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SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006

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ELETTROFORESI CAPILLARE O SU GEL D�AGAROSIO?

Capillarys� 2 Un nuovo strumento per l�elettroforesi capillare delle proteine

sieriche

Lavoro svolto da Rossi Marco

SSMT, Locarno Giugno 2006

Con la supervisione di

Dr. Phil. II, Togni Giovanni

Lavoro di ricerca svolto presso Reparto Chimica Clinica

Istituto Viollier, sede Allschwil (BL) Responsabile

Véronique Zygmunt

www.sebia.com


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INDICE

INDICE ...............................................................................................................................................1

1. RIASSUNTO/ABSTRACT..............................................................................................................2

2. INTRODUZIONE...........................................................................................................................3 2.1 PROTEINE.......................................................................................................................................... 3

2.1.1 FRAZIONI ELETTROFORETICHE ED INTERPRETAZIONE CLINICA DEL PROFILO ................... 3 2.2 EVOLUZIONE DELL�ELETTROFORESI .................................................................................... 5 2.3 ELETTROFORESI SU GEL D�AGAROSIO (AGE)...................................................................... 5 2.4 ELETTROFORESI CAPILLARE (CE)........................................................................................... 6

2.4.1 PRINCIPI dell�ELETTROFORESI CAPILLARE........................................................................................ 7 2.5 OBBIETTIVI....................................................................................................................................... 9

3. MATERIALI E METODI.............................................................................................................10 3.1 ELETTROFORESI CAPILLARE.................................................................................................. 10 3.2 ELETTROFORESI SU GEL D�AGAROSIO................................................................................ 11 3.3 RACCOLTA DEI CAMPIONI........................................................................................................ 12

3.3.1 DETERMINAZIONE DEI VALORI di riferimento................................................................................... 12 3.3.2 STUDIO DELLA PRECISIONE................................................................................................................. 12

3.4 Strumenti analizzati.......................................................................................................................... 14 3.5 ANALISI DEI COSTI ...................................................................................................................... 14 3.6 STATISTICA .................................................................................................................................... 14

4. RISULTATI...................................................................................................................................15 4.1 PRECISIONE (IMPRECISIONE).................................................................................................. 15 4.2 RISULTATI DELLE COMPARAZIONI ...................................................................................... 17

5. DISCUSSIONE.............................................................................................................................21 5.1 PRECISIONE.................................................................................................................................... 21 5.2 COMPARAZIONI............................................................................................................................ 22 5.3 VALORI DI RIFERIMENTO ......................................................................................................... 23 5.4 ALTRE CARATTERISTICHE....................................................................................................... 24

5.4.1 ANALISI DEI TEMPI ................................................................................................................................. 24 5.4.2 ANALISI DEI COSTI.................................................................................................................................. 25 5.4.3 EVENTUALI PROBLEMI .......................................................................................................................... 25

5.5 RACCOMANDAZIONI................................................................................................................... 25 5.5.1 IMMUNOTYPING ...................................................................................................................................... 26

6. CONCLUSIONE...........................................................................................................................27

7. RINGRAZIAMENTI ....................................................................................................................28

8. BIBLIOGRAFIA...........................................................................................................................29


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1. RIASSUNTO/ABSTRACT RIASSUNTO

Introduzione: L�elettroforesi capillare è una tecnica analitica d�introduzione relativamente recente. Se i primi sviluppi sono stati realizzati nei laboratori di ricerca, viene oggi adottata anche nei laboratori clinici. In effetti, grazie alla sua maggiore capacità di risoluzione, rapidità, ampie potenzialità d�applicazione, facile automazione e costi derivati inferiori, è un�interessante alternativa agli altri metodi di separazione, meno efficaci e che hanno tempi d�analisi più lunghi.

Strategia di realizzazione: L�elettroforesi capillare delle proteine sieriche è un�analisi che sta aumentando il suo impatto sui laboratori clinici. Nel 2006, è stato comparato il sistema d�elettroforesi capillare completamente automatizzato Capillarys� 2 (CE) con il sistema semi-automatico d�elettroforesi su gel d�agarosio Hydrasys-Hyrys�(AGE), ed attualmente in uso nella maggior parte dei laboratori, entrambi prodotti della ditta Sebia. Questo studio si è basato sulla valutazione delle caratteristiche analitiche e di comparazione, includendo 285 campioni della routine di laboratorio, un pool patologico, 2 pool normali ed un siero di controllo, misurando anche una capacità analitica di 90 elettroforesi/h.

Risultati: I risultati dello studio di comparazione hanno dimostrato una buona correlazione tra il metodo d�elettroforesi capillare e su gel d�agarosio (r = 0.97 per la frazione albumina, e per le γ-globuline r = 0.98), eccetto per la frazione beta (r = 0.73). La precisione nella serie fornisce dei coefficienti di variazione (CV %) inferiori a 0.7% per l�albumina, tra 0.6-1.7% per le γ-globuline, e tra 1-5% per le altre frazioni.

Conclusioni: Il Capillarys� 2 rappresenta un�alternativa concreta alla convenzionale elettroforesi su gel d�agarosio per i laboratori d�analisi con una routine giornaliera superiore a 20 campioni, combinando i vantaggi della completa automazione con le grandi capacità risolutive.

ABSTRACT Background: Capillary electrophoresis represent a relatively new technique that has been introduced recently. Although the capillary electrophoresis was first introduced in research laboratories, this technique is now making an entrance to the clinical laboratory. This is due to its rapid and highly-efficient separation power, its potential application and its possible automation. Thus, capillary electrophoresis represent a reliable alternative to some time-consuming and less effective separation techniques.

Strategy of realization: Capillary electrophoresis of serum proteins is increasingly gaining impact in clinical laboratories. In 2006, the fully automated capillary electrophoresis (CE) system, Capillarys� 2 from Sebia, was compared with the method of agarose gel electrophoresis Hydrasys�-Hyrys (AGE), from Sebia and usually currently used most in clinical laboratories. This new study focuses on the evaluation of analytical performance and a comparison between the two systems, including 285 samples taken from the routine of the laboratory, one pathologic pool, 2 normal pools and one serum of quality control, measuring, also, an analytical throughput of 90 electrophoresis/h.

Results: The results of the comparison study demonstrated a good correlation between the Capillary electrophoresis system and the agarose gel electrophoresis (r = 0.97 for albumin fraction and for the γ-globulin r = 0.98) except for β-globulin (r = 0.73). Precision within-run shows coefficients of variation (CVs %) less than 0.7% for albumin, between 0.6-1.7% for γ-globulin and between 1-5% for the other fractions.

Conclusions: The Capillarys� 2 represents a reliable alternative to conventional agarose gel electrophoresis for clinical laboratories with a daily routine superior than 20 samples, combining the advantages of full automation (rapidity, ease of use and low costs) with an high analytical resolutions.


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2. INTRODUZIONE

2.1 PROTEINE Le proteine sono macromolecole organiche azotate, d�elevato peso molecolare e di struttura molto complessa, presenti in tutte le forme di vita. Sono i costituenti organici più rappresentativi nell�organismo, specialmente animale: svolgendo funzioni diversificate ma essenziali per la vita, quali funzioni di catalisi chimica (enzimi), difesa (anticorpi), regolazione (ormoni), funzioni strutturali, trasporto e produzione d�energia. Caratterizzate inoltre dalla presenza di quattro elementi: carbonio, ossigeno, idrogeno e azoto; altri elementi quali zolfo, ferro e fosforo sono presenti in proteine più specializzate. Il peso corporeo è rappresentato per il 15% circa da proteine, la maggior parte di esse di si trova nei muscoli. Gli elementi che costituiscono le molecole proteiche sono gli amminoacidi. La combinazione dei differenti amminoacidi, tramite legami peptidici, formano la grande varietà di proteine presenti nell�organismo. Nel plasma sono contenuti 60-80 g/L di proteine di peso molecolare e funzioni eterogenee, che possono essere suddivise in 3 grandi gruppi: le albumine, le globuline e il fibrinogeno. In base alla funzione vengono classificate in: enzimi, proteine di trasporto, ormoni (glicoproteine, peptidi), immunoglobuline, frazioni del complemento, fattori della coagulazione e della fibrinolisi, proteine di mantenimento della pressione osmotica del sangue (albumina). Le proteine plasmatiche sono per la maggior parte prodotte dal fegato (ad eccezione delle immunoglobuline, ormoni e di alcuni enzimi), in equilibrio dinamico con le componenti dei tessuti e dei liquidi biologici, degradate ed eliminate soprattutto a livello epatico e gastrointestinale.

2.1.1 FRAZIONI ELETTROFORETICHE ED INTERPRETAZIONE CLINICA DEL PROFILO A scopo diagnostico le proteine totali del siero vengono separate e determinate ad un pH di 8.6. A questo valore di pH, tutte le proteine assumono carica negativa e migrano verso l�anodo (polo positivo). Mediante elettroforesi si possono separare le diverse componenti in 5 frazioni principali: albumina (frazione più veloce), α1-globuline, α2-globuline, β-globuline e γ-globuline. La figura 1 rappresenta un profilo elettroforetico normale: esso si presenta come un grafico costituito da una serie di picchi corrispondenti alle varie frazioni proteiche; mentre nella figura 2 si può osservare un profilo schematizzato delle zone elettroforetiche su gel, con le proteine ad esse associate.

Figura 1: rappresentazione grafica del profilo proteico di un campione normale, con descrizione delle proteine più importanti, suddivise nelle 5 frazioni principali (1)

Figura 2: rappresentazione schematica di un risultato su gel di un elettroforesi delle siero-proteine, con annesse la suddivisione delle varie proteine nelle frazioni proteiche (1)


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Cambiamenti nella quantità di proteine specifiche si chiamano disproteinemie e questi scompensi possono facilmente essere identificati nell�elettroforesi delle proteine sieriche. Le poche proteine che possono portare a cambiamenti significativi del profilo proteico sono:

• l�albumina: è una proteina di 69 kD che costituisce la frazione sieroproteica più abbondante. Le sue funzioni sono essenzialmente di mantenimento della pressione osmotica del sangue, di trasporto di acidi grassi, bilirubina, ormoni e farmaci; di riserva energetica e di amminoacidi. Cambiamenti nella concentrazione dell�albumina possono essere di origine ereditaria o acquisita. Le cause più frequenti della forma acquisita sono disfunzioni della distribuzione, perdita d�albumina a livello renale o intestinale oppure disturbo della sintesi dovuto a danno epatico o a carente assunzione di proteine. Inoltre l�ipoalbuminemia è un fattore importante nella patogenesi dell�edema e della sindrome nefrosica. Nelle infiammazioni si osservano, localmente degli arrossamenti, delle tumefazioni, produzione di calore e dolore, mentre a livello sistemico si manifesta una sensazione di malessere, febbre, leucocitosi e velocità di sedimentazione (VES) aumentata.

• le proteine della fase acuta: sono delle proteine prodotte in risposta a cause infiammatorie, chimiche o fisiche. Il loro scopo è quello di circoscrivere il danno e preparare l�organismo prima della reazione specifica del sistema immunitario. Le cellule infiammatorie, quali monociti/macrofagi, liberano diverse citochine, compresa l�interleuchina 6, la quale a livello epatico stimola la produzione delle proteine della fase acuta. Queste ultime si riscontrano prevalentemente nella frazione delle α1-globuline e α2-globuline. Nella fase precoce di un�infiammazione, aumenta prima la frazione delle α1-globuline, successivamente aumentano sia la frazione delle α1-globuline sia quella delle α2-globuline. La proteina C-reattiva (CRP), è una proteina della fase acuta, che migra nella zona delle γ-globuline; essa può aumentare la sua concentrazione nel siero da 10 a 1000 volte a dipendenza dello stimolo che induce la sua produzione. Altre proteine della fase acuta, come l�albumina, la transferrina (proteina che migra nella zona delle β-globuline) e la pre-albumina, diminuiscono la loro concentrazione durante uno stato infiammatorio.

• le lipoproteine: cambiamenti nella distribuzione delle lipoproteine indicano disturbi metabolici; aumenti delle LDL si manifestano nella regione delle β-globuline.

• le proteine del complemento: le componenti C3 e C4, che migrano nella regione delle β-globuline, possono aumentare anche della metà durante un�infiammazione, mentre diminuiscono nelle patologie autoimmuni.

• le immunoglobuline: la frazione delle γ-globuline è rappresentata dalle immunoglobuline e principalmente dalle IgG, che in condizioni normali è prevalente sulle altre. Un aumento delle γ-globuline configura i quadri di una gammopatia monoclonale (picco a base stretta) o della gammopatia policlonale (picco a base larga). La frazione delle immunoglobuline aumenta in modo policlonale durante infezioni acute e croniche, grazie alla produzione di molte classi d�immunoglobuline, mentre aumenta in modo monoclonale durante patologie autoimmuni. Il picco monoclonale compare quando viene espresso principalmente un solo tipo d�immunoglobulina caratterizzata da un unico tipo di catena leggera (kappa o lambda). La funzione immunologica è garantita solamente quando la loro concentrazione supera i 3 g/L.

Questo esame è indicato nella diagnosi e nel monitoraggio di malattie neoplastiche, negli stati di dispersione proteica a livello renale ed intestinale, nei disturbi immunologici, nell�insufficienza epatica, nelle malattie nutrizionali e negli stati edematosi cronici. In questi ultimi anni questo esame viene eseguito soprattutto per la diagnosi ed il monitoraggio di patologie immunologiche, nella ricerca d�eventuali gammopatie monoclonali.


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2.2 EVOLUZIONE DELL�ELETTROFORESI L�elettroforesi è una tecnica di separazione basata sul movimento di molecole cariche (ioni) in un campo elettrico. Molecole dissimili si muovono a velocità diverse e i componenti di una miscela si separano quando si applica un campo elettrico. La mobilità elettroforetica di una molecola dipende da:

• La carica netta di una molecola campione determina la direzione di movimento e ne influenza la mobilità (cationi verso catodo). Essa dipende dal pH ed è determinata dal numero relativo delle catene laterali d�amminoacidi cariche positivamente e negativamente ad un dato valore di pH. Quindi l�elettroforesi si esegue a pH costante grazie all�utilizzo di un tampone. Preferibilmente si utilizza un pH alcalino, dove la maggior parte delle proteine ha una carica netta negativa e quindi, in un campo elettrico, migreranno verso il polo positivo (anodo).

