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Estudo da adsorção de péptidos a suportes de interacção hidrofóbica sob
condições cromatográficas de não sobrecarga
Catherine Augusta Nunes
Covilhã, Setembro de 2008
UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE DDAA
BBEEIIRRAA IINNTTEERRIIOORR
UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
Estudo da adsorção de péptidos a suportes de interacção hidrofóbica sob
condições cromatográficas de não sobrecarga
Dissertação apresentada à Universidade da Beira Interior para obtenção do grau de Mestre em Bioquímica sob a orientação da Professora Dra. Ana Cristina Mendes Dias Cabral
Catherine Augusta Nunes
Covilhã, Setembro de 2008
ii
Agradecimentos
À minha orientadora, Professora Doutora Ana Cristina Mendes Dias Cabral, do
CICS e Departamento de Química da Universidade da Beira Interior, pelo apoio
científico, disponibilidade e incentivo na execução deste trabalho.
Ao Professor Doutor João Queiroz, uma vez que sem o seu apoio e
conhecimento científico este trabalho não era possível de ser executado.
À Dr.ª Fani e ao Prof. Dr. Luís pela disponibilidade, ajuda, boa disposição e
amizade durante a realização deste trabalho experimental.
A todos os meus colegas de laboratório e principalmente às minhas amigas
Ângela, Filomena, Sandra e também a Susana, Ana, Sara, Joana e Cristina e aos meus
amigos Bruno, César e Tiago que me apoiaram, incentivaram e me ajudaram durante a
execução deste trabalho experimental. Agradeço por toda a amizade durante estes anos,
e pelos momentos bons e difíceis no laboratório.
Aos meus pais, irmãos, família e namorado que nunca deixaram de acreditar em
mim, e pelo amor que me transmitiram durante estes anos.
Por último agradeço à Universidade da Beira Interior e ao CICS (Centro de
Investigação em Ciências da Saúde).
iii
Resumo
Para explicar o mecanismo de adsorção subjacente à HIC da Angiotensina I foi
efectuada a técnica sob condições lineares. As medidas experimentais foram realizadas
em função do tipo de sal e sua concentração, da temperatura e do tipo de ligando no
adsorvente para a Angiotensina I e seus derivados.
Sob condições isocráticas e a elevadas concentrações de sal, uma característica
da performance da Angiotensina I foi o “broadening” do pico e em muitos dos casos o
aparecimento de dois picos. Estes resultados foram interpretados em termos da
isomerização cis-trans da Angiotensina I (polipéptido com um resíduo de prolina) na
coluna seguida de uma “re-conformação” após interacção com o suporte. Foi proposto
que o fenómeno de pico “splitting”, o efeito combinado entre a temperatura,
concentração de sal na fase móvel e o ligando na fase estacionária é causado por
cinética de isomerização lenta que se encontram na mesma escala de tempo que a
separação cromatográfica. A concentração de sal e a temperatura promovem a
conversão da forma trans da Angiotensina I na forma cis, que tem uma maior área
superficial hidrofóbica, em presença do suporte. A retenção da forma trans da
Angiotensina I aumenta de uma força geral com o aumento da concentração de sal na
fase móvel e é afectada ligeiramente pelo efeito da temperatura.
Para além do suporte Butyl-Sepharose referido acima também foram
examinados mais dois suportes hidrofóbicos (Phenyl-Sepharose e Octyl-Sepharose). O
estudo do comportamento da Angiotensina I com os vários suportes indicou um
aumento de retenção com o aumento do comprimento da cadeia n-alquilo do ligando,
observando-se que o ligando aromático phenyl promove a alteração de conformação
(isomerização cis-trans) da Angiotensina I a concentrações salinas mais baixas que nos
outros suportes. Os suportes foram considerados como catalisadores do processo de
isomerização cis-trans.
Outro factor também estudado foi a substituição de aminoácidos em posições
distintas da Angiotensina I para utilização em HIC usando a Butyl-Sepharose e tendo
em conta o efeito da concentração de sulfato de amónio. Estes resultados demonstraram
que tanto os aminoácidos da posição 5 como da posição 10 da Angiotensina I se
encontram envolvidos na interacção hidrofóbica.
iv
Com base neste trabalho consideramos que a Angiotensina I pode ser um
péptido modelo para estudos posteriores em HIC.
v
Abstract
In order to explain the mechanism underlying the HIC adsorption of Angiotensin
I the technique was run under linear conditions. The experimental measures were done
as function of salt type, its concentration, temperature and type of adsorbent ligand
using as prove peptide Angiotensin I and its derivatives.
Under isocratic elution conditions and at the higher salt concentrations, a
characteristic of the chromatographic performance of Angiotensin I was the broadness
of the corresponding peak and in most of the cases the appearance of two peaks. These
results have been interpreted in terms of on-column cis-trans isomerization of
Angiotensin I (a proline containing polypeptide) followed by its “re-conformation” after
the interaction with the support. It has been proposed that the peak splitting
phenomenon, a combined effect between temperature, salt concentration in the mobile
phase and the ligand, is caused by slow kinetics of isomerization that is on the same
time scale as the chromatographic separation. Salt concentration and temperature
promotes the conversion of the trans form of Angiotensin I into its cis form, which has
a bigger hydrophobic surface area, in presence of Butyl- Sepharose. The retention of the
cis form of Angiotensin I increase with the increase of salt concentration in the mobile
phase and seem not to be affected by temperature. It was further proved that
Angiotensin I is only retarded on the column and not retained.
Besides the Butyl-Sepharose support above mentioned two more hydrophobic
supports (Phenyl-Sepharose and Octyl-Sepharose) were also examined. The study of the
behaviour of Angiotensin I with the various supports indicated an increase of retention
with the increase of the n-alkyl chain length. It was observed the phenyl aromatic ligand
promotes Angiotensin I conformation alteration at lower salt concentration than the
other supports. The supports were considered as catalyst for the isomerization process.
Another factor, also studied was the amino acids replacement in different
positions of Angiotensin I. These results of the adsorption of these peptides in a Butyl-
Sepharose column as function of ammonium sulphate concentrations demonstrated that
both, the amino acids in position 5 and 10 of Angiotensin I, are involved in the
hydrophobic interaction.
Based on this work it can be considered that the Angiotensin I is a good peptide
model for further studies in HIC.
vi
Palavras-Chave / Keywords
Cromatografia de interacção hidrofóbica / Hydrophobic Interaction Chromatography
Condições cromatográficas lineares/ Linear chromatographic conditions
Alteração de conformação/ Conformational changes
Phenil-Sepharose / Phenyl-Sepharose
Butil-Sepharose/ Butyl-Sepharose
Octil-Sepharose/ Octyl-Sepharose
Adsorção / Adsorption
Angiotensina I Humana / Human Angiotensin I
vii
Nomenclatura
ADH – Hormona anti-diurética
AS – Área à superfície da fase estacionária
CD – Dicroismo circular
CM – Concentração de um componente na fase móvel
CS – Concentração de um componente na fase estacionária
dc – Diâmetro da coluna
dp – Diâmetro da partícula
Df – Espessura da fase estacionária
DM – Coeficiente de difusão das moléculas de soluto na fase móvel
DS – Taxa de difusão do soluto na fase estacionária
DSC – Calorimetria diferencial de varrimento
FT-IR – Espectroscopia de infravermelhos com transformada de Fourier
h – Altura do pico
H – Cavidade hidrofóbica na superfície da molécula de soluto
HIC – Cromatografia de interacção hidrofóbica
His – Histidina
HPLC – Cromatografia líquida de alta pressão
Ile – Isoleucina
k – Constante de Bolzman
k’ – Factor de capacidade ou de retenção
K – Kelvin
KA – Coeficiente de adsorção
KC – coeficiente de distribuição
L – Ligando da matriz polimérica ou comprimento da coluna
Leu – Leucina
nM – Número de moles de um componente na fase móvel
nS – Número de moles de um componente na fase estacionária
N – Número de pratos teóricos
NMR – Ressonância magnética nuclear
Phe – Fenilalanina
Pro – Prolina
R – Constante dos gases ideais ou factor de retardamento
viii
RPC – Cromatografia líquida de fase reversa
Rs – Resolução
S – Molécula de soluto
t0 – Tempo de eluição do traço “inerte” , tS – Tempo de retenção de componentes não retidos
na coluna ou na fase estacionária
tM – Tempo de retenção de componentes não retidos na coluna ou na fase móvel
tr – Tempo de retenção
t’R – Tempo de retenção ajustado
T – Temperatura
Thr – Treonina
Tyr – Tirosina
ū – Taxa de fluxo linear da fase móvel.
V’R – Volume de retenção exacto
Val – Valina
VM – Volume de retenção da biomolécula não retida na coluna ou volume da fase móvel
VR – Volume de retenção
VS – Volume de um componente na fase estacionária
w – Largura do pico
wh – Meia altura do pico
W – Molécula de água
Z – Número de moléculas de água libertadas por biomolécula adsorvida
Símbolos gregos
α – Retenção relativa
∆G – Variação da energia de Gibbs
∆Gº – Variação da energia de Gibbs padrão
∆H – Variação de entalpia
∆S – Variação de entropia
λ – Constante de empacotamento
σ – Desvio padrão do pico Gaussiano
σ2– Variância do pico Gaussiano
φ – Razão de fases na coluna
Ψ – Factor de obstrução
ix
Índice
Agradecimentos - - - - - - - - - - ii
Resumo - - - - - - - - - - - iii
Abstract - - - - - - - - - - - v
Palavras-Chave/Keywords - - - - - - - - - vi
Nomenclatura - - - - - - - - - - - vii
Índice - - - - - - - - - - - - ix
Índice de figuras - - - - - - - - - - xi
Índice de tabelas - - - - - - - - - - xvi
1. Introdução - - - - - - - - - - - 1
1.1. Princípios sobre a cromatografia de interacção hidrofóbica - - - 2
1.1.1.Hidrofobicidade das biomoléculas e interacções hidrofóbicas - 3
1.1.2.Exemplos de alguns factores que afectam o comportamento
cromatográfico das biomoléculas em cromatografia de interacção
hidrofóbica - - - - - - - - - - 4
i) Efeito do tipo e concentração de sal - - - - 5
ii) Efeito da temperatura - - - - - - 8
iii) Efeito do ligando - - - - - - - 9
1.2. Princípios teóricos de cromatografia líquida - - - - - 10
1.2.1. O problema geral de eluição - - - - - - 10
1.2.2. Retenção cromatográfica - - - - - - 11
1.2.3. A forma do pico - - - - - - - 15
i) Difusão turbulenta - - - - - - - 17
ii) Difusão longitudinal - - - - - - 18
iii) Transferência de massa - - - - - - 18
iv) Dispersão extra-coluna - - - - - - 20
1.2.4. Resolução - - - - - - - - 20
1.3.O papel da estrutura das biomoléculas no comportamento cromatográfico - 22
1.3.1. Resíduos que controlam a retenção - - - - - 22
1.3.2. Região de contacto cromatográfica - - - - - 23
1.3.3. Comportamento cromatográfico e alterações de conformação - 24
x
1.3.4. Exemplos de algumas técnicas usadas para caracterizar a estrutura
das proteínas em cromatografia - - - - - - - 27
1.4. Métodos para medição da hidrofobicidade dos aminoácidos e a sua interacção 29
1.4.1. Tipos de escalas de hidrofobicidade dos aminoácidos - - 29
1.4.2. Métodos para o estudo das interacções - - - - 34
1.5. Aspectos gerais dos péptidos utilizados - - - - - - 35
1.5.1. Angiotensina I - - - - - - - - 36
1.5.2. Péptidos derivados da Angiotensina I - - - - - 38
1.6. Aspectos gerais dos suportes utilizados em HIC - - - - 39
2. Objectivos - - - - - - - - - - - 41
3.Procedimento Experimental - - - - - - - - 42
3.1. Reagentes - - - - - - - - - - 42
3.1.1. Fase estacionária - - - - - - - 42
3.1.2. Péptidos - - - - - - - - 43
3.1.3. Outros reagentes - - - - - - - 45
3.2. Instrumentação - - - - - - - - - 46
3.2.1. Equipamento - - - - - - - - 46
3.2.2. Eluição isocrática - - - - - - - 47
4. Resultados e Discussão - - - - - - - - - 48
4.1. Adsorção da Angiotensina I em Butyl-Sepharose - - - - 48
4.1.1. Interpretação das curvas cromatográficas - - - - 48
4.1.2. Efeito do tipo e concentração de sal - - - - - 57
4.1.3. Efeito da temperatura - - - - - - - 62
4.2. Efeito do tipo de ligando na adsorção da Angiotensina I - - - 66
4.3. Adsorção de péptidos derivados da Angiotensina I em Butyl-Sepharose - 74
5. Conclusões - - - - - - - - - - - 79
6.Perpectivas futuras - - - - - - - - - - 81
7.Bibliografia - - - - - - - - - - - 82
Anexos - - - - - - - - - - - 94
xi
Índice de figuras
Figura 1.1: Representação esquemática do processo de HIC. L – Ligando da matriz
polimérica, H – Cavidade hidrofóbica na superfície da molécula de soluto, S – Molécula de
soluto, W – molécula de água. ------------------------------------------------------------------------- 4
Figura 1.2: Série de Hofmeister e efeitos de alguns aniões e catiões na precipitação das
proteínas. -------------------------------------------------------------------------------------------------- 5
Figura 1.3: Representação esquemática do processo de adsorção e desorção em HIC.
Ligando hidrofóbico, Molécula de proteína. -------------------------------------------- 7
Figura 1.4: Representação esquemática do problema geral de eluição em cromatografia
líquida. k - factor de retenção.--------------------------------------------------------------------------10
Figura 1.5: Figura representativa da separação de uma mistura de componentes evidenciando
diferentes parâmetros de retenção. tR1 e tR2 - tempo de retenção da mistura de dois
componentes, tM - tempo de retenção de um composto não retido, h - altura do pico e wh –
meia altura do pico. -------------------------------------------------------------------------------------12
Figura 1.6: Figura representativa da forma da isotérmica de adsorção e os efeitos na forma do
pico e tempos de retenção (tR). (A) Linear; (B) Langmuir; (C) Anti-Langmuir; (D) Gaussian;
(E) tailing; (F) Frente. ----------------------------------------------------------------------------------16
Figura 1.7: Representação de Van Deemter para cromatografia líquida. Variação dos termos
A, B, CS e CM com a taxa de fluxo.--------------------------------------------------------------------17
Figura 1.8: Estrutura da Angiotensina I. Os potenciais electrostáticos à superfície molecular
estão codificados por cores: potenciais menores que -10 kT estão ilustrados a vermelho,
potenciais superiores a 10 kT estão a azul e potenciais neutros (0 kT ) estão a branco (k é a
constante de Boltzmann, 1,380622 x10-23 J/K e T é a temperatura absoluta).------------------37
xii
Figura 1.9: Estrutura da Phenyl-Sepharose High Performance, Butyl-Sepharose 4 Fast Flow,
e Octyl- Sepharose CL-4B respectivamente. --------------------------------------------------------40
Figura 3.1: Figura representativa do sistema cromatográfico AKTA PURIFIER. ------------46
Figura 4.1: Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025
mg/ml) numa coluna Butyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador diferentes
concentrações de (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7.------------------------------48
Figura 4.2: Cromatografia de interacção hidrofóbica (1ml/min) da Angiotensina I (0,025
mg/ml) numa coluna Butyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,2
M (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7.------------------------------------------------49
Figura 4.3.A: Cromatografia de interacção hidrofóbica (0,5ml/min) da Angiotensina I (0,075
mg/ml) numa coluna de Butyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador 1,2 M de
(NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7. ---------------------------------------------------49
Figura 4.3.B: Reinjecção (0,5 ml/min) das fracções colectadas da adsorção de Angiotensina I
(0,075 mg/ml) numa coluna de Butyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador 1,2 M
de (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7 ─ Reinjecção do pico I; ─ Reinjecção do
pico II. o fosfato, pH 7.. --------------------------------------------------------------------------------50
Figura 4.4: Perfil da eluição (1ml/min) de diferentes concentrações de Angiotensina I numa
coluna Butyl-Sepharose a 298.15 K com 1,2 M de (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato,
pH 7. -------------------------------------------------------------------------------------------------------52
Figura 4.5: Efeito da taxa de fluxo na forma dos picos resultantes da adsorção da
Angiotensina I a uma coluna de Butyl-Sepharose a 298.15 K em presença de 1,2 M de
(NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7. ---------------------------------------------------53
Figura 4.6.A: Cromatografia da interacção hidrofóbica (1 ml/min) da [Valina 7] –
Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa coluna Butyl-Sepharose a 298 K em presença de 1,2 M
(NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7. ---------------------------------------------------55
xiii
Figura 4.6.B: Regeneração da coluna (1 ml/min) após eluição da [Valina 7] – Angiotensina I
(0,025 mg/ml) de uma coluna de Butyl-Sepharose a 298 K com 10 mM de tampão fosfato,
pH 7. -------------------------------------------------------------------------------------------------------56
Figura 4.7: Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025
mg/ml) numa coluna Butyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador diferentes
concentrações de (Na2SO4) em 10mM de tampão fosfato, pH 7. --------------------------------57
Figura 4.8: Deconvolução do cromatograma de interacção hidrofóbica da Angiotensina I
numa coluna Butyl-Sepharose, 298.15 K a 1,2 M (NH4)2SO4 em 10 mM de fosfato, pH 7.
Cromatograma real; Picos individuais depois da deconvolução; Cromatograma soma
de picos após deconvolução. ---------------------------------------------------------------------------58
Figura 4.9: Regeneração da coluna (1ml/min) após eluição da Angiotensina I (0,025 mg/ml)
de uma coluna de Butyl-Sepharose a 298.15 K e diferentes concentrações de (NH4)2SO4 pH
7. -----------------------------------------------------------------------------------------------------------61
Figura 4.10: Regeneração da coluna (1ml/min) após equilíbrio da coluna de Butyl-Sepharose
a 298. 15 K com diferentes concentrações de (NH4)2SO4 pH 7. ----------------------------------62
Figura 4.11: Cromatografia de interacção hidrofóbica (1ml/min) da Angiotensina I (0,025
mg/ml) numa coluna Butyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,0
M (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7. ------------------------------------------------63
Figura 4.12: Cromatografia de interacção hidrofóbica (1ml/min) da Angiotensina I (0,025
mg/ml) numa coluna Butyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,0
M Na2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7. ----------------------------------------------------64
Figura 4.13: Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025
mg/ml) numa coluna Phenyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador diferentes
concentrações de (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7. ------------------------------67
xiv
Figura 4.14: Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025
mg/ml) numa coluna Octyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador diferentes
concentrações de (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7. ------------------------------67
Figura 4.15: Cromatografia de interacção hidrofóbica (1ml/min) da Angiotensina I (0,025
mg/ml) numa coluna Phenyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador
0,9 M (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7. -------------------------------------------68
Figura 4.16: Cromatografia de interacção hidrofóbica (1ml/min) da Angiotensina I (0,025
mg/ml) numa coluna Octyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,4
M (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7. ------------------------------------------------68
Figura 4.17: Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025
mg/ml) numa coluna de Phenyl-Sepharose, Butyl-Sepharose e Octyl-Sepharose a 298.15 K
usando como modelador diferentes concentrações de (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão
fosfato, pH 7. ---------------------------------------------------------------------------------------------72
Figura 4.18: Efeito da substituição da leucina 10 pela isoleucina, alanina e valina e
substituição da isoleucina 5 pela valina na Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa coluna Butyl-
Sepharose usando como modelador 1,2 M (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7 a
298 K. -----------------------------------------------------------------------------------------------------75
Figura 4.19: Efeito da substituição da leucina 10 pela isoleucina, alanina e valina e
substituição da isoleucina 5 pela valina na Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa coluna Butyl-
Sepharose usando como modelador 1,5 M (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7 a
298 K. -----------------------------------------------------------------------------------------------------76
Figura A1: Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025
mg/ml) numa coluna de Phenyl-Sepharose, Butyl-Sepharose e Octyl-Sepharose a 298.15 K
usando como modelador 0,7 M de (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7 a 298
K.kk --------------------------------------------------------------------------------------------------------94
xv
Figura A2: Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025
mg/ml) numa coluna de Phenyl-Sepharose, Butyl-Sepharose e Octyl-Sepharose a 298.15 K
usando como modelador 0,9 M de (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7 a 298
K.kk ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 94
xvi
Índice de tabelas
Tabela 3.1: Características da Phenyl-Sepharose High Performance. ---------------------------42
Tabela 3.2: Características da Butyl-Sepharose 4 Fast Flow. -------------------------------------42
Tabela 3.3: Características da Octyl-Sepharose CL-4B. -------------------------------------------43
Tabela 3.4: Características dos péptidos usados. ---------------------------------------------------44
Tabela 3.5: Apresentação dos valores de hidrofobicidade a pH 6.8 dos vários péptidos
estudados. -------------------------------------------------------------------------------------------------44
Tabela 3.6: Reagentes utilizados na técnica de cromatografia de interacção hidrofóbica. ---45
Tabela 4.1: Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna de
Butyl-Sepharose usando como modelador diferentes concentrações de [(NH4)2SO4]
preparadas em tampão fosfato, pH 7 a 298 K. ------------------------------------------------------59
Tabela 4.2: Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna de
Butyl-Sepharose usando como modelador diferentes concentrações de [Na2SO4] preparadas
em tampão fosfato, pH 7, a 298 K. -------------------------------------------------------------------59
Tabela 4.3: Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna de
Butyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,2 M de [(NH4)2SO4]
em tampão fosfato, pH 7. ------------------------------------------------------------------------------64
Tabela 4.4: Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna de
Butyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,0 M de [(NH4)2SO4])
em tampão fosfato, pH 7. ------------------------------------------------------------------------------65
xvii
Tabela 4.5: Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna de
Butyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,0 M de [Na2SO4] em
tampão fosfato, pH 7. -----------------------------------------------------------------------------------65
Tabela 4.6: Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna
Phenyl-Sepharose usando como modelador diferentes concentrações de [(NH4)2SO4]
preparadas em tampão fosfato, pH 7 a 298 K. ------------------------------------------------------69
Tabela 4.7: Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna
Octyl-Sepharose usando como modelador diferentes concentrações de [(NH4)2SO4]
preparadas em tampão fosfato, pH 7 a 298 K. ------------------------------------------------------70
Tabela 4.8: Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna
Phenyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 0,9 M de [(NH4)2SO4]
em tampão fosfato, pH 7. ------------------------------------------------------------------------------71
Tabela 4.9: Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna
Octyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1.4 M de [(NH4)2SO4]
em tampão fosfato, pH 7. ------------------------------------------------------------------------------71
Tabela 4.10: Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna
de Phenyl, Butyl e Octyl-Sepharose a diferentes concentrações de [(NH4)2SO4] em tampão
fosfato, pH 7 a 298 K. ----------------------------------------------------------------------------------73
Tabela 4.11: Valores de k’ da retenção dos péptidos derivados da Angiotensina I, numa
coluna de Butyl-Sepharose usando como modelador 1,2 M de [(NH4)2SO4] em tampão
fosfato , pH 7 a 298 K. ---------------------------------------------------------------------------------77
Tabela 4.12: Valores de k’ da retenção dos péptidos derivados da Angiotensina I, numa
coluna de Butyl-Sepharose usando como modelador 1,5 M de [(NH4)2SO4] em tampão
fosfato , pH 7 a 298 K. ---------------------------------------------------------------------------------78
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 1
1. Introdução
O desenvolvimento de técnicas e métodos de separação e purificação de
biomoléculas tem sido considerado bastante essencial para os avanços recentes da
investigação em biotecnologia.
