxertia seriada realizada em
condições in vitro, denominada de enxertia in vitro ou microenxertia, pode ser obtido
com maior rapidez e eficiência em comparação a enxertia convencional, uma vez
que propágulos com menores dimensões e mais juvenis são utilizados. A
microenxertia ou enxertia in vitro consiste em enxertar, sob condições assépticas,
um meristema ou ápice caulinar sobre um porta-enxerto estabelecido in vitro.
Aplicações da enxertia in vitro, visando o rejuvenescimento de algumas espécies de
plantas, são descritas por diversos autores. Pliego-Alfaro & Murashige (1987) e
Zaczek & Steiner (1997), por exemplo, obtiveram resultados satisfatórios mediante o
uso da enxertia in vitro com explantes coletados de plantas adultas, mostrando a
restauração da competência ao enraizamento para Persea americana e Quercus
rubra. Huang et al. (1996) citam que sucessivas enxertias in vitro, em curtos
intervalos de tempo, a partir de ápices meristemáticos extraídos de tecidos adultos
de Sequoia sempervirens, restauraram características juvenis mais rapidamente,
podendo esta técnica ser aplicada com o propósito de rejuvenescimento.
Kretzschmar & Ewald (1994) e Ewald & Kretzschmar (1996) também confirmaram a
35
influência do rejuvenescimento por meio da enxertia in vitro, em explantes oriundos
de árvores adultas de Larix na propagação clonal desta espécie. Em Eucalyptus,
Bandeira (2004) concluiu que a enxertia in vitro apresenta potencial de aplicação no
rejuvenescimento de clones adultos de interesse comercial.
Rejuvenescimento por Estaquia Seriada Neste processo, propágulos maduros (estacas) são enraizados e a partir de
sua brotação, são coletados novos propágulos (estacas) os quais são novamente
enraizados e, assim, seriadamente, até obter os resultados desejados. Desta forma,
o rejuvenescimento pela estaquia seriada consiste em enraizar em série, propágulos
adultos do clone desejado.
O efeito da confecção de estacas a partir de brotações das estacas
enraizadas em relação ao rejuvenescimento em Eucalyptus spp, resultando em
efeito positivo sobre o enraizamento, foi citado por Eldridge et al. (1994). Segundo
estes autores, resultados satisfatórios no enraizamento de Eucalyptus, decorrentes
do efeito do rejuvenescimento, podem ser obtidos após duas ou mais gerações de
estaquia seriada.
Segundo Wendling (2002), em avaliação da miniestaquia seriada em quatro
clones de Eucalyptus grandis, após sete subcultivos, esta técnica mostrou-se mais
eficiente no rejuvenescimento de clones com menor grau de juvenilidade, para as
características de enraizamento, sobrevivência, vigor radicial e aéreo. O
reaparecimento de características morfológicas juvenis e melhoria no enraizamento
de estacas pelo uso da estaquia seriada, também foi mencionado por Bonga &
Aderkas (1993).
Entretanto, apesar destas citações de uso da estaquia seriada visando o
rejuvenescimento em espécies florestais, ainda existem poucos relatados com base
científica, embora a técnica seja considerada potencial para tal propósito.
Rejuvenescimento por Micropropagação O rejuvenescimento por micropropagação consiste em estabelecer em
cultura in vitro explantes do clone desejado, subcultivar sucessivamente em meio de
cultura adequado com reguladores de crescimento, resultando em plantas com
características mais juvenis.
36
Em muitos casos, os resultados obtidos pelo uso da micropropagação
visando obter efeitos de rejuvenescimento são comparáveis aos da enxertia e
estaquia seriada. Nestas condições, rejuvenescimento parcial tem sido obtido pelos
sucessivos subcultivos de meristemas apicais de brotos micropropagados,
proporcionando melhoria no enraizamento de gemas alongadas in vitro. Segundo
Bonga & Aderkas (1993), após cinco ou seis subcultivos in vitro, clones adultos de
Eucalyptus são considerados suficientemente rejuvenescidos ou com reatividade
capaz de permitir uma subseqüente propagação por estaquia. Entretanto, vale
salientar que as dificuldades inerentes ao processo de micropropagação, bem como,
a própria resposta das espécies à cultura in vitro, proporciona respostas
diferenciadas, onde somente após alguns subcultivos pode-se avaliar a resposta do
rejuvenescimento.