• Le dimensioni (la resistenza frizionale esercitata su molecole che si muovono in soluzione da parte della matrice porosa, fa si che le molecole più piccole migrino più velocemente di quelle più grandi) e

• La forza del campo elettrico L�elettroforesi, come tecnica di separazione, fu introdotta da Arne W. K. Tiselius nel 1937 (4). Per il suo lavoro nella separazione di sostanze Tiselius fu onorato del premio Nobel per la chimica nel 1948. L�efficienza, o risoluzione, della separazione in soluzione libera, come eseguita da Tiselius, era limitata dagli effetti delle correnti di convezione (derivate dal riscaldamento dovuto al campo elettrico) e dalla diffusione termica. È per questa ragione che, l�elettroforesi convenzionali sono state eseguite, in primo luogo, in supporti anti-convezione (supporti porosi), come poliacrilamide o gel d�agarosio. I gel, nel formato di lastra o cilindrico, sono stati usati principalmente per la loro capacità di separazione in relazione alla taglia delle macromolecole biologiche, quali acidi nucleici e proteine. Nonostante sia una delle più diffuse tecniche di separazione, l�elettroforesi su gel, presenta diversi svantaggi quali lunghi tempi d�analisi, bassa risoluzione e difficoltà d�automazione. I primi due sono dovuti soprattutto all�impossibilità di aumentare la potenza del campo elettrico, al fine di evitare i problemi dovuti ad un�eccessiva produzione di calore. Un�alternativa ai gel, può essere rappresentata dalla separazione elettroforetica eseguita in un capillare, in considerazione del fatto che i capillari stessi evitano gli effetti delle correnti di convenzione, così da permettere l�esecuzione della separazione elettroforetica anche in questo supporto. I primi lavori con capillari furono descritti da Hjérten nel 1967. A quei tempi erano usati dei capillari di quarzo, aventi un diametro di 1-3 millimetri. Più tardi Virtanen e poi Mikkers eseguirono elettroforesi in capillari con un diametro interno di approssimativamente 200 µm, formati rispettivamente di vetro e Teflon. Nei primi anni �80 Jorgenson e Lukacs (5) fecero evolvere ulteriormente la tecnica elettroforetica usando dei capillari con un diametro interno di 75 µm e formati da silice fusa.

2.3 ELETTROFORESI SU GEL D�AGAROSIO (age) Per separare le proteine si deposita una porzione di siero su una matrice imbevuta di una soluzione elettrolitica (tampone), che permette il passaggio della corrente (AGE, vedi allegato 2). Il tampone ha anche lo scopo di mantenere costante il pH costante, durante tutta la migrazione, e alcalino in cui la maggior parte delle proteine possiede una carica netta negativa. La matrice porosa introduce un ulteriore effetto di setaccio molecolare; le dimensioni dei pori sono in genere dello stesso ordine di dimensione delle molecole che vengono separate, e restringono di conseguenza il movimento delle molecole più grandi rispetto a quelle più piccole. Essa può essere costituita da carta da filtro, acetato di cellulosa, gel d�agarosio (polisaccaride ottenuto dalle alghe marine e utilizzato per la separazione di proteine, lipo-proteine, DNA e RNA), gel d�acrilamide, ecc. Lo


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scopo di questi supporti è quello di ridurre la diffusione delle particelle, in modo che queste migrino e si separino in una zona ben precisa e caratteristica. Le sostanze vengono fatte migrare grazie alla differenza di potenziale elettrico tra i due elettrodi. Le grosse proteine tendono a spostarsi fra le maglie della matrice porosa più lentamente rispetto a quelle più piccole che si spostano verso l�anodo con meno difficoltà. Prima della colorazione, le proteine separate devono essere fissate in posizione in modo che non diffondano, tramite l�utilizzo di MeOH. I coloranti utilizzati sono l�Amidoschwarz, il Blue di Comassie e il Ponceau S. Per la quantificazione delle proteine separate su gel d�agarosio, la tecnica più utilizzata è la lettura mediante un densitometro. Un fascio di luce molto fine (fascio laser o luce monocromatica) viene fatto passare su tutta la lunghezza della striscia delle proteine colorate. Un lettore registra i cambiamenti d�intensità della luce che passa attraverso il gel e li rappresenta in un tracciato elettroforetico. La dimensione delle bande e la loro intensità sono proporzionali alla concentrazione delle varie proteine. Il grafico finale risulta costituito da una serie di picchi corrispondenti alle frazioni proteiche (2,3,8).

2.4 ELETTROFORESI CAPILLARE (CE) L�elettroforesi capillare è nata dalla combinazione del meccanismo di separazione dell�elettroforesi e dal concetto della strumentazione e automazione della cromatografia. Essa supera in gran parte il problema principale dell�elettroforesi senza mezzo di supporto, cioè bassa risoluzione dovuta a correnti convettive e a diffusione. Nell�elettroforesi capillare la migrazione viene eseguita in un fine capillare, tipicamente con un diametro interno da 25 µm a 75 µm, riempito solamente con del tampone (formato da elettroliti), e con una lunghezza pari a 20-200 cm. L�uso del capillare ha numerosi vantaggi, in particolare la capacità di disperdere efficacemente il calore prodotto dal campo elettrico, grazie ad un grande rapporto superficie/volume, diminuendo così l�effetto Joule (2). Questo permette l�applicazione di un campo elettrico a partire da 100 V/cm fino a 500 V/cm (10 � 30 kV), aumentando di conseguenza la capacità di risoluzione e riducendo i tempi d�analisi. Il calore generato durante l�elettroforesi è proporzionale al quadrato della corrente applicata e alla resistenza elettrica del mezzo: la produzione di calore porterà ad un allargamento delle zone facendo aumentare la velocità della diffusione dei componenti del campione nelle zone più calde, e degli ioni del tampone. La generazione di calore può portare anche ad altri problema quali la denaturazione da calore dei componenti biologici del campione da separare e la riduzione della viscosità del tampone, portando ad una diminuzione della resistenza. In pratica, la maggior parte degli apparati elettroforetici su gel, incorpora un dispositivo di raffreddamento e controllo della temperatura; ma anche così la distorsione di una zona elettroforetica rispetto alla banda netta e lineare, può essere spiegata da un�inefficiente dissipazione del calore. L�elettroforesi capillare utilizza alti voltaggi e, in considerazione di quanto detto, si capisce quanto sia importante la capacità di dissipazione del calore. L�elettroforesi capillare permette inoltre un minimo utilizzo di campione, nell�ordine di 1-50 nL, e la possibilità di un�automazione completa delle analisi, riducendo la manipolazione da parte dell�uomo, e, tramite l�utilizzo di bar-code, si minimizza la possibilità di errori e/o scambi di provetta. Una caratteristica della CE è la semplicità della strumentazione. I componenti principali dello strumento sono: un generatore di corrente ad alto voltaggio, due serbatoi per il tampone, due elettrodi e un capillare che attraversa un sistema ottico di misurazione; il tutto controllato da un computer. Nella figura 1, è rappresentato un diagramma semplificato di un generico sistema di elettroforesi capillare.


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Le estremità del capillare sono posizionate in due piccoli serbatoi contenti il tampone. Esso è identico a quello contenuto nel capillare. Il campione è introdotto nel capillare, tramite l�applicazione di una pressione esterna, grazie allo scambio del serbatoio anodico con il serbatoio contenente il campione pre-diluito automaticamente. Dopo avere rimesso l�estremità anodica del capillare nel serbatoio contente il tampone, viene applicato il campo elettrico, così da permettere la separazione elettroforetica del campione in esame. La determinazione delle molecole separate viene eseguita all�estremità catodica direttamente attraverso le pareti del capillare, tramite lettura diretta per spettrometria d�assorbimento (7).

Figura 3: Diagramma semplificato di un generico sistema d�elettroforesi capillare, composto da un capillare, due serbatoi per il tampone un contenitore per il campione, due elettrodi e un generatore di alto voltaggio(7).

Un buon capillare deve essere chimicamente ed elettricamente inerte, trasparente ai raggi UV, flessibile ma robusto, e poco costoso. I capillari di silice fusa soddisfano molti di questi parametri, e sono dunque quelli più utilizzati al giorno d�oggi. I diametri interni dei capillari di silice fusa possono variare a partire da 10 µm fino a 200 µm, mentre quelli esterni variano da 300 a 350 µm: un buon compromesso fra efficiente dissipazione del calore e necessità di un percorso della luce non troppo breve per la rivelazione mediante spettrofotometria UV/visibile. Questi capillari sono ricoperti da uno strato esteriore di un polimero, al fine di assicurare forza e flessibilità. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è il suo ampio campo di applicazione. Originariamente è stata concepita per l�analisi di macromolecole biologiche; ma successivamente essa ha dimostrato una capacità di separazione di altri componenti: amminoacidi, droghe, vitamine, pesticidi, ioni inorganici, acidi organici, peptidi e proteine, carboidrati, oligonucleotidi e frammenti di restrizione di DNA, come pure cellule e particelle di virus (6).

2.4.1 PRINCIPI dell�ELETTROFORESI CAPILLARE La migrazione degli analiti è avviata dall�applicazione di un campo elettrico tra i due serbatoi alle estremità del capillare. È importante notare, però, che tutti gli ioni presenti nel campione da separare, positivi o negativi, migrano nella stessa direzione attraverso il capillare, questo è dovuto all�azione del flusso elettroendo-osmotico (EOF), il quale ha una forza maggiore rispetto alla tendenza degli ioni di migrare nel campo elettrico, trascinandoli con se (7). Esso rappresenta un costituente fondamentale dell�elettroforesi capillare, e si manifesta come un movimento di volume di liquido di tampone nel capillare. L�EOF è la conseguenza delle cariche poste sulla superficie interna del capillare. In condizioni acquose la maggior parte delle superfici dei solidi possiede un eccesso di cariche negative. Nei capillari di silice fusa l�EOF è causato dai numerosi gruppi SiOH sulla superficie interna del capillare, i quali possono esistere nella forma anionica (SiO-) a valori di pH superiore a 3. Attratti ai gruppi Si-O-, i cationi, presenti nel tampone, tendono a formare 2 strati interni (�diffuse double layer�) sulla superficie interna del capillare. Quando si applica il campo elettrico, lo strato più esterno di cationi, e quelli rimanenti nel tampone, vengono trascinati verso il catodo. La soluzione tampone tende a migrare assieme allo strato esterno di cationi, generando così il flusso elettroendo-osmotico, che trascina con se gli analiti da separare. L�EOF dipende dalla forza del campo elettrico, dal pH e dalla composizione ionica del tampone. Il vantaggio del flusso elettroendo-osmotico è il fatto che causa il movimento di tutte le specie, indipendentemente dalla carica elettrica della molecola, nella stessa direzione, come si può notare


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nella figura 4. Nei capillari con una superficie interna negativa, il flusso generato si muove dall�anodo verso il catodo. I cationi migrano più velocemente grazie alla somma dell�EOF con la forza del campo elettrico, le sostanze neutre sono trascinate con la stessa velocità del tampone, ed infine gli anioni migrano più lentamente, dato che sono rallentati dalla tendenza di migrazione verso l�anodo.

Figura 4: La figura quattro mostra le differenti velocità di migrazione dei soluti, aventi cariche elettriche diverse, dovute alla presenza del flusso elettroendo-osmotico nell�elettroforesi capillare (7). Nella CE solo piccoli volumi di campione sono introdotti nel capillare, nell�ordine dei nL. Queste quantità sono proporzionali al piccolo volume del capillare. L�iniezione del campione nel capillare può avvenire secondo due tecniche principali:

• Iniezione idrodinamica: è la tecnica più diffusa. Essa viene eseguita tramite l�applicazione di una pressione al margine del capillare di inserzione e viene applicato un vacum (sotto vuoto) al margine terminale del capillare. Il volume di campioni iniettato è in funzione delle dimensioni del capillare, dalla viscosità del tampone, dalla pressione applicata e dal tempo di applicazione.

• Iniezione eletrocinetica o elettromigrazione: è eseguita tramite il posizionamento del margine anodico del capillare nella fiala contente il campione e applicando un campo elettrico. I campioni entrano nel capillare sotto l�azione della migrazione del campo elettrico e dall�azione del flusso elettroendo-osmotico. La quantità di campione introdotto dipende dalla mobilità elettroforetica specifica di ogni soluto e dalla forza dell�EOF generato.

In tutte e due i casi, il volume del campione iniettato non è una quantità conosciuta, ma può essere calcolata. Invece del volume, i parametri di quantificazione per l�iniezione sono il tempo di pressione, per l�iniezione idrodinamica, e il tempo di voltaggio, per quella elettrocinetica. La determinazione delle molecole nella CE, deve fare fronte alle piccole dimensioni del capillare e quantità di campione. Il metodo più comunemente utilizzato è la determinazione tramite lo spettro di assorbimento UV, durante la migrazione delle molecole. In questo sistema, una sezione del capillare stesso è utilizzato come camera di misurazione. La tecnica di determinare gli analiti direttamente nel capillare permette la misurazione degli stessi senza perdita di risoluzione. La porzione di capillare utilizzato per la misurazione UV, deve essere otticamente trasparente: per questo motivo, in questa regione, viene eliminato il polimero utilizzato per il rivestimento del capillare. Secondo la legge di Lambert-Beer, la sensitività della misurazione è proporzionale alla lunghezza della cella. Dunque per migliorare la capacità di misura bisogna cercare di aumentare il percorso della luce, senza però perdere in capacità risolutiva. Esistono due principali metodi che possono essere utilizzati per aumentare il percorso della luce: il capillare stesso può essere espanso creando una bolla (�bubble cell�) creando una zona con un diametro maggiore, oppure creando un segmento �Z�, al fine di aumentare il tragitto della luce.


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Alla fine della migrazione e quindi anche dalla misurazione dei componenti separati, i risultati appaiono come dei grafici, che riportano gli analiti riscontrati sotto forma di picchi con differenti tempi di ritenzione.