O objectivo principal do processo de purificação de biomoléculas não inclui
somente a remoção de contaminantes indesejados mas também a concentração da
biomolécula desejada, na sua forma final para a aplicação pretendida, e a sua
transferência para um ambiente onde é estável.
A pureza das biomoléculas é um pré-requisito para os estudos acerca da sua
estrutura e função ou da sua aplicação. O grau de pureza requerido depende do seu uso
final.
Existem variadas técnicas de purificação de biomoléculas, contudo diferentes
tipos de cromatografia têm-se tornado dominantes devido ao seu poder de resolução
(Queiroz et al., 2001). A popularidade das técnicas cromatográficas pode ser atribuída à
sua versatilidade. Várias fases estacionárias podem ser obtidas comercialmente. Cada
fase estacionária tem a habilidade de separar analitos explorando a afinidade que cada
analito tem para com os diferentes ligandos imobilizados à superfície da fase
estacionária. Por outro lado, a composição da fase móvel e/ou pH são variáveis chave
que também podem ser exploradas de modo a obter a purificação do produto pretendido
(Thrash e Pinto, 2000)
Diferentes mecanismos de adsorção estão na base da separação de solutos por
uma variedade de processos de interacção cromatográfica. Na cromatografia de filtração
em gel, cromatografia de troca iónica, cromatografia de afinidade e cromatografia de
interacção hidrofóbica, a separação das biomoléculas é feita com base nas suas
propriedades biológicas e físico-químicas como é o caso respectivamente do tamanho
molecular, das suas cargas, das suas características bioespecíficas e da sua
hidrofobicidade (Kennedy, 1990; Garcia e Pires, 1993).
Durante os últimos anos, a cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC) tem
sido desenvolvida por muitos investigadores e hoje em dia encontra-se estabelecida
como uma poderosa técnica de bioseparação, tanto à escala laboratorial como à escala
industrial, para a purificação de biomoléculas (Wu e Karger, 1996; Sofer e Hagel, 1997;
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 2
Grund, 1998). Este método é bastante eficaz na remoção de vírus de plasma humano, no
isolamento de enzimas bacterianas, na purificação de proteínas e de anticorpos
monoclonais (Einarsson et al., 1981; Gagnon et al., 1995; Pfeiffer, 1995; Diogo et al.,
2000; Thrash e Pinto, 2000; Queiroz et al., 2001) e plasmídeos para aplicações
terapêuticas (Diogo et al., 2000).
1.1. Princípios sobre a cromatografia de interacção hidrofóbica
A HIC promove a separação de biomoléculas com base na interacção
hidrofóbica entre ligandos hidrofóbicos imobilizados no suporte e regiões apolares
existentes à superfície das biomoléculas (Queiroz et al., 2001).
Os diferentes tipos de condições para que a eluição ocorra podem ser usados
para a purificação de misturas complexas de biomoléculas que poderão ser bastante
difíceis de separar aplicando outra técnica cromatográfica (Queiroz et al., 2001). De
facto, a HIC tem sido usada com a finalidade de separar as biomoléculas e exibe
características de ligação complementares a outras técnicas cromatográficas (Janson e
Rydén, 1993). Van Oss et al., (1986) propuseram que as forças de Van der Waals são o
factor que mais contribui para as interacções hidrofóbicas apesar do mecanismo
complexo que as envolve. Nesta técnica os danos estruturais das biomoléculas são
mínimos e a sua actividade biológica é mantida devido às suas interacções fracas o que
não se verifica noutras técnicas tais como a cromatografia de afinidade, troca iónica ou
cromatografia de fase reversa (Fausnaugh et al., 1984; Regnier, 1987). A HIC é uma
técnica muito popular na medição da hidrofobicidade do soluto uma vez, que explora as
propriedades hidrofóbicas das biomoléculas, trabalhando num ambiente mais polar e
menos desnaturante do que a cromatografia de fase reversa (RPC), dado que esta requer
o uso de solventes apolares para eluir a proteína devido à sua forte ligação ao
adsorvente (El Rassi, 1996).
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 3
1.1.1. Hidrofobicidade das biomoléculas e interacções hidrofóbicas
A hidrofobicidade é a repulsão entre os compostos apolares e o ambiente polar
como é o caso da água (Queiroz et al., 2001). Este termo é também usado para referir os
modelos moleculares, geralmente envolvendo a ordem das moléculas de água que
rodeiam os solutos apolares (Dill, 1990a). Quando um composto apolar é inserido em
água, ocorre um aumento da ordem das moléculas de água que se encontram à volta dos
seus grupos hidrofóbicos levando a uma diminuição de entropia (∆S<0). Se a alteração
da entalpia (∆H) é pequena em relação ao valor de T∆S, resulta numa mudança positiva
do valor da energia de Gibbs (∆G>0) de acordo com a seguinte equação:
STHG ∆−∆=∆ (1)
onde ∆H e ∆S é a variação de entalpia e entropia, respectivamente, e T é a temperatura
absoluta. Este processo não ocorre de forma espontânea, pois seria termodinamicamente
desfavorável (Queiroz et al., 2001).
Quando vários compostos apolares são colocados em água, estes associam-se
espontaneamente devido às interacções hidrofóbicas levando a um aumento de entropia
(∆S>0), o qual resulta da diminuição do número de moléculas de água ordenadas em
torno dos grupos hidrofóbicos devido à diminuição da exposição destes grupos à água
(Queiroz et al., 2001). (figura 1.1). A associação intermolecular de grupos hidrofóbicos
minimiza o aumento da energia de Gibbs por diminuição da área de contacto das
proteínas com solventes polares (Queiroz et al., 2001).
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 4
Figura 1.1. Representação esquemática do processo de HIC. L – Ligando da matriz polimérica, H –
Cavidade hidrofóbica na superfície da molécula de soluto, S – Molécula de soluto, W – molécula de água.
(Representação esquemática adaptado de “Hydrophobic Interaction Chromatography”. Principles and
Methods” Amersham Bioscience (Uppsala Sweden)).
1.1.2. Exemplos de alguns factores que afectam o comportamento cromatográfico
das biomoléculas em cromatografia de interacção hidrofóbica
Na HIC, a retenção das proteínas é principalmente afectada pela hidrofobicidade
das biomoléculas (Fausnaugh et al., 1984; Lienqueo et al., 2002; Queiroz et al., 2001) e
especialmente pela distribuição de hidrofobicidade à sua superfície (Mahn et al., 2005;
Mahn et al., 2004). No entanto, as condições de funcionalidade obviamente também
afectam o comportamento cromatográfico das proteínas na HIC (Jennissen, 2005;
Ladiwala et al., 2006; Queiroz et al., 2001) numa grande extensão. As propriedades da
fase móvel (tipo de sal, força iónica, pH), as características da fase estacionária
(natureza química do suporte, tipo de ligando hidrofóbico, comprimento da cadeia e
grau de substituição do ligando) e a temperatura são factores que afectam geralmente o
comportamento cromatográfico das biomoléculas em HIC.
Neste ponto vamo-nos debruçar apenas sobre alguns factores, nomeadamente o
efeito do tipo e concentração de sal, o efeito da temperatura e o efeito do ligando.
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 5
Aumento do efeito “salting-out”
Aumento do efeito “salting-in”
i) Efeito do tipo e concentração de sal
Tiselius (1948) foi o primeiro investigador a aplicar o termo “ cromatografia por
salting-out”. Este autor demonstrou que os aminoácidos e as proteínas ligam-se a
suportes sólidos neutros com concentrações elevadas de fosfatos alcalinos. A
denominação de HIC foi introduzida por Hjertén (1973) para descrever a separação de
biomoléculas tendo em conta o efeito do sal numa matriz hidrofóbica. Porath et al.,
(1973) provou que a adsorção hidrofóbica é reforçada pela adição de cloreto de sódio ou
fosfato de sódio numa solução tampão.
O efeito do tipo de sal na retenção das proteínas tem sido fortemente
investigado, e foi demonstrado que segue a série de Hofmeister (figura 1.2) para a
precipitação das proteínas em soluções aquosas (Jennissen 2005; Melander e Horvath,
1977; Jennissen, 1986).
Figura 1.2. Série de Hofmeister e efeitos de alguns aniões e catiões na precipitação das proteínas
(Pombeiro, 1998).
Na série de Hofmeister (figura 1.2), os sais caotrópicos (cloreto de magnésio e
sulfato de magnésio) promovem a solubilidade das biomoléculas e assim tendem a
diminuir a força da interacção hidrofóbica e consequentemente a ligação das
biomoléculas à fase estacionária (Porath, 1986). Os sais caotrópicos podem alterar a
estabilidade das biomoléculas quer pela sua ligação directa ou pela modificação das
propriedades do solvente. No último caso, a presença das moléculas caotrópicas cria
uma perturbação na rede das ligações de hidrogénio entre as moléculas de água que
Catiões
Aniões
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 6
pode resultar no enfraquecimento do efeito hidrofóbico. Por outro lado a ligação destes
sais às biomoléculas pode resultar num enfraquecimento das interacções hidrofóbicas
entre os aminoácidos apolares que estabilizam o estado nativo das biomoléculas (Salvi
et al., 2005). Salvi et al., (2005) observaram que a redução do número de estados
ordenados no seio da solução devido à presença dos sais caotrópicos cria uma
interacção efectiva entre as moléculas destes sais e as proteínas. Como resultado deste
facto, as moléculas caotrópicas acumulam-se próximo da superfície das proteínas. Este
efeito deve-se à existência de uma vantagem em termos da energia de Gibbs quando as
moléculas caotrópicas se encontram junto à superfície das proteínas porque a redução
dos estados ordenados à superfície é menor que no seio da solução. Em contraste, os
sais cosmotrópicos (sulfato de sódio, potássio ou amónio) promovem interacções
hidrofóbicas e precipitação das proteínas, devido a elevado “salting-out” ou efeitos de
incremento da tensão superficial molal (Porath, 1986). A presença de sal aumenta a
energia livre das biomoléculas e este aumento de energia livre é proporcional à área
superficial hidrofóbica das biomoléculas. A associação intermolecular dos grupos
hidrofóbicos minimiza o aumento da energia livre pela diminuição da área de contacto
das biomoléculas com o meio polar (Queiroz et al., 2001). Por esta razão, quando a fase
estacionária hidrofóbica é introduzida no sistema, as biomoléculas ligam-se a esta de
forma a minimizar a sua área de contacto e a do adsorvente com a solução salina de
modo a produzir um aumento mínimo em energia livre. Por consequinte, num meio com
elevada concentração de sal a forma ligada das biomoléculas é termodinamicamente
mais estável do que a sua forma não ligada. Este facto explica a ligação das
biomoléculas à fase estacionária hidrofóbica quando existe uma elevada concentração
de sal. A adsorção aumenta com elevada concentração de sal na fase móvel e a eluição é
obtida pela diminuição da concentração de sal no eluente (figura 1.3) (Melander e
Horváth, 1977; Fausnaugh e Regnier, 1986; Roe, 1989).
A selecção adequada do tipo de sal no eluente resulta em alterações
significativas não só na retenção da proteína total, mas também na selectividade da
separação (Rippel e Szepesy, 1994). Diferentes autores (Perkins et al., 1997; Roettger et
al., 1989) demonstraram que existe alteração de selectividade quando se aplica
diferentes tipos de sal na fase móvel. Para sais neutros e cosmotrópicos, como é o caso
do (NH4)2SO4 e NaCl, a retenção da proteína aumenta com o aumento da concentração
do sal, mas para sais caotrópicos, como o NaSCN, diminui a retenção da proteína em
estudo com o aumento da concentração do sal (Xia et al., 2004; Roettger et al., 1989;
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 7
Elevada concentração
de sal
Baixa concentração
de sal
Perkins et al., 1997).O efeito dos sais na retenção das proteínas foi explicado pelo
número de moléculas de água libertadas induzido por diferentes tipos de sal. Assim, a
selectividade de certos tipos de sal em HIC, pode ser interpretada como a capacidade
para excluir as moléculas de água da superfície das proteínas e da superfície do ligando.
Figura 1.3. Representação esquemática do processo de adsorção e desorção em HIC. Ligando
hidrofóbico, Molécula de proteína (Amersham Biosciences, 2002).
A teoria solvofóbica e o modelo de interacção preferencial têm sido aplicados de
forma a interpretar o efeito do sal na ligação das biomoléculas em sistemas de HIC. A
teoria solvofóbica baseia-se na associação e solvatação das espécies e esta teoria assume
que o incremento da tensão superficial molal do sal determina a retenção (Melander e
Horvath, 1977; Melander et al., 1984). De acordo com a teoria solvofóbica uma
cavidade é formada e depois encerrada em ambas as fases, estacionária e móvel. Esta
teoria nem sempre é válida se o sal interagir fortemente com as biomoléculas,
Fausnaugh e Regnier (1986) estudaram a adsorção de várias proteínas na presença de
diferentes tipos de sal e observaram que a teoria solvofóbica poderá não explicar
adequadamente as diferenças na retenção das biomoléculas em presença de vários tipos
de sal em HIC. Outra alternativa à teoria solvofóbica é fornecida pela análise de
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 8
interacção preferencial a qual se foca na interacção dos solutos com as proteínas. O
efeito do sal na adsorção de proteínas em HIC foi investigado por análise de interacção
preferencial por Perkins et al., (1997). Estes autores com base nesta teoria
desenvolveram uma correlação entre o factor de capacidade do soluto e a concentração
do sal em HIC.
ii) Efeito da temperatura
De uma forma geral, a temperatura também afecta a HIC. Mas este efeito tem
recebido menos atenção do que o efeito do sal.
Hjertén et al., (1974) estabeleceram, (sob condições de não sobrecarga, quando a
superfície cromatográfica, as propriedades da fase móvel, a solubilidade da proteína em
solução aquosa e o estado conformacional da biomolécula não varia com a temperatura)
uma correlação entre a temperatura e a retenção das biomoléculas, o aumento da
temperatura leva ao aumento da retenção das biomoléculas e a diminuição da
temperatura geralmente provoca a sua diminuição promovendo assim a sua eluição. Este
comportamento é explicado pelo facto de a retenção das biomoléculas em HIC ser um
processo conduzido entropicamente (Energia de Gibbs (∆G) dada por ln k´= ln φ –
(∆Gº/RT)). Contudo, a temperatura também pode afectar o estado conformacional das
biomoléculas e a sua solubilidade. Este fenómeno explica a relação inversa entre a
retenção da biomolécula e a temperatura, observada em alguns casos.
Vailaya e Horvath (1996) estabeleceram a existência de relações
exotermodinâmicas (compensação entalpia-entropia) em processos de HIC. Valores de
entalpia positivos e alterações de entropia podem ser observados a baixas temperaturas.
Haidacher et al., (1996) investigaram o efeito da temperatura na retenção de
alguns derivados de aminoácidos em HIC, num intervalo de temperatura de 5 a 50ºC.
Estes investigadores aplicaram a equação de Van’t Hoff para os diferentes sistemas
cromatográficos e demonstraram um máximo no intervalo de temperatura usado. Este
comportamento foi atribuído à variação de capacidade calorífica negativa associada com
a retenção das biomoléculas. A variação da capacidade calorífica aumentou com a
temperatura enquanto que a variação de entalpia e entropia foi positiva a baixas
temperaturas, mas negativa a elevadas temperaturas. Por outras palavras, os autores
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 9
demonstraram que a retenção é um processo conduzido entropicamente a baixas
temperaturas e um processo conduzido entalpicamente a elevadas temperaturas.
iii) Efeito do ligando
Os vários tipos de fases estacionárias podem diferir no tipo de ligando, no
comprimento da cadeia do ligando e na densidade do ligando.
Ligandos com carácter hidrofóbico intermédio, são mais eficientes que ligandos
que promovem fortes interacções hidrofóbicas, uma vez que exercem forças moderadas
e a eluição de biomoléculas é conseguida por uma simples diminuição da concentração
de sal, evitando-se assim o uso de solventes orgânicos, agentes caotrópicos ou
detergentes (Queiroz et al., 2001).
Os ligandos mais usados em HIC são os alcanos de cadeia linear (como o butil,
octil) e alguns grupos aromáticos (como o phenyl). A phenyl e outros grupos aromáticos
são aplicados como ligandos com óptimos resultados devido à mistura de interacções
tanto hidrofóbicas como aromáticas (П-П).
A um grau de substituição constante na matriz os ligandos n-alcanos constituem
uma série homóloga na escala de hidrofobicidade (Tanford, 1972):
metyl<ethyl<propyl< buty<l pentyl< hexyl< heptyl <octyl
A hidrofobicidade e a força da interacção aumentam com o aumento do comprimento da
cadeia n-alquilo mas a selectividade da adsorção pode diminuir. Por outro lado, o
aumento no grau de substituição do suporte leva ao aumento na capacidade da ligação à
fase estacionária, devido à elevada probabilidade de se formar ligações por multi-ponto,
e por vezes, torna-se difícil eluir a proteína sem ocorrer desnaturação (Hjertén et al.,
1974). Aplicando o mesmo tipo de ligando e o mesmo tipo de suporte base, a
selectividade do gel em HIC pode ser manipulada alterando a densidade de ligandos
(Lin et al., 2000). A relação entre a densidade de ligandos e a retenção das biomoléculas
depende aparentemente do tamanho desta, no entanto a hidrofobicidade superficial das
biomoléculas deverá ser considerado o factor que mais afecta a retenção (Fausnaugh et
al., 1984).
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 10
1.2. Princípios teóricos de cromatografia líquida
1.2.1. O problema geral de eluição
Um cromatograma típico da separação de uma mistura de componentes, o qual
ilustra as características da cromatografia, e é frequentemente referido como problema
de eluição geral pode observar-se na figura 1.4.
Figura 1.4. Representação esquemática do problema geral de eluição em cromatografia líquida. k - factor
de retenção (Sewell, 2000).
As propriedades que o cromatograma ilustra e que devem ser explicadas pela teoria de
cromatografia são (Sewell, 2000):
• Os componentes da mistura são eluídos da coluna a diferentes tempos de retenção.
• A largura do pico aumenta com o tempo de retenção (forma do pico e
“broadening”).
• A separação dos pares de picos não é constante (resolução da coluna).
Tempo
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 11
1.2.2. Retenção cromatográfica
Os parâmetros relativos à retenção são determinados em termos do tempo,
volumes da fase móvel ou factores de retenção (k) (previamente referidos como factores
de capacidade). Se a taxa de fluxo é constante, os volumes são proporcionais ao tempo,
isto é, o tempo de retenção (tR) é análogo ao volume de retenção (VR) (Sewell, 2000).
Se a mistura é submetida à técnica de cromatografia, o tempo necessário para o
componente ser eluído da coluna, o tempo de retenção (total) (tR) é calculado desde o
momento da injecção até ao aparecimento da altura máxima do pico. Todos estes
parâmetros incluindo a largura do pico analisado na linha base (w) ou a meia altura do
pico (wh), e a eluição da biomolécula não retida na coluna, são essenciais em
cromatografia e estão ilustrados na (figura 1.5). Esta figura evidencia a separação de
dois componentes da mistura eluídos com tempos de retenção (tR) 1 e (tR) 2, e o
componente não retido na coluna a tempo de retenção, (tM) (Sewell, 2000).
O volume de retenção (VM) da biomolécula não retida na coluna é também
denominado de volume da fase móvel e iguala o volume (ambos inter e intra-partículas)
à disposição da fase móvel na coluna (Sewell, 2000).
O tempo/volume de retenção ajustado (t’R/ V’R) é o tempo/volume de eluição total
menos o tempo/volume de retenção da fase móvel:
MRRMRR VVVttt −=−= ';' (2)
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 12
Figura 1.5. Figura representativa da separação de uma mistura de componentes evidenciando diferentes
parâmetros de retenção. tR1 e tR2 - tempo de retenção da mistura de dois componentes, tM - tempo de
retenção de um composto não retido, h - altura do pico e wh – espessura a meia altura do pico (Sewell,
2000).
A biomolécula não retida na coluna, que não tem qualquer afinidade com a fase
estacionária, e não exibe exclusão passa pela coluna à mesma velocidade que a fase
móvel. A substância com afinidade à fase estacionária move-se através da coluna mais
lentamente do que a fase móvel. A razão destas duas velocidades é conhecida como
factor de retardamento (R):
móvelfasedaãomovimentaçdevelocidade
retidopicodoãomovimentaçdevelocidadeR = (3)
O componente passa algum tempo tanto na fase móvel (tM) como na fase
estacionária (tS), então o tempo de retenção (tR) é dado pela seguinte equação:
SMR ttt += (4)
Tempo Composto não retido
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 13
O tempo dispendido na fase estacionária depende do coeficiente de distribuição
(KC) tal que SCR VKt = onde VS é o volume na fase estacionária. Se CS e CM são
concentrações de componente na fase estacionária e fase móvel respectivamente, a
constante de distribuição é dada por:
MSC CCK /= (5)
A velocidade de movimentação dos componentes ao longo da coluna é
inversamente proporcional à constante de distribuição, isto é, a substância com uma
concentração elevada na fase estacionária (com um coeficiente de distribuição elevado)
move-se lentamente através da coluna. Os componentes da mistura são, portanto,
separados se os seus coeficientes de distribuição diferirem. Aplicando como variável o
volume em vez da variável tempo obtém-se a expressão seguinte:
SCRSCMR VKVouVKVV =+= ' (6)
sendo esta a equação fundamental em cromatografia, mas que ignora os efeitos de não
linearidade da isotérmica de adsorção e de “broadening”.
Em cromatografia de adsorção o volume da fase estacionária é substituído pela
área à superfície (AS) da fase estacionária, e o coeficiente de distribuição é substituído
pelo coeficiente de adsorção (KA) (Sewell, 2000).
Uma expressão alternativa (factor de retenção: k) para a distribuição do
componente da amostra em termos do número relativo de moles (n) do componente na
fase estacionária e na fase móvel, é:
)/(/ MSCMS VVKnnk ⋅== (7)
iaestacionárfasemóvelfasenasolutodequantidade
móvelfasenasolutodequantidadeR
+= (8)
ou )1/(1)/( knnnR SMM +=+= (9)
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 14
Substituindo o factor de retenção na equação (6):
)1( kVVdáVKVV MRSCMR +=+= (10)
ou aplicando tempos de retenção:
MMRMR tttkktt /)()1( −=⇔+= (11)
Esta expressão é muitas vezes aplicada como forma de expressar a retenção a
partir de valores facilmente mensuráveis e sem a necessidade de recorrer a medições de
taxas de fluxo.