Segundo Franclet et al. (1987), a técnica da micropropagação é eficiente no
rejuvenescimento de propágulos maduros, embora muitas espécies arbóreas
maduras não possam ser micropropagadas em escala comercial, provavelmente em
razão da falta de otimização das condições de cultura in vitro e do número
insuficiente de subcultivos adotados. Em experimento conduzido com explantes de
Sequoia sempervirens coletados de árvores com 50 e 500 anos de idade, esses
autores chegaram à conclusão de que o principal fator de rejuvenescimento pela
micropropagação foi o tempo de exposição dos explantes a citocinina BAP
(benzilaminopurina). Assim, menores períodos entre um subcultivo e outro
aumentaram o rejuvenescimento, principalmente, dos propágulos das árvores de
500 anos.
Uma aplicação direta do rejuvenescimento pela micropropagação seriada na
área florestal é a propagação clonal pela microestaquia, a qual é baseada no
máximo aproveitamento da juvenilidade dos tecidos vegetais, cujo desenvolvimento
e aplicação em Eucalyptus tiveram como origem os trabalhos realizados por Assis et
al. (1992). Na propagação clonal de alguns clones de Eucalytpus pela microestaquia
no Brasil, onde o objetivo principal é a melhoria da performance de enraizamento
das microestacas, resultados satisfatórios têm sido obtidos após 10 a 12 subcultivos
pela micropropagação, onde os efeitos de rejuvenescimento alcançados são
atribuídos principalmente aos subcultivos intensivos e da utilização da citocinina
BAP (benzilaminopurina) nos meios de cultura.
Titon (2001), avaliando a sobrevivência na saída da casa de vegetação,
37
enraizamento na saída da casa de sombra e sobrevivência das mudas aos 50 dias,
observou, em clones de Eucalyptus, resultados superiores na microestaquia em
relação à miniestaquia. Essa diferença foi mais pronunciada em clones com maior
dificuldade de enraizamento, indicando, nesses casos, possível efeito de
rejuvenescimento dos clones com o uso da microestaquia. Para o mesmo
experimento, as mudas oriundas da microestaquia apresentaram altura e diâmetro
de colo aos 50 dias e peso de matéria seca de raiz aos 28 dias iguais ou superiores
aos da miniestaquia, reforçando a suposição de maior grau de juvenilidade das
microestacas em detrimento das miniestacas.
Também resultados de pesquisa obtidos por Xavier et al. (2001) apontaram
a eficiência do rejuvenescimento de dois clones híbridos de Eucalyptus grandis pela
micropropagação, a qual foi constatada pela superioridade dos resultados obtidos
na microestaquia sobre a miniestaquia, em relação ao percentual e velocidade de
enraizamento. No entanto, tem sido constatado que após algum período de coleta
de microestacas nas microcepas, estas têm perdido gradativamente o grau de
juvenilidade obtido pelo rejuvenescimento quanto ao enraizamento, indicando que o
rejuvenescimento obtido pela micropropagação não é permanente. Da mesma
forma, o uso de mudas de microestacas não reproduz os mesmos efeitos de
juvenilidade das mudas de micropropagação.
Apesar das dificuldades encontradas para propagação clonal pela
micropropagação de clones de Eucalyptus, esta tem sido considerada como a
principal técnica potencial para incrementar o enraizamento de gemas alongadas in
vitro, principalmente devido aos recentes avanços com plantas transgênicas,
embriogênese somática e a tecnologia de sementes sintéticas usadas para restaurar
a condição juvenil de plantas fisiologicamente maduras.
De modo geral, a micropropagação tem sido considerada como uma técnica
com grande potencial no rejuvenescimento de espécies florestais. Entretanto, esta
técnica ainda carece de desenvolvimento científico para sua plena utilização, além
de ser uma técnica onerosa e exigir mão-de-obra especializada.
Revigoramento Vegetativo De forma geral, pode-se caracterizar o revigoramento como certas práticas
culturais visando propiciar maior vigor fisiológico em brotações da planta de tal forma
38
que proporcione propágulos vegetativos vigorosos e responsivos à propagação
clonal.