2.5 OBBIETTIVI La separazione delle proteine sieriche, tramite elettroforesi, è ormai un�analisi di routine, con lo scopo di individuare alterazioni qualitative e/o quantitative delle proteine e soprattutto per la ricerca di componenti monoclonali nel siero, per il monitoraggio di patologie maligne e/o immuni dei linfociti B (quali MGUS, mieloma multiplo, �), ed in minima parte per la diagnosi di stati infiammatori e altri scompensi proteici (disproteinemie, deficienze congenite di proteine). Con la tecnica dell�elettroforesi le proteine sieriche vengono separate in 5 frazioni principali: albumina, α1-globuline, α2-globuline, β-globuline e γ-globuline. L�interpretazione clinica del grafico elettroforetico si basa sulla variazione del contenuto di una o più delle 5 frazioni maggiori e sull�analisi visiva del risultato al fine di riscontrare eventuali alterazioni patologiche rispetto al tracciato normale. Al giorno d�oggi, all�interno dei laboratori clinici, la separazione delle proteine è effettuata principalmente tramite l�utilizzo di gel d�agarosio, come supporto per la migrazione, con l�ausilio di strumenti semi-automatici, quali Hydrasys�-Hyrys (Sebia) o Paragon (Beckman Coulter). Nonostante l�utilizzo di questo tipo di apparecchiatura e di kit pronti all�uso, questa tecnica rimane laboriosa e con lunghi tempi di analisi. Da molti anni a questa parte le richieste di elettroforesi delle proteine sono cresciute a tal punto da rendere necessario un�automatizzazione del lavoro per incrementare le prestazioni fornite e la velocità dell�analisi. Durante l�ultimo decennio, l�elettroforesi capillare è emersa come una nuova tecnica con grandi prestazioni analitiche (9,10). È per questo motivo che nel 2006, è stato deciso di testare un nuovo apparecchio per l�elettroforesi capillare: il Capillarys� 2 della ditta Sebia (Francia). Il primo strumento automatizzato per l�elettroforesi capillare delle proteine sieriche e la caratterizzazione di gammopatie monoclonali in routine, il Paragon CZE2000� (Beckman Coulter), è stato commercializzato nel 1994. L�apparecchio Capillarys� 2 permette una separazione delle proteine completamente automatizzata a partire dall�inserimento del campione, fino all�ottenimento del tracciato elettroforetico. L�obbiettivo del mio lavoro di diploma è la valutazione delle caratteristiche dell�apparecchio automatizzato per l�elettroforesi multicapillare delle proteine sieriche (Capillary�2, Sebia), basato sul principio dell�elettroforesi capillare in soluzione libera, comparandolo con il sistema di elettroforesi in gel d�agarosio Hydrasys-Hyrys� (Sebia). Questo lavoro di comparazione è stato svolto all�interno del laboratorio Viollier nella sede principale di Allschwil (BL, Svizzera). In questo laboratorio la tecnica elettroforetica attualmente in uso è l�elettroforesi su gel d�agarosio tramite l�utilizzo del sistema semi-automatizzato Hydrasys-Hyrys� della ditta Sebia. Oltre all�analisi di comparazione sono state valutate altre caratteristiche, quali la precisione dell�apparecchio capillare, i costi dei due sistemi, tempi di analisi, ed inoltre sono stati determinati i valori di riferimento per il sistema capillare. Tramite questo studio si vorrebbe introdurre il nuovo apparecchio, Capillarys� 2, nella routine del laboratorio. Esso permette la separazione, in tampone alcalino, delle proteine del siero umano nelle 6 maggiori frazioni proteiche (albumina, α1-, α2-, β1-, β2- e γ-globuline), eseguendo automaticamente tutte le fasi del processo di separazione fino ad ottenere un profilo proteico per l�analisi qualitativa e/o quantitativa delle frazioni ottenute. I suoi vantaggi includono un�alta risoluzione, riproducibilità, sensibilità nella determinazione di paraproteine (vs. AGE), utilizzo di piccole quantità di campione e reagenti, e automazione completa.


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3. MATERIALI E METODI In questo lavoro sono state comparate due tecniche elettroforetiche: l�elettroforesi su gel d�agarosio tramite il sistema Hydrasys�-Hyrys (Sebia) e l�elettroforesi capillare, tramite lo strumento Capillarys� 2 (Sebia, Francia).

3.1 ELETTROFORESI CAPILLARE Il sistema Capillarys� 2 comprende 8 capillari in parallelo (con un diametro interno inferiore a 100 µm), così da permettere 8 analisi simultaneamente. Utilizzando rack di 13x8 il Capillarys� 2 riesce ad eseguire 90 elettroforesi per ora. Il pipettaggio dei campioni avviene direttamente dalla provetta primaria (da 13 a 16 mm di diametro e da 75 a 100 mm di altezza) o in microprovette da 1,5 mL posizionate su provette primarie, sempre senza tappo. Lo strumento capillare esegue sempre 8 elettroforesi contemporaneamente, dunque se si deve analizzare un numero inferiore a 8 campioni su un rack, il resto delle posizioni deve essere occupato da delle provette contenenti acqua bidistillata. L�iniezione dei campioni (diluiti 1/10 con tampone) nei capillari avviene tramite il sistema idrodinamico, applicato per 4 secondi (campione iniettato circa 1 nL); lo strumento necessita di un volume morto di campione di circa 200 µL. La separazione avviene applicando una differenza di potenziale costante di 9 kV alle estremità di ogni capillare, per una durata di 4 minuti. La temperatura dei capillari è tenuta sotto controllo a 35°C per effetto Peltier durante tutta la migrazione. La misurazione delle proteine viene effettuata all�estremità anodica del capillare per spettrometria di assorbimento ad una lunghezza d�onda di 200 nm. Alla fine della misurazione i capillari vengono risciacquati utilizzando una soluzione di lavaggio e poi nuovamente riempiti con la soluzione tampone. La separazione delle proteine è eseguita utilizzando il kit Capillarys Protein(e) 6 (ref. n° 2003), che, in un tampone basico (pH 9.9), permette la separazione delle proteine sieriche in 6 frazioni maggiori nel seguente ordine: γ-globuline, β2-globuline, β1-globuline, α2-globuline, α1-globuline ed albumina. La composizione del kit Capillarys Protein(e) 6 comprende: 2 flaconi da 700 mL di tampone di analisi a pH 9.9 pronto all�uso, un flacone da 70 mL di soluzione di lavaggio concentrata (da portare a volume di 700 mL con acqua bidistillata) contenente della soda caustica, una confezione di 90 di coppette multiple monouso per la diluizione automatica dei campioni di siero e 3 filtri monouso per i flaconi dei reattivi. Gli altri reagenti necessari sono: acqua bidistillata per il risciacquo del sistema automatico, Capiclean (soluzione enzimatica concentrata, Sebia, ref. n° 2051, 1 flacone da 12 mL) contenente enzimi proteolitici e composti chimici per la pulizia settimanale dei capillari e dell�ago di prelievo del sistema automatico. Il procedimento dell�analisi è completamente automatizzato e prevede le seguenti fasi: la lettura dei codici a barre delle provette primarie (fino a 8) e dei portacampioni, la diluizione dei campioni a partire dalle provette primarie, il lavaggio dei capillari, l�iniezione dei campioni diluiti, la separazione e la lettura diretta delle proteine separate. Le fasi manuali sono le seguenti: il caricamento delle provette primarie nei portacampioni, l�inserimento dei portacampioni nel sistema Capillarys� 2, l�avvio della sequenza automatica e il recupero dei portacampioni dopo l�analisi. I profili corrispondenti ai campioni analizzati appaiono sullo schermo dopo circa 10 minuti (tempo calcolato per i primi 8 campioni). Il trattamento dei risultati e l�identificazione delle varie frazioni è effettuata automaticamente dal programma software Phoresis (versione 5.29), fornito con l�apparecchio. I profili elettroforetici sono analizzati visivamente per rilevare eventuali anomalie. Il kit CAPILLARYS IMMUNOTYPING permette la rilevazione e la caratterizzazione in tampone basisco (pH = 9.9) delle proteine monoclonali (immunotipizzazione) nel siero umano tramite elettroforesi capillare nel sistema automatico Capillarys� 2. Questo Kit deve essere utilizzato


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insieme al kit Capillarys Protein(e) 6. Ogni campione di siero da analizzare viene mescolato con diversi antisieri specifici, anti-catene pesanti gamma (IgG), alfa (IgA) e mu (IgM), e anti-catene leggere kappa e lambda (libere e legate). Con questa metodica l�immunotipizzazione viene effettuata con antisieri monospecifici e permette l�identificazione dei picchi monoclonali individuati con l�elettroforesi. Nel sistema Capillarys� 2, costituito da 8 capillari in parallelo, il campione è iniettato all�anodo simultaneamente in 6 capillari (i capillari 7 e 8 non vengono utilizzati). Il profilo proteico di riferimento è ottenuto per iniezione del campione pre-diluito, in presenza del tampone del kit Protein(e) 6, nel capillare 1 per l�esecuzione del tracciato elettroforetico del campione. I profili degli antisieri sono ottenuti per iniezione del campione pre-diluito in presenza degli antisieri di diverse specificità negli altri 5 capillari (dal numero 2 al 6). La sovrapposizione di uno dei profili degli antisieri con il profilo di riferimento ottenuto sul capillare 1, permette di visualizzare la scomparsa e/o la diminuzione di un picco monoclonale sul profilo antisiero e di dedurne una gammopatia. L�immunotipizzazione viene eseguita in quattro fasi. Prima di tutto viene diluito il siero con un diluente specifico contenuto nel doppio pozzetto della barretta degli antisieri. Il siero diluito viene quindi mescolato con i relativi antisieri. Il complesso antigene-anticorpo si forma rapidamente in fase liquida e non richiede un tempo d�incubazione o di sedimentazione. La terza fase prevede l�iniezione dei campioni trattati nei 6 capillari (estremità anodica), seguita dalla separazione elettroforetica. La rilevazione diretta delle proteine avviene a 200 nm, sul lato catodico del capillare. Infine viene eseguita una sovrapposizione del profilo di riferimento ottenuto sul capillare 1 con i profili ottenuti con gli antisieri, ciò che permette la caratterizzazione della proteina monoclonale. Il kit Capillarys Immunotyping è composto da 60 coppette multiple monouso con antisieri (immunoglobuline totali di mammifero), pronte all�uso. Ogni antisiero ha un colore specifico e le coppette hanno una forma caratteristica che permette l�inserimento sui portacampioni del sistema Capillarys� 2 soltanto nella posizione corretta.

3.2 ELETTROFORESI SU GEL D�AGAROSIO Tecnica semi-automatizzata, effettuata con il sistema Hydrasys�, che permette la separazione delle proteine sieriche in un tampone alcalino (pH 9.2) su una matrice di gel d�agarosio (Hydragel 7 Protein(e) o Hydragel 15/30 Protein(e)). Le proteine sono separate in 5 frazioni principali: albumina, α1-globuline, α2-globuline, β-globuline e γ-globuline. Le proteine separate vengono colorate tramite una soluzione di Amidoschwarz e l�eccesso di colorante viene eliminato mediante una soluzione acida (acido citrico 0.5 g/L dopo diluizione). Le frazioni proteiche vengono valutate visivamente per la ricerca di eventuali anormalità. Con la densitometria (a 570 nm) si ottiene una quantificazione precisa di ogni zona colorata presente sul gel. Il sistema Hydrasys� comporta le seguenti tappe: l�applicazione dei campioni non diluiti (10 µL di siero), la migrazione elettroforetica a 20 W (per il kit Hydragel 15/30 protein(e)) ad una temperatura di 20°C controllata con elemento Peltier, per una durata di circa 7 minuti, l�essiccatura (10 minuti a 65°C), la colorazione del gel, la decolorazione, l�essiccatura finale e la lettura su uno scanner densitometrico (Hyrys�, Sebia, Versione 4.16) a 570 nm. La composizione del kit di reattivi Hydragel Protein(e) comprende: delle strisce tamponate pronte all�uso (le quali hanno il compito di riserva di tampone per l�elettroforesi ed assicurano il contatto tra il gel e gli elettrodi (pH 9.2 ± 0.3), un flacone da 10 mL di colorante Amidoschwarz concentrato (soluzione acida a pH 2; ad una concentrazione di 4 g/L), etilene-glicolo (6.7%, diluente per la soluzione colorante concentrata), gli applicatori per il siero, i filtri e le carte assorbenti, e 10 gel d�agarosio pronti all�uso. Ogni gel contiene 8 g/L d�agarosio e del tampone Tris-barbital ad un pH di 9.2 ± 0.1. Gli altri reattivi necessari sono una soluzione di decolorazione contenente 0.5 g/L di acido citrico (da diluire 1:1'000 con acqua distillata: portare 5 mL di soluzione concentrata in 5 litri con acqua distillata), una soluzione di lavaggio Hydrasys� (tampone alcalino pH 8.8 ± 0.3 e sodio azide 0.625%), del Fluidil� (Sebia, reattivo di composizione protetta e da acquistare separatamente) per il trattamento dei campioni viscosi o torbidi, e infine acqua distillata per le diluizioni.


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Le immunofissazioni sono realizzate su dei gel Hydragel 4 IF�, Sebia. Ogni gel contiene: 8 g/L d�agarosio e del tampone Tris-barbital, ad un pH di 8.8 ± 0.1. La composizione del kit di reattivo Hydragel 4 IF� comprende: 10 gel d�agarosio, delle strisce tamponate, del colorante Amidoschwarz, del colorante violetto acido (2 g/L di violetto acido, 10% di acido acetico), del diluente (tampone alcalino pH 8.0 ± 0.3, blu di bromofenolo), un fissatore e gli anti-sieri (contenenti delle immunoglobuline totali di mammifero anti-globuline umane), e dei filtri assorbenti. Gli altri reattivi necessari sono: una soluzione decolorante (acido citrico: 0.5 g/L da diluire 1:1'000 con acqua distillata), una soluzione di lavaggio (tampone alcalino a pH 8.8 e sodio azide: 0.625%), del Fluidil� e dell�acqua distillata per le diluizioni.

3.3 RACCOLTA DEI CAMPIONI I campioni impiegati nella comparazione degli apparecchi provengono dalla routine interna del laboratorio Viollier (Allschwil, BL), il quale raccoglie i campioni provenienti dalle sue sedi minori in tutta la Svizzera (vedi allegato 1). I materiali utilizzati sono campioni di siero raccolti in provette senza anticoagulanti e centrifugati presso le varie sedi dove viene effettuato il prelievo, e spediti successivamente nella sede centrale. Nella sede di Allschwil essi vengono centrifugati per 10 minuti a 3000 g a 25°C. Nell�arco di 2 mesi, 285 campioni della routine sono stati processati lo stesso giorno, prima sul sistema Hydrasys� e succecssivamente sull�apparecchio Capillarys� 2. La scelta dei campioni per le analisi di comparazione è stata completamente randomizzata. In 173 campioni l�albumina è stata quantificata, sull�apparecchio Cobas Integra� 800 (Roche Diagnostics, Rotkreuz), con metodo facente capo al verde di bromocresolo, nel reparto di automazione del laboratorio, ed i valori sono stati comparati con quelli dell�albumina ottenuta con il sistema capillare e rispettivamente su gel d�agarosio. I risultati sono stati analizzati mediante regressione lineare.

3.3.1 DETERMINAZIONE DEI VALORI di riferimento Per la determinazione dei valori di riferimento sono stati presi in considerazione dei campioni (n = 100) aventi un tracciato elettroforetico su gel d�agarosio normale (valori in %: albumina 55-73, α1 1.6-3.4, α2 7.5-13.5, β 7.4-13.2 e γ 7.2-20), proteine totali comprese tra 60 e 80 g/L, albumina tra 37 e 51 g/L, IgG tra 6.64 e 14.94 g/L, IgA tra 0,57 e 3.24 g/L e IgM tra 0.39 e 1.57 g/L. I campioni processati tramite elettroforesi su gel d�agarosio, che presentavano un tracciato elettroforetico e delle proteine totali normali, sono stati processati con l�elettroforesi capillare; successivamente, sempre nello stesso giorno, sono state eseguite le analisi delle immunoglobuline e dell�albumina. I campioni che presentavano dei valori patologici sono poi stati scartati, dato che per questo studio vengono presi in considerazione solo i campioni che presentano dei valori normali per i parametri sopra menzionati. La distribuzione delle età dei pazienti presi in considerazione variano dai venti agli ottanta anni, con una media (n = 100) di 56 anni. Per l�analisi dei valori normali, le immunoglobuline (IgG, IgA e IgM) sono state determinate tramite analisi di turbidimetria (Cobas Integra� 800) sui campioni di siero. Mentre l�albumina è stata determinata con il metodo del verde di bromocresolo, sempre sull�apparecchio Cobas Integra� 800.