Uma vez que:
/LtM = ū (12)
A equação (11) pode ser reescrita como:
tR = L/ ū (1+k) (13)
onde L é o comprimento da coluna e ū é a taxa de fluxo linear da fase móvel.
Desta forma o tempo de retenção é directamente proporcional ao comprimento da
coluna e inversamente proporcional à taxa de fluxo linear da fase móvel (Sewell, 2000).
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 15
1.2.3. A forma do pico
A variação da concentração do soluto na fase estacionária com a concentração do
soluto na fase móvel, a temperatura constante, é designada como isotérmica de
adsorção. A teoria cromatográfica simples assume uma isotérmica linear, isto é, o
coeficiente de distribuição é constante. Nestas condições o tempo de retenção é
independente da concentração da amostra e o pico move-se a uma velocidade constante.
Devido a difusão longitudinal na direcção do fluxo, o perfil do pico apresenta uma
distribuição Gaussiana. Se a isotérmica é não linear (Langmuir ou anti-Langmuir), o
coeficiente de distribuição não é constante varia com a concentração do soluto e existe
uma distribuição de velocidades ao longo do pico a qual é descrita como um “tailing”
ou “fronting” (Sewell, 2000). Esta relação entre a forma da isotérmica e a forma do pico
é ilustrada na figura 1.6.
A largura do pico cromatográfico é influenciada pela eficiência da coluna e pode
ser expressa em termos do número de pratos (N), e é calculada a partir das seguintes
equações que dependem dos valores usados para a largura do pico (figura 1.5):
2222 )/(545.5)/(16)/()/( hRbRRR wtwttVN ==== σσ (14)
onde σ é o desvio padrão do pico Gaussiano.
O comprimento da coluna dividido pelo número de pratos é igual à altura dos
pratos ou à altura equivalente aos pratos teóricos (H) e regulariza o número de pratos
por comprimento da coluna: H=L/N. O conceito de pratos em cromatografia representa
o comprimento da coluna em que as moléculas de soluto atingem o equilíbrio de
distribuição. Deste modo, um número elevado de pratos teóricos corresponde a uma
coluna com uma boa eficiência (Sewell, 2000).
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 16
Tempo
Concentração na fase móvel
Figura 1.6. Figura representativa da forma da isotérmica de adsorção e os efeitos na forma do pico e
tempos de retenção (tR). (A) Linear; (B) Langmuir; (C) Anti-Langmuir; (D) Gaussian; (E) tailing; (F)
Frente (Seweel, 2000).
Considerar os processos cromatográficos controlados apenas pelo equilíbrio
proporcionam uma explicação satisfatória da retenção em termos dos coeficientes de
distribuição, mas se for considerado “broadening” da banda é necessária uma
aproximação diferente – a teoria de velocidade para cromatografia. Esta teoria foi
primeiramente aplicada por Van Deemter (1995) (Sewell, 2000) à cromatografia gasosa,
mas mais tarde estendeu-se à cromatografia líquida. À medida que a banda de soluto
passa na coluna a largura da banda aumenta e o soluto é diluído pela fase móvel. Apesar
do processo de fluxo do fluído ser complexo, podem considerar-se três principais
factores que contribuem para um “broadening” da banda (isto é, a variância (σ2) do pico
Gaussiano): difusão turbulenta, difusão longitudinal e transferência de massa (figura
1.7).
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 17
Taxa de fluxo linear
Figura 1.7. Representação de Van Deemter para cromatografia líquida. Variação dos termos A, B, CS e
CM com a taxa de fluxo (Sewell, 2000).
i) Difusão turbulenta
As moléculas que fluem pela fase estacionária poderão percorrer vias de
diferentes comprimentos provocando pequenas variações nos tempos de retenção. Isto
tem o efeito de “broadening” na banda de uma quantidade que depende do diâmetro da
partícula (dp),
pdA λ2= (15)
A constante de empacotamento (λ) é um termo empírico que depende da forma
(esférica ou irregular) do material empacotado e da eficiência do empacotamento, e
atinge um valor mínimo de ≅ 0.5.Para colunas tubulares abertas não existe este termo
(Sewell, 2000).
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 18
ii) Difusão longitudinal
As moléculas de soluto sofrem difusão na direcção longitudinal (isto é, ao longo
do perfil axial da coluna) de acordo com as leis de Fick. O “spreading” da banda é
directamente proporcional ao coeficiente de difusão (DM) das moléculas de soluto na
fase móvel, e inversamente proporcional à taxa de fluxo da fase móvel. É introduzido o
factor de obstrução (Ψ) de forma a ter em conta a difusão restrita na fase estacionária:
/2 MDB ψ= ū (16)
A difusão molecular longitudinal só é significativa em cromatografia líquida se
forem usadas pequenas partículas na fase estacionária (<10µm) a baixas velocidades da
fase móvel e com um coeficiente de difusão do soluto relativamente elevado (Sewell,
2000).
iii) Transferência de massa
Em cromatografia líquida, o “broadening” produzido pela transferência de massa
envolve tanto a fase estacionária como a fase móvel. Existem 2 processos responsáveis
pelo “broadening” na fase estacionária (CS). O primeiro processo envolve uma
velocidade finita de transferência de massa na zona de interface fase estacionária/fase
móvel no topo da coluna. O soluto é distribuído entre estas duas fases de acordo com os
valores do coeficiente de distribuição. À medida que a banda se move pela coluna o
soluto vai interagindo continuamente com a fase estacionária onde se dissolve. De
forma a manter o equilíbrio, o soluto na parte superior da banda irá dissolver-se da fase
estacionária para a fase móvel. Como este processo não é instantâneo o pico obtido do
cromatograma sofrerá “broadening”. O segundo processo envolve uma distribuição
estatística da velocidade de difusão das moléculas na fase estacionária, que resulta numa
pequena variação do tempo que as moléculas passam na fase estacionária. Uma fase
móvel que se movimenta rapidamente na coluna acentua o “broadening”. Uma taxa
elevada de difusão do soluto na fase estacionária (DS) diminui o “broadening” (Sewell,
2000):
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 19
S
f
SD
d
k
kqC
û
)1(.
2
2+= (17)
onde q é um factor de configuração, que depende da natureza da fase estacionária. Em
cromatografia de adsorção, o termo CS é expresso em termos de cinética de
adsorção/desorção das moléculas de soluto na fase estacionária.
O “broadening” da fase móvel também resulta de dois tipos de processos. A
transferência de massa na fase móvel (CM) resulta de forças de atrito que modificam o
perfil do fluxo laminar ao longo do canal entre duas partículas, resultando numa
velocidade de fluxo elevada no centro deste canal. A ausência da transferência de massa
(C*M) é o resultado da difusão lenta das moléculas de soluto dentro e fora dos poros da
fase estacionária. A soma das transferências de massa na fase móvel pode ser
representadas pela seguinte expressão:
McpM DddfC /û).,( 22= (18)
onde dp é o diâmetro da partícula e dc é o diâmetro da coluna, DM o coeficiente de
difusão do soluto na fase móvel e ū a velocidade linear (Sewell, 2000).
Gidding (1965), reconhecendo que as moléculas são livres para se difundirem de
um caminho para outro introduziu o termo “multipath” (A) e o termo transferência de
massa na fase móvel (CM) de modo que a variação da altura dos pratos teóricos com a
taxa de fluxo linear ū é dada por:
/BH = ū+ CS ū + CM ū{1/A+1/CMū} (19)
A contribuição dos vários termos para a altura dos pratos teóricos é ilustrada na
figura 1.7.
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 20
iv) Dispersão extra-coluna
Até agora só analisamos “broadening” da banda devido a processos da coluna
cromatográfica, mas a avaliação da performance do sistema, a avaliação do sistema
como um todo é extremamente importante. Deste modo, o sistema de injecção, o
detector e a tubagem do sistema todos contribuem para a forma do pico. O objectivo da
injecção é colocar a amostra na coluna. A transferência lenta da amostra desde o
injector até à coluna origina um “broadening” ou um pico “tailing”. Grandes volumes
“mortos” no detector podem levar a uma mistura de componentes e deterioração da
separação bem como à diluição dos picos da amostra, e redução dos limites de detecção
(Sewell, 2000).
1.2.4. Resolução
A separação cromatográfica é alcançada apenas quando existe diferença entre os
coeficientes de distribuição de 2 componentes, isto é, quando as interacções moleculares
(forças de dispersão, interacções dipolo e ligações de hidrogénio) entre as moléculas da
amostra e a fase estacionária são suficientemente diferentes para cada componente, ou
seja a energia livre de distribuição dos componentes da mistura pela fase estacionária é
diferente.
Uma fase estacionária que produz um grau de separação elevado é dita uma
coluna com uma elevada selectividade (Sewell, 2000).
Quando se pretende separar componentes de uma mistura é necessário prevenir
que os compostos se voltem a misturar novamente e a forma de obter esta separação é
uma função da eficiência da coluna, determinada pelo número de pratos teóricos. Os
efeitos da selectividade da fase estacionária e eficiência da coluna são expressos em
termos da resolução dos picos na coluna (Sewell, 2000):
2/)(
)()(
21
12
ww
ttR RR
S+
−= (20)
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 21
Um valor de Rs = 1.5 representa normalmente o valor base para a separação de
picos Gaussianos. Para obter a resolução máxima de um pico, é necessário uma
selectividade e eficiência elevada.
Uma resolução elevada pode ser obtida pelo aumento do comprimento da coluna
desde que a separação dos picos seja proporcional à distância de migração na coluna,
mas a largura dos picos só é proporcional à raiz quadrada da distância de migração
(Sewell, 2000).
A equação de Purnell demonstra como a resolução do pico está relacionada com o
factor de retenção (k), com o número de pratos teóricos e com a retenção relativa (α)
(Sewell, 2000):
2
22
1.
)1(.
4 k
kNR S
+
−=
α
α (21)
onde o subscrito 2 refere-se ao segundo pico. Em cromatografia líquida a retenção
relativa é determinada pela natureza da fase móvel bem como da fase estacionária. De
forma a obter uma separação satisfatória deve ser realizada um balanço entre as
interacções (forças de dispersão, interacções dipolo-dipolo, interacções dipolo-
induzido-dipolo e ligações de hidrogénio).
A resolução do pico aumenta rapidamente com o aumento do k, mas valores
superiores a 10 o termo 11 2
2 →+ k
k já não faz parte da resolução (equação 21). Valores
de k inferiores a 1 dão tempos de retenção e resoluções bastante baixas, logo valores de
k óptimos devem situar-se entre 1 e 10. A equação de retenção )1(û/ kLtR +=
demonstra que o tempo de retenção é função da velocidade da fase móvel (ū) e do factor
de retenção (Sewell, 2000).
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 22
1.3. O papel da estrutura das biomoléculas no comportamento cromatográfico
Com base no conhecimento acerca das interacções proteína-proteína e o facto de
que as proteínas são matrizes tridimensionais com uma grande diversidade na
distribuição dos seus grupos funcionais à superfície, Regnier (1987) propôs que (i) é
estericamente impossível que todos os aminoácidos entrem em contacto com a
superfície do adsorvente cromatográfico em simultâneo, (ii) somente os resíduos que se
encontram próximos ou na superfície exterior da proteína poderão desempenhar um
maior impacto no comportamento cromatográfico, (iii) só uma fracção dos aminoácidos
externos interagem com um tipo particular da matriz cromatográfica como é o caso da
matriz por troca iónica ou afinidade (iv) a heterogeneidade na distribuição dos
aminoácidos à superfície das proteínas pode permitir que as porções da superfície
externa dominem o comportamento cromatográfico, (v) a região da superfície externa
que determina o comportamento cromatográfico pode variar entre os vários modos
cromatográficos, (vi) as variações estruturais que alteram a composição dos
aminoácidos na região de contacto soluto-adsorvente irão modificar o comportamento
cromatográfico e (vii) a matriz cromatográfica poderá alterar a estrutura da proteína
adsorvida (Regnier, 1987).
A suportar o modelo proposto por Regnier (1987) encontram-se as evidências
enumeradas a seguir.
1.3.1. Resíduos que controlam a retenção
O facto de que só os resíduos dos aminoácidos que se encontram na ou próximos
da superfície externa das biomoléculas podem interagir com outras biomoléculas ou
com a superfície, tem sido extensivamente documentados. Por outro lado, os
aminoácidos que se encontram no interior da matriz das biomoléculas não
desempenham um papel tão directo nas interacções com a superfície. Variantes de
biomoléculas que resultam de mutações, erros de expressão, ou algum tipo de
modificação translacional podem ser só diferenciadas das biomoléculas nativas por
técnicas de separação mediadas pela superfície se a sua alteração estrutural modifica a
estrutura das biomoléculas ou se surge sobre a superfície externa (Regnier, 1987).
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 23
1.3.2. Região de contacto cromatográfica
Geralmente, a área superficial das biomoléculas envolvida no processo de
adsorção não é mais do que uma pequena centena de angstroms ao quadrado. A
alteração de um único aminoácido ou modificações mínimas na sua orientação espacial
na região de interacção pode causar um grande impacto na adsorção.
Uma substituição num aminoácido de uma proteína ou péptido poderá influenciar
o comportamento cromatográfico somente quando este se encontra na área do soluto
que estabelece um contacto directo com o adsorvente cromatográfico ou quando altera a
estrutura da biomolécula de forma a afectar a região de contacto cromatográfica. Com a
disponibilidade de várias variantes naturais e a capacidade em produzir um número
ilimitado de variantes sintéticas através da tecnologia de ADN recombinante, é possível
por processos de mapeamento, localizar as regiões no exterior das biomoléculas que
determinam o comportamento cromatográfico (Regnier, 1987).
Existem 7 variantes da “avian” lisozima, todas elas possuindo estruturas
aproximadamente idênticas entre si, observadas por cristalografia de raio X (Bott e
Sarma, 1976). Quando estas isoenzimas são examinadas por HIC, uma região particular
da superfície molecular oposta à fenda catalítica domina a retenção cromatográfica
(Fausnaugh e Regnier, 1986). Esta área vai do resíduo 41 ao 102 e do resíduo 75 à
região de hélice α que começa no resíduo 89. A substituição de aminoácidos nesta
região altera o comportamento cromatográfico, enquanto que a substituição na outra
face externa da biomolécula não desempenhou nenhum tipo de influência no que diz
respeito à retenção. No entanto a região de contacto é suficientemente extensa em HIC
de modo que 6 ou 7 variantes da lisozima podem ser separadas.
A retenção em outros modos cromatográficos pode também ser dominado por
porções específicas à superfície das biomoléculas. Por exemplo, a cromatografia da
“hen egg white” lisozima em colunas de afinidade por metal imobilizado é influenciada
pela histidina, existindo apenas um resíduo de histidina na posição 15.
As hélices amfipáticas providenciam outro caso da distribuição assimétrica de
aminoácidos que determinam uma região de contacto cromatográfica específica em
polipéptidos (Regnier, 1987). Porque existe uma acumulação de aminoácidos
hidrofóbicos numa zona da hélice amfipática, esta região da molécula dominará a
retenção em HIC (Regnier, 1987).
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 24
Uma elevada distribuição assimétrica irá produzir uma região de contacto
específica contrariamente a uma distribuição uniforme que leva a que todas as áreas da
superfície da molécula estejam igualmente envolvidas no processo de adsorção. Por
exemplo, aminoácidos hidrofílicos e hidrofóbicos são segregados em proteínas
amfipáticas. Estendendo esta lógica à comparação dos vários modos cromatográficos,
espera-se que as regiões de contacto cromatográficas destas proteínas estejam
localizadas em diferentes porções da sua superfície (Regnier, 1987).
1.3.3. Comportamento cromatográfico e alterações de conformação
Geralmente as biomoléculas sob condições fisiológicas possuem um estado
conformacional predilecto. Infelizmente condições não fisiológicas têm de ser usadas
durante o processo de isolamento destas biomoléculas. Desta maneira, as biomoléculas
de interesse podem ser desnaturadas sendo necessário o “refolding” destas de forma a
recuperarem a sua estrutura nativa. Embora, o “refolding” de polipéptidos de cadeia
pequena seja de fácil execução, já o mesmo não se pode dizer para proteínas de cadeia
comprida e polipéptidos que sofreram uma modificação pós-translacional. Obviamente
é melhor, se possível, prevenir a desnaturação durante as separações cromatográficas.
Ambas as forças hidrofóbicas e coulombicas são extremamente importantes na
manutenção da estrutura das biomolécula. As mesmas forças são usadas para efectuar as
separações cromatográficas. Na sua essência, a coluna compete na região de contacto
com o resto da estrutura da biomolécula por grupos funcionais que se encontram na
interface. Quando as forças hidrofóbicas e coulombianas na coluna são mais fortes do
que aquelas que mantêm a estrutura das biomoléculas, a desnaturação pode ocorrer. A
fase móvel pode também promover a desnaturação. Os solutos que se encontram
fortemente retidos requerem a maior parte das vezes aditivos para serem eluídos,
provocando a ruptura das forças hidrofóbicas e coulombianas intramoleculares para
além da região de contacto hidrofóbico. A desnaturação pode ocorrer em todos os tipos
de colunas de cromatografia líquida. Tais alterações de estrutura em sistemas
cromatográficos possuem várias implicações. Em cromatografia de escala preparativa,
se a biomolécula de interesse desnatura irreversivelmente o rendimento do processo
diminuirá. Numa escala analítica, as alterações de estrutura poderão conduzir a erros na
estimativa de parâmetros em modelos de adsorção/desorção e em análises de amostras
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 25
puras. Num nível mais fundamental, as mudanças de estrutura, se ignoradas, poderão
levar a uma interpretação errada dos mecanismos de adsorção (Regnier, 1987). O
problema da desnaturação é mais preocupante na RPC onde os solventes orgânicos e
muitas fases móveis acídicas devem ser usados para eluir as biomoléculas. Uma vez que
as forças hidrofóbicas desempenham um papel bastante relevante na organização e
manutenção da estrutura tridimensional das biomoléculas, a presença de resíduos alquil
silanos na coluna, solvente orgânicos na fase móvel e as condições muito acídicas
podem levar à desnaturação das biomoléculas. As biomoléculas multiméricas com
subunidades diferentes representam um segundo problema. A desnaturação de tais
biomoléculas na coluna pode causar a dissociação e a separação de subunidades, que
serão bastante difíceis de localizar e reunir novamente nas biomoléculas nativas. A
desnaturação pode aumentar a complexidade da amostra ao ponto de ser impossível
diferenciar entre os componentes da amostra e os artefactos (Regnier, 1987).
A hidrofobicidade externa das biomoléculas no estado nativo é bastante diferente
da do estado “unfolded” porque as cadeias hidrofóbicas são expostas durante a
desnaturação (Regnier, 1987). Medições espectroscópicas directas mostraram que
quando a lisozima contacta com um adsorvente de RPC, ocorre uma alteração da
conformação na área de contacto cromatográfica da biomolécula. À medida que a
biomolécula é adsorvida à superfície, alguns triptofanos da lisozima são rapidamente
expostos ao solvente. É ainda possível que em fases móveis desnaturante as
biomoléculas possam sofrer “folding” e “unfolding” durante o processo cromatográfico.
A velocidade deste processo determina o que se obterá predominantemente a
biomolécula nativa, a biomolécula desnaturada ou a mistura de conformações. A
interconversão das conformações no sistema cromatográfico pode também influenciar a
forma do pico. Tanto em HIC (Wu et al., 1996) como em RPC (Regnier, 1987) a
tendência é passar de um pico no estado nativo, através de um pico extenso no sistema
em equilíbrio para um pico no estado desnaturado (Regnier, 1987).
Melander et al., (1982) nos seus estudos com dipéptidos que continham resíduos
de L-prolina examinaram a presença de picos múltiplos no cromatograma. Através deste
estudo, estes investigadores concluíram que os péptidos que continham resíduos de
prolina podiam produzir múltiplos picos em HPLC se a prolina não se encontrasse no
terminal N. Este fenómeno foi explicado como consequência da alteração de
conformação cis-trans do péptido a uma taxa que é comensurável com o processo da
distribuição cromatográfica entre a fase móvel e a fase estacionária.
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 26
Com base na teoria solvofóbica (Horváth et al., 1976; Horváth e Melander,
1978; Horváth e Melander, 1980) estes autores justificaram o facto da retenção da
conformação cis ser maior do que a trans, uma vez que a primeira possui uma área
superficial de contacto mais elevada com os ligandos (Melander et al., 1982).
Aumentando a temperatura da coluna foi mostrado com a ribonuclease A que o
tamanho do pico da biomolécula desnaturada aumenta com o diminuição de um pico
extenso. Em geral, a retenção cromatográfica aumenta com a desnaturação em RPC e
HIC. Foi demonstrado por “diode-array spectroscopy” que nos picos extensos pode
haver uma variação na composição da conformação (Wu et al., 1996). É desejável
escolher condições cromatográficas que seleccionam um único estado conformacional
para a separação (Regnier, 1987).
Ainda que a estrutura da biomolécula possa ser alterada em RPC, a estrutura
secundária e terciária pode ser retida. As provas desta conclusão foram baseadas em
diversas observações que: (i) mais de um pico pode ser observado para uma única
biomolécula, o que significa que existem múltiplos estados conformacionais durante a
sua passagem através da coluna e estas conformações têm comportamentos de adsorção
distintos que conduzem a picos extensos ou múltiplos no perfil de eluição e que diferem
no grau de “unfolding”. Em 1989, Karger e Blanco (1989) descreveram o efeito das
alterações estruturais das proteínas induzidas na coluna. Estes investigadores
demonstraram o comportamento destas alterações por fluorescência intrínseca e
demonstraram ainda fortes evidências de que a conformação das proteínas pode ser
alterada durante o processo de adsorção ou no estado adsorvido, (ii) a retenção não pode
ser calculada por um simples somatório do incremento de grupos de aminoácidos
individuais em polipéptidos (Regnier, 1987), (iii) a contribuição para a retenção de um
grupo funcional depende da sua posição no polipéptido, (iv) existe uma pequena relação
entre o valor de Z (número de moléculas de água libertadas por biomolécula adsorvida)
e o peso molecular em sistemas não desnaturantes, (v) o número Z aumenta em
condições mais desnaturantes (Geng e Regnier, 1984), e (vi) as técnicas
espectrofotométricas demonstram a retenção do conteúdo helicoidal das biomoléculas à
superfície do adsorvente (Regnier, 1987).
Com ambos proteínas e péptidos, a adição de solventes orgânicos durante a RPC
sob condições acídicas produz uma maior ruptura da estrutura terciária e quaternária do
que da estrutura secundária. Este facto deve-se às forças hidrofóbicas que são
consideradas como as maiores contribuidoras da estrutura terciária e quaternária e as
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 27
ligações de hidrogénio são mais estáveis em solventes orgânicos do que na água. A
manutenção da estrutura terciária durante a RPC está geralmente associada com os
polipéptidos ligados por pontes dissulfito.