Existem inúmeras formas de se obter o revigoramento vegetativo, sendo que
uma das principais utilizadas na silvicultura clonal é pelas podas drásticas ou corte
raso. Neste processo, propágulos juvenis são obtidos pelo abate de árvores adultas
selecionadas buscando induzir o crescimento de gemas dormentes existentes na
base da cepa. Este procedimento de obtenção de propágulos vegetativos está
baseado no fato de que as características juvenis são mantidas naquela porção de
crescimento da árvore. Assim, com base no gradiente de juvenilidade em árvores,
brotações juvenis surgem a partir das gemas dormentes presentes na porção da
cepa remanescente, após serem dadas às condições para crescimento em função
da retirada do efeito de dominância apical exercido pela parte aérea decepada pelo
abate da árvore. Este sistema tem sido usado com sucesso na produção de estacas
mais juvenis de Eucalyptus, onde após a decepa da árvore, as brotações obtidas
são utilizadas como a base para a propagação clonal comercial desta espécie.
Outras formas de obtenção de brotações juvenis como o anelamento e o uso do
fogo na base da planta matriz também são citadas (ALFENAS et al., 2004).
O revigoramento por tratos silviculturais também tem sido adotado com
eficiência no processo de propagação clonal. Dentre estes, citam-se adubações,
irrigações e manejo direcionado para a obtenção de maior número possível de
brotações vigorosas.
Outra forma de revigoramento em plantas são as podas sucessivas, as quais
visam aumentar a produção de propágulos vigorosos e manter a juvenilidade dos
mesmos. Este procedimento é o que vem sendo adotado em jardins clonais, nos
seus diferentes sistemas de manejo das cepas, em que as mesmas são mantidas
baixas para produção de brotações juvenis aptas para a formação de propágulos
com bom potencial de enraizamento.
O melhor conhecimento das exigências nutricionais, hídricas e de manejo
dos clones componentes de programas de silvicultura clonal também leva à
formação de brotações mais vigorosas e aptas para o processo de propagação
vegetativa. Em Eucalyptus, isto se comprova pelo fato de que clones com maior
tempo no programa de clonagem respondem melhor ao enraizamento e formação
das mudas, visto seu melhor conhecimento e ajuste mais refinado de suas
exigências.
39
Em algumas situações, ocorre certa confusão entre revigoramento e
rejuvenescimento, em que revigoramento refere-se ao vigor fisiológico
proporcionado pela prática adotada, enquanto que o rejuvenescimento obtido pelas
diferentes técnicas citadas anteriormente buscam a obtenção de uma reversão da
maturação para uma condição mais juvenil.
Efeito “C” (Efeito da “Clonagem”)
O “efeito C” ou “efeito da clonagem”, amplamente conhecido no setor
florestal, refere-se aos efeitos não genéticos, decorrentes das interações de ações
no processo de produção de mudas, interações com o meio ambiente, interação
nutricional e fisiológica (efeito ciclófise e topófise), o qual modifica a resposta
esperada na clonagem, ou seja, crescimento por igual das plantas originárias de um
mesmo clone.
Segundo Scarassati (1993), o efeito “C” que causa esta alteração nos clones
não pode e não deve ser visto como uma anomalia do desenvolvimento da planta,
mas sim como um fator que não pode ser controlado durante o processo e, ou que
por falta de conhecimento adequado, não é controlado. De forma geral, o efeito “C”
pode ser agrupado em efeito decorrente das variações ambientais, variações no
padrão de qualidade das mudas produzidas e dos aspectos de morfologia e
fisiologia dos propágulos vegetativos utilizados na propagação clonal.
Entre os efeitos ambientais, pode-se citar aqueles relacionados com a
densidade de plantio, competição nutricional, diferenças entre a região de seleção e
a região do plantio do clone (interação clone x ambiente), idade de avaliação, entre
outros. Quantos aos efeitos decorrentes do padrão de qualidade das mudas, estes
são aqueles atribuídos a desuniformidade no processo de produção das mesmas,
levando a heterogeneidade na sua qualidade, gerando padrões de respostas de
crescimento desiguais no futuro plantio clonal.
O efeito “C” decorrente dos aspectos de morfologia e fisiologia dos
propágulos vegetativos recai, principalmente, sobre os efeitos ciclófise e topófise.
Com o advento das técnicas de miniestaquia e microestaquia, as variações em
40
termos morfológicos e fisiológicos entre mudas de um mesmo clone têm sido
reduzidas (diminuição do efeito “C”) em virtude de uma menor variação nos padrões
de propágulos utilizados.
Frampton & Foster (1993) citaram que o efeito “C” tem merecido a atenção
da comunidade científica e a sua quantificação tem sido realizada por diversas
maneiras, como a instalação de testes clonais visando mensurar a magnitude do
efeito “C” decorrente do efeito da idade ontogenética.
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