3.3.2 STUDIO DELLA PRECISIONE Lo studio della riproducibilità nella serie (3 x 10 n), di giorno in giorno (4 x 10 n) e per la riproducibilità dei capillari, è stato effettuato utilizzando 4 tipi di campioni diversi:

• un siero di controllo di qualità liofilizzato della ditta Sebia (lot: 01045/01, scd: 04/2009, vedi allegato 12): quattro flaconi di siero di controllo liofilizzato sono stati ricostituiti aggiungendo 1 mL di acqua distillata per ogni campione. Essi sono stati lasciati ricostituire per 30 minuti, al termine dei quali i quattro sieri sono stati uniti in un unico pool. Da questo pool sono state eseguite 20 aliquote, da 200 µL ciascuna, in piccole microprovette eppendorf da 1.5 mL. 10


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aliquote sono state analizzate in un'unica mattina al fine di determinare i valori per la ripetibilità nella serie. Successivamente le 10 aliquote sono state poste in frigorifero a 2-8°C e sono state rianalizzate successivamente, una dopo l�altra in 10 giorni non consecutivi, nell�arco di 16 giorni, per determinare la precisione di giorno in giorno e stabilire così gli effetti della conservazione del siero a temperatura di 4°C. Le altre 10 aliquote sono state congelate a -20°C e anch�esse, sono state analizzate, nell�arco di 16 giorni, per l�analisi della riproducibilità di giorno in giorno. Per l�analisi della riproducibilità degli 8 capillari, sono state preparate 8 aliquote di controllo di qualità, tramite la ricostituzione di altri 2 flaconi di controllo liofilizzato. Queste aliquote sono state processate contemporaneamente sugli 8 capillari, 3 volte nella stessa giornata.

• due pool normali (1 e 2) diversi ottenuti mischiando dei sieri che presentavano un tracciato elettroforetico su gel d�agarosio normale, valori delle proteine totali compresi tra 60 e 80 g/L, albumina tra 37 e 51 g/L, IgG tra 6.64 e 14.94 g/L, IgA tra 0,57 e 3.24 g/L e IgM tra 0.39 e 1.57 g/L. Sono state eseguite 20 aliquote, da 200 µL ciascuna, del pool normale 1. 10 aliquote sono state analizzate, nella stessa giornata, per la determinazione della precisione nella serie, mentre le altre 10 aliquote sono state congelate a -20°C ed analizzate una dopo l�altra, in 10 giorni non consecutivi, nell�arco di 16 giorni totali, per la determinazione della precisione di giorno in giorno. Per l�analisi della riproducibilità dei capillari si è utilizzato il pool normale 2. Sono state preparate 32 aliquote di 200 µL ciascuna: le prime 8 sono state analizzate contemporaneamente sugli 8 capillari, mentre le rimanenti sono state congelate a -20°C. Nei 3 giorni consecutivi seguenti, sono state scongelate 8 aliquote per giorno, e analizzate sugli 8 capillari simultaneamente.

• un pool patologico, creato in laboratorio, aggiungendo al siero di un paziente con una gammopatia monoclinale di tipo IgG/K, un pool di sieri normali provenienti dalla routine del laboratorio e aventi proteine, albumina e immunoglobuline normali (ambiti normali come sopra citati): sono state eseguite 20 aliquote, da 200 µL ciascuna. 10 aliquote sono state analizzate, nella stessa giornata, per la determinazione della precisione nella serie, mentre le altre 10 aliquote sono state congelate a -20°C ed analizzate una dopo l�altra, in 10 giorni non consecutivi, nell�arco di 16 giorni totali, al fine di determinare i parametri della precisione di giorno in giorno.

Lo scongelamento dei campioni da analizzare è stato effettuato togliendoli dal congelatore 30 minuti prima di effettuare l�analisi, e mescolate delicatamente sul vortex. Tabella 1: Riassunto dell�utilizzo dei vari campioni nello studio della precisione dell�apparecchio Capillarys� 2

10 aliquote

Precisione nella serie

Precisione di giorno in giorno (congelate a 4°C) 4 flaconi da

1 mL 20

aliquote 10 aliquote Precisione di giorno in giorno

(congelate a -20°C) 10 analisi in 10 giorni non

consecutivi (16 giorni totali)

Campione di

controllo 2 flaconi da

1 mL 8 aliquote Precisione capillari 3 volte nella stessa giornata

10 aliquote Precisione nella serie 10 analisi nella stessa giornata Pool

normale 1 Pool di sieri 20 aliquote

10 aliquote Precisione di giorno in giorno (congelate a -20°C)

10 analisi in 10 giorni non consecutivi (16 giorni totali)

10 aliquote Precisione nella serie 10 analisi nella stessa giornata Pool

patologico Pool di sieri 20 aliquote

10 aliquote Precisione di giorno in giorno (congelate a -20°C)

10 analisi in 10 giorni non consecutivi (16 giorni totali)

8 aliquote 8 analisi simultanee sugli 8 capillari Campione fresco Pool

normale 2 Pool di sieri 32 aliquote

24 aliquote 8 analisi simultanee per 3 giorni consecutivi Campione congelato a -20°C


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3.4 Strumenti analizzati Per l�esecuzione del mio lavoro di diploma ho utilizzato principalmente tre tipi di apparecchi. Per l�elettroforesi capillare ho utilizzato lo strumento Capillarys� 2, della ditta Sebia (Francia). Per l�elettroforesi su gel d�agarosio lo strumento Hydrasys� sempre della ditta Sebia (Francia) combinato con l�apparecchio densitometrico Hyrys�(Sebia, Francia). Per la determinazione dei valori dell�albumina, delle proteine totali, e delle immunoglobuline (IgA, IgG ed IgM), dati utilizzati per la determinazione dei valori normali e per la comparazione della quantificazione dell�albumina, lo strumento utilizzato è il Cobas Integra� 800, della ditta Roche Diagnostics (Rotkreuz, Svizzera).

3.5 ANALISI DEI COSTI I costi dei due metodi di analisi sono stati stimati confrontando il prezzo di listino, fornito dalla ditta MEDIM Schweiz GmbH (Medical Diagnosic Products, Zugo), rappresentate in Svizzera della ditta Sebia. Il prezzo unitario dell�analisi, con l�apparecchio Capillaris�2 e con l�apparecchio Hydrasys�, è stato determinato prendendo in considerazione il prezzo totale del kit di analisi per i due sistemi ed il numero totale di analisi che si possono effettuare con il rispettivo kit. Per l�analisi dell�ammortamento della spesa d�acquisto dell�apparecchio Capillarys� 2, è stato preso in considerazione il prezzo dell�apparecchio (corrispondente a CHF 96'000.--, più CHF 6'000.-- per il PC, il monitor e la stampante) su un periodo di 10 anni. I giorni lavorativi di un anno sono stati calcolati (giorni festivi non considerati nel calcolo) a partire da 52 settimane annuali, composte da 5 giorni lavorativi, per un totale di 260 giorni all�anno.

3.6 STATISTICA La raccolta dei dati, sia per l�analisi di comparazione, della determinazione dei valori normali e per l�analisi della riproducibilità è stata eseguita tramite la creazione di una tabella di raccolta dati con il programma Microsoft Office Excel 2003. Le analisi statistiche sono state eseguite con l�utilizzo del programma Analyse-it� (General + Clinical Laboratori 1.71), per quanto riguarda la verifica dei valori normali in elettroforesi capillare e per la comparazione dei dati nella determinazione dell�albumina. Le rette di regressione lineare sono state ottenute tramite il programma Microsoft Office Excel e sono state usate per la valutazione analitica dell�elettroforesi capillare comparata con la tecnica di elettroforesi su gel d�agarosio. Media, Deviazione Standard e Coefficiente di variazione (CV) sono stati calcolati per la valutazione della precisione dell�apparecchio Capillarys� 2.


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4. RISULTATI

Un tipico grafico di una migrazione elettroforetica, ottenuto tramite lo strumento Capillarys� 2 è illustrato nella figura 5. Il profilo elettroforetico è molto simile a quello ottenuto con un�elettroforesi su gel d�agarosio. Come si può vedere nella figura 6, sono stati messi a confronto i tracciati di un campione normale fatto migrare sui due sistemi elettroforetici. La differenza più marcata tra i due tracciati è osservabile nella regione delle β-globuline, dove la maggiore risoluzione del sistema di elettroforesi capillare permette una separazione di questa regione in due frazioni: β1- e β2-globuline. Inoltre la regione delle γ-globuline appare, nella maggior parte dei casi, più stretta nell�elettroforesi capillare rispetto a quella ottenuta su gel d�agarosio. La fondamentale differenza fra i due metodi risiede nella modalità di migrazione. Nell�elettroforesi capillare l�ultima frazione ad essere determinata è l�albumina. Grazie all�azione del flusso elettroendo-osmotico le proteine

sieriche vengono trascinate attraverso il capillare fino alla finestra di misurazione nell�ordine inverso rispetto alla loro mobilità elettroforetica convenzionale.

Figura 5: Tipico profilo elettroforetico ottenuto con lo strumento Capillarys� 2. Frazione per frazione sono anche riportate le principali proteine sieriche (1)

Figura 6: Tracciato elettroforetico, dello stesso campione di siero, ottenuto con lo strumento Capillarys� 2 (a), programma Phoresis, e con lo strumento Hyrys, Sebia (b), Versione 4.16.

4.1 PRECISIONE (IMPRECISIONE) I risultati dello studio della precisione ottenuti sono riportati nelle tabelle 2 e 3. Nella tabella 2 vengono riportati i risultati dell�imprecisione nella serie (ripetibilità, vedi allegati 7 e 8), ottenuti misurando 10 volte nella stessa giornata tre campioni: un di controllo di qualità, un campione di

a b

Regione beta

globuline Regione

beta globuline

Regione gamma

globuline

Regione gamma globuline


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siero normale (pool normale 1) ed un campione patologico (pool) che presenta una gammopatia monoclonale (IgG/K).

Tabella 2: Risultati dello studio di precisione per il Capillarys� 2 usando tre tipi di campione

Imprecisione nella serie (n=10; ripetibilità) Frazione Campione CQ,

n = 10 Pool normale,

n = 10 Pool Patologico,

n = 10 Albumina Media, % CV (nella serie), %

62.3 0.69

63.6 0.63

53.4 0.72

α1-globuline Media, % CV (nella serie), %

4.2

2.20

4.1

3.64

3.82 3.66


9.07 1.80

9.5 1.4

8.74 2.76

β1-globuline Media, % CV (nella serie), %

6.13 1.55

6.32 1.25

5.49 2.91


4.28 1.48

4.12 3.2

3.28 4.72

γ-globuline Media, % CV (nella serie), %

14.0 1.67

12.4 1.13

25.3 0.63

Nella tabella 3, sono riportati i risultati dell�imprecisione di giorno in giorno su 4 campioni differenti: un controllo di qualità conservato a -20°C, lo stesso campione di qualità ma conservato in frigorifero a 4°C, un campione normale 1 conservato a -20°C e un campione patologico conservato a -20°C (vedi allegati 5 e 6). Tabella 3: Risultati dello studio di precisione per il Capillarys� 2 usando 4 tipi di campione

Imprecisione di giorno in giorno (n=10; riproducibilità) Frazione CQ

conservato a -20°C n = 10

CQ conservato a 4°C,

n = 10

Pool normale conservato a -20°C,

n = 10

Pool patologico, conservato a -20°C,

n = 10 Albumina Media, % CV (nella serie), %

62.6 0.47

63.4 0.60

63.6 0.54

53.1 0.65


4.16 2.32

3.94 3.21

4.05 2.10

3.83 2.48


9.01 0.97

8.6

2.05

9.6

1.39

9.03 1.65


6.12 1.50

6.2

1.70

6.36 1.33

5.59 2.45


4.18 2.47

4.16 3.04

4.14 2.60

3.14 3.42

γ-globuline Media, % CV (nella serie), %

13.9 1.81

13.7 1.76

12.2 1.91

25.3 0.66

Prima dell�analisi dell�imprecisione, nella serie e di giorno in giorno, è stata anche verificata l�imprecisione dei capillari, al fine di determinare se gli otto capillari dello strumento misurano nello stesso modo, e danno dei risultati riproducibili. I risultati ottenuti su un campione di siero


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(pool normale 2), che non mostra una gammopatia monoclonale, sono riportati nella tabella 4 (vedi allegato 9). Si può notare che per la frazione dell�albumina il capillare con una maggiore riproducibilità risulta essere il capillare 7 (CV = 0.16%), mentre il meno preciso è il capillare 5 (CV = 0.79). Per quanto riguarda la frazione delle γ-globuline i CV variano da 0.69%, del capillare 7, a 2.72% del capillare 8. Per le altre frazioni i CV variano da 0.46% a 6.21%. Tabella 4: Risultati dello studio della precisione dei capillari tramite l�analisi di un campione normale nell�arco di 4 giorni consecutivi.