A temperatura a que os polipéptidos sofrem desnaturação na coluna de HIC e
RPC é quase sempre mais baixa do que em solução. Este comportamento tem sido
atribuído à natureza das próprias fases estacionárias. Uma vez que a estrutura terciária e
quaternária são estabilizadas por interacções hidrofóbicas, a possibilidade de
desnaturação deve ser sempre tomada em consideração quando se emprega uma coluna
hidrofóbica (Regnier, 1987).
Deste modo é extremamente importante compreender como e porque é que a
desnaturação ocorre e quais os efeitos que a desnaturação pode causar na performance
cromatográfica (Sane et al., 1999).
1.3.4. Exemplos de algumas técnicas usadas para caracterizar a estrutura
das proteínas em cromatografia
O dicroismo circular (CD) (Drake et al., 1989; Kurosu et al., 1990; Boulkanz et
al., 1997) e a espectroscopia de infravermelhos com transformada de Fourier (FT-IR)
(Turula e Haseth, 1996) são exemplos de alguns técnicas usadas para caracterizar as
estruturas das proteínas em solução antes e depois da eluição da coluna cromatográfica.
Todavia, o “refolding” espontâneo das proteínas após a desorção dificulta a
interpretação dos resultados. A conformação após exposição pode ser considerada como
uma representação inadequada do estado da proteína quando esta se encontra a interagir
com o meio.
Vários investigadores têm tentado caracterizar as estruturas das proteínas no
estado adsorvido (Sane et al., 1999). Kondo e Mihara (1996) aplicaram o (CD) para
estimar o conteúdo em estrutura secundária das proteínas adsorvidas em partículas
constituídas por sílica. No entanto, para minimizar os efeitos da dispersão da luz, este
estudo foi limitado aos materiais constituídos por nano partículas não funcionalizadas
(Sane et al., 1999).
Boulkanz et al., (1997) usaram FT-IR para caracterizar a estrutura da albumina
sérica humana adsorvida num suporte de fase reversa. No entanto as mudanças
estruturais reportadas por estes autores encontravam-se dentro do erro característico das
medidas em FT-IR. Por outro lado, a grande contribuição da água para o sinal de
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 28
infravermelho da amida I tornam a estimativa da estrutura da proteína no estado
adsorvido difícil. Para ultrapassar este problema Katzenstein et al., (1986) usaram fases
móveis deuteradas durante a caracterização por espectroscopia FT-IR de proteínas
ligadas a suportes de C8-sílica. Apesar de estes autores terem observado variações
significativas no espectro de absorvância da amida I, não puderam quantificar a
estrutura da proteína adsorvida.
A espectroscopia de fluorescência também tem sido aplicada para caracterizar a
estrutura terciária de proteínas adsorvidas em superfícies planas (Asanov et al., 1996;
Robeson et al., 1996), nano partículas (Maste et al., 1996) e em suporte de HIC e RPC
(Katzenstein et al., 1986; Oroszlan et al., 1990). Esta técnica, ainda que muito sensível,
providencia informação somente acerca do microambiente dos resíduos de triptofano e
tirosina na proteína. Também, no caso das proteínas que contêm múltiplos resíduos de
triptofano e tirosina, a interpretação do espectro torna-se difícil (Sane et al., 1999).
McNay e Fernandez (1999) usaram ressonância magnética nuclear (NMR) e
técnicas de troca de protão por deuterão na amida para estudar o desenrolamento da
lisozima adsorvida a suportes de fase reversa. Com esta técnica resíduos que participam
no processo de desenrolamento à superfície do suporte de RPC podem ser identificados,
no entanto a estrutura da proteína no estado adsorvido continua por determinar.
Uma outra técnica alternativa e quantitativa para a caracterização das estruturas
secundárias das proteínas é a espectroscopia de Raman. Algumas vantagens desta
técnica incluem a conveniência de seleccionarem amostras de proteínas em estados
sólidos, em solução, suspensão, imobilizadas e adsorvidas a suportes, sendo necessária
uma preparação mínima. Sane et al., (1999) demonstraram a utilidade da espectroscopia
de Raman para a caracterização “in-situ" da estrutura secundária das proteínas e o seu
uso na interpretação a nível molecular do comportamento de retenção das proteínas.
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 29
1.4. Métodos para medição da hidrofobicidade dos aminoácidos e a sua interacção
1.4.1. Tipos de escalas de hidrofobicidade dos aminoácidos
Um dos problemas em elucidar o mecanismo do “folding” das proteínas é
determinar a natureza do “unfolded” inicial das proteínas sob condições que favorecem
o estado nativo (Wu e Raleigh, 1998). O cerne deste problema decai nas interacções
entre cada aminoácido que fazem a estrutura terciária. Estão envolvidas quatro tipos de
interacções entre as quais: hidrofóbica, electrostática, ligações de hidrogénio e
interacções Van der Waals (Biswas et al., 2003). Pensa-se que as últimas interacções
juntamente com as interacções hidrofóbicas predominem e que outros tipos de
interacções tais como amina-aromático (Burley e Petsko, 1986) e aromático-aromático
também (Burley e Petsko, 1985) desempenhem um papel crucial na estabilização da
estrutura da proteína.
O carácter hidrofóbico de cada aminoácido em particular é uma propriedade
significativa na compreensão da estrutura da proteína ou péptido porque nos mostra
como é que se enrolam no seu estado nativo (Biswas et al., 2003).
O efeito hidrofóbico é considerado como a força que conduz o processo de
“folding” das proteínas (Honig e Yang, 1995).
O conceito de hidrofobicidade tem sido cuidadosamente examinado ao longo
dos anos. As razões para tal interesse devem-se ao facto de que este conceito permite
um melhor conhecimento de como os aminoácidos interagem nas proteínas e uma forma
de prever as propriedades estruturais das proteínas, isto é, a capacidade das proteínas
formarem uma hélice α e o reconhecimento de cadeias β.
A hidrofobicidade é geralmente medida pela partição do soluto apolar entre uma
fase lipídica e uma fase aquosa. À medida que o soluto é excluído da fase aquosa, as
moléculas de água ordenam-se em redor da cavidade produzida pelo soluto apolar.
Consequentemente, a entropia diminui durante este processo. Outro fenómeno
termodinâmico que ocorre durante este processo é o aumento significativo da
capacidade calorífica (Biswas et al., 2003). Estes dois parâmetros termodinâmicos
definem o efeito hidrofóbico (Tanford, 1980) que ocorre à temperatura ambiente
(Biswas et al., 2003).
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 30
O facto de as interacções hidrofóbicas serem dominantes no processo de
“folding” das proteínas conduziu ao desenvolvimento das escalas de hidrofobicidade
(Kauzmam, 1959). Diversas revisões têm sido apresentadas sobre este tópico (Rose et
al., 1985; Hopp, 1986; Cornette et al., 1987; Espositi et al., 1990). Biswas et al., (2003)
dividiu as escalas no que diz respeito à escolha do método usado para a sua obtenção.
Segundo este autor os métodos podem ser divididos em 5 categorias diferentes: partição
(particularmente líquido-líquido), cálculo da área superficial acessível, RPC e técnicas
cromatográficas, mutagénese dirigida e medições das propriedades físicas (Biswas et
al., 2003).
A partição entre duas fases líquidas imiscíveis é considerada como o método
mais comum da medição de hidrofobicidade. A maior parte dessas escalas envolvem o
uso de diferentes tipos de solventes orgânicos. Os solventes usados no estudo de
partição tentam retratar o interior da proteína. Contudo existe um problema que envolve
o uso de solventes orgânicos, a sua miscibilidade com a água leva a alterações no
carácter de ambas as fases e por consequinte torna-se difícil obter valores de
hidrofobicidade correctos (Biswas et al., 2003). A primeira grande escala foi
desenvolvida por Nozaki e Tanford (1971). Estes autores usaram o etanol e o dioxano
como solventes orgânicos para moldar o interior da proteína. Este trabalho permanece
como um dos mais citados na literatura. Têm também sido utilizados métodos de
partição que usam fases não líquidas como a fase gasosa e a fase micelar. Contudo,
devido à hidrofobicidade das micelas, os coeficientes de partição de aminoácidos
polares e carregados não podem ser determinados (Biswas et al., 2003). A utilidade das
fases de vapor foi desenvolvida por Wolfenden et al., (1981) com o intuito de medir a
afinidade das cadeias laterais dos aminoácidos com a água. Teoricamente, a fase de
vapor forma um solvente apolar mais simples uma vez que o soluto não interage com
ele (Sharp et al., 1991).
Os problemas relacionados com os métodos de partição assentam primeiramente
na incapacidade de simular o interior da proteína o qual é difícil de aceder (Damadoran
e Song, 1986). O uso de aminoácidos livres é muito complicado devido à sua solvatação
(Biswas et al., 2003). Por outro lado, pontes de hidrogénio que são perdidas na
transferência para solventes orgânicos não são restabelecidas nestes, mas
frequentemente encontram-se no interior da proteína. Os métodos de partição líquido-
vapor também têm várias desvantagens, incluindo a introdução de forças de dispersão e
desfavorecimento da fase de vapor originada por aminoácidos alifáticos devido à
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 31
necessidade de compensação das ligações de hidrogénio que foram quebradas (Rose et
al., 1985). Por outro lado, a partição líquido-micela pode não representar de uma forma
acertada os valores de hidrofobicidade devido à presença de outros tipos de interacções
(Biswas et al., 2003).
Com o advento dos modelos moleculares, e com o aumento de bibliotecas de
estruturas de proteínas desenvolveram-se métodos que estimam a hidrofobicidade dos
aminoácidos com base no grau de exposição destes ao solvente. Estes métodos têm sido
aplicados na maior parte das vezes exclusivamente na previsão da conformação das
proteínas. Existem duas principais vantagens no uso da medição da área superficial
acessível. A primeira vantagem deste método é não envolver a modelação dos solutos
ou do interior da proteína. São realizadas medições nas proteínas e executadas
correlações entre o grau de exposição e a hidrofobicidade. A segunda vantagem deste
método é que se consegue verificar nas proteínas a presença da estrutura secundária,
estrutura terciária e também a presença da estrutura quaternária (Biswas et al., 2003).
As desvantagens dos métodos de área superficial acessível devem-se ao facto de que
estes métodos são dependentes das definições de átomos polares e apolares e de a base
de dados de estruturas das proteínas ser limitada. Os métodos de área superficial
acessível também só efectuam a medição da acessibilidade estática, em vez da
acessibilidade de proteínas dinâmicas em solução (Biswas et al., 2003). Por outro lado a
maior parte das escalas não tem em conta a polaridade da superfície antes de efectuar a
distinção entre hidrofóbico e hidrofílico (Biswas et al., 2003). É referido que as
medições de área superficial acessível dão-nos informação em termos da
hidrofobicidade média de um tipo de aminoácidos mas não providenciam informação
acerca dos resíduos individuais (Biswas et al., 2003).
O método cromatográfico considerado o método mais popular para a medição da
hidrofobicidade do soluto é a cromatografia líquida de fase reversa (RPC) (Biswas et
al., 2003). Pensa-se que uma das razões da sua popularidade se deve ao facto de que a
fase estacionária apolar “imita”, uma membrana biológica (Hodges et al., 1994). Muitos
dos métodos usam péptidos como soluto e aplicam análises de regressão para relacionar
a hidrofobicidade dos aminoácidos com a retenção do péptido. A principal vantagem do
uso de péptidos é que a carga terminal dos péptidos não exclui a partição em RPC. A
maior parte das vezes são usados péptidos com cerca de 15 resíduos de aminoácidos em
termos de comprimento para evitar a formação de estruturas secundárias que deste
modo poderiam provocar um grande impacto em termos da retenção. Ocasionalmente
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 32
são usadas proteínas e a hidrofobicidade de cada aminoácido é calculada da mesma
forma que com péptidos. São raramente usados aminoácidos individuais e a sua
derivatização é muitas vezes necessária devido à incapacidade dos aminoácidos livres
sofrerem partição em géis com 18 carbonos (C18) devido às cargas na zona terminal.
Contudo, os aminoácidos livres têm sido usados em outras técnicas cromatográficas. A
aplicação de aminoácidos é vantajoso desde que estes não sofram efeitos da vizinhança
e que não se encontrem sujeitos a efeitos de localização que podem dar origem a dados
ambíguos.
Como referido, além da RPC outras técnicas cromatográficas têm sido usadas,
Gehas e Wetlaufer (1990) aplicaram a HIC de aminoácidos derivados de dansil na
concepção das suas escalas de hidrofobicidade. Em HIC, a retenção é baseada
estritamente na área de contacto hidrofóbica e portanto providencia interacções mais
fracas que a RPC.
Aboderin (1971) desenvolveu uma escala usando a retenção de péptidos num gel
hidrofílico com uma fase móvel aquosa de 1-butanol e piridina.
A cromatografia de camada fina foi também usada para relacionar os valores de
mobilidade dos aminoácidos livres com a sua hidrofobicidade. Apesar da grande
utilização dos métodos cromatográficos, estes são algo ambíguos, principalmente
devido à dependência das escalas de parâmetros cromatográficos. A densidade de
ligação de cadeias à fase estacionária, a área superficial e o diâmetro de poro a escolha e
concentração do solvente orgânico, a selecção do pH e até mesmo a temperatura podem
afectar os valores absolutos da hidrofobicidade, bem como a sua ordem relativa (Biswas
et al., 2003).
A mutagénese dirigida é um método bioquímico também usado para a medição
da hidrofobicidade dos aminoácidos. Este método emprega a tecnologia de ADN
recombinante, e são realizadas substituições uma por uma na sequência dos
aminoácidos de proteínas naturais. A principal vantagem deste método é a medição da
estabilidade da proteína baseada na inserção de aminoácidos específicos (Biswas et al.,
2003). Um dos principais inconvenientes dos métodos de mutagénese dirigida é que
nenhum resíduo numa proteína particular pode ser substituído pelos 20 aminoácidos que
ocorrem na natureza (Yutani et al., 1987). Outra desvantagem inclui o custo,
perturbação de outras interacções (Mendel et al., 1992), e a falta de utilidade que não
seja só a medição da estabilidade da proteína (Biswas et al., 2003).
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 33
Existem ainda uma variedade de escalas de hidrofobicidade de aminoácidos
baseadas na medição das propriedades físicas, como a tensão superficial, temperatura de
transição, energia de solvatação e a capacidade calorífica molar parcial. As vantagens
deste método são a velocidade, facilidade de uso e a flexibilidade em termos do soluto
(Biswas et al., 2003). Bull e Breese (1974) desenvolveram uma das escalas mais
reconhecidas, pela medição dos valores de tensão superficial numa solução de cloreto
de sódio de 20 aminoácidos naturais. As medições de tensão superficial possuem várias
desvantagens importantes (Biswas et al., 2003). As ligações de hidrogénio que são
quebradas e os grupos carregados que são neutralizados após transferência da solução
aquosa para a proteína mantêm-se intactos na interface solução-ar (Kyte e Doolittle,
1982).
Outra propriedade física usada na medição da hidrofobicidade dos aminoácidos
é a energia livre de solvatação (Biswas et al., 2003). A energia livre de solvatação é
estimada como o produto da acessibilidade de um átomo ao solvente por um parâmetro
de solvatação atómico.
Makhatadze e Privalov (1990) mediram a capacidade calorífica aparente de
vários péptidos e compostos orgânicos usando a microcalorimetria na gama de
temperatura entre os 5 e os 125ºC. Os aminoácidos foram divididos em 3 categorias,
com base nos valores das suas capacidades caloríficas, e são classificados como
hidrofóbicos se o aumento da temperatura conduz à diminuição dos valores da variação
da capacidade calorífica. Com base neste método a treonina, tirosina e histidina foram
categorizados.
Outra técnica de medição de escalas de hidrofobicidade de aminoácidos baseada
na medição de propriedades físicas é a temperatura de transição, esta é medida por
calorimetria diferencial de varrimento (DSC) e o estudo estabelece uma relação entre a
hidrofobicidade relativa do péptido e o inverso da sua temperatura de transição. No
entanto existem várias desvantagens no uso da temperatura de transição para a medição
da hidrofobicidade. A carga e a baixa solubilidade de alguns aminoácidos influenciam
os valores de hidrofobicidade obtidos (Biswas et al., 2003). Também o “melting”
gradual das proteínas pode conduzir a valores que são difíceis de distinguir (Bull e
Breese, 1974).
Examinando os diferentes métodos de medição da hidrofobicidade dos
aminoácidos anteriormente descritos, é razoável colocar a seguinte questão: como é que
os valores destes métodos correspondem a medições exactas da hidrofobicidade.
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 34
Um dos estudos mais completos acerca das discrepâncias observadas nas escalas
de hidrofobicidade dos aminoácidos foi realizado por Trinquier e Sanejouand (1998).
Estes investigadores combinaram os vários valores da hidrofobicidade de 144 escalas e
desenvolveram um sistema de ordenação baseado na frequência com que cada
aminoácido é marcado como hidrofílico ou hidrofóbico. Foram produzidos três grupos
como resultado desta análise: Como aminoácidos hidrofóbicos existem o triptofano, a
metionina, a cisteína, a fenilalanina, a isoleucina, a leucina, a valina, a glicina, a
arginina e a serina. Como aminoácidos hidrofílicos existem a tirosina, a asparagina, a
lisina, o aspartato, o glutamato, a histidina e a glutamina. Como aminoácidos
ambivalentes existem a alanina, a treonina e a prolina (Biswas et al., 2003). Trinquier e
Sanejouand (1998) afirmaram que estas categorias deveriam ser aceites com algum grau
de precaução uma vez que não partem de uma amostra suficientemente grande.
1.4.2. Métodos para o estudo das interacções
Cooper (1999) abordou a questão da compreensão da termodinâmica de
interacção entre as biomoléculas e afirmou que existindo modelos que examinam estas
interacções, estes dificilmente distinguem os vários componentes da interacção, como
proteína-proteína, proteína-ligando e ácido nucleico-ligando. Nesta mini-revisão de
(Cooper, 1999) as vantagens das medidas de calorimetria sobre a análise de Van’t Hoff
são discutidas assim como a compensação entropia-entalpia.
Como já foi referido anteriormente a cromatografia é um método
tradicionalmente usado para a separação das misturas. No entanto a coluna
cromatográfica em vez de ser usada somente como meio de separação, pode também ser
usada como ferramenta para a medição das interacções. A fase estacionária pode ser
considerada como o “receptor” enquanto que as amostras injectadas podem ser
consideradas como “ligandos” (Biswas et al., 2003). Mant e Hodges (1989) aplicaram
esta premissa para medirem as interacções e estudarem a hidrofobicidades dos
aminoácidos. Lin et al. (2000) estudaram extensivamente a área dos péptidos e das
proteínas e como é que estas moléculas interagem com as fases estacionárias apolares.
Diferentes áreas de cromatografia foram utilizadas no estudo das interacções
entre aminoácidos, destacamos aqui a HIC. Vailaya e Horvath (1996) realizaram um
estudo usando três tipos de fases estacionárias diferentes e uma série de aminoácidos
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 35
derivados de dansyl com a finalidade de determinarem as interacções hidrofóbicas.
Foram realizados muitos estudos de modo a interpretar o papel da concentração de sal
em HIC mas até este estudo, os efeitos da temperatura ainda não tinham sido
investigados. Os dados termodinâmicos deste estudo revelaram efeitos significativos da
capacidade calorífica demonstrando uma variação positiva de entalpia e entropia a
baixas temperaturas e a elevadas temperaturas uma diminuição e aproximação de
valores negativos (Biswas et al., 2003) destas quantidades. Os dados calorimétricos
traduziram muito bem os seus resultados, mostrando que esta característica identifica o
processo hidrofóbico.
1.5. Aspectos gerais dos péptidos utilizados
É do conhecimento geral a importância significativa dos péptidos para os
organismos vivos. A capacidade de detectar, quantificar e modelar estas biomoléculas é
extremamente importante para o estudo das suas funções básicas. Esta capacidade é
importante especialmente na área da bioanalítica (Buszewski et al., 2007). O método
mais popular para a análise de péptidos é a cromatografia líquida de alta pressão
(HPLC). O comportamento cromatográfico dos péptidos é determinado pelo carácter
das suas cadeias laterais e grupos substituintes, que definem o seu carácter ácido ou
básico (presença de grupos ionizáveis) ou o grau de hidrofobicidade ou hidrofilicidade.
Por outro lado a estrutura dos péptidos desempenha também um papel bastante
relevante durante a eluição cromatográfica (Buszewski et al., 2007). Neste projecto
péptidos como a Angiotensina I e seus derivados serão utilizados de modo a esclarecer o
mecanismo de interacção com o adsorvente.
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 36
1.5.1. Angiotensina I
O péptido utilizado neste estudo foi a Angiotensina I humana. Este é formado na
circulação por acção da renina, secretada pelos rins, sobre o angiotensinogénio
produzido pelo fígado (Do et al., 1987).
A Angiotensina I é o percursor da Angiotensina II, conhecida pela sua
multiplicidade de acções biológicas, relacionadas com o sistema endócrino e com o
sistema nervoso central e periférico (Spyroulias et al., 2003). Embora a Angiotensina I
não exiba o mesmo interesse biológico e farmacológico que a Angiotensina II, é o
percursor desta última. Após hidrólise pela peptidil –peptidase A ou kinase II, a inerte
Angiotensina I (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu) é convertida na
biologicamente activa Angiotensina II (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) (Skeggs et
al., 1956). A Angiotensina II é um potente agente vasoactivo tendo um papel vital na
regulação da pressão sanguínea, na conservação do volume sanguíneo total e na
homeostase (Spyroulias et al., 2003) está também envolvida na libertação da ADH
(hormona anti-diurética) no crescimento celular e na estimulação do sistema nervoso
simpático.
Um dos maiores problemas em determinar a conformação da Angiotensina em
solução, a uma resolução elevada, é a disponibilidade de material altamente purificado.
A interpretação dos dados físicos de uma grande quantidade de péptidos sintéticos de
elevada pureza sugere a existência de diferentes populações de conformações (Galardy
et al., 1976).
Spyroulias et al., (2003) analisaram a estrutura da Angiotensina I através de
espectroscopia bidimensional de ressonância magnética nuclear de protão em
dimetilsulfóxido e numa mistura de 2,2,2 – trifluoroetanol/água. Estes autores
demonstraram que os resíduos de Tyr4, His6 e Phe8 compreendem o núcleo hidrofóbico
que se encontra no centro da molécula. Os anéis de Tyr4 e His6 formam um ângulo de ≈
35º, enquanto que a distância entre os seus centros é de 6,1 Å. O anel fenil da Phe8
encontra-se orientado na direcção do “centro” hidrofóbico formado pela Tyr4 e pela
His6 (figura 1.8).
Spyroulias et al., (2003) demonstraram ainda que os terminais do péptido
possuem um carácter hidrofílico devido à densidade de cargas negativas no terminal C e
à densidade de cargas positivas no terminal N (figura 1.8), tais propriedades impõem à
Angiotensina I um carácter de dipolo.
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 37
Um outro estudo de ressonância magnética nuclear da Angiotensina foi realizado
por (Galardy et al., 1976). Estes autores estudaram a dependência da conformação da
Angiotensina do pH. Observaram que o isómero cis (em menor quantidade) e o isómero
trans (em maior quantidade) são claramente visíveis para as ressonâncias do carbono γ
da prolina 7 a elevado valor de pH, enquanto que apenas a baixo pH o trans é visível.
Mostraram assim a possibilidade de isomerização cis-trans da prolina 7 no péptido
Angiotensina.
A existência de duas conformações para a Angiotensina II a elevados valores de
pH pode ser relevante em termos de actividade biológica. O aumento da actividade
biológica observado para a Angiotensina II com o aumento de pH pode assim ser
resultado da existência do isómero cis-prolina (Schaechtelin et al., 1974).
Figura 1.8. Estrutura da Angiotensina I. Os potenciais electrostáticos à superfície molecular estão
codificados por cores: potenciais menores que -10 kT estão ilustrados a vermelho, potenciais superiores a
10 kT estão a azul e potenciais neutros (0 kT ) estão a branco (k é a constante de Boltzmann, 1,380622
x10-23 J/K e T é a temperatura absoluta) (Spyroulias et al., 2003).
Estrutura principal
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 38
1.5.2. Péptidos derivados da Angiotensina I
É sabido que factores como a composição e sequência em aminoácidos de um
péptido e o tamanho da sua cadeia podem afectar fortemente a sua retenção em
cromatografia de interacção hidrofóbica. Apesar de a hidrofobicidade relativa dos
diferentes péptidos poder ser avaliada por diferentes métodos, a compreensão a nível
molecular de como os diferentes aminoácidos presentes interagem com a superfície
hidrofóbica não é facilmente obtida (Liu et al., 2006). De acordo com Liu et al., (2006)
a interacção hidrofóbica pode ser dividida em cinco sub-processos sequenciais: (a)
moléculas de água ou iões que rodeiam a superfície das biomoléculas são excluídas, (b)
moléculas de água ou iões que rodeiam o adsorvente de HIC são excluídas; (c)
interacções hidrofóbicas entre a biomolécula e o adsorvente, (d) rearranjo estrutural da
biomolécula no adsorvente e (e) rearranjo estrutural no seio da solução das moléculas de
água e iões excluídos. A forma como cada aminoácido participa em cada sub-processo
necessita de ser elucidada.
De forma a interpretar a contribuição hidrofóbica no processo de adsorção de
alguns dos aminoácidos na Angiotensina I foi realizado um estudo alterando apenas um
aminoácido na sua sequência. Neste estudo aplicamos na substituição apenas
aminoácidos alifáticos. O grupo dos aminoácidos alifáticos é considerado o maior grupo
de aminoácidos que contribui para a hidrofobicidade das biomoléculas. Num estudo
realizado por Liu et al., (2006) a contribuição hidrofóbica dos aminoácidos alifáticos
segue uma determinada ordem: leucina> isoleucina> valina> alanina. Este resultado é
semelhante aos obtidos pelas diferentes escalas de hidrofobicidade. Com excepção da
leucina que aparece como sendo mais hidrofóbica que a isoleucina. Num estudo
realizado por Meek (1980) os coeficientes de retenção (em minutos) determinados por
HPLC de fase reversa numa coluna de ODS demonstraram que os aminoácidos
alifáticos e aromáticos contribuem positivamente para os valores de retenção e que se
alteram com as pequenas variações de pH. Os resíduos com cadeias acídicas contribuem
negativamente para os valores de retenção que aumentam de magnitude com o aumento
do seu estado ionizado. Os resíduos dos aminoácidos básicos e neutros contribuem com
um pequeno efeito na retenção (Meek, 1980).
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 39
1.6. Aspectos gerais dos suportes utilizados em HIC
O primeiro tipo de fase estacionária hidrofóbica foi obtido por ligação de vários
aminoácidos apolares a um suporte inerte ou matriz (Rimerman e Hatfield, 1973). O
suporte mais usado foi a agarose mas a celulose, dextrano e sílica também foram
empregues (Queiroz et al., 2001). Inicialmente a fase estacionária usada em HIC exibia
tanto um carácter hidrofóbico como iónico (Er-el et al., 1972; Yon, 1972; Hofstee,
1973) resultando da ligação de grupos amina alifáticos e aromáticos à agarose
(Sepharose) pelo método do brometo de cianogénio (Axén et al., 1967). Assim o
fraccionamento cromatográfico obtido com estas fases estacionárias era devido tanto a
interacções electrostáticas como hidrofóbicas com as proteínas (Queiroz et al., 2001).
Porath et al., (1973), Hjertén et al., (1974) foram os primeiros investigadores a
sintetizar adsorventes hidrofóbicos não carregados. Hjertén et al., (1974) aplicou um
método baseado no éter glicidil que hoje em dia é muito aplicado na produção dos géis
comerciais phenyl e octyl Sepharose.
Os géis constituídos por polissacarídeos (agarose) são os suportes mais usados na
tradicional HIC de baixa pressão, no entanto em HIC de alta pressão têm sido
introduzidas várias fases estacionárias baseadas em suportes orgânicos e inorgânicas
constituídas por micropartículas rígidas (Queiroz et al., 2001).
Os vários tipos de fases estacionárias podem diferir no tipo de ligando, no
tamanho da cadeia do ligando, na densidade de ligando e no tipo de matriz ou suporte.
Os ligandos mais usados em HIC são cadeias lineares de alcanos com ou sem um
grupo amino terminal. Phenyl (e outros grupos aromáticos) são também usados como
ligandos com bons resultados devido à mistura de interacções hidrofóbicas com
interacções aromáticas (П-П). Para um grau de substituição constante na matriz a
hidrofobicidade e a força de interacção aumenta com o aumento do comprimento da
cadeia alquil linear: metyl<ethyl<propyl< buty<l pentyl< hexyl< heptyl <octyl no
entanto a selectividade de adsorção pode decrescer (Queiroz et al., 2001).
Neste trabalho foi usada como matriz a Sepharose. Os suportes comerciais
utilizados (figura 1.9) são sintetizados por imobilização covalente de Phenyl em
Sepharose High Performance, Butyl em Sepharose 4 Fast Flow e Octyl em Sepharose
CL-4B, respectivamente.
1.Introdução
Universidade da Beira Interior 40
Figura 1.9. Estrutura da Phenyl-Sepharose High Performance, Butyl-Sepharose 4 Fast Flow e Octyl-
Sepharose CL-4B, respectivamente (Queiroz et al., 2001).
A matriz Phenyl Sepharose High Performance é formada por acoplamento de
ligandos phenyl, a agarose 6% via ligações éter estáveis e tanto a Butyl -Sepharose 4
Fast Flow como a Octyl-Sepharose CL-4B são formadas por acoplamento de ligandos
butyl e octyl, respectivamente, a agarose 4% via também ligações éter estáveis
(Pharmacia).
2.Objectivos
Universidade da Beira Interior 41
2- Objectivos
Existe um interesse prático considerável em desenvolver um melhor
entendimento dos mecanismos subjacentes à adsorção de biomoléculas em
cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC).
Assim sendo, o principal objectivo deste trabalho é investigar o mecanismo pelo
qual o péptido Angiotensina I, estruturalmente mais simples que uma proteína, adsorve
ao suporte cromatográfico de interacção hidrofóbica. Sob condições cromatográficas
lineares, são analisados no processo os efeitos da temperatura, do suporte, da
concentração e tipo de sal e da substituição de aminoácidos no péptido.
3.Procedimento Experimental
Universidade da Beira Interior 42
3. Procedimento Experimental
3.1. Reagentes 3.1.1. Fase estacionária Os suportes de HIC usados neste trabalho foram a Phenyl-Sepharose High
Performance, Butyl-Sepharose 4 Fast Flow, e a Octyl-Sepharose CL-4B (figura 1.9),
ambas adquiridas à GE Healthcare Life Sciences (Uppsala, Sweden). Cada suporte é
empacotado numa coluna com uma altura de 1,9 cm e com um diâmetro de 1,0 cm.
Algumas das características dos suportes são enumeradas na tabela 3.1 a 3.3.
Tabela 3.1: Características da Phenyl-Sepharose High Performance (Pharmacia).
Estrutura dos poros
Agarose a 6%, em forma esférica
Tamanho mínimo das partículas
34 µm
Limites das dimensões das partículas
24-44 µm
Grau de substituição
Aproximadamente 25 µm de phenyl/ mL
de gel
Tabela 3.2: Características da Butyl-Sepharose 4 Fast Flow (Pharmacia).
Estrutura dos poros
Agarose a 4%, em forma esférica
Tamanho mínimo das partículas
90 µm
Limites das dimensões das partículas
45-165 µm
Grau de substituição
Aproximadamente 50 µmol de grupos
butyl/ mL de gel
3.Procedimento Experimental
Universidade da Beira Interior 43
Tabela 3.3: Características da Octyl-Sepharose CL-4B (Pharmacia).
Estrutura dos poros
Agarose a 4%, em forma esférica
Tamanho mínimo das partículas
90 µm
Limites das dimensões das partículas
45-165 µm
Grau de substituição
Aproximadamente 40 µm de octyl/ mL de
gel
3.1.2. Péptidos
A Angiotensina I Humana (figura 1.8) com um grau de pureza superior a 90%
(HPLC) foi escolhida como péptido de estudo. A angiotensina I é um péptido com peso
molecular de 1296 Da e cuja sequência de aminoácidos é Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-
Phe-His-Leu; foi adquirida à Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA), e foi usada sem
purificações adicionais.
Outros péptidos (tabela 3.4 e 3.5) também aplicados no sistema de cromatografia
líquida foram os derivados da Angiotensina I Humana também estes adquiridos à
Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). O estudo destes péptidos foi realizado de modo a
interpretar o papel de cada aminoácido substituído no péptido no processo de adsorção
por interacção hidrofóbica.
3.Procedimento Experimental
Universidade da Beira Interior 44
Tabela 3.4. Características dos péptidos usados.
Péptidos
derivados da
Angiotensina I
Sequência
Massa Molecular
(Da)
Pureza (%)
Ile 10 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-
Phe-His-Ile 1297 95
Ala 10 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-
Phe-His-Ala 1254 88
Val 10 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-
Phe-His-Val 1282,5 97
Val 5 Asp-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-
Phe-His-Leu 1282 93
Val 7 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Val-
Phe-His-Leu 1299 95
Tabela 3.5. Apresentação dos valores de hidrofobicidade a pH 6.8 dos vários péptidos estudados
(https://www.sigmaaldrich.com/cgibin/hsrun/Suite7/Suite/HAHTpage/Suite.HsDesignTool.run?prod_type=
PPEPTIDE.).
Angiotensina e péptidos derivados desta Hidrofobicidade (pH 6.8)
Angiotensina I
33,60
[Isoleucina 10] – Angiotensina I
33,50
[Alanina 10] -Angiotensina I
27,70
[Valina 10] -Angiotensina I
31,20
[Valina 5] -Angiotensina I
31,30
[Valina 7] -Angiotensina I
45,80
3.Procedimento Experimental
Universidade da Beira Interior 45
3.1.3. Outros reagentes
Em todas as experiências foi usado tampão fosfato (pH 7) o qual consiste numa
mistura de soluções de fosfato de sódio dibásico e monobásico (tabela 3.6). Como
modelador foram utilizados o sulfato de amónio e sódio (tabela 3.6). Outros reagentes
utilizados na técnica de HIC são igualmente enumerados na tabela 3.6.
Tabela 3.6. Reagentes utilizados na técnica de cromatografia de interacção hidrofóbica.
Reagentes Grau de pureza (%) Marca
Etanol (C2H6O) 99,5% Panreac
Hidróxido de sódio (NaOH) > 98% Pronalab
Ácido clorídrico (HCl) ≥ 99,5% Merck
Cloreto de sódio (NaCl) ≥ 99,5% Merck
Sulfato de amónio ((NH4)2SO4) 100% Sigma-Aldrich
Sulfato de sódio (Na2SO4) 99% Merck
Dihidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4)
99% Riedel-de-Haën
Hidrogenofosfato de sódio (Na2HPO4)
99% Sigma-Aldrich
3.Procedimento Experimental
Universidade da Beira Interior 46
3.2. Instrumentação
3.2.1. Equipamento Para a obtenção dos diferentes dados experimentais foi utilizado o sistema
cromatográfico de alta resolução (HPLC/FPLC), AKTA PURIFIER 10 da GE
Healthcare Life Sciences (Uppsala, Sweden) desenhado para separações rápidas e
seguras de biomoléculas tais como proteínas, péptidos ou ácidos nucléicos. Este sistema
pode ser utilizado em várias técnicas cromatográficas nas quais se aplicam gamas de
trabalho que vão desde o µg ao mg, taxas de fluxo de 0,001 mL/min a 10 mL/min e
pressões de 0-25 MPa. O AKTA PURIFIER possui um sistema operacional de fácil
execução, incorporando várias características que minimizam o tempo de preparação
dos ensaios e maximizam a reprodutibilidade dos resultados. Os sistemas do AKTA
PURIFIER são controlados pela UNICORN 5.11.
Figura 3.1. Figura representativa do sistema cromatográfico AKTA PURIFIER
(http://www.york.ac.uk/depts/biol/tf/protein_purifier.htm) (12/03/08).
Tampão
Monitor (condutividade,pH)
Detector de UV
Bombas
Bomba A Bomba B
Misturador
Válvula de saída
Filtro
Injector
3.Procedimento Experimental
Universidade da Beira Interior 47
A temperatura foi controlada por um banho da Amersham Bioscience (Uppsala,
Sweden) o Multi- Temp III, o qual circula através da camisa termostática, que envolve a
coluna, água a temperatura constante com uma precisão de ± 0,1 ºC.
3.2.2. Eluição isocrática
A determinação do factor de capacidade medido para a Angiotensina I e seus
derivados foi realizada a várias temperaturas 288; 293; 298; 303 e 308 K. A coluna é
inicialmente equilibrada com a fase móvel de interesse (sulfato de amónio ou sulfato de
sódio com concentrações que variaram entre 0,5 e 1,5 M) a uma taxa de fluxo que
variou entre 0,5 e 5,0 ml/min. Considera-se atingido o equilíbrio quando a linha de base
do ultravioleta e a condutividade se mantêm estáveis. O tempo de retenção do soluto (tr)
foi obtido através da injecção de 100 µL de diferentes concentrações (0,1; 0,075; 0,050;
0,1 mg/ml) de Angiotensina I Humana e seus derivados (usando como solvente o
tampão fosfato, pH 7, com modelador). O tempo de eluição de um composto não retido
(t0) foi determinado injectando à mesma taxa de fluxo a mesma quantidade e
concentração de amostra preparada em tampão fosfato sem modelador. O perfil da
eluição foi determinado por medições contínuas de absorvância a 220 nm. Foram
realizados entre 2 a 3 ensaios para o estudo do perfil de cada eluição. Posteriormente à
eluição, a coluna foi lavada com 5 volumes de tampão fosfato 10 mM a pH 7 de forma a
eluir qualquer material que tenha permanecido ligado hidrofobicamente à coluna e em
seguida com água destilada e etanol 20%.
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 48
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220 n
m) 0.7 M Sulfato de amónio
0.8 M
0.9 M
1.0 M
1.2 M
1.4 M
1.5 M
10 mM de tampão fosfato
4. Resultados e Discussão 4.1. Adsorção da Angiotensina I em Butyl-Sepharose 4.1.1. Interpretação das curvas cromatográficas
O comportamento de retenção da Angiotensina I numa coluna de Butyl-
Sepharose foi investigado em função da concentração de sal (figura 4.1) e temperatura
(figura 4.2). Sob condições de eluição isocrática e a elevadas concentrações de sal uma
das características a salientar acerca da performance da Angiotensina I humana é o
“tailing” do pico ou a presença de dois picos no perfil cromatográfico.
Figura 4.1. Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa
coluna Butyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador diferentes concentrações de (NH4)2SO4 em
10 mM de tampão fosfato, pH 7.
A presença de mais picos num cromatograma do que o esperado com base no
número de componentes na amostra é usualmente atribuído a impurezas. Para testar esta
hipótese, os picos I e II resultantes da separação mostrada na figura 4.3.A foram
recolhidos e re-cromatografados sob as mesmas condições. Ambas as fracções, apesar
da sua homogeneidade inicial, eluíram também como dois picos (figura 4.3.B). Com
base nestes resultados, é pouco provável a presença de impurezas o que era de esperar
uma vez que a Angiotensina I utilizada apresenta uma pureza superior a 95%.
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 49
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
Volume (ml)
Rela
tive A
bso
rban
ce (
mA
U)
(220 n
m)
288 K
293 K
298 K
303 K
308 K
10 mM phosfate buffer10 mM de tampão fosfato
Figura 4.2. Cromatografia de interacção hidrofóbica (1ml/min) da Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa
coluna Butyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,2 M (NH4)2SO4 em 10 mM
de tampão fosfato, pH 7.
Figura 4.3.A. Cromatografia de interacção hidrofóbica (0,5ml/min) da Angiotensina I (0,075 mg/ml)
numa coluna de Butyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador 1,2 M de (NH4)2SO4 em 10 mM de
tampão fosfato, pH 7.
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Absorv
ância
Rela
tinva (m
AU
)
(220nm
)
Pico I
Pico II
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 50
0,00
1,00
2,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Ab
so
rvâ
nc
ia R
ela
tiv
a (
mA
U)
(22
0n
m)
Figura 4.3.B. Reinjecção (0,5 ml/min) das fracções colectadas da adsorção de Angiotensina I (0,075
mg/ml) numa coluna de Butyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador 1,2 M de (NH4)2SO4 em 10
mM de tampão fosfato, pH 7 ─ Reinjecção do pico I; ─ Reinjecção do pico II.
Existem, contudo uma série de razões físicas pelas quais uma substância pode
produzir picos múltiplos. Entre estas razões físicas encontram-se uma introdução pobre
da amostra na coluna, a heterogeneidade do empacotamento da coluna (Cavazzini et al.,
1999), uma má distribuição do fluxo de eluente (Horvath e Lin, 1976) e um perfil radial
de temperatura na coluna não uniforme (Perchalski e Wilder, 1979). A introdução da
amostra e o controlo do fluxo do eluente foram realizados correctamente considerando
as características do sistema cromatográfico usado, o AKTA PURIFIER 10. De forma a
verificar o empacotamento da coluna, o factor de assimetria (Af) foi calculado e o valor
obtido foi de 1.5, um valor bastante razoável para colunas de HIC pequenas (Builder,
1993). Finalmente o perfil de temperatura na coluna foi assegurado por uma camisa de
termostatização (adquirida à GE Healthcare) com uma precisão de ± 0,1 ºC. Assim,
nenhuma das razões físicas acima enumeradas parece estar na origem dos perfis
cromatográficos observados neste trabalho. Uma outra interpretação dos resultados
poderia ser a presença de uma superfície não homogénea (Jungbauer et al., 2005).
Podem existir zonas no suporte com elevada e baixa afinidade para as biomoléculas.
Neste caso, a razão de ambos os picos seria constante e não deveria depender da
concentração de sal na fase móvel (figura 4.1) e da temperatura (figura 4.2).
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 51
A cinética de transferência de massa e a sobrecarga da coluna podem também
ser responsáveis pelo perfil cromatográfico aqui observado. O processo cinético que dita
o “broadening” da banda de moléculas de baixo peso molecular, e de moléculas
orgânicas rígidas é influenciado pela dispersão axial no seio da fase móvel, dispersão
devido a uma transferência de massa lenta no espaço intrapartículas e dispersão devido
à resistência de transferência de massa na fase móvel e na fase estacionária (Builder,
1993). Para compostos onde a área superficial molecular e a respectiva difusividade do
soluto permanecem essencialmente constantes durante a análise cromatográfica, cada
uma das contribuições para um “broadening” da banda enumeradas acima podem ser
satisfatoriamente contabilizadas por tratamento teórico (Builder, 1993), designadamente
a equação de Van Deemter. Dois pontos fundamentais distinguem a origem de um
“broadening” do pico com origem na cinética de transferência de massa de outros
efeitos, particularmente os de origem não linear. Sabe-se que o “broadening” de origem
não linear diminui à medida que a concentração da amostra diminui, enquanto que o
“broadening” com origem na cinética de transferência de massa é pouco afectado por
tais alterações, também o “broadening” cinético é especialmente proeminente a elevadas
velocidades (Fornstedt et al., 1996; Lin et al., 1988), mas o “broadening” não linear é
quase independente da taxa de fluxo (Minoura et al., 2002). Na figura 4.4 podemos
observar que com a diminuição da concentração da amostra os perfis de eluição do
péptido são idênticos sendo a área total do pico proporcional à concentração da amostra,
também o tempo de retenção da amostra demonstrou pouca dependência da sua
concentração. Por outro lado o “broadening” depende da taxa de fluxo (figura 4.5),
podemos observar que o “broadening” aumenta com o aumento da taxa de fluxo como
esperado da cinética de transferência de massa no entanto o “splitting” do pico é mais
proeminente a velocidades lentas. Em condições extremas o “splitting” do pico com
origem na cinética de transferência de massa pode ser observado quando uma porção da
amostra injectada abandona a coluna a um tempo zero não sendo retida, enquanto que o
resto da amostra elui com um perfil alongado (Cavazzini et al., 1999). As tendências
observadas com a variação da concentração de sulfato de amónio e da temperatura
(figuras 4.1 e 4.2) à primeira vista parecem ser consistentes com um pico “flow-
through”, mas não é o caso porque o primeiro pico elui a um tempo diferente do tempo
de eluição do traço “inerte” (t0) (figura 4.1 e 4.2). Também, como referido
anteriormente, a dependência do perfil cromatográfico da taxa de fluxo (figura 4.5)
demonstrou um “splitting”do pico mais proeminente a baixas taxas de fluxo. A uma
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 52
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
Volume (ml)
Ab
so
rvâ
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ia R
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tiv
a (
mA
U)
(22
0 n
m)
0.1 mg/ml
0.075 mg/ml
0.050 mg/ml
0.025 mg/ml
taxa de fluxo baixa um pico “flow-through” é menos provável uma vez que existe
tempo suficiente para ser estabelecido o equilíbrio entre a Angiotensina I ligada e não
ligada. Logo para explicar estes resultados, outros mecanismos que não a cinética de
transferência de massa e a sobrecarga da coluna devem ser tidos em conta.
Figura 4.4. Perfil da eluição (1ml/min) de diferentes concentrações de Angiotensina I numa coluna
Butyl-Sepharose a 298.15 K com 1,2 M de (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7.
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 53
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Ab
so
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a (
mA
U)
(22
0n
m)
0.5 ml/min
1.0 ml/min
1.5 ml/min
2.0 ml/min
5.0 ml/min
Figura 4.5. Efeito da taxa de fluxo na forma dos picos resultantes da adsorção da Angiotensina I a uma
coluna de Butyl-Sepharose a 298.15 K em presença de 1,2 M de (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato,
pH 7.