ALBUMINA α1-globuline α2-globuline n=4 n=4 n=4

Capillare Media DS CV Capillare Media DS CV Capillare Media DS CV 1 63.1 0.30 0.48 1 4.1 0.08 1.99 1 11.6 0.05 0.43 2 62.4 0.41 0.66 2 4.1 0.14 3.45 2 11.8 0.21 1.77 3 62.5 0.26 0.41 3 4.1 0.08 1.99 3 11.8 0.13 1.10 4 61.7 0.13 0.21 4 4.3 0.10 2.24 4 12.0 0.13 1.05 5 62.2 0.49 0.79 5 4.2 0.13 3.01 5 11.8 0.08 0.69 6 62.3 0.32 0.51 6 4.1 0.05 1.21 6 11.9 0.10 0.84 7 62.4 0.10 0.16 7 4.2 0.10 2.29 7 11.7 0.14 1.21 8 61.8 0.17 0.28 8 4.3 0.13 3.04 8 11.8 0.10 0.81

TOT 62.3 (media) 0.4 TOT 4.2 (media) 2.4 TOT 11.8 (media) 1.0

β1-globuline β2-globuline γ globuline n=4 n=4 n=4

Capillare Media DS CV Capillare Media DS CV Capillare Media DS CV 1 5.7 0.06 1.02 1 4.0 0.10 2.38 1 11.6 0.24 2.062 5.7 0.14 2.48 2 4.1 0.25 6.21 2 12.0 0.10 0.803 5.7 0.10 1.67 3 4.0 0.17 4.38 3 12.0 0.10 0.804 5.8 0.10 1.64 4 4.1 0.17 4.28 4 12.2 0.10 0.795 5.8 0.10 1.74 5 4.2 0.21 4.94 5 11.9 0.15 1.266 5.8 0.17 2.96 6 4.1 0.17 4.19 6 11.9 0.22 1.827 5.8 0.05 0.87 7 4.1 0.08 1.99 7 11.9 0.08 0.698 6.0 0.10 1.68 8 4.2 0.10 2.27 8 12.0 0.33 2.72


4.2 RISULTATI DELLE COMPARAZIONI I risultati della comparazione dei metodi di quantificazione delle frazioni proteiche (n = 285) sono presentati nella tabella 5 (Rappresentazioni grafiche, vedi allegati 3 e 4). Non si osservano variazioni tra i due metodi per quanto riguarda la frazione dell�albumina e quella γ-globulinica (r > 0.97). Nonostante una correlazione di r = 0.96, per la frazione delle α1-globuline, si nota un errore sistematico, il quale provoca dei risultati aumentati, nell�elettroforesi capillare, in media dell�1.6% (1.1 g/L). La frazione delle β-globuline denota, invece, un coefficiente di correlazione inferiore alle altre frazioni (r = 0.73). Tabella 5: Metodo di comparazione per la quantificazione delle frazioni proteiche

Capillarys vs. Hydrasys Comparazione dati in % Differenze medie g/L

Frazione Regressione lineare (n=285) Albumina r = 0.97 -1.7 (da -6.8 a 5.6)

Alfa1-globuline r = 0.96 1.1 ( da 0.3 a 2.6)

Αlfa2-globuline r = 0.92 -0.4 (da -2.2 a 1.3)

Βeta-globuline r = 0.73 0.1 (da -4.2 a 4.3)

Gamma-globuline r = 0.98 0.9 (da -3.9 a 4.3)

Tabella 2: Risultati ottenuti nella comparazione tra i risultati misurati con il sistema capillare e con quello di elettroforesi su gel d�agarosio. I dati sono stati calcolati tramite regressione lineare tra i valori ottenuti. I risultati mostrano dei coefficienti di correlazione per le frazioni proteiche superiori allo 0.90, tranne per la frazione delle β-globuline (r = 0.73).


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La figura 7 mostra la rappresentazione grafica della comparazione tra i due sistemi (regressioni lineari) per le 5 frazioni elettroforetiche su un totale di 285 campioni analizzati.

Figura 7: Grafici dello studio della comparazione tra il sistema capillare (asse delle ordinate) e quello su gel d�agarosio (asse delle ascisse), per le varie frazioni elettroforetiche (n = 285)

È stata inoltre effettuata una comparazione tra i due metodi per quanto riguarda la determinazione della frazione dell�albumina. Nella figura 8 si possono notare i grafici delle rette di regressione lineare ottenute tramite la comparazione del sistema capillare e quello su gel d�agarosio. Per quanto riguarda la comparazione dei valori in % è stato ottenuto un coefficiente di correlazione di 0.93, mentre per i valori in g/L il coefficiente di correlazione è di 0.96. Figura 8: Grafici di comparazione per la determinazione dell�albumina tra elettroforesi su gel di agarosio (ascissa) e quella capillare (Capillarys� 2) (ordinata). Nel grafico a) la comparazione tra i due metodi è stata eseguita con valori espressi in g/L mentre il grafico b) è stato ottenuto con i valori espressi in %. Nel grafico viene inoltre riportato il valore del coefficiente di variazione, per le due comparazioni. I campioni analizzati sono 173.

Si nota una differenza per quanto riguarda la frazione dell�albumina, se la determinazione dell�albumina (in g/L), con il sistema su gel d�agarosio e capillare, viene comparata con la

determinazione dell�albumina con il metodo del verde di bromocresolo (Cobas Integra� 800), metodo di riferimento attualmente in uso presso il laboratorio. La figura 9 illustra


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una comparazione descrittiva delle misurazioni dell�albumina in g/L sui tre sistemi; mentre nella figura 10 si possono osservare due grafici (bias plot) che rappresentano la comparazione tra la determinazione dell�albumina in g/L con il metodo del verde di bromocresolo e rispettivamente con l�elettroforesi su gel d�agarosio (a) e con il Capillarys� 2 (b). Per quanto riguarda la determinazione con il sistema capillare si ottiene un errore sistematico di 0.7%, mentre l�errore aumenta al 2.32% con il sistema su gel d�agarosio. Figura 9 (a fianco): Rappresentazione grafica dei valori, in g/L, dell�albumina, misurati con il metodo del verde di bromocresolo (Cobas Integra 800) (a), con il sistema dell�elettroforesi su gel d�agarosio (b) e capillare (c)

Figura 10: (a) Grafico di comparazione (bias plot) tra il sistema Cobas Integra� 800 e l�elettroforesi su gel d�agarosio per la determinazione dell�albumina (risultati espressi in g/L � sull�ordinata è espressa la differenza tra la misurazione con il sistema su gel d�agarosio e con il Cobas Integra� 800), (b) Grafico di comparazione (bias plot) tra il sistema Cobas Integra� 800 e l�elettroforesi capillare per la determinazione dell�albumina (risultati espressi in g/L � sull�ordinata è espressa la differenza tra la misurazione con il sistema capillare e con lo strumento Cobas Integra� 800) Nella tabella 6 sono riportati I risultati per i valori di riferimento ottenuti sull�apparecchio Capillarys� 2, a partire da una popolazione di individui (n = 100), che non mostrano paraproteinemie o altre alterazioni proteiche. La distribuzione delle età delle persone prese in considerazione per lo studio è raffigurata nella figura 11. L�età media dei pazienti è circa 56 anni, mentre l�arco degli anni delle persone spazia da 20 ad 80 anni. Non sono state effettuate delle distinzioni tra uomini e donne.

Figura 11: Distribuzione delle età dei pazienti presi in considerazione per l�analisi dei valori normali


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Tabella 6: Valori di riferimento in % e in g/L per lo strumento Capillarys� 2 determinati a partire da una popolazione di 100 campioni normali, confrontati con quelli forniti dalla ditta Sebia (Francia) e quelli in vigore per l�elettroforesi su gel d�agarosio

Valori ottenuti Sebia (Francia), sistema capillare

Viollier, elettroforesi su gel d�agarosio

Frazione Valori in % Valori in g/L Valori in % Valori in % Albumina 56.0 � 69.0 37.1 � 50.1 55.8 � 66.1 55.0 � 73.0 α1-globuline 2.7 � 5.4 1.9 � 3.7 2.9 � 4.9 1.6 � 3.4 α2-globuline 6.5 � 13.2 4.6 � 9.1 7.1 � 11.8 7.5 � 13.5 β-globuline 8.1 � 12.2 5.6 � 8.5 7.9 � 13.7 7.4 � 13.2 β1-globuline 4.6 � 6.9 3.2 � 4.9 4.7 � 7.2 β2-globuline 2.8 � 5.9 2.0 � 4.1 3.2 � 6.5

γ-globuline 9.6 � 17.5 6.4 � 12.5 11.1 � 18.8 7.2 � 20 Nella tabella 7 sono riportati i risultati delle immunofissazioni (Immunotyping) eseguite nell�arco dello sviluppo del lavoro di diploma, effettuate per prendere confidenza con l�apparecchio Capillarys� 2 (n = 36). Tabella 6: Confronto della determinazione delle componenti monoclonali tramite esecuzione dell�immunotyping, sull�apparecchio Capillarys� 2, e dell�immunofissazione, sull�apparecchio Hydrasys� per l�elettroforesi su gel d�agarosio (n = 36)

Numero di campioni Risultati immunotyping Risultati immunofissazione 12 Negativa Negativa 9 Positiva IgG/Lambda Positiva IgG/Lambda 6 Positiva IgG/Kappa Positiva IgG/Kappa 2 Positiva IgA/Kappa Positiva IgA/Kappa 1 Positiva IgA/Lambda Positiva IgA/Lambda 1 Positiva IgM/Kappa Positiva IgM/Kappa 1 Positiva IgM/Lambda Positiva IgM/Lambda 2 Positiva Banda debole non indagata 2 Negativa Banda debole


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5. DISCUSSIONE Lo strumento Capillarys� 2 fa parte della seconda generazione di apparecchi automatici multicapillari per l�analisi delle proteine sieriche. Grazie alla sua completa automazione (lettura del codice a barre, diluizione, migrazione e quantificazione) non richiede nessuna manipolazione tecnica da parte del personale, a partire dall�inserimento del campione fino all�ottenimento dei grafici della separazione elettroforetica.

5.1 PRECISIONE Prima di procedere all�analisi della riproducibilità sul Capillarys� 2, sono stati eseguiti dei controlli di precisione, tramite l�utilizzo di un pool normale, al fine di determinare la riproducibilità degli 8 capillari dello strumento. Le analisi sono state eseguite utilizzando un siero congelato (pool normale 2) per 3 giorni consecutivi. I risultati indicano che gli otto capillari hanno una riproducibilità variabile. Si può notare che il capillare con delle variazioni maggiori risulta essere il capillare 2. In questo capillare i CV delle varie frazioni elettroforetiche sono sempre superiori ai CV medi delle rispettive frazioni, tranne per la frazione delle γ-globuline, dove il CV, misurato in questo capillare, risulta inferiore alla media ed alle altre misurazioni delle γ-globuline sugli altri capillari. Il capillare che fornisce risultati più ripetibili è il capillare 7. Si può notare inoltre che i CV più elevati si osservano per la frazione delle β2-globuline, con una variazione dei CV da 1.99%, del capillare 7, e il 6.21% del capillare 2. La media dei CV sugli 8 capillari, per la frazione delle β2-globuline è di 3.8%. La stessa comparazione è stata eseguita su un siero di controllo, il quale è stato analizzato 3 volte nella stessa giornata, sugli 8 capillari. Questo studio fornisce dei risultati non propriamente simili a quelli ottenuti con il pool normale 2. Il capillare più ripetibile, con il siero di controllo, risulta essere il capillare 6, tranne per la frazione delle α2-globuline, mentre il capillare meno ripetibile risulta essere proprio il capillare 7, con dei CV che variano da 1.10% a 5.4% (sulla base di analisi effettuate in laboratorio, vedi allegato 10). Per questo studio sono comunque stati presi in considerazione i risultati ottenuti con il pool normale 2, poiché esso rispecchia stessa matrice dei campioni dei pazienti. I risultati dell�imprecisione nella serie forniscono dei CV, per l�albumina < 1.0%, per le γ-globuline < 1.7% e < 5% per le altre frazioni elettroforetiche. I risultati ottenuti, nel nostro laboratorio, sono migliori dei risultati riportati in letteratura (11-13), ma comparabili per quanto riguarda i dati forniti dalla ditta Sebia, concernenti il kit Protein(e) 6 (CV albumina < 1.0%, per le γ-globuline < 1.7% e < 4% per le altre frazioni elettroforetiche) (1). Questo sta ad indicare che lo strumento Capillarys� 2 possiede riproducibilità superiori rispetto agli strumenti di generazioni precedenti come il Capillarys (CV albumina < 2.6%, per le γ-globuline < 2.7% e < 7% per le altre frazioni elettroforetiche) (11), o altri strumenti di elettroforesi capillare (come per esempio il CZE�2000 della ditta Beckman Coulter: CV albumina < 2.5%, per le γ-globuline < 6.8% e < 10% per le altre frazioni elettroforetiche) (12). Inoltre il Capillarys� 2 è più preciso rispetto ai metodi di elettroforesi convenzionali su gel (gel d�agarosio o acetato di cellulosa). Kahn e Strony (15) riportano dei CV che variano da 2.9% per l�albumina sierica, a 9.5% per la frazione delle α1-globuline, mentre Baars e Lombarts, per le stesse frazioni, osservarono dei CV tra 4% e 32%, ed enfatizzando la dipendenza del risultato dell�elettroforesi su gel con le capacità tecniche dell�operatore che esegue l�analisi (16). Per quanto riguarda l�imprecisione di giorno in giorno si sono ottenuti i seguenti di CV: per la frazione dell�albumina, dei CV di 0.47% con il controllo di qualità conservato in congelatore, un valore di 0.60% con il controllo di qualità conservato in frigorifero, di 0.54% con il pool normale 1 conservato in congelatore e di 0.65% con il pool patologico, sempre conservato in congelatore a -20°C. Invece per la frazione delle γ-globuline, abbiamo ottenuto i seguenti CV: un valore di 0.66% con il pool patologico, di 1.81% con il controllo di qualità conservato in congelatore, di 1.76% con


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il controllo di qualità conservato in frigorifero e di 1.91% per il pool normale 1 conservato in congelatore. Per le altre frazioni elettroforetiche, considerando solamente i campioni conservati in congelatore nell�arco di 16 giorni, sono stati ottenuti dei CV < 2.48% per la frazione delle α1-globuline, < 1.65% per quella delle α2-globuline, < 2.45% per le β1-globuline e < 3.42% per le β2-globuline. Si nota che, considerando i risultati ottenuti con i controlli di qualità, i valori sono più riproducibili se conservati a -20°C, piuttosto che a 2-8°C. Inoltre per le frazioni più piccole (α1-globuline, α2-globuline, β1-globuline, β2-globuline), i CV sono maggiori nel campione patologico rispetto agli altri campioni, sempre conservati in congelatore; mentre la determinazione della frazione delle γ-globuline risulta più precisa, rispetto agli altri campioni analizzati (controllo di qualità, conservato a 4°C e congelato, e al pool normale 1 congelato).

5.2 COMPARAZIONI Le rette di regressione, per le varie frazioni elettroforetiche hanno dato dei coefficienti di correlazione che sono riportati nella tabella 5. Lo studio effettuato ha riscontrato un coefficiente di correlazione per la frazione dell�albumina, con valori espressi in percentuale, pari a 0.97. Questo valore risulta simile a quanto riscontrato in bibliografia, come si può notare nella tabella 7. La stessa considerazione vale anche per la frazione delle γ-globuline.

Tabella 7: tabella che mostra i coefficienti di correlazione per le 6 maggiori frazioni elettroforetiche, ottenuti nello studio (prima colonna) e quelli riscontrati in bibliografia Capillarys� 2

vs. Hydrasys-Hyrys®

Ditta Sebia (Francia). Capillarys� vs. AGE (1)

Capillarys� vs. Hydrasys-Hyrys® (11)

Capillarys� vs. Hydrasys-Hyrys® (14)

Paragorn CZE®2000 vs. Hydrasys-Hyrys®

(12) Frazione Coefficiente di correlazione = r, (valori analizzati in %) Albumina 0.97 0.97 0.99 0.95 0.98 α1-globuline 0.96 0.97 0.84 0.79 0.76 α2-globuline 0.92 0.95 0.94 0.91 0.90 β1-globuline 0.85 β2-globuline 0.73 0.97 0.82 0.79 0.65

γ-globuline 0.98 0.97 0.99 0.97 0.98 Si osservano invece delle differenze nella misurazione della frazione delle α1-globuline. Il coefficiente di correlazione per questa frazione risulta di r = 0.96. Il dato più importante che si estrapola dal grafico di correlazione lineare per questa frazione (figura 7), è l�aumento medio di circa il 150% dei i valori misurati con il Capillarys� 2, rispetto a quelli misurati con il sistema di elettroforesi su gel d�agarosio. Nella letteratura sono riportati degli studi che mostrano risultati simili con altri apparecchi di elettroforesi capillare, come il CZE�2000 (circa 100% di differenza (13)) e anche con la prima versione dell�apparecchio Capillarys� (circa il 200% di differenza (11)). Queste osservazioni impongono pertanto una correzione o una nuova determinazione dei valori di riferimento per quanto riguarda l�apparecchio di elettroforesi capillare. L�aumento della frazione delle α1-globuline nell�elettroforesi capillare è dovuto essenzialmente a due motivi:

• Il primo motivo è legato alla presenza di gruppi acidi nella proteina α1-glicoproteina acida, i quali interferiscono con il legame dei coloranti usati per la quantificazione delle proteine nei sistemi di elettroforesi su gel d�agarosio. Il metodo di determinazione UV, utilizzato dallo strumento Capillarys� 2, non è condizionato dalla presenza di questi gruppi acidi, e dunque esso determina valori superiori i rispetto all�elettroforesi su gel.

• Il secondo motivo è che la determinazione delle proteine a 200 nm offre una migliore determinazione dell�orosomucoide, il quale è difficilmente quantificabile con le tecniche di colorazione (13,17).


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Inoltre si può osservare una correlazione, per quanto riguarda la frazione delle β-globuline, inferiore rispetto alle altre frazioni. Per questa frazione si osserva un coefficiente di correlazione di 0.73, che nell�elettroforesi capillare può essere causato dallo spostamento della zona di migrazione di alcune componenti quali le lipo-proteine, dalla zona β, nell�elettroforesi su gel, alla zona α/β, finanche alla zona dell�albumina. In aggiunta, questo risultato può essere spiegato dalla composizione del tampone utilizzato nell�elettroforesi capillare e dalla diversa risoluzione delle due tecniche, che causano la divisione in due zone della frazione delle β-globuline. La correlazione tra i due sistemi, per quanto riguarda la frazione delle γ-globuline, frazione maggiormente coinvolta nella medicina di laboratorio per la diagnosi della maggior parte delle gammopatie monoclonali, offre un coefficiente di correlazione di 0.98 per i risultati in % (r = 0.99 per i risultati espressi in g/L). Dunque possiamo dire che non esistono delle differenze per quanto riguarda la frazione delle γ-globuline tra il sistema Hydrasys�-Hyrys e quello dell�elettroforesi capillare, con lo strumento Capillarys� 2. Un coefficiente di correlazione di 0.93 è stato riscontrato tra la determinazione dei valori dell�albumina in %, con il sistema dell�elettroforesi su gel d�agarosio e quella capillare (r = 0.96 per i valori in g/L, vedi figura 8). La figura 9 mostra una rappresentazione grafica dei valori dell�albumina in g/L determinati sui tre sistemi (Cobas Integra� 800, Capillarys� 2 e Hydrasys�-Hyrys), e si può osservare direttamente come i valori determinati con il sistema dell�elettroforesi capillare si avvicinano maggiormente a quelli ottenuti con il metodo del verde di bromocresolo (Cobas Integra 800), rispetto alla determinazione con il sistema su gel d�agarosio. Sempre questa figura si può inoltre osservare che, sia con l�elettroforesi capillare e sia con l�elettroforesi su gel d�agarosio, l�albumina risulta sempre più elevata rispetto a quella misurata con il metodo di riferimento all�interno del laboratorio. L�albumina, sullo strumento Capillarys� 2, è maggiore in media di circa il 0.7%, mentre l�albumina determinata con il sistema Hydrasys�-Hyrys presenta un errore sistematico del 2.3% (considerando un intervallo di confidenza dei valori al 95%). Sono stati inoltre eseguiti dei grafici di correlazione lineare tra la determinazione dell�albumina, in g/L, con il metodo del verde di bromocresolo (Cobas Integra� 800), con i due sistemi elettroforetici. Confrontando la determinazione dell�albumina con l�elettroforesi capillare con il metodo al verde di bromocresolo, si ottiene un coefficiente di correlazione di 0.87 (vedi allegato 11). Mentre il confronto tra la determinazione dell�albumina con l�elettroforesi su gel d�agarosio e la determinazione con il metodo al verde di bromocresolo, da un risultato di r pari a 0.85 (vedi allegato 11). In conclusione, possiamo quindi affermare che i due sistemi sovrastimano il valore dell�albumina rispetto all�automazione, su Cobas Integra� 800, ma i valori ottenuti con il Capillarys�2 sono meglio paragonabili a questi ultimi.

5.3 VALORI DI RIFERIMENTO Analizzando i campioni di 100 persone che non presentano nessun segno di una gammopatia monoclonale, e/o altri scompensi proteici nel siero, sono stati ottenuti i valori normali per l�elettroforesi capillare, che sono riportati nella tabella 6. I valori ottenuti sono confrontabili con quelli forniti dalla ditta Sebia (vedi tabella 6) (1). La differenza maggiore nei valori di riferimento tra quelli ottenuti per l�elettroforesi capillare rispetto ai quelli utilizzati per l�elettroforesi su gel d�agarosio, è riscontrabile nei valori della frazione delle α1-globuline. I valori ottenuti, oltre che ad essere confrontabili con quelli forniti dalla ditta Sebia, sono simili a quelli ottenuti e pubblicati da Klein e Jolliff (18), i quali riportano un ambito normale tra 2.7 e 5.1. Inoltre in questo studio non è stata verificata la variabilità dopo un cambio di lotto dei reattivi o dei capillari.


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5.4 ALTRE CARATTERISTICHE La maggiore risoluzione dell�elettroforesi capillare, permette la separazione di routine della frazione β-globuline in β1- e β2-globuline. La separazione in 6 frazioni maggiori permette una più facile individuazione di componenti monoclonali, presenti in piccole concentrazioni, o la cui migrazione si è arrestata nella zona beta. Infatti, in una frazione beta unica, componenti come la transferrina, la componente C3 del complemento o le β-lipoproteine, possono mascherare la presenza di eventuali picchi monoclinali. Nella elettroforesi capillare la frazione delle β1-globuline corrisponde alla transferrina, mentre la frazione delle β2-globuline, alla componente C3 del complemento. Nei 285 casi analizzati per la comparazione dei metodi, sono state riscontrate, con l�elettroforesi capillare, due bisalbuminemie (anomalia caratterizzata da una doppia banda dell�albumina osservata nel tracciato elettroforetico), non ulteriormente indagate e non riscontrate sull�elettroforesi su gel d�agarosio, probabilmente a causa della minore capacità di separazione rispetto all�elettroforesi capillare. Analizzando i vari tracciati elettroforetici, si nota un�ulteriore differenza rispetto al grafico elettroforetico ottenuto su gel d�agarosio: si osserva un restringimento della frazione gamma a vantaggio della frazione delle β2-globuline. Questo non ha grande rilevanza da un punto di vista clinico ma, come pure per lo sdoppiamento della frazione delle β-globuline, ha una rilevanza analitica nell�interpretazione dei tracciati da parte del personale di laboratorio: essendo abituati ad analizzare i grafici ottenuti con metodi convenzionali è necessario un breve periodo di adattamento per l�interpretazione dei nuovi tracciati.

5.4.1 ANALISI DEI TEMPI Tecniche di separazione convenzionali, che utilizzano una membrana o un gel, hanno lunghi tempi di analisi e necessitano di conoscenze tecniche e pratiche riguardanti tutte le fasi dell�analisi, a partire dalla manipolazione del gel, dalla preparazione e ricostituzione del tampone, dalla preparazione della soluzione di lavaggio e di colorazione, dall�applicazione del campione, dalla colorazione e misurazione con densitometro. Mediamente sono necessari fino a 90 minuti per ottenere un tracciato elettroforetico. È per questo motivo che sono stati sviluppati dei sistemi automatici per ottimizzare il lavoro. Il Capillarys� 2 è uno strumento completamente automatizzato che include nanotecnologie e che esegue contemporaneamente 8 separazioni delle proteine in circa 4 minuti, con un�alta capacità lavorativa (90 elettroforesi per ora. Per il primo rack, lo strumento impiega circa 13 minuti, mentre per i rack successivi lo strumento impiega 8 minuti, dato che mentre esegue la migrazione del rack precedente, contemporaneamente diluisce i campioni di quello seguente. La capacità massima del sistema è l�esecuzione di 13x8 rack contemporaneamente, per un totale di 104 pazienti. Per quanto riguarda l�esecuzione degli immunotyping, lo strumento impiega 10 minuti per eseguire la prima analisi (su ogni rack va inserito un solo campione), mentre i successivi campioni vengono analizzati in circa 7 minuti ciascuno (dato che mentre viene eseguita la migrazione del campione precedente viene già diluito il successivo). Dunque in un ora vengono effettuate circa 8 immunofissazioni. Per eseguire 4 immunofissazioni su gel (4 campioni per gel) mediante lo strumento Hydrasys�, si impiega circa 1 ora e 10 minuti (senza contare la preparazione iniziale del campione, che comprende la sua diluizione manuale e applicazione sul supporto, come pure la preparazione degli antisieri da pipettare). Per il passaggio da una metodica all�altra (elettroforesi proteine � ImmunoTyping e viceversa), lo strumento necessita di un tempo inferiore ad un minuto. Una volta acceso lo strumento, prima di poter eseguire qualsiasi analisi, è necessario un ciclo di messa in funzione che dura circa 10-12 minuti; mentre prima di poter spegnere l�apparecchio bisogna eseguire un ciclo di spegnimento che richiede circa 15 minuti.


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5.4.2 ANALISI DEI COSTI Il prezzo del kit 30 SP (serum protein) Hydrasys, utilizzato per l�esecuzione dell�elettroforesi su gel d�agarosio, ammonta a CHF 499.20. Con questo kit si possono analizzare un massimo di 300 campioni, per un costo unitario dell�analisi di CHF 1,66. Mentre il kit per l�esecuzione dell�elettroforesi capillare sullo strumento Capillarys� 2 costa CHF 1'420.--, e si possono eseguire 720 analisi, da cui si ricava un costo di analisi di CHF 1,97. La singola elettroforesi capillare ha un costo superiore di CHF 0.31, rispetto all�elettroforesi su gel (circa 18.7%). Nonostante un costo superiore della singola analisi, la strumentazione capillare richiede una manipolazione, da parte del tecnico di analisi, nettamente inferiore rispetto alla tecnica convenzionale su gel. Il tempo dedicato dall�operatore all�analisi capillare è limitato all�inserimento dei campioni nell�apparecchio e all�analisi dei risultati al termine della migrazione, permettendogli di svolgere altri compiti nell�attesa dei risultati. Al contrario, con il sistema su gel d�agarosio l�operatore, come già detto, deve dedicare più tempo allo svolgimento dell�analisi fino all�interpretazione finale dei risultati. Sempre per quanto riguarda l�analisi dei costi, secondo Lissoir, Wallemacq e Maisin (14), il costo di un test, in termini di reattivi, per l�apparecchio Capillarys�, è identico a quello del sistema semi-automatizzato Hydrasys� (circa EUR 0.60 per test). Nonostante il costo della singola analisi risulti simile e considerando nel calcolo il tempo impiegato dal personale, il prezzo dell�analisi capillare risulta essere inferiore di circa il 20%. In questo caso, il costo superiore dell�analisi convenzionale è dovuto al maggiore impiego della manodopera. Il costo dell�apparecchio Capillarys� 2, secondo listino, è di CHF 102'000.--. Calcolando un ammortamento della spesa su 10 anni e 260 giorni lavorativi l�anno, l�apparecchio risulta conveniente per i laboratori la cui routine supera un quantitativo di analisi giornaliere di 20 campioni. Tabella 8: riassunto dei costi, in CHF, del sistema capillare e su gel d�agarosio

Elettroforesi capillare Elettroforesi convenzionale Costo del Kit 1'420.-- 499.20

Numero massimo di analisi per kit 720 300 Costo singola analisi 1.97 1.66

Prestazione del personale Inserimento campione Interpretazione risultati

Preparazione del campione per la migrazione

Preparazione per la colorazione gel Lettura densitometrica Interpretazione risultati

5.4.3 EVENTUALI PROBLEMI All�inizio della nostra valutazione abbiamo dovuto fare fronte a dei problemi dovuti al fatto che l�apparecchio non era stato posizionato su un piano completamente orizzontale. Le vibrazioni da esso provocate causavano la perdita, all�interno dello strumento, della coppetta multipla per la diluizione del campione posizionata sul rack. Per quanto riguarda il software non sono stati riscontrati problemi.

5.5 RACCOMANDAZIONI Eccezion fatta per lo studio della precisione di giorno in giorno, non sono stati verificati gli effetti della conservazione sul campione di siero. Essa potrebbe essere eseguita misurando delle aliquote di un campione di controllo e/o un pool di sieri (a dipendenza della possibilità del laboratorio), dopo un giorno di conservazione a -20°C, dopo 2 giorni, dopo una settimana e eventualmente dopo un mese, confrontando alla fine delle misurazioni la variazione del risultato nel tempo. Questo lavoro


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potrebbe essere effettuato anche a differenti temperature, sempre per verificare l�effetto della conservazione del campione nel tempo, simulando delle condizioni ambientali che possono eventualmente influire sui risultati dei campioni inviati al laboratorio di analisi (ad esempio temperature estive, invernali, tempo di trasporto, ecc). In questo studio ci siamo concentrati sulla valutazione delle qualità analitiche dello strumento Capillarys� 2, per quanto riguarda l�analisi dell�elettroforesi delle proteine sieriche. Essendo il Capillarys� 2 uno strumento multiparametrico, in futuri studi si potrebbero verificare le capacità dell�apparecchio soprattutto per quanto riguarda l�esecuzione degli immunotyping (basati sulla procedura dell�immunosottrazione, vedi capitolo seguente). Le altre analisi che, con gli appositi kit, questo strumento permette attualmente di effettuare, e che quindi potrebbero essere soggette a studi futuri, sono l�analisi dell�elettroforesi delle proteine urinarie, immunotyping delle proteine urinarie, l�elettroforesi dell�emoglobina e l�analisi della separazione delle isoforme sieriche della transferrina (CDT).