A agregação do soluto e alterações na composição molecular da área de contacto
hidrofóbica estabelecida entre o soluto e os ligandos podem também causar o
“broadening” e/ou “splitting” do pico. A agregação do soluto não é provavelmente
responsável pelo fenómeno observado sob as condições cromatográficas de interacção
hidrofóbica usadas e a concentração de péptido empregue.
As variações na composição molecular da área de contacto hidrofóbica
estabelecida entre o soluto e os ligandos cromatográficos pode ser a causa para o
“broadening” da banda ou até mesmo do “splitting” do pico, mas se for este o caso,
apenas ocorrerá durante o contacto com a fase estacionária, após a interacção o péptido
sofre uma “re-conformação” uma vez que o perfil de eluição da Angiotensina I (figura
4.3.A) e a reinjecção das fracções colectadas são semelhantes (figura 4.3.B).
A interconversão entre diferentes estados conformacionais pode levar à
formação de regiões de interacção múltiplas envolvendo a superfície da molécula e dos
ligandos imobilizados no suporte e a alterações na cinética de adsorção (Purcell et al.,
1993).
Associadas com a interconversão conformacional estão mudanças nas dimensões
hidrodinâmicas dos péptidos as quais influenciam as suas propriedades de difusão,
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 54
contudo as mudanças nas regiões interactivas do péptido terão um efeito mais
significativo no perfil experimental observado (Purcell et al., 1993), particularmente
quando esta alteração ocorre na presença da superfície cromatográfica. A capacidade de
detectar e resolver estes intermediários cinéticos dependerá da sensibilidade da técnica
de espectroscopia, do tempo de relaxação cromatográfica associado com os diferentes
fenómenos, da magnitude das diferenças entre o tempo de retenção para as diferentes
espécies, e na variância do pico de cada espécie (Melander et al., 1982).
É sabido que os péptidos podem estar tanto na conformação cis como na trans no
que respeita à ligação amida, no entanto a maior parte dos péptidos existem
exclusivamente na forma trans. Contudo, uma mistura dos isómeros pode muitas vezes
ser observada com péptidos que contêm um grupo amino secundário (prolina ou os
aminoácidos N-alquilados). A prolina é conhecida como tendo um papel único, uma vez
que a sua cadeia lateral se encontra ligada a um átomo de azoto α, o isómero cis deste
péptido é apenas ligeiramente menos estável do que o isómero trans e ambos os
isómeros são geralmente observados durante os estudos de NMR de pequenos péptidos
que contêm na sua composição o aminoácido prolina (Lebl et al., 1991). A
Angiotensina I como péptido precursor da Angiotensina II, um péptido que possui uma
gama interessante de actividades biológicas e um interesse farmacológico bastante
relevante, foi igualmente estudado por espectroscopia de 1H NMR (Spyroulias et al.,
2003; Liakopoulou-Kyriakides e Galardy, 1979; Galardy et al., 1976). Este estudo
demonstrou que estes péptidos exibem isomerismo cis-trans da ligação Histidina-
Prolina (Galardy et al., 1976). Esta observação é consistente com o facto de que a
velocidade de isomerização de ambas as estruturas é lenta quando comparada com a
escala de tempo da análise de NMR. A velocidade à qual uma nova composição de
equilíbrio da mistura cis-trans é alcançada por pequenas variações das condições é
relativamente lenta, (na mesma escala de tempo que uma corrida em FPLC) (Melander
et al., 1982). Assim, a rotação cis-trans da ligação prolina pode estar na origem dos
perfis cromatográficos observados neste trabalho. O fenómeno poderá ser causado por
uma cinética de isomerização lenta que se encontra na mesma escala de tempo da
separação cromatográfica (Melander et al., 1982). Melander et al., (1982) estudaram em
detalhe o efeito da isomerização cis-trans de dipéptidos que continham na sua estrutura
o aminoácido prolina por RPC. Os seus resultados demonstraram claramente que a
isomerização lenta da ligação imido no péptido é a responsável pela formação do
“splitting” do pico sob condições isocráticas; a área superficial hidrofóbica que afecta a
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 55
força da ligação do eluído à fase estacionária é diferente para a conformação trans e cis,
a forma cis tem uma maior área superficial hidrofóbica. Também o estudo de Gesquire
et al., (1989) e Lebl et al., (1991) acerca da isomerização cis-trans de pequenos péptidos
com aminoácido prolina é consistente com esta conclusão. No entanto, o perfil
cromatográfico observado no nosso estudo é distinto do estudo realizado por Yamasaki
et al., (1999) e Byun et al., (2000). Nos seus estudos usando Angiotensina I, nenhum
“broadening” da banda e/ou “splitting” do pico foi referido por estes autores. As
diferenças observadas podem ter base nos diferentes sistemas péptido/adsorvente
estudados (Phenyl-5PW, Ether-5PW e Synchropak pentyl columns), dando ênfase aos
distintos comportamentos que os sistemas podem manifestar, e à importância de
caracterizar cada sistema de forma independente.
Outra forma de analisarmos a origem do “splitting” do pico foi substituindo a
prolina na posição 7 da Angiotensina I pela valina nesta mesma posição. Uma vez que
este péptido modificado possui um coeficiente de hidrofobicidade maior que a
Angiotensina I (tabela 3.5) em presença de 1,2 M de sulfato de amónio e à temperatura
de 298 K ficou retido na coluna de Butyl-Sepharose tendo sido apenas eluído após a
regeneração da coluna com tampão fosfato a pH 7 (figura 4.6.A e 4.6.B).
Figura 4.6.A. Cromatografia da interacção hidrofóbica (1 ml/min) da [Valina 7] – Angiotensina I (0,025
mg/ml) numa coluna Butyl-Sepharose a 298 K em presença de 1,2 M (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão
fosfato, pH 7.
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Ab
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mA
U)
(22
0n
m)
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 56
-100,00
-50,00
0,00
50,00
100,00
150,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220n
m)
Figura 4.6.B. Regeneração da coluna (1 ml/min) após eluição da [Valina 7] – Angiotensina I (0,025
mg/ml) de uma coluna de Butyl-Sepharose a 298 K com 10 mM de tampão fosfato, pH 7.
Com base na análise realizada neste ponto pode ser assumido que o primeiro
pico, do perfil cromatográfico resultante da eluição da Angiotensina I numa coluna de
Butyl-Sepharose, representa a forma trans da Angiotensina I, o segundo pico representa
a forma cis e a conversão entre estas duas formas é promovida em presença do suporte
Butyl-Sepharose, a altas concentrações de sal no eluente. De facto, a análise dos perfis
cromatográficos mostra que os dois picos se encontram em coalescência (figura 4.1 e
4.2) sugerindo que a região localizada entre eles contém moléculas que experimentaram
uma alteração da conformação durante a eluição e que ocorreu uma isomerização cis-
trans significativa da Angiotensina I na coluna (Gesquiere et al., 1989). A semelhança
entre o perfil da eluição da Angiotensina I (figura 4.3.A) e a reinjecção das fracções
colectadas (figura 4.3.B) também reforça a ideia de um processo que ocorre na coluna
seguido de uma rápida “re-conformação” do péptido após interacção. O progresso da
alteração de conformação induzido pela interacção com a fase estacionária é claramente
dependente do tempo de contacto. Previsivelmente, à medida que o tempo de contacto
com o suporte aumenta, a probabilidade da molécula sofrer alteração da conformação
aumenta simultaneamente, resultando como já foi dito anteriormente no aumento do
“splitting” do pico observado a taxas de fluxo mais baixas (figura 4.5).
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 57
4.1.2. Efeito do tipo e concentração de sal
Na região linear da isotérmica, a adsorção pode ser completamente caracterizada
pelo comportamento do factor de retenção. Desta forma, os valores de retenção para a
Angiotensina I humana numa coluna Butyl – Sepharose foram determinados em função
do tipo e concentração de sal. A presença de sal desempenha uma grande influência
sobre o modo de equilíbrio em HIC (Queiroz et al., 2001). Assim, as eluições
isocráticas para a Angiotensina I humana numa coluna Butyl-Sepharose foram obtidas
aplicando diferentes concentrações de sulfato de amónio (figura 4.1) e sulfato de sódio
(figura 4.7) a 298 K.
Figura 4.7. Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa
coluna Butyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador diferentes concentrações de (Na2SO4) em
10mM de tampão fosfato, pH 7.
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220n
m)
0.6 M Sulfato de sódio
0.8 M
1.0 M
1.2 M
10 mM de tampão fosfato
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 58
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0
2
4
6
8
10
Absorv
ância
Rela
tiva (
mA
U)
(220nm
)
Volume (ml)
O factor de retenção, k’, medido sob condições isocráticas foi calculado
directamente dos cromatogramas como:
k’ = tr – t0 / t0
onde o tr é o tempo de retenção do soluto e t0 o tempo de eluição do soluto.
De forma a obter o tempo de retenção dos picos foi feito um “deconvolute” dos
cromatogramas onde se verificava a existência de dois picos, utilizando a subrotina
“Peak Fit” do programa MATLAB (figura 4.8).
Figura 4.8. Deconvolução do cromatograma de interacção hidrofóbica da Angiotensina I numa coluna
Butyl-Sepharose, 298.15 K a 1,2 M (NH4)2SO4 em 10 mM de fosfato, pH 7. Cromatograma real;
Picos individuais depois da deconvolução; Cromatograma soma de picos após deconvolução.
Este estudo indicou que não existe uma retenção significativa para as
concentrações mais baixas de sulfato de amónio 0,7; 0,8 e 0,9 M (tabela 4.1) a esta
temperatura. Mas para concentrações mais elevadas deste sal a retenção da
Angiotensina I humana neste suporte aumentou com o aumento da molaridade do
sulfato de amónio na fase móvel (tabela 4.1), como esperado de acordo com a teoria
solvofóbica. O mesmo resultado foi obtido aplicando diferentes concentrações de
sulfato de sódio, para as concentrações mais baixas de sulfato de sódio (0,6 e 0,8 M)
não existe uma retenção significativa (tabela 4.2) mas para as concentrações mais
elevadas deste sal (1,0 e 1,2 M) a retenção da Angiotensina I humana aumentou com o
aumento da molaridade de sulfato de sódio na fase móvel (tabela 4.2).
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 59
Tabela 4.1. Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna de Butyl-
Sepharose usando como modelador diferentes concentrações de [(NH4)2SO4] preparadas em tampão
fosfato, pH 7 a 298 K.
[(NH4)2SO4] (M) k’ (1ºpico) k’ (2º pico)
0,7 0,21 -
0,8 0,31 -
0,9 0,28 -
1,0 0,20 0,82
1,2 0,25 1,27
1,4 0,23 1,94
1,5 0,25 3,41
Tabela 4.2. Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna de Butyl-
Sepharose usando como modelador diferentes concentrações de [Na2SO4] preparadas em tampão fosfato,
pH 7, a 298 K.
[Na2SO4] (M) k’ (1ºpico) k’ (2º pico)
0,6 0,10 -
0,8 0,70 -
1,0 0,07 1,03
1,2 0,12 2,67
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 60
Quanto ao estudo do efeito do tipo de sal, indicou que a 298 K e para a mesma
concentração a retenção em presença de sulfato de sódio é maior que em presença de
sulfato de amónio, indicando que o sulfato de sódio tem uma maior habilidade para
promover as interacções hidrofóbicas entre a Angiotensina I e a Butyl-Sepharose. Este
facto deve-se ao sulfato de sódio possuir um incremento de tensão superficial molal
mais elevado que o sulfato de amónio (2,73x10-3 dym g cm-1 mol-1 versus 2,16x10-3
dym g cm-1 mol-1, respectivamente) (Melander et al., 1984; Shansky et al., 1990) desta
forma o sulfato de sódio irá promover um acréscimo da tensão à superfície superior ao
sulfato de amónio, o qual fortalece a interacção péptido-ligando (Pahlman et al., 1977;
Melander e Horváth, 1977).
Pode observar-se através da (figura 4.1 e 4.7) que à medida que a concentração
de sal aumenta, a área do primeiro pico diminui simultaneamente aumentando a área do
segundo pico. Estes resultados podem ser interpretados com base nos factos enumerados
no ponto 4.1.1 (Melander et al., 1982; Lebl et al., 1991; Galardy et al., 1976; Gesquiere
et al., 1989) que: (i) a maior parte dos péptidos existem exclusivamente na forma trans,
(ii) pequenos péptidos com prolina podem encontrar-se tanto na forma cis como na
forma trans, (iii) interconversão entre a forma trans e cis é promovida na coluna (iv)
devido a uma área hidrofóbica menor, a conformação trans do péptido elui mais
rapidamente do que a conformação cis correspondente.
Das figuras 4.1 e 4.7 também pode ser observado que para concentrações de sal
elevadas a retenção do segundo pico aumenta com o aumento da concentração de sal na
fase móvel, este comportamento é de esperar uma vez que a conformação cis da
Angiotensina I interage preferencialmente com a fase estacionária e a teoria solvofóbica
prevê o aumento da retenção com o aumento da concentração de sal (tabelas 4.1 e 4.2).
A energia livre das biomoléculas em solução é aumentada em presença de sulfato de
amónio e sulfato de sódio, devido ao poder destes sais para estruturarem a água. A
interacção entre a biomolécula e os ligandos aumenta à medida que a concentração do
sal aumenta. As moléculas de sal removem algumas moléculas de água que se
encontram a rodear a biomolécula e esta num esforço para reduzir a sua energia livre
adsorve-se à superfície do gel. Como consequência a energia livre da biomolécula é
reduzida porque a área superficial da biomolécula exposta ao sal é reduzida (Melander
et al., 1984).
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 61
-50,00
-30,00
-10,00
10,00
30,00
50,00
70,00
90,00
110,00
130,00
150,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
Volume (ml)
Ab
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rvân
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Rela
tiva (
mA
U)
(220n
m)
1.0 M Sulfato de amónio
1.4 M
1.5M
A HIC é uma forma alternativa de explorar as propriedades hidrofóbicas das
biomoléculas, trabalhando num ambiente mais polar e menos desnaturante que a RPC.
Como já foi dito anteriormente as interacções hidrofóbicas são promovidas na
presença de sal e assim as biomoléculas são retidas em presença de sais “salting-out”.
Quando as biomoléculas em presença do sal são injectadas numa coluna de HIC sob
condições isocráticas, dependendo da força de interacção podem ser observados
diferentes cenários: as biomoléculas podem ser retardadas na coluna mas não retidas ou
uma fracção da quantidade de amostra aplicada é eluída e o resto da amostra que ficou
retida no suporte é desorvida com tampão de concentração salina baixa ou água. A
interacção entre a Angiotensina I e a Butyl-Sepharose está relacionada com o primeiro
cenário, a Angiotensina I foi apenas retardada mas não retida na coluna, uma vez que a
regeneração da coluna com tampão fosfato 10 mM a pH 7.0 apresenta um perfil
cromatográfico idêntico para as diferentes condições estudadas após a eluição da
Angiotensina I a diferentes concentrações de sulfato de amónio (figura 4.9) ou após o
equilíbrio da coluna com diferentes concentrações de sulfato de amónio (figura 4.10).
Figura 4.9. Regeneração da coluna (1ml/min) após eluição da Angiotensina I (0,025 mg/ml) de uma
coluna de Butyl-Sepharose a 298. 15 K e diferentes concentrações de (NH4)2SO4 pH 7.
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 62
-90,00
-60,00
-30,00
0,00
30,00
60,00
90,00
120,00
150,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220n
m)
1.0 M Sulfato de amónio
1.4 M
1.5 M
Figura 4.10. Regeneração da coluna (1ml/min) após equilíbrio da coluna de Butyl-Sepharose a 298. 15 K
com diferentes concentrações de (NH4)2SO4 pH 7.
Assim é observado neste estudo a alteração de conformação na coluna, seguida de uma
rápida “re-conformação”, de uma biomolécula não retida em HIC sob condições
isocráticas.
4.1.3. Efeito da temperatura
Uma vez que a temperatura tem um papel importante em HIC. O comportamento
cromatográfico da Angiotensina I foi também analisado a diferentes temperaturas. Em
HIC, sob condições de não sobrecarga, quando a superfície cromatográfica, as
propriedades da fase móvel, a solubilidade da biomolécula em solução aquosa e o seu
estado conformacional não variam com a temperatura, a HIC é um processo conduzido
entropicamente, baixas temperaturas geralmente promovem a eluição da proteína, e o
aumento da temperatura aumenta a retenção das proteínas (Hjertén et al., 1974). Neste
trabalho podemos observar, tanto em presença de sulfato de amónio como sulfato de
sódio, que com o aumento da temperatura, a área do primeiro pico da Angiotensina I
diminui simultaneamente com o aumento da área do segundo pico (figuras 4.2, 4.11 e
4.12). Este resultado, como referido anteriormente, é consistente com um processo de
isomerização cis-trans. Á medida que a temperatura aumenta a taxa de isomerização
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 63
também deverá aumentar, isto porque a energia de activação da isomerização cis-trans é
tipicamente 20 Kcal/mol (Melander et al., 1982; Brandts et al., 1975; LaPlanche e
Rogers, 1964; Love et al., 1972). Por outro lado a temperatura tem um efeito menos
dramático na retenção do que o efeito da concentração de sal, para as temperaturas mais
altas a retenção do segundo pico é aproximadamente igual (figuras 4.2, 4.11 e 4.12 e
tabelas 4.3 a 4.5).
Figura 4.11. Cromatografia de interacção hidrofóbica (1ml/min) da Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa
coluna Butyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,0 M (NH4)2SO4 em 10 mM
de tampão fosfato, pH 7.
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220n
m)
288 K
293 K
298 K
303 K
308 K
10 mM de tampão fosfato
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 64
Figura 4.12. Cromatografia de interacção hidrofóbica (1ml/min) da Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa
coluna Butyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,0 M Na2SO4 em 10 mM de
tampão fosfato, pH 7.
Tabela 4.3. Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna de Butyl-
Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,2 M de [(NH4)2SO4] preparadas em
tampão fosfato, pH 7.
Temperatura (K) k’ (1ºpico) k’ (2º pico)
288,15 0,60 -
293,15 0,61
1,32
298,15 0,25 1,27
303,15 1,08 3,26
308,15 1,55 3,17
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220n
m)
288 K
293 K
298 K
303 K
308 K
10 mM de tamão fosfato
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 65
Tabela 4.4. Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna de Butyl-
Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,0 M de [(NH4)2SO4]) em tampão fosfato,
pH 7.
Temperatura (K) k’ (1ºpico) k’ (2º pico)
288,15 0,19 -
293,15 0,20 -
298,15 0,20 0,82
303,15 0,17 0,72
308,15 0,16 0,78
Tabela 4.5. Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna de Butyl-
Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,0 M de [Na2SO4] em tampão fosfato, pH
7.
Temperatura (K) k’ (1ºpico) k’ (2º pico)
288,15 0,45 -
293,15 0,71 2,03
298,15 0,07 1,03
303,15 0,03 1,52
308,15 0,02 1,83
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 66
Em solução aquosa (Melander et al., 1982; Lin e Brandts, 1979) a entalpia do
equilíbrio cis-trans é aproximadamente zero, como resultado a composição de equilíbrio
cis-trans não deverá ser influenciada pela temperatura e por conseguinte não é de prever
alteração na retenção. Contudo, tendo em conta o efeito da temperatura em HIC é de
esperar um ligeiro aumento na retenção devido ao aumento da magnitude das
interacções hidrofóbicas com o aumento de temperatura e à alteração de conformação
das biomoléculas e no concomitante aumento da área de contacto hidrofóbica durante a
ligação à superfície cromatográfica (Vailaya et al., 1998). Este facto pode ser observado
às temperaturas mais altas nas figuras 4.2, 4.11 e 4.12 e nas tabelas 4.3 a 4.5.
4.2. Efeito do tipo de ligando na adsorção da Angiotensina I
Com o intuito de obter uma visão mais geral acerca da retenção e alteração de
conformação durante a adsorção da Angiotensina I seleccionamos uma variedade de
fases estacionárias. As fases estacionárias estudadas neste trabalho consistiram de
grupos apolares (phenyl, butyl e octyl) ligados a um suporte polimérico hidrofílico, a
Sepharose. Deste modo o comportamento da retenção da Angiotensina I em presença de
ligandos lineares (butyl e octyl) e aromáticos (phenyl) foi estudado em função da
concentração de sal (figura 4.1, 4.13 e 4.14) e temperatura (figura 4.2, 4.15 e 4.16).
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 67
Figura 4.13. Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa
coluna Phenyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador diferentes concentrações de (NH4)2SO4 em
10 mM de tampão fosfato, pH 7.
Figura 4.14. Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa
coluna Octyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador diferentes concentrações de (NH4)2SO4 em
10 mM de tampão fosfato, pH 7.
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220 n
m)
0.5 M Sulfato de amónio
0.6 M
0.7 M
0.8 M
0.9 M
10 mM de tampão fosfato
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220n
m)
0.5 M de Sulfato de amónio
0.7 M
0.8 M
0.9 M
1.0 M
1.2 M
1.4 M
10 mM de tampão fosfato
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 68
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220n
m)
288 K
293 K
298 K
303 K
308 K
10 mM de tampão fosfato
Figura 4.15. Cromatografia de interacção hidrofóbica (1ml/min) da Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa
coluna Phenyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 0,9 M (NH4)2SO4 em 10 mM
de tampão fosfato, pH 7.
Figura 4.16. Cromatografia de interacção hidrofóbica (1ml/min) da Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa
coluna Octyl-Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1,4 M (NH4)2SO4 em 10 mM
de tampão fosfato, pH 7.
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220 n
m)
288 K
293 K
298 K
303 K
308 K
10 mM de tampão fosfato
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 69
O perfil cromatográfico da Angiotensina I a 298 K nos vários suportes aqui
estudados indicou que às concentrações mais baixas de sulfato de amónio quer na
Butyl-Sepharose quer na Phenyl-Sepharose (0,5 a 0,8 M) não existe uma retenção
significativa, mas para as concentrações mais elevadas de sal (tabela 4.1 e 4.6) a
retenção aumentou com o aumento da concentração de sal na fase móvel. Já em
presença da Octyl-Sepharose mesmo às concentrações mais baixas de sal foi observado
alguma retenção (tabela 4.7).
Tabela 4.6. Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna Phenyl-
Sepharose usando como modelador diferentes concentrações de [(NH4)2SO4] preparadas em tampão
fosfato, pH 7 a 298 K.
[(NH4)2SO4] (M) k’ (1ºpico) k’ (2º pico)
0,5 0,39 -
0,6 0,52 -
0,7 0,06
0,52
0,8 0,05
0,86
0,9 0,01 1,08
O efeito da temperatura no processo de interacção hidrofóbica com os diferentes
suportes estudados (Phenyl e Octyl-Sepharose) seguiu uma tendência idêntica à
apresentada em presença da Butyl-Sepharose no ponto 4.13, a taxa de isomerização
parece aumentar com a temperatura e às temperaturas mais altas a retenção não varia
significativamente (figura 4.15 e 4.16 e tabela 4.8 e 4.9).
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 70
Tabela 4.7. Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna Octyl-
Sepharose usando como modelador diferentes concentrações de [(NH4)2SO4] preparadas em tampão
fosfato, pH 7 a 298 K.
[(NH4)2SO4] (M) k’ (1ºpico) k’ (2º pico)
0,5 0,32
1,06
0,7 0,31
1,71
0,8 0,37
1,70
0,9 0,07
1,99
1,0 0,43 1,72
1,2 0,64
2,14
1,4 0,88 2,66
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 71
Tabela 4.8. Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna Phenyl-
Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 0,9 M de [(NH4)2SO4] em tampão fosfato,
pH 7.
Temperatura (K) k’ (1ºpico) k’ (2º pico)
288,15 0,02
0,84
293,15 0,01
0,96
298,15 0,01
1,08
303,15 0,03
1,27
308,15 0,03
1,29
Tabela 4.9. Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna Octyl-
Sepharose a diferentes temperaturas usando como modelador 1.4 M de [(NH4)2SO4] em tampão fosfato,
pH 7.
Temperatura (K) k’ (1ºpico) k’ (2º pico)
288,15 0,49
1,45
293,15 0,55
1,85
298,15 0,88
2,66
303,15 1,01
2,97
308,15 0,97
2,12
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 72
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
20,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220n
m)
0.7 M Phenyl
0.9 M Phenyl
0.7 M Butyl
0.9 M Butyl
1.2 M Butyl
1.4 M Butyl
0.7 M Octyl
0.9 M Octyl
1.2 M Octyl
1.4 M Octyl
Vários autores afirmam que a hidrofobicidade e a força da interacção da
biomolécula com a fase estacionária aumenta com o aumento do comprimento da cadeia
n-alquilo apesar da selectividade da adsorção poder diminuir e ligandos com grupos
aromáticos são aplicados em estudos com óptimos resultados devido à existência de
interacções hidrofóbicas e aromáticas (П-П) (Queiroz et al., 2001). Neste estudo
podemos confirmar o facto verificado pelos autores acima referidos, uma vez que a
ligação hidrofóbica do péptido ao suporte aumentou com o aumento do comprimento da
cadeia n-alquilo no ligando (figura 4.17 e Anexo A, figura A1 e A2) e (tabela 4.10).
Apesar do grau de substituição do suporte Butyl-Sepharose ser relativamente maior que
o grau de substituição do suporte Octyl-Sepharose (tabela 3.2 e 3.3), o efeito do
comprimento da cadeia n-alquilo sobrepõe-se ao efeito do grau de substituição do
ligando no suporte.
Analisando os perfis cromatográficos em presença dos diferentes suportes
observamos que à medida que a concentração de sal (figura 4.13, 4.14 e 417) e
temperatura aumentam (figura 4.15 e 4.16) a área do primeiro pico diminui
simultaneamente com o aumento da área do segundo pico, a mesma tendência que a
observada no suporte Butyl-Sepharose (figura 4.1 e 4.2) enumerada no ponto 4.1.1.
Figura 4.17. Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa
coluna de Phenyl-Sepharose, Butyl-Sepharose e Octyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador
diferentes concentrações de (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7.
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 73
Tabela 4.10. Valores de k’ obtidos para a eluição isocrática da Angiotensina I numa coluna de Phenyl,
Butyl e Octyl-Sepharose a diferentes concentrações de [(NH4)2SO4] em tampão fosfato, pH 7 a 298 K .
Primeiro pico; Segundo pico; X – Não foi realizado o ensaio.
[(NH4)2SO4] (M) Phenyl
(k’) Butyl (k’)
Octyl (k’)
0,06 0,16 0,31 0,7
0,52 - 1,71
0,01 0,17 0,07 0,9
1,08 - 1,99
X 0,21 0,64 1,2
X 1,28 2,14
X 0,16 0,88
Tem
pera
tura
298
(K
)
1,4 X 1,92 2,66
Com base na análise realizada no ponto 4.1.1 podemos igualmente sugerir que
ao primeiro pico corresponde a forma trans do péptido e ao segundo pico a forma cis e
que a conversão entre estas duas formas se dá em presença do suporte e é promovida
pela temperatura e presença de sal. Nas mesmas condições, comparando a Butyl-
Sepharose com a Phenyl-Sepharose podemos apontar que em presença desta última o
péptido sofre uma alteração de conformação provavelmente promovida devido às
interacções aromáticas П-П que este ligando possui, e assim deste modo irá promover a
interacção da Angiotensina I com a superfície cromatográfica a concentrações de sal
mais baixas do que a Butyl-Sepharose. Pode dizer-se que tanto a Phenyl-Sepharose
como a Butyl-Sepharose e Octyl-Sepharose actuam como catalisadores no processo de
alteração de conformação da Angiotensina I.
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 74
4.3. Adsorção de péptidos derivados da Angiotensina I em Butyl-Sepharose
Foi reconhecido, desde há mais de 20 anos, que a não ser que os péptidos sejam
objecto de restrições conformacionais, o comportamento cromatográfico destes em
HPLC pode ser relacionado com a sua composição em aminoácidos (Biswas et al.,
2003). A HPLC de fase reversa tem sido frequentemente aplicada na criação de escalas
de hidrofilicidade/hidrofobicidade (Tripet et al., 2007). Inicialmente, esta aproximação
envolve a atribuição de valores de hidrofilicidade/hidrofobicidade por análise de
regressão dos tempos de retenção em HPLC de fase reversa de uma série de péptidos de
diferente composição e comprimento (Meek, 1980; Meek e Rossetti, 1981; Sue et al.,
1981; Wilson et al., 1981; Brown et al., 1982; Sasagwa et al., 1982; Jinno e Tanigawa,
1988; Valko et al., 1997; Plass et al., 1998; Sílvia et al., 2001). Diferentes
investigadores referiram que péptidos com 15-20 resíduos eram eluídos mais
rapidamente do que o previsto pelo somatório simples dos coeficientes de
hidrofobicidade (Wilson et al., 1981; Sasagawa et al., 1982; Nice et al., 1981; Sue et
al., 1981; Wehr et al., 1982). Este comportamento não ideal foi assumido como sendo
devido à estrutura do polipéptido a qual pode remover certos aminoácidos do contacto
hidrofóbico com a fase estacionária. Contudo Mant et al., (1989) demonstraram que
existe também uma dependência do tamanho da cadeia polipeptídica independente de
quaisquer considerações conformacionais. O efeito da sequência em aminoácidos no
péptido também foi estudado, Zhou et al., (1990) sugeriram que os efeitos da sequência
em aminoácidos podem ser divididos em 2 categorias: efeitos conformacionais e efeitos
da vizinhança próxima. O primeiro dos efeitos resulta da adopção por parte do péptido
de uma dada conformação na interacção com a fase estacionária. O segundo resulta da
interacção entre cada aminoácido e o seu vizinho imediato o que vai restringir as
conformações acessíveis à cadeia polipeptídica (Tripet et al., 2007).
No presente estudo, decidimos investigar o efeito da substituição da [leucina 10]
na Angiotensina I, pelos aminoácidos [isoleucina 10], [alanina 10] e [valina 10] e
substituição da [isoleucina 5] no mesmo péptido pela [valina 5]. Este estudo foi
realizado com o objectivo de interpretar o efeito destas substituições na interacção
hidrofóbica destes péptidos com o suporte Butyl-Sepharose. Assim os valores de
retenção da substituição da leucina 10 pela isoleucina 10, alanina 10 e valina 10 e
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 75
isoleucina 5 pela valina 5 na Angiotensina I foram determinados numa coluna Butyl-
Sepharose tendo em conta o efeito da concentração de sulfato de amónio.
De uma forma geral através da observação do perfil da eluição destes péptidos
verificamos que a 298 K a retenção aumentou com o aumento da molaridade do sal na
fase móvel (figura 4.18 e 4.19) como era de esperar de acordo com a teoria solvofóbica.
Pode observar-se através da figura 4.18 e 4.19 que à medida que a concentração de sal
aumenta, a área do primeiro pico diminui e simultaneamente aumenta a área do segundo
pico. Como já foi mencionado no estudo da adsorção da Angiotensina I os péptidos com
prolina podem se encontrar tanto na conformação cis como na conformação trans,
devido a uma menor área hidrofóbica a conformação trans elui mais rapidamente do que
a conformação cis correspondente. Com o aumento da força iónica, a 1,5 M, podemos
verificar um aumento da conversão da forma trans na forma cis.
Figura 4.18. Efeito da substituição da leucina 10 pela isoleucina, alanina e valina e substituição da
isoleucina 5 pela valina na Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa coluna Butyl-Sepharose usando como
modelador 1,2 M (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7 a 298 K.
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220n
m)
Angiotensina I
[isoleucina 10]-Angiotensina I
[alanina 10]-Angiotensina I
[valina 10]-Angiotensina I
[valina 5]-Angiotensina I
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 76
Figura 4.19. Efeito da substituição da leucina 10 pela isoleucina, alanina e valina e substituição da
isoleucina 5 pela valina na Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa coluna Butyl-Sepharose usando como
modelador 1,5 M (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7 a 298 K.
Não existe dúvida de que os aminoácidos alifáticos são considerados os
aminoácidos que mais contribuem para a hidrofobicidade das proteínas ou péptidos (Liu
et al., 2006). De entre os péptidos contendo este tipo de aminoácidos segundo Liu et al.,
(2006) a contribuição hidrofóbica dos aminoácidos alifáticos segue a seguinte ordem:
leucina>isoleucina> valina> alanina. Estes resultados são semelhantes à maior parte das
escalas hidrofóbicas com excepção da leucina que aparece com um valor superior ao da
isoleucina. Gehas e Wetlaufer (1990) mediram o tempo de retenção de dansil derivados
com 20 aminoácidos comuns através da HIC e verificaram que a área exposta da
isoleucina é maior do que a da leucina. A ordem da hidrofobicidade da leucina e
isoleucina varia de acordo com os métodos usados para esta medição. A área superficial
hidrofóbica da isoleucina é recorrendo ao cálculo maior do que a da leucina. Contudo de
acordo com Biswas et al., (2003) 7 de 13 estudos cromatográficos indicaram que a
isoleucina é mais hidrofóbica que a leucina, e 5 de 9 estudos obtidos pelo método de
partição de 2 fases demonstraram que a hidrofobicidade da leucina é maior que a da
isoleucina.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Ab
so
rvãn
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220n
m)
Angiotensina I
[isoleucina 10]-Angiotensina I
[alanina 10]-Angiotensina I
[valina 10]-Angiotensina I
[valina 5]-Angiotensina I
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 77
No nosso estudo a 298 K e à concentração de 1,2 M de sulfato de amónio a
retenção dos péptidos segue a ordem mencionada por Liu et al., (2006) (figura 4.18 e
tabela 4.11) apresentando a Angiotensina I (com leucina na posição 10) o factor de
capacidade mais baixo. Neste caso verifica-se que a variação nos valores de retenção
dos diferentes péptidos não está directamente correlacionada com o comprimento das
cadeias dos aminoácidos. A variação observada a esta força iónica poderá remeter-nos
para um processo de interconversão entre as duas conformações (cis-trans), ainda
incompleto. De facto, a uma concentração de 1,5 M de sulfato de amónio verificamos
que no primeiro pico os tempos de retenção correspondentes à substituição da [leucina
10] pelos diferentes aminoácidos (isoleucina, valina e alanina) na Angiotensina I não
variam significativamente, isto é, os tempos de retenção para os vários péptidos
estudados são semelhantes (figura 4.19 e tabela 4.12). Já no que diz respeito ao segundo
pico, a variação nos tempos de retenção segue a ordem proposta por Liu et al., (2006)
(figura 4.19 e tabela 4.12). Este estudo demonstra ainda o envolvimento da leucina 10
na interacção com a superfície cromatográfica.
Tabela 4.11. Valores de k’ da retenção dos péptidos derivados da Angiotensina I, numa coluna de Butyl-
Sepharose usando como modelador 1,2 M de [(NH4)2SO4] em tampão fosfato , pH 7 a 298 K.
Péptidos derivados da Angiotensina I k’ (1ºpico) k’ (2º pico)
Angiotensina I 0,25 1,27
[Isoleucina 10] – Angiotensina I 0,78
1,65
[Alanina 10] -Angiotensina I 0,50
2,19
[Valina 10] -Angiotensina I 0,74
3,17
[Valina 5] -Angiotensina I 0,88 2,90
4.Resultados e Discussão
Universidade da Beira Interior 78
Tabela 4.12. Valores de k’ da retenção dos péptidos derivados da Angiotensina I, numa coluna de Butyl-
Sepharose usando como modelador 1,5 M de [(NH4)2SO4] em tampão fosfato , pH 7 a 298 K.
Péptidos derivados da Angiotensina I k’ (1ºpico) k’ (2º pico)
Angiotensina I 0,25 3,41
[Isoleucina 10] – Angiotensina I 0,34
2,09
[Alanina 10] -Angiotensina I 0,44
1,19
[Valina 10] -Angiotensina I 0,24
1,64
[Valina 5] -Angiotensina I 0,28
1,72
Em relação à hidrofobicidade da [valina 5] -Angiotensina I e [valina 10] -
Angiotensina I, ambas apresentam graus de hidrofobicidade semelhantes (tabela 3.5) o
que vai ao encontro aos resultados obtidos no nosso estudo, coeficientes de retenção
semelhantes (tabela 4.12). Podemos assim igualmente, dizer que o aminoácido na
posição 5 do péptido Angiotensina I se encontra envolvido no processo de interacção
hidrofóbica.
5.Conclusões
Universidade da Beira Interior 79
5. Conclusões
A interacção da Angiotensina I com uma coluna de Butyl-Sepharose em
presença do sulfato de amónio e sódio pode promover alterações de conformação deste
péptido na coluna seguido de uma rápida “re-conformação” após interacção. O broad
e/ou picos múltiplos observados nos perfis cromatográficos deste péptido podem surgir
por conversão da forma trans da Angiotensina I na forma cis, a qual tem uma área
superficial maior. A influência da concentração de sal e temperatura no processo
também foram analisados, pensa-se que a temperatura, a concentração e tipo de sal
promovem a isomerização da Angiotensina I na coluna. Também como esperado, a
retenção da forma cis da Angiotensina I aumenta com o aumento da concentração de sal
na fase móvel e parece não ser afectada pelo efeito da temperatura.
Por forma a melhorar a interpretação do comportamento da Angiotensina I,
foram ainda estudados diferentes suportes cromatográficos. Foram comparados três
suportes a phenyl, butyl e octyl Sepharose tendo em conta o efeito da temperatura e
concentração de sulfato de amónio. Pela análise dos perfis cromatográficos obtidos
verificou-se que apesar do grau de substituição do suporte Butyl-Sepharose ser
relativamente maior que a Octyl-Sepharose a interacção da Angiotensina I com o
suporte aumentou com o aumento do comprimento da cadeia n-alquilo do ligando. A
concentrações de sal mais baixas e à mesma temperatura o ligando Phenyl-Sepharose
quando comparado com a Butyl-Sepharose promove uma maior alteração de
conformação do péptido resultando numa maior retenção deste. Assim consideramos
que o suporte parece servir como catalisador desta alteração de conformação.
O presente estudo, também permitiu evidenciar o efeito da adsorção de péptidos
derivados da Angiotensina I numa coluna Butyl-Sepharose sob condições lineares
variando a concentração de sulfato de amónio. Observamos que o comportamento dos
péptidos derivados da Angiotensina I evidenciado só tem significado aplicando
concentrações de sal superiores a 1,2 M de sulfato de amónio. No que diz respeito ao
estudo da substituição tanto da isoleucina na posição 5 como da leucina na posição 10
da Angiotensina I pelos diferentes aminoácidos, podemos dizer que ambas as posições
do péptido acima descritas parecem interagir com a superfície cromatográfica durante o
processo de adsorção.
5.Conclusões
Universidade da Beira Interior 80
Em HIC, onde as interacções não são tão fortes como noutros tipos de
cromatografia, a obtenção de uma prova analítica das alterações de conformação é
bastante complexa devido a uma “re-conformação” rápida das biomoléculas após
desorção. Contudo, quando a cinética da alteração de conformação está na mesma
escala de tempo da separação cromatográfica, a sensibilidade da técnica de
espectroscopia é suficiente e a magnitude das diferenças observadas nos tempos de
retenção para as diferentes conformações é satisfatória, os perfis cromatográficos
podem providenciar informação sobre a dinâmica conformacional que pode ocorrer
durante a migração cromatográfica.
Assim, pensamos que a Angiotensina I poderá ser um bom péptido modelo para
aceder a alterações de conformação em colunas de HIC, facilitando o processo de
modelação desta técnica cromatográfica.
6.Perspectivas Futuras
Universidade da Beira Interior 81
6. Perspectivas Futuras Com a elaboração deste trabalho experimental, surgiram outros aspectos que
também podem ajudar a descrever o comportamento da Angiotensina em HIC, e desta
forma projectar este estudo para outros projectos de investigação.
Através da análise dos cromatogramas podemos observar que uma das
características da Angiotensina I foi o “broadening” e na maior parte dos casos o
aparecimento de dois picos. Uma análise da retenção da [valina 7] -Angiotensina I que
resulta da substituição da prolina a concentrações salinas mais baixas do que as
realizadas neste estudo poderão reforçar a interpretação dos resultados obtidos.
Um dos parâmetros que pode afectar a performance da HIC é o pH da fase
móvel, isto porque a forma do pico e o número de picos podem ser examinados
qualitativamente em função deste factor.
Quanto ao estudo do comportamento cromatográfico dos péptidos derivados da
Angiotensina I, em função da temperatura (estudo realizado, mas não apresentado) não
foi conclusivo, concentrações de sal superiores a 1,5 M de sulfato de amónio deveram
ser usadas. A interpretação de parâmetros termodinâmicos seria bastante útil na análise
dos cromatogramas obtidos. Outro ponto também interessante seria estudar o efeito da
substituição de aminoácidos noutros locais da Angiotensina I e a aplicação de outros
tipos de aminoácidos.
Também, no estudo do comportamento da Angiotensina I com os vários suportes
estudados podem ser utilizados modelos de interacção de HIC. Estes modelos podem
ser aplicados para verificar a extensão da alteração de conformação com os vários
suportes.
Outro aspecto importante é o estudo do comportamento da Angiotensina I sob
condições cromatográficas não lineares. Este estudo poderia ser bastante importante na
interpretação do comportamento deste péptido nestas condições cromatográficas.
7.Bibliografia
Universidade da Beira Interior 82
7. Bibliografia
� Aboderin A.A (1971) An empirical hydrophobicity scale for α-amino-acids and
some of its applications. Int.J.Biochem. 2, 537-544.
� Aguilar M.I, Hearn M.T.W (1991) In HPLC of Proteins, Peptides and
Polynucleotides: Contemporary Topics and Applications; M.T.W. Hearn Ed.,
VCH Publishers: New York, 247-275.
� Asanov A.N, Delucas L.J, Oldham P.B, Wilson W.W (1996) Interfacial
aggregation of bovine serum related to crystallization conditions studied by total
internal reflection fluorescence. J.Colloid Interface Sci. 196, 62-73.
� Axén R, Porath J, Ernback S (1967) Chemical coupling of peptides and proteins
to polysaccharides by means of cyanogen halides. Nature 214, 1302-1306.
� Biswas K.M, DeVido D.R, Dorsey J.G (2003) Evaluation of methods for
measuring amino acid hydrophobicities and interaction. J.Chromatogr.A 1000,
637-655.
� Bott R, Sarma M (1976) Crystallographic study of turkey egg-white lysozyme
and its complex with disaccharide. J.Mol.Biol. 106, 1037-1046.
� Boulkanz L, Vidal-Madjar C, Balcar N, Baron M-H (1997) Adsorption
mechanism of human serum albumin on a reversed-phase support by kinetics,
chromatographic, and FTIR methods. J.Colloid Interface Sci. 188, 58-67.
� Brandts J.F, Halvorson H.R, Brennan M (1975) Consideration of the possibility
that the slow step in protein denaturation reactions is due to cis-trans isomerism
of proline residues. Biochemistry 14, 4953-4963.
� Brown C.A, Bennett H.P.J, Solomon S (1982) The isolation of peptides by high-
performance liquid chromatography using predicted elution positions. Anal.
Biochem. 124, 201-208.
� Builder S.E (1993) Hydrophobic interaction chromatography: Principles and
Methods, Pharmacia: San Francisco, 56-58.
� Bull H.B, Breese K (1974) Surface tension of amino acid solutions: A
hydrophobicity scale of the amino acid residues. Arch. Biochem.Biophys. 161,
1665-1670.
7.Bibliografia
Universidade da Beira Interior 83
� Burley S.K, Petsko G.A (1985) Aromatic-aromatic interaction: a mechanism of
protein structure stabilization. Science 229, 23-28.
� Burley S.K, Petsko G.A (1986) Amino-aromatic interactions in proteins. FEBS
Lett. 203, 139-143.
� Buszewski B, Kowalska S, Kowalkowski T, Rozpedowska K, Michel M,
Jonsson T (2007) HPLC columns partition by chemometric methods based on
peptides retention. J.Chromatogr.B 845, 253-260.
� Byun C.K, Song J.H, Lee S.K, Kim D.H, Lee D.W (2000) Salt effects on the
retention of peptides in hydrophobic interaction chromatography. J. Liq. Chrom.
& Rel. Technol. 23, 2963-2978.
� Cavazzini A, Remelli M, Dondi F, Felinger A (1999) Stochastic theory of
multiple-site linear adsorption chromatography. Anal.Chem. 71, 3453-3462.
� Cooper A (1999) Thermodynamic analysis of biomolecular interactions.
Curr.Opin.Chem.Biol. 3, 557-563.
� Cornette, J.L, Cease K.B, Margalit H, Spouge J.L, Berzofsky J.A, DeLisi C
(1987) Hydrophobicity scales and computacional tecniques for detecting
amphipathic structures in proteins. J. Mol. Biol. 195, 659-685.
� Damodaran S, Song K.B (1986) The role of solvent polarity in the free energy
transfer of amino acid side chains from water to organic solvents. J.Biol.Chem.
261, 7220-7222.
� Dill K.A (1990a) Dominant forces in protein folding. Biochemistry 29, 7133-
7155.
� Diogo M.M, Queiroz J.A, Monteiro G.A, Martins S.A.M, Ferreira G.N.M,
Prazeres D.M.F (2000) Purification of a cystic fibrosis plasmid vector for gene
therapy using hydrophobic interaction chromatography. Biotechnol.Bioeng. 68,
576–583.
� Do Y.S, Shinagawa T, Tam H, Inagami T, Hseuh W (1987) Characterization of
pure human renal renin. Evidence for a subunit structure. J. Biol. Chem. 262,
1037–1043.
� Drake A.F, Fung M.A, Simpson C.F (1989) Protein conformation changes as the
result of binding to reversed-phase chromatography column materials.
J.Chromatogr. 476, 159-163.
7.Bibliografia
Universidade da Beira Interior 84
� Einarsson M, Kaplan L, Nordenfelt E, Miller E (1981) Removel of Hepatitis-B
virus from a concentrate of coagulation-factors 2, 7, 9 and 10 by hydrophobic
interaction chromatography. Journal of Virological Methods 3, 213-228.