5.5.1 IMMUNOTYPING Lo studio e la comparazione dell�identificazione delle componenti monoclonali non era un obbiettivo di questo lavoro di diploma, ma potrebbe esserlo per futuri lavori con questo apparecchio. Per prendere confidenza con esso sono stati anche eseguiti 36 immunotyping. Dei 36 casi analizzati si sono notate quattro differenze (vedi tabella 6). In due casi si è riscontrato una banda debole nella regione delle immunoglobuline con il sistema su gel (non ulteriormente indagate), mentre gli immunotyping, di questi stessi campioni, sono risultati positivi (uno di specificità IgG/K e l�altro IgG/L). Mentre negli altri due casi si è osservata una banda debole nella zona delle γ-globuline su gel (una di specificità IgA/L e la seconda non ulteriormente indagata), mentre gli immunotyping sono risultati negativi. Da questo risulta una concordanza dell�89%, anche se sono stati analizzati un numero insufficiente di campioni per poter essere considerato un parametro affidabile. In ulteriori studi si potrebbe dunque determinare la concordanza dei due sistemi, includendo le percentuali di falsi-positivi o di falsi-negativi riscontrati, e la sensibilità dell�apparecchio capillare utilizzando dei sieri con componenti monoclonali a concentrazioni scalari regressive, al fine di determinare la più grande diluizione che fornisce un risultato positivo (limite inferiore discriminante).


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6. CONCLUSIONE In conclusione, lo strumento Capillarys� 2 è un apparecchio multicapillare per l�elettroforesi capillare, designato per l�analisi delle proteine sieriche umane. Le sue qualità analitiche possono permettere al laboratorio di risparmiare una grande quantità di tempo, in confronto alle tecniche di elettroforesi su gel d�agarosio, attualmente in uso nella maggior parte dei laboratori. Le sue grandi prospettive, per quanto concerne le sue applicazioni, come l�analisi delle proteine urinarie, la separazione dell�emoglobina, o la separazione delle isoforme della transferrina (CDT) ne fanno un apparecchio sempre più indispensabile per l�evoluzione futura dei laboratori specializzati. Grazie ai suoi numerosi vantaggi, quali la grande rapidità, la facilità di utilizzo del apparecchio (non richiede specifiche conoscenze e capacità tecniche dell�operatore di laboratorio) e del software, bassi costi e minimo consumo dei reattivi, buona precisione ed alta risoluzione ne fanno quindi un ottima alternativa in laboratorio ai metodi di elettroforesi convenzionale. Il software offre inoltre la possibilità di creare un database per memorizzare le curve elettroforetiche dei vari pazienti, e permette il confronto con eventuali curve dello stesso paziente conservate in memoria. Considerato quanto sopra e riassunto nella tabella 9, si può concludere che l�introduzione di questo strumento risulta vantaggioso all�interno di laboratori clinici con una routine giornaliera di almeno 20 campioni, permettendo così di ridurre i tempi di analisi e le esigenze del laboratorio. Infine, proprio grazie alla facilità di utilizzo dell�apparecchio e del software, sarà necessario solo un breve periodo di formazione e di adattamento del personale al nuovo strumento. Tabella 9: Rappresentazione riassuntiva delle caratteristiche degli apparecchi Elettroforesi capillare Elettroforesi su gel d�agarosio Costo singola analisi CHF 1.97 CHF 1.66 Tempi di elettroforesi 4 min 7 min Tempi di analisi Fino a 37 min per 30 tracciati Fino a 90 min per 30 tracciati Facilità di uso Alta Media Apparecchio multiparametrico SI

Elettroforesi, immunotyping, separazione emoglobine, CDT,

urine,

SI Elettroforesi ed

immunofissazione, urine

Innovazioni future SI - Risoluzione Maggiore rispetto AGE Minore rispetto CE Quantità di campione nL (volume morto di 200 µL) 10 µL


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7. RINGRAZIAMENTI I miei ringraziamenti vanno in particolar modo all�Istituto Viollier per avermi dato la possibilità di effettuare il mio periodo di stage pratico e il mio lavoro di diploma nella sede di Allschwil (BL). Ringrazio tutte le persone che hanno contribuito alla realizzazione del mio lavoro di diploma �

� la ditta MEDIM (Medical Diagnostic Products, rappresentate in Svizzera della ditta Sebia), per avermi messo a disposizione gratuitamente l�apparecchio Capillarys� 2 e i reattivi per l�esecuzione del mio lavoro di diploma;

� il Dr. Phil II Giovanni Togni, per il suo supporto e i consigli dati durante tutto il periodo di formazione pratica e del lavoro di diploma, che mi hanno aiutato a proseguire e a migliorare sempre;

� Véronique Zygmunt, capo laboratorio del reparto di chimica, per il suo aiuto nella valutazione dell�apparecchio;

� tutte le colleghe reparto di chimica e chimica speciale del laboratorio Viollier di Allschwil per il loro aiuto e sostegno in questi mesi di lavoro;

� il direttore ad interim Andrea Boffini, per il sostegno metodologico durante tutto l�anno scolastico;

� le docenti Daniela Marcacci e Sonia Marci per il loro sostegno e aiuto, non solo durante lo svolgimento del lavoro di diploma;

� alla docente di inglese Susanne Gilbert per l�aiuto e la correzione nella redazione dell�Abstract;

� La mia famiglia per l�aiuto e la comprensione incondizionata dimostrati in questi ultimi

mesi non solo per lo sviluppo grafico e di correzione del lavoro; � La famiglia Forgiarini per avermi accolto ad Oberwil in questi ultimi mesi.


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8. BIBLIOGRAFIA

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Ruth C. Veres. GENETICA dall’analisi formale alla genomica. McGraw-Hill, 2004 3. Rob Reed, David Holmes, Jonathan Weyers, Allan Jones. Metodologie di base per le

scienze biomolecolari. Zanichelli, 2002 4. Arne W. K. Tiselius. Electrophoresis and adsorption analysis as aids in investigations of

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638 9. Lehmann R, Voelter W, Liebich HM. Capillary electrophoresis in clinical chemistry. J

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Benlakehal, Bernard Bousquet, Bernard Gourmel, Thierry Le Bricon. Automated multicapilary electrophoresis for analysis of human serum proteins. Clin Chem 2003; 49: 1909-1915

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13. Bienvenu J, Graziani MS, Arpin F, Bernon H, Blessum C, Marchetti C, Righetti G, Somenzini , Verga G, Aguzzi F. Multicenter evaluation of the paragon CZE®2000 capillary zone electrophoresis system for serum protein electrophoresis and monoclonal component typing. Clin Chem 1998; 44: 599-605

14. Lissoir B, Wallemacq P, Maisin D. Électrophorèse des protéines sériques: comparaison de la technique en capillaire de zone Capillarys™ (Sebia) et de l’électrophorèse en gel d’agarose Hydrasys™ (Sebia). Annales de Biologie Clinique 2003 Volume 61; 5: 557-562

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30

Elettroforesi capillare o su gel d�agarosio? Capillarys�2: un nuovo apparecchio per l�elettroforesi capillare delle proteine sieriche Giugno 2006 Marco Rossi Istituto Viollier Allschwil (BL) Dr. Phil II Giovanni Togni

INDICE ALLEGATI

ALLEGATO 1............................................. 1 - ERRORE. IL SEGNALIBRO NON È DEFINITO.8 Tabella per la raccolta dei dati ....................................................................................................................................1 - 8

ALLEGATO 2....................................................................................................................................9 ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO ................................................................................................................. 9

ALLEGATO 3:.................................................................................................................................10 Rette di regressione ottenute dalla correlazione tra il sistema di elettroforesi su gel d�agarosio e il sistema di elettroforesi capillare per le varie frazioni proteiche, con valori espressi in %............................................................. 10

ALLEGATO 4:.................................................................................................................................11 Rette di regressione ottenute dalla correlazione tra il sistema di elettroforesi su gel d�agarosio e il sistema di elettroforesi capillare per le varie frazioni proteiche, con valori espressi in g/L........................................................... 11

ALLEGATO 5:.................................................................................................................................12 Tabelle che raggruppano i dati raccolti nella determinazione dell�imprecisione di giorno in giorno, per i vari campioni: controllo di qualità congelato e a temperatura di 4°C, pool normale 1 ed un pool patologico.................... 12

ALLEGATO 6:.................................................................................................................................13 Rappresentazioni grafiche dell�andamento, sull�arco dei 16 giorni, dei valori ottenuti tramite l�analisi di 4 .............. 13

ALLEGATO 7:.................................................................................................................................14 Tabelle che raggruppano i dati raccolti nella determinazione della precisione nella serie, per i vari campioni: controllo di qualità, pool normale 1 e pool patologico (n = 10)..................................................................................... 14

ALLEGATO 8:.................................................................................................................................15 Rappresentazioni grafiche, dei valori ottenuti tramite l�analisi di 4 campioni (campione di controllo di qualità, pool normale 1 ed un pool patologico), al fine di determinare la precisione nella serie ....................................................... 15

ALLEGATO 9:.................................................................................................................................16 Tabelle che raggruppano i dati raccolti nella determinazione della precisione dei capillari, nell�arco di 4 giorni consecutivi su di un campione di siero normale (pool normale 2)................................................................................. 16

ALLEGATO 10:...............................................................................................................................17 Risultati dello studio della precisione dei capillari, mediante l�analisi di un campione di controllo di qualità, contemporaneamente sugli 8 capillari, per tre volte nell�arco della stessa giornata...................................................... 17

ALLEGATO 11:...............................................................................................................................18 Grafici di regressione lineare tra la determinazione dell�albumina, in g/L, con il sistema del verde di bromocresolo (Cobas Integra�800) e rispettivamente con il sistema dell�elettroforesi capillare (a) e su gel di agarosio (b) ........... 18

ALLEGATO 12:...............................................................................................................................19 Siero di controllo per elettroforesi della ditta Sebia (Francia): lot 01045/01, scd 04/2009........................................... 19


9

ALLEGATO 2 ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO L�elettroforesi è una tecnica di separazione basata sul movimento di molecole cariche in un campo elettrico. Molecole, caricate elettricamente, dissimili possiedono differenti velocità di separazione attraverso una soluzione, sotto l�influsso di un campo elettrico. La mobilità elettroforetica di una particella caricata varia in base a:

• La sua carica netta: le molecole cariche negativamente � anioni � migrano verso l�anodo, mentre le molecole cariche positivamente � cationi � migrano verso il catodo; le molecole altamente cariche si muovono più velocemente verso l�elettrodo di carica opposta

• Le sue dimensioni: la resistenza frizionale esercitata su molecole che si muovono in soluzione da parte della matrice porosa, fa si che le molecole più piccole migrino più velocemente di quelle più grandi

• La forza del campo elettrico e dalle proprietà del mezzo di migrazione.

La mobilità aumenta con l�intensificazione della forza del campo elettrico (voltaggio), ma vi sono limiti pratici all�uso d�alti voltaggi nell�elettroforesi su gel, specialmente dovuti all�elevato riscaldamento. La carica netta di una proteina dipende dal pH ed è determinata dal numero relativo delle catene laterali d�amminoacidi cariche positivamente e negativamente ad un dato valore di pH. In genere la separazione delle proteine si esegue in un pH alcalino, in cui la maggior parte delle proteine ha una carica netta negativa. Per separarle si deposita una porzione di siero su una matrice imbevuta di una soluzione elettrolitica (tampone), che permette il passaggio della corrente. La matrice porosa introduce un ulteriore effetto di setaccio molecolare. Le dimensioni dei pori sono in genere dello stesso ordine di dimensione delle molecole che vengono separate, e restringono di conseguenza il movimento delle molecole più grandi rispetto a quelle più piccole. La matrice può essere costituita da carta da filtro, acetato di cellulosa, gel d�agarosio (polisaccaride ottenuto dalle alghe marine e utilizzato per la separazione di proteine, lipo-proteine, DNA e RNA), gel d�acrilamide,� Lo scopo di questi supporti è quello di ridurre la diffusione delle particelle, in modo che queste migrino e si separino in una zona ben precisa e caratteristica. Il tampone ha una duplice funzione: garantire il passaggio della corrente e mantenere costante il pH. Le sostanze vengono fatte migrare grazie alla differenza di potenziale elettrico tra i due elettrodi. Le grosse proteine tendono a spostarsi fra le maglie della matrice porosa più lentamente rispetto a quelle più piccole che si spostano verso l�anodo con meno difficoltà. Prima della colorazione le proteine separate devono essere fissate in posizione in modo che non diffondano, tramite l�utilizzo di MeOH. I coloranti utilizzati per la colorazione sono l�Amido Schwarz, il Blue di Comassie e il Ponceau S. Per la quantificazione delle proteine separate su gel d�agarosio, la tecnica più utilizzata è la lettura mediante un densitometro. Un fascio di luce molto fine (fascio laser o luce monocromatica) viene fatto passare su tutta la lunghezza della striscia delle proteine colorate. Un lettore registra i cambiamenti d�intensità della luce che passa attraverso il gel e li rappresenta in un profilo. La dimensione delle bande e la loro intensità sono proporzionali alla concentrazione delle varie proteine. Il grafico finale risulta costituito da una serie di picchi corrispondenti alle frazioni proteiche (2,3,8).


10

ALLEGATO 3 Rette di regressione ottenute dalla correlazione tra il sistema d�elettroforesi su gel d�agarosio e il sistema d�elettroforesi capillare per le varie frazioni proteiche, con valori espressi in %

ALBUMINA %

y = 0.9935x - 2.0473R2 = 0.9367

10

20

30

40

50

60

70

80

90

10 30 50 70 90

AGE

CE

FRAZIONE ALFA1 %

y = 1.3433x + 0.6847R2 = 0.9207

02468

101214161820

0 5 10 15 20

AGE

CE

FRAZIONE ALFA2 %

y = 1.0584x - 1.2113R2 = 0.8414

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30

AGE

CE

FRAZIONE BETA TOT %

y = 0.8006x + 2.1865R2 = 0.5266

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25

AGEC

E

FRAZIONE GAMMA %

y = 0.9518x + 1.9418R2 = 0.9687

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60

AGE

CE


11

ALLEGATO 4: Rette di regressione ottenute dalla correlazione tra il sistema d�elettroforesi su gel d�agarosio e il sistema d�elettroforesi capillare per le varie frazioni proteiche, con valori espressi in g/L

ALBUMINA g/L

y = 0.9602x - 0.0029R2 = 0.944

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

10.0 30.0 50.0 70.0

AGE

CE

FRAZIONE ALFA1 g/L

y = 1.3269x + 0.5123R2 = 0.9133

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

0.0 5.0 10.0 15.0

AGE

CE

FRAZIONE ALFA2 g/L

y = 1.1024x - 1.1857R2 = 0.8345

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0

AGE

CE

FRAZIONE BETA TOT g/L

y = 0.9024x + 0.8164R2 = 0.5705

0.02.04.06.08.0

10.012.014.016.018.020.0

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0

AGE

CE

FRAZIONE GAMMA g/L

y = 0.9792x + 1.1132R2 = 0.9821

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

0.0 20.0 40.0 60.0

AGE

CE


12

ALLEGATO 5: Tabelle che raggruppano i dati raccolti nella determinazione dell�imprecisione di giorno in giorno, per i vari campioni: controllo di qualità congelato e a temperatura di 4°C, pool normale 1 ed un pool patologico Controllo di qualità: lot 01045/01, conservato in congelatore a -20°C Giorno 1 2 6 7 9 12 13 14 15 16 9.03 10.03 14.03 15.03 17.03 20.03 21.03 22.03 23.03 24.03 Albumina 62.8 62.3 62.6 63 62.5 62.4 62.2 62.9 63 62.8 alfa1 4 4.2 4.1 4.1 4.1 4.2 4.3 4.3 4.2 4.1 alfa2 8.9 9 9 8.9 9 9 9.2 9 9 9.1 beta1 6.1 6.2 6.1 6.1 6.3 6.1 6.1 6.2 6 6 beta2 4.2 4.2 4.3 4.4 4.1 4.1 4.1 4.2 4.1 4.1 γ 14 14.1 13.9 13.6 14 14.2 14.1 13.4 13.7 13.9 Controllo di qualità: lot 01045/01, conservato in frigorifero ad una temperatura di 4°C Giorno 1 2 6 7 9 12 13 14 15 16 9.03 10.03 14.03 15.03 17.03 20.03 21.03 22.03 23.03 24.03 Alb 63 62.7 63.5 63.7 63.8 64 63.5 63.5 63.4 63.2 alfa1 3.9 4 3.7 3.8 3.9 4 4.1 4 3.9 4.1 alfa2 8.8 8.7 8.7 8.3 8.3 8.5 8.6 8.7 8.7 8.7 beta1 6.1 6.2 6.2 6.4 6.3 6.1 6.2 6.3 6.1 6.1 beta2 4.3 4.4 4 4.2 4.2 4 4.1 4.2 4.1 4.1 γ 13.9 14 13.9 13.6 13.5 13.4 13.5 13.3 13.8 13.8 Pool Normale, conservato in congelatore a -20°C Giorno 1 2 6 7 9 12 13 14 15 16 9.03 10.03 14.03 15.03 17.03 20.03 21.03 22.03 23.03 24.03 Alb 63 63.8 63.9 63.9 63.7 63.8 63.8 63 63.7 63.8 alfa1 4.1 4 4 3.9 4 4.1 4 4.2 4.1 4.1 alfa2 9.7 9.4 9.4 9.6 9.6 9.7 9.6 9.8 9.5 9.7 beta1 6.5 6.3 6.3 6.3 6.5 6.3 6.3 6.4 6.4 6.3 beta2 4 4.2 4.3 4.1 4.2 4 4.1 4.1 4.3 4.1 γ 12.7 12.3 12.1 12.2 12 12.1 12.2 12.5 12 12 Pool Patologico, conservato in congelatore a -20°C Giorno 1 2 6 7 9 12 13 14 15 16 9.03 10.03 14.03 15.03 17.03 20.03 21.03 22.03 23.03 24.03 Alb 53.2 52.7 53.7 52.7 53 53.4 53.2 52.7 53.4 53 alfa1 3.7 4 3.7 3.9 3.9 3.8 3.8 3.8 3.8 3.9 alfa2 9.1 9.1 8.8 9.3 9 9 9 9.2 8.9 8.9 beta1 5.4 5.4 5.5 5.7 5.6 5.6 5.7 5.7 5.5 5.8 beta2 3.3 3.2 3.1 3.1 3.1 3.1 3.2 3.2 2.9 3.2 γ 25.3 25.6 25.2 25.3 25.4 25.1 25.1 25.4 25.5 25.2


13

ALLEGATO 6: Rappresentazioni grafiche dell�andamento, sull�arco dei 16 giorni, dei valori ottenuti tramite l�analisi dei 4 campioni (campione di controllo di qualità, pool normale 1 ed un pool patologico conservati a -20°C, e un campione di controllo conservato a 4°C)

ALBUMINA

5055

6065

70

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Giorni

Valo

re

CQcongCQfrigoP.normaleP.patologico

FRAZIONE ALFA1

33.5

44.5

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Giorni

Valo

ri

Alfa1CQcongAlfa1CQfrigoAlfa1P.normaleAlfa1P.patologico

FRAZIONE ALFA2

77.5

88.5

99.510

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 1 1 1 15

Giorni

CQcongCQfrigoP.normP.patologico

FRAZIONE BETA1

45678

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Giorni

Valo

ri

CQcongCQfrigoP.normP.patologico

FRAZIONE BETA2

23456

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Giorni

Valo

riCQcongCQfrigoP.normP.patologico

FRAZIONE GAMMA

51015202530

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16Giorni

Valo

ri

CQcongCQfrigoP.NormP.patologico


14

ALLEGATO 7: Tabelle che raggruppano i dati raccolti nella determinazione della precisione nella serie, per i vari campioni: controllo di qualità, pool normale 1 e pool patologico (n = 10) Controllo di Qualità: Lot: 01045/01 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Alb 62.2 62.6 63 62.4 62 62.4 62.7 62.5 61.4 62.3 alfa1 4.2 4.1 4.2 4.3 4.3 4.1 4.1 4.1 4.3 4.1 alfa2 9.2 9.1 8.7 9.1 9.2 9 9 9 9.3 9.1 beta1 6.1 6 6.1 6.2 6.1 6 6.1 6.2 6.2 6.3 beta2 4.2 4.2 4.3 4.3 4.3 4.4 4.2 4.3 4.3 4.3 γ 14.1 14 13.7 13.7 14.1 14.1 13.9 13.9 14.5 13.9 Pool Normale 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Alb 63.5 63.5 64.2 63.8 62.9 63.6 63.9 63.9 63 63.5 alfa1 4.2 4.1 3.9 4 4.3 4 3.9 4.1 4.3 4.2 alfa2 9.7 9.5 9.3 9.3 9.6 9.5 9.4 9.5 9.6 9.6 beta1 6.3 6.3 6.2 6.3 6.4 6.4 6.3 6.2 6.4 6.4 beta2 4 4.1 4.3 4.2 4.3 4.2 4.1 3.9 4.1 4 γ 12.3 12.5 12.1 12.4 12.5 12.3 12.4 12.4 12.6 12.3 Pool Patologico 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Alb 52.9 53.5 53.6 54 53.1 52.9 53.6 53.6 52.9 53.5 alfa1 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 4 3.6 3.7 4.1 3.8 alfa2 9.3 8.6 8.6 8.6 8.9 8.8 8.5 8.6 8.6 8.9 beta1 5.3 5.3 5.5 5.6 5.6 5.5 5.3 5.5 5.8 5.5 beta2 3.4 3.5 3.3 3 3.2 3.4 3.4 3.3 3.2 3.1 γ 25.3 25.3 25.2 25 25.4 25.4 25.6 25.3 25.4 25.2


15

ALLEGATO 8: Rappresentazioni grafiche, dei valori ottenuti tramite l�analisi di 4 campioni (campione di controllo di qualità, pool normale 1 ed un pool patologico), al fine di determinare la precisione nella serie

ALBUMINA (precisione giornaliera)

50

55

60

65

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Misurazioni

Valo

re

CQP.NORMALEP.PATOLOGICO

ALFA 1 (precisione giornaliera)

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Misurazioni

Valo

ri


ALFA2 (precisione giornaliera)

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10MISURAZIONI

VALO

RI


BETA1 (precisione giornaliera)

4.55

5.56

6.57

7.5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

M ISU R A Z ION I


BETA2 (precisione giornaliera)

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10MISURAZIONI

VALO

RI


GAMMA (precisione giornaliera)

10

1520

25

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10MISURAZIONI

VALO

RI



16

ALLEGATO 9: Tabelle che raggruppano i dati raccolti nella determinazione della precisione dei capillari, nell�arco di 4 giorni consecutivi su di un campione di siero normale (pool normale 2) Frazione alb alfa1 alfa2 beta1 beta2 gamma Capillare 20.03 20.03 20.03 20.03 20.03 20.03 1 62.8 4.1 11.7 5.6 4 11.8 2 62.7 4.1 11.8 5.6 3.7 12.1 3 62.6 4.2 11.7 5.8 3.7 12 4 61.7 4.2 12.2 5.9 3.8 12.2 5 62.8 4 11.7 5.6 3.9 12 6 62.4 4.1 11.8 5.7 4 12 7 62.3 4.1 11.8 5.8 4 12 8 61.6 4.2 11.9 5.8 4.1 12.4 Frazione alb alfa1 alfa2 beta1 beta2 gamma Capillare 21.03 21.03 21.03 21.03 21.03 21.03 1 63.4 4.2 11.6 5.6 3.9 11.3 2 62.8 4 11.5 5.7 4.1 11.9 3 62.8 4.1 11.6 5.6 4 11.9 4 61.5 4.4 12 5.8 4.2 12.1 5 61.6 4.3 11.8 5.8 4.4 12.1 6 61.8 4.2 11.8 6 4.1 12.1 7 62.5 4.2 11.5 5.8 4.1 11.9 8 61.7 4.3 11.7 6 4.3 12 Frazione alb alfa1 alfa2 beta1 beta2 gamma Capillare 22.03 22.03 22.03 22.03 22.03 22.03 1 62.8 4.1 11.6 5.7 4.1 11.7 2 62.3 4.3 11.7 5.6 4.1 12 3 62.2 4.1 11.9 5.7 4 12.1 4 61.6 4.3 12 5.7 4.1 12.3 5 62.2 4.2 11.8 5.8 4.2 11.8 6 62.5 4.1 12 5.6 3.9 11.9 7 62.3 4.3 11.8 5.7 4.1 11.8 8 61.7 4.1 11.9 6 4.3 12 Frazione alb alfa1 alfa2 beta1 beta2 gamma Capillare 23.03 23.03 23.03 23.03 23.03 23.03 1 63.2 4 11.6 5.7 4.1 11.4 2 61.9 4 12 5.9 4.3 11.9 3 62.4 4 11.8 5.8 4.1 11.9 4 61.8 4.2 11.9 5.9 4.1 12.1 5 62.1 4.2 11.9 5.8 4.2 11.8 6 62.4 4.1 11.8 5.8 4.3 11.6 7 62.3 4.1 11.7 5.8 4.2 11.9 8 62 4.4 11.8 6 4.2 11.6


17

ALLEGATO 10: Risultati dello studio della precisione dei capillari, mediante l�analisi di un campione di controllo di qualità, contemporaneamente sugli 8 capillari, per tre volte nell�arco della stessa giornata Frazione alb alfa1 alfa2 beta1 beta2 gamma Capillare 7.03 7.03 7.03 7.03 7.03 7.03 Prima determinazione 1 63.4 4.2 8.9 6 4 13.5 2 62.5 4.2 9.2 6 4.1 14 3 62.7 4 9 6.3 4.1 13.9 4 62.3 4 9.1 6.2 4 14.4 5 62.4 4.1 9.1 6.3 4.2 13.9 6 63 4 9.1 5.9 4 14 7 63.3 4 9 5.8 4.1 13.8 8 62 4.1 9.3 6.2 4.1 14.3 7.03 7.03 7.03 7.03 7.03 7.03 Seconda determinazione 1 63.1 4 9.1 5.9 4 13.9 2 62.8 4.1 9 6.2 4.1 13.8 3 62.3 4 9.1 6.2 4.2 14.2 4 62.1 4 9 6.4 4 14.5 5 62 4 9 6.4 4.2 14.4 6 63.2 4 8.8 6 4.1 13.9 7 61.7 4.2 9.2 6.4 4.2 14.3 8 62.5 4.1 9.1 6.2 4 14.1 Capillare 7.03 7.03 7.03 7.03 7.03 7.03 Terza determinazione 1 62.8 4 9.2 5.9 4 14.1 2 62.7 4 9.2 6 3.9 14.2 3 63.1 4 9 6 4 13.9 4 61.7 4.2 9.4 6.3 4.1 14.3 5 62.4 4 9.2 6.1 4.1 14.2 6 62.7 4 9.2 6 4 14.1 7 62.9 4 9.1 6 3.9 14.1 8 61.8 4 9.3 6.2 4.3 14.4 ALBUMINA ALFA1 ALFA2 capillare Media Dev.st CV capillare Media Dev.st CV capillare Media Dev.st CV 1 63.1 0.30 0.48 1 4.1 0.12 2.84 1 9.1 0.15 1.68 2 62.7 0.15 0.24 2 4.1 0.10 2.44 2 9.1 0.12 1.26 3 62.7 0.40 0.64 3 4.0 0.00 0.00 3 9.0 0.06 0.64 4 62.0 0.31 0.49 4 4.1 0.12 2.84 4 9.2 0.21 2.27 5 62.3 0.23 0.37 5 4.0 0.06 1.43 5 9.1 0.10 1.10 6 63.0 0.25 0.40 6 4.0 0.00 0.00 6 9.0 0.21 2.30 7 62.6 0.83 1.33 7 4.1 0.12 2.84 7 9.1 0.10 1.10 8 62.1 0.36 0.58 8 4.1 0.06 1.42 8 9.2 0.12 1.25 TOT 62.6 (media) 0.6 TOT 4.1 (media) 1.7 TOT 9.1 (media) 1.5 BETA1 BETA2 GAMMA. capillare Media Dev.st CV capillare Media Dev.st CV capillare Media Dev.st CV 1 5.9 0.06 0.97 1 4.0 0.00 0.00 1 13.8 0.31 2.21 2 6.1 0.12 1.90 2 4.0 0.12 2.86 2 14.0 0.20 1.43 3 6.2 0.15 2.48 3 4.1 0.10 2.44 3 14.0 0.17 1.24 4 6.3 0.10 1.59 4 4.0 0.06 1.43 4 14.4 0.10 0.69 5 6.3 0.15 2.44 5 4.2 0.06 1.39 5 14.2 0.25 1.78 6 6.0 0.06 0.97 6 4.0 0.06 1.43 6 14.0 0.10 0.71 7 6.1 0.31 5.04 7 4.1 0.15 3.76 7 14.1 0.25 1.79 8 6.2 0.00 0.00 8 4.1 0.15 3.70 8 14.3 0.15 1.07



18

ALLEGATO 11: Grafici di regressione lineare tra la determinazione dell�albumina, in g/L, con il sistema del verde di bromocresolo (Cobas Integra�800) e rispettivamente con il sistema dell�elettroforesi capillare (a) e su gel d�agarosio (b)

a b


19

ALLEGATO 12: Siero di controllo per elettroforesi della ditta Sebia (Francia): lot 01045/01, scd 04/2009.

capillarysŽ 2 - sbt - sistema bibliotecario ticinese ... · ssmt, marco rossi, giugno 2006 2 di 29...

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