� El Rassi Z (1996) Recent progress in reversed-phase and hydrophobic
interaction chromatography of carbohydrate species. J.Chromatogr. A 720, 93-
118.
� Er-el Z, Zaidenzaig Y, Shaltiel S (1972) Hydrocarboncoated sepharoses. Use in
the purification of glycogen phosphorilase. Biochem.Biophys.Res.Commum 49,
383-390.
� Espositi M.D, Crimi M, Venturoli G (1990) A critical evaluation of the
hydropathy profile of membrane proteins. Eur. J.Biochem. 190, 207-219.
� Fausnaugh J.L, Kennedy L.A, Regnier F.E (1984) Comparison of hydrophobic-
interaction and reversed-phase chromatography of proteins. J.Chromatogr. 317,
141-155.
� Fausnaugh J.L, Regnier F.E (1986) Solute and mobile phase contributions to
retention in hydrophobic interaction chromatography of proteins. J.Chromatogr.
A 359, 131-146.
� Fornstedt T, Zhong G, Guiochon G (1996) Peak tailing and mass transfer
kinestics in linear chromatography. J.Chromatogr. A 741, 1-12.
� Gagnon P, Grund E, and Lindback T (1995) Large-scale process development
for hydrophobic interaction chromatography. Part I: gel selection and
development of binding conditions. Biopharm April: 21.
� Galardy R.E, Bleich H.E, Ziegler P, Craig L.C (1976) The pH dependence of the
conformation of angiotensin peptides by nuclear magnetic resonance: Cis-trans
isomerism of proline 7. Biochemistry. 1976, 2303-2309.
� Garcia F.A.P, Pires, E.M.V (1993) Chromatography. In: Kennedy J.F, Cabral
J.M.S (Eds.) Recovery processes for Biological Materials. Wiley, London, 415-
451.
� Gehas J, Wetlaufer D.B (1990) Isocratic hydrophobic interaction
chromatography of dansil amino acids: Correlation of hydrophobicity and
retention parameters. J.Chromatogr. 511, 123-130.
� Geng X, Regnier F.E (1984) Retention model for proteins in reversed-phase
liquid chromatography. J.Chromatogr. 296, 15-30.
7.Bibliografia
Universidade da Beira Interior 85
� Gesquiere J.C, Cung M.T, Tartar A (1989) Slow isomerization of some proline-
containing peptides inducing peak splitting during reversed-phase high-
performance liquid chromatography. J.Chromatogr. 478, 121-129.
� Grund E (1998) Hydrophobic interaction chromatography of proteins. Biosep.
Bioprocess 1, 65-88.
� Haidacher D, Vailaya A, Horváth C (1996) Temperature effects in hydrophobic
interaction chromatography. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2290-2295.
� Hjertén S (1973) Some general aspects of hydrophobic interaction
chromatography. J.Chromatogr. 87, 325-331.
� Hjertén S, Rosengren J, Pahlman S (1974) Hydrophobic interaction
chromatography. The synthesis and the use of some alkyl and aryl derivatives of
agarose. J.Chromatogr. 101, 281-288.
� Hodges R.S, Zhu B-Y, Zhou N.E, Mant C.T (1994) Reversed-phase liquid
chromatography as a useful probe of hydrophobic interactions involved in
protein folding and protein stability. J.Chromatogr.A 676, 3-15.
� Hofstee B.H.J (1973) Protein binding by agarose carrying hydrophobic groups
in conjunction with changes. Biochem.Biophys.Res.Commun 50, 751-757.
� Honig B, Yang A.S (1995) Free energy balance in protein folding. Adv. Protein
Chem. 46, 27-58.
� Hopp T.P (1986) Methods for identifying antigenic determinants and other
interaction sites. J.Immunol. Methods 88, 1-18.
� Horváth C, Lin H-J (1976) Movement and band spreading of unsorbed solutes in
liquid chromatography. J.Chromatogr.126, 401-420.
� Horváth C, Lin H-J (1978) Band spreading in liquid chromatography: General
plate height equation and a method for the evaluation of the individual plate
height contributions. J.Chromatogr. 149, 43-70.
� Horváth C.S, Melander W (1978) Reversed-phase chromatography and the
hydrophobic effect. Amer.Lab. 10, 17-36.
� Jandel Scientific, “Table Curve 2 D”, Version 7.3.0.267, USA, 2006.
� Jason J.C, Rydén L (1993) Protein separation and purification. In: Rehm H.J,
Reed G (Eds.) Biotecnology. 3 VCH, Weinheim, 617-642.
� Jennissen H (1986) Protein binding to two-dimensional hydrophobic binding
chromatography. Sorption kinetics of phosphorylase b on immobilized butyl
residues. J.Coll.Interf.Sci. 111, 570-586.
7.Bibliografia
Universidade da Beira Interior 86
� Jennissen H (2005) Hydrophobic interaction chromatography: harnessing
multivalent protein-surface interactions for purification procedures. Methods
Mol.Biol. 305, 81-89.
� Jinno K, Tanigawa E (1988) Retention prediction of small peptides in reversed-
phase liquid chromatography. Chromatographia 25, 613- 617.
� Jungbauer A, Machold C, Hahn R (2005) Hydrophobic interaction
chromatography of proteins III. Unfolding of proteins upon adsorption. J.
Chromatogr. A 1079, 221-228.
� Karger B.L, Blanco R (1989) The effects of on-column structural changes of
proteins on their HPLC behaviour. Talanta 36, 243-248.
� Katzenstein G.E, Vrona S.A, Wechsler R.J, Steadman B.L Lewis R.V,
Middaugh C.R (1986) Role of conformational changes in the elution of proteins
from reversed-phase HPLC columns. Proc. Natl.Acad.Sci.USA 83, 4268-4272.
� Kauzmann (1959) Some factors in the interpretation of protein denaturation.
Adv. Protein Chem. 14, 1-63.
� Kennedy R.M (1990) Hydrophobic chromatography. In: Deutsher, M.P. (Ed.)
Guide to Protein Purification, Methods Enzymology Academic Press Inc,
London, 182, 339-343.
� Kondo A, Mihara J (1996) Comparison of adsorption and conformation of
haemoglobin and myoglobin on various inorganic ultrafine particles. J.Colloid
Interface Sci. 177, 214-221.
� Kurosu Y, Sasaki T, Takakuwa T, Sakayanagi N, Hibi K, Senda M (1990)
Analysis of proteins by high-performance liquid chromatography with circular
dichroism spectrophotometric detection. J.Chromatogr. 515, 407-414.
� Kyte J.K, Doolittle R.F (1982) A simple method for displaying the hydrophatic
character of a protein. J.Mol.Biol. 157, 105-132.
� Ladiwala A, Xia F, Luo Q, Breneman C.M, Cramer S.M (2006) Investigation of
protein retention and selectivity in HIC systems using quantitative structure
retention relationship models. Biotechnology and Bioengineering 93, 836-850.
� LaPlanche L.A, Rogers M.T (1964) Cis and trans configurations of the peptide
bond in N-monosubstituted amides by nuclear magnetic resonance. J. Amer.
Chem. Soc. 86, 337-341.
7.Bibliografia
Universidade da Beira Interior 87
� Laurine A, Laplanche, Rogers M.T (1963) cis and trans configurations of the
peptide bond in N-monosubstituted amides by nuclear magnetic resonance. J.
Amer. Chem. Soc. 86, 337-341.
� Lebl M, Fang S, Hruby V.J (1991) High-performance liquid chromatography of
peptides at reduced temperatures: Separation of isomers. J.Chromatogr. 586,
145-148.
� Liakopoulou-kyriakides M, Galardy R.E (1979) s-Cis and trans isomerism of the
his-pro peptide bonds in angiotensin and thyroliberin analogues. Biochemistry
18, 1952-1957.
� Lienqueo M.E, Mahn A, Asenjo J.A (2002) Mathematical correlations for
predicting protein retention times in hydrophobic interaction chromatography.
J.Chromatogr. A 978, 71-9.
� Lin B.L, Golshan-Shirazi S, Ma Z, Guiochon G (1988) Shock effects in
nonlinear chromatography. Anal. Chem. 60, 2647-2653.
� Lin F-Y, Chen W-Y, Ruaan R-C, Huang H-M (2000) Microcalorimetric studies
of the interactions between proteins and hydrophobic ligands in hydrophobic
interaction chromatography: effects of chain length, density and the amount of
bound protein. J.Chromatogr. A 872, 37-47.
� Lin L.N, Brandts S.F (1979) Evidence suggesting that some proteolytic enzymes
may cleave only the trans form of the peptide bond. Biochemistry 18, 43-47.
� Liu Chih-I, Hsu Keh-Ying, Ruaan Ruoh-Chyu (2006) Hydrophobic Contribution
of Aminoacids in Peptides Measured by Hydrophobic Interaction
Chromatography. J.Phys.Chem.B 110, 9148-9154.
� Love A.L, Alger T.D, Olson R.K (1972) Nuclear magnetic resonance rate
studies of hindered rotation in methyl N-acetylsarcosinate. J. Phys. Chem. 76,
853-855.
� Mahn A, Lienqueo M.E, Asenjo J.A (2004) Effect of surface hydrophobicity
distribution on retention of ribonucleases in hydrophobic interaction
chromatography. J.Chromatogr. A 1043, 47-55.
� Mahn A, Zapata-Torres G, Asenjo J.A (2005) A theory of protein-resin
interaction in hydrophobic interaction chromatography. J.Chromatogr. A 1066,
81-8.
7.Bibliografia
Universidade da Beira Interior 88
� Makhatadze G.I, Privalov P.L (1990) Heat capacity of proteins: I. Partial molar
heat capacity of individual amino acid residues in aqueous solution: Hydration
effect. J.Mol.Biol. 213, 375-384.
� Mant C.T, Zhou N.E, Hodges R.S (1989) Correlation of protein retention times
in reversed-phase chromatography with polypeptide chain length and
hydrophobicity. J.Chromatogr. 476, 363-375.
� Maste M.C.L, Pap E.H.W, Hoek A.V, Norde W, Visser A.J.W.G (1996)
Spectroscopic investigation of the structure of a protein adsorbed on
hydrophobic latex. J.Colloid Interface Sci. 180, 632-633.
� McNay J.L, Fernandez E.J (1999) How does a protein unfold on a reversed-
phase liquid chromatography surface. J.Chromatogr.A 849, 135-148.
� Meek J.L (1980) Prediction of peptide retention times in high-pressure liquid
chromatography on the basis of amino acid composition. Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 77, 1632-1636.
� Meek J.L, Rossetti Z.L (1981) Factors affecting retention and resolution of
peptides in high-performance liquid chromatography. J.Chromatogr. 211, 15-28.
� Melander W, Corradini D, Horváth C (1984) Salt mediated retention of proteins
in hydrophobic interaction chromatography. Application of solvophobic theory.
J. Chromatogr. 317, 67-85.
� Melander W, Horváth C (1977) Salts effects on hydrophobic interaction in
precipitation and chromatography of proteins: an interpretation of lyotropic
series. Arch.Biochem.Biophys. 183, 200-215.
� Melander W.R, Jacobson J, Horváth C (1982) Effect of molecular structure and
conformational change of proline-containing dipéptidos in reversed-phase
chromatography. J.Chromatogr.234, 269-276.
� Mendel D, Ellman J.A, Chang Z, Veenstra D.L, Kollman P.A, Schultz P.G
(1992) Probing protein stability with unnatural amino acids. Science 256, 1798-
1802.
� Minoura N, Rachkov A, Higuchi M, Shimizu T (2002) Study of the factors
influencing peak asymmetry on chromatography using a molecularly imprinted
polymer prepared by the epitope approach. Bioseparation 10, 399-407.
� Nice E.C, Capp M.W, Cooke N, O’Hare M.J (1981) Comparison of short and
ultrashort-chain alkylsilane-bonded silicas for the high-performance liquid
7.Bibliografia
Universidade da Beira Interior 89
chromatography of proteins by hydrophobic interaction methods. J.
Chromatogr. 218, 569-580.
� Nozaki Y, Tanford C (1971) Chemistry and metabolism of macromolecules: The
solubility of amino acids and two glycine peptides in aqueous ethanol and
dioxane solutions. Establishment of a hydrophobicity scale. J. Biol. Chem. 246,
2211- 2217.
� Oroszlan P, Blanco R, Lu X-M, Yarmush D, Karger B.L (1990) Intrinsic
fluorescence studies of the kinetic mechanism of unfolding of α-lactalbumin on
weakly hydrophobic chromatographic surfaces. J.Chromatogr.500, 481-502.
� Pahlman S, Rosengren J, Hjertén S (1977) Hydrophobic interaction
chromatography on uncharged Sepharose derivatives. Effects of neutral salts on
the adsorption of proteins. J.Chromatogr. 131, 99-108.
� Perchalski R.J, Wilder B.J (1979) Reverse phase liquid chromatography at
increased temperature Anal.Chem. 51, 774-776.
� Perkins T.W, Derek S.M, Thatcher W.R, Edwin N.L (1997) Protein retention in
hydrophobic interaction chromatography: modelling variation with buffer ionic
strength and column hydrophobicity. J.Chromatogr.A 766, 1-14.
� Pfeiffer N (1995) Companies report progress in possible monoclonal therapies.
Genetic Engineering News November: 1.
� Plass M, Valko K, Abraham M.H (1998) determination of solute descriptors of
tripéptido derivatives based on high-throughput gradient high-performance
liquid chromatography retention data. J. Chromatogr.A 803, 51-60.
� Pombeiro AJLO (1998) Técnicas e operações unitárias em química laboratorial,
3ª Edição, Fundação Calouste Gulbenkien, Lisboa.
� Porath J (1986) Salt-promoted adsorption: recent developments. J.Chromatogr.
376, 331-341.
� Porath J, Sundberg L, Fornstedt N, Olson I (1973) Salting-out in amphiphilic
gels as a new approach to hydrophobic adsorption. Nature 245, 465-466.
� Purcell A.W, Aguilar M.I, Hearn T.W (1993) High-performance liquid
chromatography of amino acids, peptides, and proteins. 123. Dynamics of
peptides in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Anal.
Chem. 65, 3038-3047.
� Queiroz J.A, Tomaz C.T, Cabral J.M.S (2001) Hydrophobic interaction
chromatography of proteins. Journal of Biotechnology 87, 143-159.
7.Bibliografia
Universidade da Beira Interior 90
� Regnier F.E (1987) The role of protein structure in chromatographic behaviour.
Science 238, 319-323.
� Rimerman R.A, Hatfield G.W (1973) Phosphate-induced protein
chromatography. Science 182, 1268-1270.
� Rippel G, Szepesy L (1994) Hydrophobic interaction chromatography of
proteins on an Alkyl-Superose column. J.Chromatogr. A 664, 27-32.
� Robeson J.L, Tilton R.D (1996) Spontaneous reconfiguration of adsorbed
lysozyme layers observed by total internal reflection fluorescence with a pH-
sensitive fluorophore. Langmuir 12, 6104-6113.
� Roe S (1989) Purification based on hydrophobicity. In: Harris, E.L.V, Angal S
(Eds.), Protein Purification Methods: A practical Approach. IRL Press, Oxford,
221-232.
� Roettger B.F, Myers J.A, Ladisch M.R, Regnier F.E (1989) Adsorption
phenomena in hydrophobic interaction chromatography. Biotechnol.Prog. 5, 79-
88.
� Rose G.D Glerash L.M, Smith J.A (1985) Turns in peptides and proteins. Adv.
Protein Chem. 37, 1-109.
� Salvi G, De los Rios P, Vendruscolo M (2005) Effective interactions between
chaotropic agents and proteins. Proteins: Structure, Function, and
Bioinformatics 61, 492-499.
� Sane S.U, Cramer S.M Przybycien T.M (1999) Protein structure perturbations
on chromatographic surfaces. J.Chromatogr. A 849, 149-159.
� Sasagawa T, Okuyama T, Teller D.C (1982) Prediction of peptide retention
times in reversed-phases high-performance liquid chromatography during linear
gradient elution. J. Chromatogr. 240, 329-340.
� Schaechtelin G, Walter R, Salomon H, Jelínek J, Karen P, Cort J.H (1974)
Enhancement of the activity of angiotensin II by certain cations.
Mol.Pharmacol. 10, 57-67.
� Sewell P.A (2000) Theory of liquid chromatography. Encyclopedia of
separation science Academic Press, London.
� Shansky R.E, Wu S-L, Figueroa A, Karger B.L (1990) HPLC of biological
macromolecules: Methods and Applications, Marcel Dekker, New York, 95.
7.Bibliografia
Universidade da Beira Interior 91
� Sharp K.A, Nicholls A, Friedman R, Honig B (1991) Extracting hydrophobic
free energies from experimental data: relationship to protein folding and
theoretical models. Biochemistry 30, 9686-9697.
� Silvia M.F, Chipre L.F, Raba J, Luco J.M (2001) Amino acids characterization
by reversed-phase liquid chromatography. Partial least-squares modelling of
their transport properties. Chromatographia 53, 392- 400.
� Skeggs L.T, Kahn J.R, Shumway N.P (1956) Preparation and function of the
hypertensin converting enzyme. J Exp Med, 103, 295-299.The first report on the
isolation and partial characterization of ACE, in this case from horse plasma.
� Sofer G.K, Hagel L (1997) Handbook of Process Chromatography: A Guide to
optimization, scale-up and validation Academic Press, London.
� Spyroulias G.A, Nikolakopoulou P, Tzakos A, Gerothanassis I.P, Magafa V,
Manessi-Zoupa E, Cordopatis P (2003) Comparison of the solution structures of
angiotensin I & II. Implication for structure-function relationship. Eur. J
.Biochem. 270, 2163-2173.
� Su S-J, Grego B, Niven B, Hearn M.T.W (1981) Analysis of group retention
contributions for peptides separated by reversed phase high performance liquid
chromatography. J.Liq.Chromatogr. 4, 1745-1764.
� Tanford C (1972) Hydrophobic free energy micelle formation and the
association of proteins with amphiphiles. J.Mol.Biol. 67, 59-74.
� Tanford C (1980) The hydrophobic effect, Second ed. Wiley, New York.
� Thrash M.E, Pinto N.G Encyclopedia of Analytical Chemistry, Wiley:
Chichester, 2000, 7259.
� Tiselius A (1948) Adsorption separation by salting out. Arkiv för Kemi,
Mineralogi Geologi, 26B, 1-5.
� Trinquier G, Sanejouand Y.H (1998) Which effective property of amino acids is
best preserved by the genetic code? Protein Eng. 11, 153-169.
� Tripet B, Cepeniene D, Kovacs J.M, Manta C.T, Krokhin O.V, Hodges R.S
(2007) Requirements for prediction of peptide retention time in reversed-phase
high-performance liquid chromatography: Hydrophilicity/hydrophobicity of
side-chains at the N-and C-termini of peptides are dramatically affected by the
end-groups and location. J. Chromatogr.A 1141, 212-225.
7.Bibliografia
Universidade da Beira Interior 92
� Turula V.E, Haseth J.A (1996) Particle Beam LC/FT-IR spectrometry studies of
biopolymer conformations in reversed-phase HPLC separations: native globular
proteins. Ana.Chem. 499, 629-638.
� Vailaya A (1998) Fundamentals of hydrophobic interactions in liquid
chromatography, PhD Thesis, Yale University Yale, USA.
� Vailaya A, Horváth Cs (1996) Enthalpy-entropy compensation in hydrophobic
interaction chromatography. J.Phys.Chem. 100, 2447-2455.
� Valko K, Bevan C, Reynolds D (1997) Chromatographic hydrophobicity index
by fast-gradient RP-HPLC: A high-throughput alternative to log P/log D. Anal.
Chem. 69, 2022-2029.
� Van Oss C.J, Good R.J, Chaudhury M.K (1986) Nature of the antigen-antibody
interaction. Primary and secondary bonds: optimal conditions for association
and dissociation. J.Chromatogr. 376, 111-119.
� Wehr C.T, Correia L, Abbot S.R (1982) Evaluation of stationary and mobile
phases for reversed-phase high performance liquid chromatography of peptides.
J.Chromatogr.Sci 20, 114-119.
� Wilson K.J, Honegger A, Hughes G.J (1981) Comparison of buffers and
detection systems for high-pressure liquid chromatography of peptide mixtures.
Biochemical J. 199, 43-51.
� Wolfenden R, Anderson L, Cullis P.M, Southgate C.C.B (1981) Affinities of
amino acid side chains for solvent water. Biochemistry 20, 849-855.
� Wu S-L, Figueroa A, Karger B.L (1996) Protein conformational effect in
hydrophobic interaction chromatography: Retention characterization and the role
of mobile phase additives and stationary phase hydrophobicity. J.Chromatogr.A
371, 3-27.
� Wu W-J, Raleigh D.P (1998) Local control of peptide conformation:
stabilization of cis proline peptide bonds by aromatic proline interactions.
Biopolymers 45, 381-394.
� Xia F, Nagrath D, Garde S, Cramer S.M (2004) Evaluation of selectivity
changes in HIC systems using a preferential interaction based analysis.
Biotechnology and Bioengineering 87, 354-363.
� Yamasaki Y.K, Uchida K, Tomizawa H, Ishikawa O, Inouye K (1999)
Separation of amino acids and peptides by high performance hydrophobic
interaction chromatography. J. Liq. Chrom. & Rel. Technol. 22, 1965-1974.
7.Bibliografia
Universidade da Beira Interior 93
� Yon R.J (1972) Chromatography of lipophilic proteins on adsorbents containing
mixed hydrophobic and ionic groups. Biochemistry126, 765-767.
� Yutani K, Ogasahara K, Tsujita T, Sugino Y (1987) Dependence of
conformational stability on hydrophobicity of the amino acid residue in a series
of variant proteins substituted at a unique position of tryptophan synthase α-
subunit. Proc. Natl.Acad.Sci.USA 84, 4441-4444.
� Zhou N.E, Mant C.T, Hodges R.S (1990) Effect of preferred binding domains on
peptide retention behaviour in reversed-phase chromatography: Amphipatic
alpha-helices. Pept.Res. 3, 8-20.
Anexos
Universidade da Beira Interior 94
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220n
m)
0.7 M Phenyl
0.7 M Butyl
0.7 M Octyl
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
Volume (ml)
Ab
so
rvân
cia
Rela
tiva (
mA
U)
(220n
m)
0.9 M Phenyl
0.9 M Butyl
0.9 M Octyl
Anexos: Anexo A
Figura A1. Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa
coluna de Phenyl-Sepharose, Butyl-Sepharose e Octyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador 0,7
M de (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7 a 298 K.
Figura A2. Cromatografia de interacção hidrofóbica (1 ml/min) da Angiotensina I (0,025 mg/ml) numa
coluna de Phenyl-Sepharose, Butyl-Sepharose e Octyl-Sepharose a 298.15 K usando como modelador 0,9
M de (NH4)2SO4 em 10 mM de tampão fosfato, pH 7 a 298 K.